pmid: "35548631"
title: "Nanopartículas de fibroína de seda carregadas com andrografólido"
authors: "Zhongyu X, Jiangmeng R, Qiufang J, Fuzheng R, Mengting H, Wenrui D, Bubing Z"
journal: "RSC advances"
pubdate: "2018 Oct 04"
doi: "10.1039/c8ra04156c"
source: "PMC Full Text"
Nanopartículas de fibroína de seda carregadas com andrografólido
Autores
Zhongyu X, Jiangmeng R, Qiufang J, Fuzheng R, Mengting H, Wenrui D, Bubing Z
Periodico
RSC advances (2018 Oct 04)
Conteudo
Nanopartículas de fibroína da seda carregadas com andrografólide†
Andrografólide (AP) é um diterpenoide isolado da Andrographis paniculata com um amplo espectro de atividades biológicas, incluindo anti-inflamatória, anticancerígena, hepatoprotetora e anti-hiperlipidêmica. No entanto, sua baixa solubilidade em água e instabilidade resultam em menor biodisponibilidade, o que limita seriamente sua função farmacológica. Neste estudo, foi relatada a tentativa de usar fibroína da seda regenerada (RSF) como carreador de fármaco para encapsular AP. As nanopartículas de RSF carregadas com AP foram preparadas por um método simples e limpo, sem agentes tóxicos. Além disso, atenção especial foi dada à otimização da formulação. Finalmente, os tamanhos das nanopartículas de RSF carregadas com AP variaram de 200 a 1000 nm, e as nanopartículas apresentaram formato esférico, conforme observado por microscopia eletrônica de transmissão. A carga de fármaco e a eficiência de encapsulação foram de cerca de 25,9% e 87,3%, respectivamente. Além disso, o tempo de liberação das nanopartículas de RSF carregadas com AP foi de cerca de 3 dias. O tamanho das partículas e o comportamento de liberação do fármaco puderam ser ajustados pelo tratamento com glicol amina. Os estudos de citotoxicidade in vitro demonstraram que as nanopartículas de RSF apresentaram citotoxicidade desprezível para as células, e a atividade antiproliferativa das nanopartículas de RSF carregadas com AP mostrou que estas podem aderir facilmente às células HeLa e MDA-MB-231. Todos esses resultados indicam que este nanocarreador de fármaco biomacromolecular tem grande potencial para quimioterapia em aplicações clínicas.
Andrografólide (AP) é um diterpenoide isolado da Andrographis paniculata com um amplo espectro de atividades biológicas, incluindo anti-inflamatória, anticancerígena, hepatoprotetora e anti-hiperlipidêmica.
Introdução
Andrografólide (AP) é um diterpenoide natural isolado da Andrographis paniculata e exibe um amplo espectro de atividades biológicas, incluindo anti-inflamatória, anticancerígena, hepatoprotetora e anti-hiperlipidêmica. No entanto, o AP é insolúvel tanto em água quanto em solventes apolares. Além disso, é rapidamente metabolizado no duodeno e jejuno para formar um conjugado de sulfato que é hidrofílico e provavelmente impermeável. Todos esses fatores levam diretamente a uma menor biodisponibilidade oral (2,67%) do AP e limitam seriamente sua função farmacológica. Para resolver esses problemas, pesquisadores projetaram muitas novas formas farmacêuticas para o AP, como comprimidos dispersíveis, pílulas gota, microemulsão oral, lipossomas, nanocristais e complexos de inclusão com ciclodextrina. Embora resultados desejados tenham sido obtidos ao melhorar a biodisponibilidade do AP, a aplicação clínica do AP ainda é restrita devido à menor taxa de carga de fármaco, taxa de aprisionamento, baixa estabilidade das formas farmacêuticas e à presença de resíduos de solventes orgânicos. Para superar esses problemas, é necessário desenvolver sistemas carreadores de fármacos adequados.
A fibroína de seda regenerada (RSF) proveniente da seda de Bombyx mori é uma das proteínas fibrosas amplamente utilizadas na pesquisa biomédica e farmacêutica. Ela consiste em grandes regiões hidrofóbicas separadas por regiões relativamente curtas e mais hidrofóbicas. A RSF torna-se solúvel em água ao adotar uma conformação aleatória e/ou helicoidal, mas facilmente se torna insolúvel em água após uma transição conformacional para folha β induzida por diversos fatores, como solventes orgânicos, força de cisalhamento, sonicação, aumento de temperatura e alteração de pH. Isso implica que a RSF possui características de auto-montagem, oferecendo uma oportunidade única no design de estruturas supramoleculares. Além disso, a fibroína de seda exibe boa biocompatibilidade, biodegradabilidade controlável e baixas respostas inflamatórias, sugerindo ainda que a RSF é uma candidata ideal como carreador de fármacos em nanoescala.
Vários esforços foram realizados para desenvolver nanopartículas de RSF (RSFNPs). Por exemplo, nanopartículas de mistura de fibroína de seda e albumina com tamanho de 140–300 nm foram preparadas pelo método de dessolvatação e utilizadas para carregar o fármaco modelo metotrexato. Em outro estudo, nanopartículas de RSF carregadas com cisplatina, com aproximadamente 59 nm de diâmetro, preparadas por eletropulverização, demonstraram liberação in vitro sustentada por mais de 15 dias. Também foi relatado que nanopartículas de RSF podem ser preparadas pela simples adição gota a gota de solução de RSF em solventes orgânicos próticos e apróticos polares miscíveis em água, como etanol, metanol, n-propanol, isopropanol, tetraidrofurano e acetona. Neste estudo, um método limpo foi desenvolvido para preparar RSFNPs carregando AP com tamanhos de partícula previsíveis e controláveis, baseado na auto-montagem da proteína da seda. Para obter nanopartículas uniformes e estáveis, glicol amina (mPEGNH2) foi introduzido no processamento, e atenção especial foi dada à função do mPEGNH2. O tamanho médio de partícula das nanopartículas carregadas com AP (AP-RSFNPs) variou de 200 a 1000 nm. A carga de fármaco das AP-RSFNPs foi de cerca de 25,7%, muito superior aos resultados anteriores; a eficiência de encapsulação do fármaco foi mantida em um nível adequado de aproximadamente 87,3%, e o tempo de liberação foi de cerca de 3 dias.
Neste estudo, AP-RSFNPs foram projetadas para aplicações em quimioterapia linfática, uma modalidade terapêutica relativamente nova aplicada no tratamento de metástases linfáticas em pacientes com cânceres do trato digestivo e de pulmão. Diferentemente da quimioterapia intravenosa convencional, a principal abordagem dessa quimioterapia consiste no uso de sistemas de liberação de fármacos e administrações intersticiais locais, como injeções intramusculares, subcutâneas, intratumorais e intraperitoneais, para direcionar os agentes aos linfonodos regionais. Observou-se que as partículas atravessam os vasos linfáticos, mas não os capilares sanguíneos, principalmente devido à diferença de permeabilidade. Estudos com lipossomas carregados com fármacos e partículas de PLGA mostram que tamanhos de partícula variando de centenas de nanômetros a micrômetros são adequados para a quimioterapia linfática, pois as partículas menores atravessam facilmente os linfonodos, enquanto as maiores são facilmente retidas pelos tecidos linfonodais durante a filtração física, alcançando assim uma liberação prolongada do fármaco.
Experimental
Materiais
Casulos do bicho-da-seda Bombyx mori foram obtidos na Província de Zhejiang, China. AP foi adquirido da Sichuan Chengdu DESITE Biological Technology Co. Ltd. Glicol amina (mPEGNH2) foi adquirido da Aladdin. A linhagem HeLa e a linhagem MDA-MB-231 foram fornecidas pelo Instituto de Biologia Celular de Xangai, Academia Chinesa de Ciências. Todos os reagentes foram adquiridos da Shanghai Zhenxin Chemical Factory (China).
Preparação da solução aquosa de RSF
A solução aquosa de RSF foi preparada conforme descrito anteriormente, com pequenas modificações. Resumidamente, casulos de Bombyx mori foram cortados em pequenos pedaços e fervidos por 60 minutos em solução de Na2CO3 a 0,5%; o sólido foi lavado várias vezes com água deionizada. Após secagem completa, a seda desengomada foi dissolvida em solução de LiBr 9,3 mol L−1 a 60 °C por 4 h. A solução foi então dialisada em tubo de celulose semipermeável (14 kD MWCO) contra água deionizada por 3 dias para remover o sal. Em seguida, a solução de fibroína da seda dialisada foi centrifugada a 10.000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante foi coletado e armazenado a 4 °C para uso posterior. A concentração final da solução de RSF foi de cerca de 3–8% em massa.
Preparação de nanopartículas de RSF carregadas com AP
A solução aquosa de mPEGNH₂ a 10% foi lentamente adicionada gota a gota à solução de RSF sob agitação suave a 100 rpm, obtendo-se concentrações finais de RSF de 5, 10, 20 e 30 mg mL⁻¹; em seguida, a mistura foi agitada suavemente por 30 minutos. Posteriormente, uma certa quantidade de solução etanólica de AP foi lentamente adicionada à mistura com diferentes proporções volumétricas de VRSF/Vetanol, conforme mostrado na Tabela 1. A mistura final foi agitada suavemente por 5 minutos e incubada em refrigerador a −20 °C. Após o descongelamento à temperatura ambiente, obteve-se uma emulsão leitosa ou gelatina. Para remover o fármaco não encapsulado, 5 mL da suspensão foram dialisados com 1 L de água deionizada por 4 h e, em seguida, liofilizados para obtenção do pó liofilizado, que foi armazenado a 4 °C para uso posterior.
Características da suspensão de nanopartículas de RSF carregadas com AP
Amostra RSF (%) AP (mg mL⁻¹) mPEGNH₂ (%) EtOH : RSF (V/V) Tempo de congelamento (h) Diâmetro médio volumétrico (nm) Variância (P.I.) 1 0,5 2 5% 0,2 5 528,2 0,108 2 0,5 4 10% 0,25 10 423,9 0,002 3 0,5 6 20% 0,4 20 332,0 0,107 4 0,5 7 30% 0,5 24 947,7 0,664 5 1 2 10% 0,4 24 322,8 0,097 6 1 4 5% 0,5 20 996,9 0,410 7 1 6 30% 0,2 10 378,7 0,412 8 1 7 20% 0,25 5 623,0 0,477 9 2 2 20% 0,5 10 >1000 — 10 2 4 30% 0,4 5 238,9 0,312 11 2 6 5% 0,25 24 503,4 0,333 12 2 7 10% 0,2 20 893,9 0,254 13 3 2 30% 0,25 20 495,7 0,479 14 3 4 20% 0,2 24 495,7 0,479 15 3 6 10% 0,5 5 >1000 — 16 3 7 5% 0,4 10 372,0 0,172
Caracterização das nanopartículas de RSF carregadas com AP
Análise de tamanho
Os tamanhos das nanopartículas de RSF carregadas com AP foram analisados à temperatura ambiente com o sistema de dimensionamento de partículas PSS NICOMP.
Medidas de espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier
As medidas de espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR) das nanopartículas de RSF puras, carregadas com AP, tratadas com PEG e das misturas de AP com nanopartículas de RSF tratadas com PEG, bem como do pó de AP (na forma de reflexão total atenuada (ATR)), foram obtidas com o equipamento Shimadzu IRPrestige-21. Para cada medida, foram coletadas 32 varreduras com resolução de 4 cm⁻¹.
Observações morfológicas
O pó liofilizado foi diretamente adicionado sobre fitas condutoras montadas em suportes de amostra para microscopia eletrônica de varredura (MEV). As morfologias das nanopartículas de RSF foram obtidas com o MEV Hitachi S-3400N a 15 kV. A emulsão recém-preparada foi diluída com água deionizada antes da observação por microscopia eletrônica de transmissão (MET). As imagens de MET foram obtidas com o JEM-1400 a 200 kV.
Encapsulação e liberação in vitro de AP
A quantidade de AP nas nanopartículas foi determinada com HPLC Agilent 1260 após tratamento com metanol por ultrassom durante 15 min. As análises por HPLC foram realizadas em coluna C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) a uma temperatura de coluna de 30 °C, utilizando uma fase móvel de metanol e água fornecida a uma vazão de 0,5 mL min⁻¹, e a detecção foi conduzida a 230 nm. O volume de injeção foi de 20 μL. A curva de calibração foi linear para AP na faixa de concentração de 10–300 ng μL⁻¹ (R² = 0,9996) com a equação linear A = 79,58C − 273,16 (A é a área do pico e C é a concentração do padrão com a unidade de ng μL⁻¹). Os valores de desvio padrão relativo (DPR) das precisões inter e intradia não excederam 3%. A análise e o processamento dos dados foram realizados pelo Agilent Chemstation.
A capacidade de carregamento de fármaco (DL) e a eficiência de encapsulação (EE) foram calculadas da seguinte forma:
Liberação in vitro de AP a partir das nanopartículas carregadas com AP e a influência do PEG
A liberação de três tipos de AP-RSFNPs, solução saturada de AP e suspensão de AP foi realizada pelo método de diálise em solução tampão fosfato (PBS) mantida a pH 7,4. Colocamos um mililitro de suspensão de AP-RSFNPs (0,9 mg mL⁻¹ em PBS), solução saturada de AP (0,043 mg mL⁻¹ em PBS) e suspensão de AP (0,9 mg mL⁻¹ em PBS) em sacos de diálise. Os sacos foram colocados em um frasco com 49 mL de PBS adicionado como meio de dissolução. O frasco cônico foi mantido a 37 °C com velocidade de oscilação de 100 rpm. Em intervalos de tempo regulares, uma alíquota do meio de dissolução (1 mL) foi retirada e centrifugada (10.000 rpm por 5 min); o sobrenadante foi utilizado para análise por HPLC. Em seguida, o mesmo volume de meio de dissolução fresco foi reposto para manter a condição sink. Todas as operações foram realizadas em triplicata.
Ensaio de citotoxicidade in vitro com MTT
Células HeLa foram cultivadas em meio de cultura DMEM e semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 8.000 células por poço a 37 °C sob 5% de CO₂. Após 12 h, o meio de cultura foi removido e substituído por meio fresco contendo diferentes quantidades de RSFNPs puras. Após 24 h, 20 μL de solução de corante MTT foram adicionados a cada poço e incubados por mais 4 h. Em seguida, o meio foi removido e os cristais de formazan foram dissolvidos com 200 μL de DMSO. Um leitor de ensaio imunoenzimático (ELISA) foi então utilizado para medir a intensidade de luminescência a 570 nm de cada poço. A viabilidade celular relativa em relação à amostra controle, incubada com meio de cultura celular sem nanopartículas de RSF, foi calculada da seguinte forma: aqui, [A]teste é a absorbância da amostra teste e [A]controle é a absorbância da amostra controle.
Atividade antiproliferativa de AP livre e AP-RSFNPs
As atividades antiproliferativas de AP livre e AP-RSFNPs foram avaliadas pelo ensaio MTT utilizando células HeLa e células MDA-MB-231. O procedimento foi semelhante ao da citotoxicidade in vitro descrita acima; apenas substituímos RSFNPs por AP-RSFNPs. Como grupo controle, células HeLa e células MDA-MB-231 também foram incubadas com soluções puras de AP, nas quais a quantidade de AP foi ajustada para o mesmo nível presente nos AP-RSFNPs correspondentes.
Resultados e discussão
Formação e caracterização dos AP-RSFNPs
AP-RSFNPs com tamanhos controláveis foram obtidos pela automontagem da fibroína da seda, adicionando etanol à solução de RSF e, em seguida, submetendo ao congelamento. Embora a emulsão de RSFNPs carregada com AP recém-preparada fosse muito estável, podendo ser armazenada à temperatura ambiente por pelo menos 4 semanas sem agregação aparente, verificou-se que as nanopartículas não se redispersavam facilmente em solução tampão após serem centrifugadas da emulsão; além disso, ainda havia algumas partículas grandes com tamanhos superiores a 1000 nm (Fig. 1).
Distribuição de tamanho das nanopartículas de RSF carregadas com AP com a razão volumétrica entre etanol e RSF de 0,4.
Para aumentar a redispersibilidade e a estabilidade das nanopartículas de RSF carregadas com AP na solução tampão e para prevenir a formação de partículas maiores, mPEG-NH2 foi introduzido nas nanopartículas de RSF. Sugeriu-se que a interação entre RSF e PEG é principalmente a força eletrostática entre as cargas negativas na RSF e as cargas positivas no mPEG-NH2. A principal razão para a melhoria na uniformidade das nanopartículas redispersas por essa PEGuilação foi considerada como sendo os efeitos de repulsão estérica das cadeias de PEG ancoradas na superfície das nanopartículas, conforme relatado na literatura.
A concentração inicial de RSF, a concentração de AP, a razão volumétrica entre solução de etanol e RSF, a razão mássica entre mPEG-NH2 e RSF e o tempo de congelamento afetam a forma e o tamanho das partículas. Para obter um sistema adequado, experimentos ortogonais foram planejados, conforme mostrado na Tabela 1. Devido ao aumento na concentração de RSF, as partículas tornaram-se menores, e houve um aumento de partículas maiores ao mesmo tempo, como mostrado na Tabela 1. O aumento na concentração de AP também afetou o tamanho das partículas. Partículas adequadas com tamanho médio de 200–400 nm foram obtidas com a razão volumétrica entre solução de etanol e RSF de 0,4. Ao mesmo tempo, quando a razão volumétrica entre solução de etanol e RSF atingiu 0,5, o tamanho das partículas aumentou para mais de 1000 nm. Conseguimos controlar as nanopartículas de RSF carregadas com AP com tamanhos de partícula de 200 a 1000 nm, o que é adequado para quimioterapia linfática, alterando as condições de reação.
Tanto as imagens de MEV quanto as de MET (Figs. 2 e 3) demonstraram que as AP-RSFNPs eram grânulos esféricos sem agregação aparente. Por exemplo, o tamanho das nanopartículas mostrado na Fig. 2 variou de 100 a 500 nm, o que estava de acordo com a diferença observada em seus diâmetros hidrodinâmicos. Para observar o efeito da PEGuilação, as imagens de MET das RSFNPs sem tratamento com PEG e de dois tipos de RSFPNPs tratadas com PEG, que foram tratadas com PEG antes da formação das nanopartículas (B-PEG-RSFNPs) e após a formação das nanopartículas (A-PEG-RSFNPs), e suas respectivas partículas carregadas com fármaco AP-RSFNPs, B-PEG-AP-RSFNPS e A-PEG-AP-RSNPs são mostradas na Fig. 2. Após o carregamento do fármaco, as partículas ficaram claramente maiores do que aquelas sem fármaco, mas seus tamanhos ainda eram inferiores a 500 nm. A distribuição de partículas tratadas com PEG tendeu a ser melhor do que a das partículas sem tratamento com PEG, o que confirmou os achados da análise de partículas. Não houve alteração evidente entre B-PEG-RSFNPs e A-PEG-RSFNPs. A Fig. 3 mostra as imagens de MEV de quatro tipos de AP-RSFNPs, preparadas com razão volumétrica de etanol e RSF de 0,4; as imagens de MEV também concordaram com os achados da análise de partículas.
Imagem de MET do sistema de nanopartículas de RSF.
Imagem de MEV do sistema de nanopartículas de RSF carregadas com AP, com razão volumétrica entre etanol e RSF de 0,4 ((a): nº 3; (b): nº 5; (c): nº 10; (d): nº 16).
A estrutura da fibroína da seda consiste em grandes regiões de aminoácidos hidrofóbicos separadas por curtas regiões hidrofílicas. O domínio hidrofóbico da fibroína da seda é composto por sequências amplamente repetidas de (Gly–Ala–Gly–Ala–Gly–Ser)n. A fibroína da seda apresenta bandas de vibração características entre 1630 e 1650 cm−1 para amida I (estiramento CO), 1540–1520 cm−1 para amida II (dobramento secundário N–H) e 1270–1230 cm−1 para amida III (funcionalidades C–N e N–H) nos espectros de FT-IR. Nas fibras de seda nativas, as sequências repetidas organizam-se por ligações de hidrogênio, formando folhas β, reticulação e estruturas de seda estabilizadas. A RSF comumente exibe α-hélices e enrolamento aleatório em vez de uma estrutura de folha β em solução aquosa. Como os espectros de FT-IR de α-hélices, enrolamento aleatório e folha β são diferentes, os espectros de FT-IR de diferentes partículas de RSF foram registrados para explorar a conformação da RSF nessas partículas.
Para investigar mais a fundo o efeito do PEG, obtivemos os espectros de infravermelho das RSFNPs (RSFNPs1), B-PEG-RSFNPS (RSFNPs2) e A-PEG-RSNPs (RSFNPs3) e das correspondentes partículas carregadas com fármaco RSFNPs4, RSFNPs5 e RSFNPs6, conforme mostrado na Tabela 2. Os dados de espectroscopia de infravermelho de cada material no sistema e das misturas físicas também foram estudados para comparação.
Dados de espectroscopia de infravermelho de diferentes nanopartículas de RSF, pó de RSF liofilizado puro, materiais originais e seu pó de mistura física
Material Amidas I (cm−1) Amidas II (cm−1) Amidas III (cm−1) RSFNPs1 1624.06 1523.76 1263.37 RSFNPs2 1625.99 1529.55 1219.01 RSFNPs3 1620.21 1529.55 1222.03 RSFNPs4 1629.85 1517.98 1232.51 RSFNPs5 1620.21 1514.12 1230.58 RSFNPs6 1624.06 1514.12 1234.44 RSF 1641.42 1529.22 1238.50 mPEGNH2 — — 1240.23 AP 1674.21 — — Mistura física 1641.42 1525.69 1220.94, 1240.43
O pó liofilizado de RSF puro (RSF) apresentou picos de absorção em 1641 cm⁻¹ (amida I), 1529 cm⁻¹ (amida II) e 1238 cm⁻¹ (amida III), que representam a configuração de α‑hélices e enovelamento aleatório da RSF em solução aquosa. As RSFNPs1 exibiram picos de absorção em 1624 cm⁻¹ (amida I), 1524 cm⁻¹ (amida II) e 1263 cm⁻¹ (amida III), que representam as folhas β. Após comparar os dados espectrais de FT‑IR das RSFNPs1, RSFNPs2 e RSFNPs3, verificou‑se que suas bandas de amida II e amida III eram diferentes, o que mostrou que o tratamento com PEG pode reduzir parcialmente as frações de folhas β; essa redução foi ligeiramente maior nas partículas sintetizadas com tratamento com PEG antes da automontagem, em comparação com o tratamento com PEG após a automontagem. A representação esquemática do processo de automontagem da fibroína da seda com PEGuilação é mostrada na Fig. 4. Primeiro, quando a RSF foi misturada com PEG, formou‑se uma interação eletrostática entre as cargas negativas da RSF e as cargas positivas do mPEG‑NH₂. Durante o processo de automontagem, essa força e os efeitos de repulsão estérica das cadeias de PEG ancoradas podem causar uma diminuição dos domínios de folhas β nas RSFNPs; após a automontagem, a outra parte do PEG foi usada para modificar a superfície das partículas. Sem o tratamento com PEG, mais folhas β foram transformadas a partir das α‑hélices e do enovelamento aleatório da RSF, o que foi a causa da formação de partículas maiores.
Representação esquemática do processo de automontagem da fibroína da seda com PEGuilação.
Carregamento de fármaco, eficiência de encapsulação e liberação in vitro do fármaco das AP‑RSFNPs
A capacidade de carga de fármaco das AP-RSFNPs aumentou com o aumento da concentração inicial de AP. Ao mesmo tempo, a capacidade de carga de fármaco também aumentou quando a razão mAP/mRSF aumentou, mas a extensão da melhora não foi significativa e a solução de AP em etanol foi limitada. Diferentes processos de tratamento com PEG também podem alterar a eficiência de encapsulação, conforme mostrado na Tabela 3. A carga de fármaco e a eficiência de encapsulação de AP-RSFNPs2 (tratamento com PEG antes da encapsulação), AP-RSFNPs3 (tratamento com PEG após a encapsulação) e AP-RSFNPs4 (tratamento com PEG antes e depois) foram melhores do que as de AP-RSFNPs1 (sem tratamento com PEG). Após comparar três tipos de partículas carregadas com fármaco tratadas com PEG, AP-RSFNPs2, AP-RSFNPs3 e AP-RSFNPs4, inferimos que a eficiência de encapsulação de AP-RSFNPs2 foi melhor do que as das outras duas. Esse aumento pode ser causado pelo efeito de solubilização do PEG na solução aquosa de fibroína da seda. Com o tratamento com PEG, a carga de fármaco diminuiu, enquanto a eficiência de encapsulação aumentou. A carga de fármaco adequada atingiu 25,9% e a eficiência de encapsulação atingiu 87,3% com o tratamento com PEG antes e depois da encapsulação do fármaco quando [RSF] = 5 mg mL−1, mAP/mRSF = 12 : 25 e mPEGNH2 : mRSF = 0,2 : 1.
Capacidade de carga de fármaco e eficiência de encapsulação de diferentes nanopartículas
Amostra EE% DL% AP-RSFNPs1 84,5 28,9 AP-RSFNPs2 89,6 26,4 AP-RSFNPs3 85,7 25,5 AP-RSFNP4 87,3 25,9
Foi relatado que a liberação do fármaco a partir das nanopartículas e micropartículas de RSF depende da estrutura da seda e das interações entre o composto e a seda. A redução dos domínios de folha β nas partículas permite uma degradação mais rápida, o que acelera a liberação do fármaco. Os domínios de folha β das diferentes RSFNPs tratadas com PEG estavam em níveis diferentes, o que foi confirmado por FT-IR. As curvas de liberação in vitro do fármaco das RSFNPs carregadas com AP são mostradas na Fig. 5. Após comparar os dois tipos de nanopartículas com a suspensão de AP e a solução saturada de AP, verificou-se que a taxa de liberação das B-AP-RSFNPs foi mais lenta do que a da solução saturada de AP; no entanto, foi mais rápida do que a da suspensão de AP e das A-AP-RSFNPs. A liberação das B-AP-RSFNPs foi semelhante à das A-AP-RSFNPs nas 8 h iniciais e depois tornou-se mais rápida após 8 h. Para as B-AP-RSFNPs, 90,9% de AP foi liberado em 72 h, enquanto para as A-AP-RSFNPs foi de 65,8%. Esses resultados de liberação do fármaco concordaram com os achados de FT-IR e indicaram que, alterando os métodos de tratamento com PEG, podemos controlar a fração de folha β nas partículas, o que pode ser usado para projetar tipos adequados de AP-RSFNPs para diferentes usos.
Perfis de liberação in vitro de diferentes B-AP-RSFNPs, A-AP-RSFNPs, AP (solução saturada de AP) e suspensão de AP determinados por um método de diálise em PBS (pH 7,4) como meio de liberação. Os dados representam média ± DP de três testes (n = 3).
Citotoxicidade in vitro das RSFNPs
A citotoxicidade das nanopartículas de RSF puras foi avaliada com células Hela pelo ensaio MTT, e os resultados são mostrados na Fig. 6. A Fig. 6 indica que as células incubadas com nanopartículas de RSF em baixa concentração (0,1 μM) exibiram viabilidade quase igual à do controle. A viabilidade celular diminuiu lentamente com o aumento da concentração das nanopartículas de RSF, mas ainda era de cerca de 80% quando a concentração das nanopartículas de RSF era tão alta quanto 200 μM. Portanto, a citotoxicidade das nanopartículas de RSF é bastante baixa.
Citotoxicidade de RSFNPs puras com células Hela após 24 h de incubação.
Inibição do crescimento celular in vitro de células Hela e MDA-MB-231 com AP-RSFNPs
A viabilidade das células Hela e MDA-MB-231 após contato com AP-RSFNPs por 24 h é mostrada nas Fig. 6 e 7. Com o aumento da quantidade de AP-RSFNPs no meio de cultura, mais células Hela foram mortas ou inibidas porque mais fármaco AP foi liberado. Quando a concentração de AP no meio de cultura era de 50 μM, menos de 10% das células Hela estavam vivas após 24 h de incubação. Para avaliar a eficiência anticâncer do fármaco após encapsulação em RSFNPs, o fármaco AP livre foi usado como controle. De modo geral, mais células Hela foram mortas ou inibidas nos grupos AP-RSFNP do que nos grupos controle. Não houve grande diferença quando a concentração de AP era inferior a 20 μM, enquanto a diferença se tornou maior quando a concentração de AP aumentou para mais de 20 μM. Quando a concentração de AP aumentou para 50 μM, a viabilidade das células Hela em contato com AP-RSFNPs foi de 8,8%, enquanto a com AP livre foi de 29,5%. No entanto, quando a concentração aumentou para mais de 100 μM, a viabilidade das células Hela foi quase a mesma nos dois grupos. A Fig. 7 mostra que o contato com AP-RSFNPs na concentração de 50 μM de AP tem o mesmo efeito de inibição celular que o AP livre a 100 μM. A Fig. 8 mostra que quando a concentração de AP era inferior a 20 μM, as células MDA-MB-231 mortas ou inibidas nos grupos AP-RSFNP foram ligeiramente menores do que nos grupos controle. Quando a concentração de AP era superior a 50 μM, a viabilidade celular das AP-RSFNPs foi ligeiramente maior do que a do grupo controle.
Viabilidade celular de AP e AP-RSFNPs com células Hela após 24 h de incubação.
Viabilidade celular de RSFNPs, AP e AP-RSFNPs com células MDA-MB-231 após 24 h de incubação.
Dois tipos de experimentos celulares mostraram que o efeito de morte celular das AP-RSFNPs exibiu a mesma tendência de quando a concentração de AP era baixa; o efeito de morte celular das AP-RSFNPs foi menor ou igual ao do controle. Quando a concentração de AP foi maior, o efeito de morte foi maior do que o do grupo controle. A mesma tendência indicou que as AP-RSFNPs podem aderir facilmente às células HeLa e MDA-MB-231. Ao mesmo tempo, o AP encapsulado nas AP-RSFNPs necessitou de tempo para ser liberado, e nem todo o AP foi liberado em 24 h, o que pode ser observado nas curvas de liberação mostradas na Fig. 4. Devido à liberação de mais AP das AP-RSFNPs, a vantagem dessas AP-RSFNPs é clara.
Conclusões
Neste artigo, relatamos a preparação de um nanocarreador baseado em polímero natural para encapsular um fármaco anticâncer hidrofílico, o andrografólide, e estudamos as condições de preparação e as propriedades das partículas. As nanopartículas de RSF carregadas com AP foram preparadas com sucesso por um método verde e brando, no qual apenas adições de etanol, mPEG-NH2 e congelamento da solução de RSF-etanol estavam envolvidas. A caracterização do sistema de nanopartículas mostra que as AP-RSFNPs possuem forma e tamanho controláveis pelo processo projetado. As partículas apresentam maior carregamento de fármaco (25,9%) e melhor eficiência de encapsulação (87,3%). O tamanho volumétrico médio dessas AP-RSFNPs é de cerca de 300 nm, o que pode ser benéfico para a quimioterapia linfática. O tempo de liberação in vitro das RSFNPs carregadas com AP é de cerca de 3 dias, e a taxa de liberação pode ser ajustada pelo processo de PEGuilação. A inibição do crescimento celular em 24 h das células HeLa com AP-RSFNPs é melhor do que aquela com AP livre. Todos esses resultados indicam que tal nanocarreador de fármaco anticâncer tem grande potencial em tratamentos clínicos futuros.
Conflitos de interesse
Não há conflitos a declarar.
Material Suplementar
Notas e referências