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pmid: "26675774"
title: "Existe um papel causal da concentração de homocisteína na pressão arterial? Um estudo de randomização mendeliana."
authors: "Borges MC, Hartwig FP, Oliveira IO, Horta BL"
journal: "The American journal of clinical nutrition"
pubdate: "2016 Jan"
doi: "10.3945/ajcn.115.116038"
source: "PMC Full Text"

Existe um papel causal da concentração de homocisteína na pressão arterial? Um estudo de randomização mendeliana.

Autores

Borges MC, Hartwig FP, Oliveira IO, Horta BL

Periodico

The American journal of clinical nutrition (2016 Jan)

Conteudo

Existe um papel causal da concentração de homocisteína na pressão arterial? Um estudo de randomização mendeliana12

Contexto: Compreender se a homocisteína é uma causa ou um marcador de aumento da pressão arterial é relevante, pois a homocisteína sanguínea pode ser efetivamente reduzida por intervenções seguras e de baixo custo (por exemplo, suplementação com vitaminas B-6, B-9 e B-12).

Objetivo: O objetivo foi avaliar a influência causal da homocisteína na pressão arterial sistólica e diastólica (PAS e PAD, respectivamente) em adultos com o uso de randomização mendeliana (RM).

Delineamento: Foram utilizados dados da Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982 (Brasil). Um total de 4297 indivíduos foram avaliados em 2004–2005 (idade média: 22,8 anos). A associação da concentração de homocisteína com a PAS e a PAD foi avaliada por regressão linear convencional de mínimos quadrados ordinários (MQO) e regressão de mínimos quadrados em dois estágios (MQ2E) (análise de RM). O polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) C677T (rs1801133) foi utilizado como variável instrumental para a concentração de homocisteína. Também aplicamos a RM a dados do Consórcio Internacional para Pressão Arterial (ICBP) de estudos de associação genômica ampla (>69.000 participantes), utilizando o rs1801133 e SNPs adicionais associados à homocisteína como instrumentos.

Resultados: Na regressão por MQO, um aumento de 1 unidade de DP na concentração logarítmica de homocisteína foi associado a um aumento de 0,9 (IC 95%: 0,4; 1,4) mmHg na PAS e de 1,0 (IC 95%: 0,6; 1,4) mmHg na PAD. Na regressão por MQ2E, para o mesmo aumento na homocisteína, os coeficientes foram de −1,8 mmHg para a PAS (IC 95%: −3,9; 0,4 mmHg; P = 0,01) e 0,1 mmHg para a PAD (IC 95%: −1,5; 1,7 mmHg; P = 0,24). Na análise de RM dos dados do ICBP, a concentração de homocisteína não foi associada à PAS (β = 0,6 mmHg para cada aumento de 1 unidade de DP na homocisteína logarítmica; IC 95%: −0,8; 1,9 mmHg), mas foi positivamente associada à PAD (β = 1,1 mmHg; IC 95%: 0,2; 1,9 mmHg). A associação da homocisteína geneticamente aumentada com a PAD não foi consistente entre os diferentes SNPs.

Conclusão: No geral, os presentes achados não corroboram a hipótese de que a homocisteína tenha um papel causal na pressão arterial, especialmente na PAS.

INTRODUÇÃO
Um risco maior de doença arterial coronariana é observado entre indivíduos com concentrações plasmáticas muito elevadas de homocisteína, como em alguns defeitos genéticos raros, incluindo mutações no gene que codifica a cistationa β-sintase (CBS).5 Esse achado levantou a hipótese de que a homocisteína poderia estar envolvida na etiologia das doenças cardiovasculares (DCVs).
A associação entre homocisteína e DCV foi inicialmente replicada em estudos retrospectivos, mas estudos prospectivos subsequentes produziram associações consideravelmente mais fracas, levantando a preocupação de que a associação da hiper-homocisteinemia com o risco de DCV na população geral pudesse ser explicada por causalidade reversa ou confusão residual. Por outro lado, essa associação possui plausibilidade biológica, uma vez que a homocisteína tem sido associada ao aumento da pressão arterial.

O uso de variantes genéticas como instrumentos para melhorar a inferência causal em estudos observacionais é conhecido como randomização mendeliana (RM). O termo deriva das leis de herança de Mendel, que estabelecem que os pares de alelos se separam para formar gametas (primeira lei) e que os alelos em diferentes loci segregam independentemente uns dos outros durante a formação dos gametas (segunda lei). Ao contrário dos estudos observacionais tradicionais, a RM não é tão suscetível a confusão, erro de medição e causalidade reversa, porque o genótipo é definido na concepção, as variantes genéticas podem ser medidas com precisão e sua distribuição é geralmente independente de fatores de confusão "clássicos", como características socioeconômicas e de estilo de vida, desde que não haja estratificação populacional.

A RM tem sido utilizada anteriormente para investigar o potencial papel causal da homocisteína na doença arterial coronariana e no acidente vascular cerebral com o uso de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) no gene que codifica a enzima 5,10-metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) como variável instrumental (VI) para a concentração de homocisteína circulante. Esse SNP, conhecido como MTHFR C677T (rs1801133), consiste em uma substituição de citosina por timidina no nucleotídeo 677 na MTHFR. Isso resulta em uma substituição de alanina por valina no códon 222 da enzima, o que é prejudicial para sua atividade e leva a um aumento importante nas concentrações de homocisteína no sangue. Em uma meta-análise anterior, a associação entre esse SNP e a doença coronariana foi modesta ou diferiu de forma negligenciável de zero. A associação com o acidente vascular cerebral variou de acordo com a localização geográfica, com resultados nulos em estudos europeus, norte-americanos e australianos e resultados positivos em estudos asiáticos. Essa heterogeneidade pode ser atribuída à modificação de efeito pela ingestão de folato ou ao viés de pequenos estudos.

A compreensão do papel causal da hiper-homocisteinemia na doença vascular e seus fatores de risco, incluindo a pressão arterial, é relevante porque a concentração de homocisteína pode ser efetivamente reduzida por intervenções simples, seguras e baratas, como a suplementação com ácido fólico, vitamina B-6 e vitamina B-12. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência causal da homocisteína na pressão arterial em adultos com o uso da abordagem de RM.

MÉTODOS
Fontes de dados
Este estudo incluiu dados em nível individual da Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982 e dados resumidos dos seguintes consórcios diferentes: o International Consortium for Blood Pressure (ICBP), a maior meta-análise de estudos de associação genômica ampla (GWASs) para concentração de homocisteína disponível, o Global Lipids Genetics Consortium (GLGC), o Meta-Analyses of Glucose and Insulin-Related Traits Consortium (MAGIC) e o Genetic Investigation of Anthropometric Traits (GIANT) Consortium. Detalhes sobre cada fonte de dados são fornecidos abaixo.

Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982
Participantes
Pelotas é uma cidade de médio porte, com quase 330.000 habitantes, localizada no sul do Brasil. Em 1982, todas as maternidades da cidade foram visitadas diariamente e 99,2% dos nascimentos foram identificados. Os recém-nascidos vivos cujas famílias residiam na zona urbana da cidade foram avaliados e suas mães entrevistadas (n = 5914). Esses indivíduos foram acompanhados em diversas ocasiões. Detalhes adicionais da metodologia do estudo foram descritos anteriormente. Em 2004–2005, 4297 membros da coorte (idade média: 22,8 anos; intervalo: 21,9–23,7 anos) foram avaliados, o que, quando somado aos 282 que se sabia terem falecido, representou uma taxa de acompanhamento de 77,4%. Os indivíduos responderam a um questionário e tiveram amostras de sangue venoso coletadas.

Variáveis
A pressão arterial sistólica e diastólica (PAS e PAD, respectivamente) foi medida no início e no final da entrevista usando um monitor digital de pressão arterial de pulso calibrado (Omron HEM-629) no braço esquerdo. Antes de cada medição, o indivíduo foi instruído a sentar-se e descansar por pelo menos 5 minutos. Foi utilizada a média das 2 medições. A concentração de homocisteína circulante foi determinada por imunoensaio de quimioluminescência com o uso do sistema Immulite (Siemens Health Care Diagnostics).

O DNA foi extraído de leucócitos do sangue periférico por lise sequencial com o uso da técnica de "salting-out", adaptada do protocolo de Miller et al. Após a extração, o DNA foi congelado a −70°C. A genotipagem foi realizada utilizando o array Illumina HumanOmni2.5-8v1 (Illumina Inc.). Os critérios de exclusão de controle de qualidade para SNPs consistiram em um valor de P de equilíbrio de Hardy-Weinberg <1 × 10−7, ser monomórfico e uma taxa de genotipagem <95%. Para os indivíduos, os critérios de exclusão foram os seguintes: falta de informações para >3% dos SNPs genotipados e parentesco críptico [parentesco >0,1, conforme descrito anteriormente]. Para este estudo, utilizamos o SNP MTHFR C677T como instrumento devido à sua associação forte e bem caracterizada com as concentrações de homocisteína circulante.
As covariáveis foram as seguintes: sexo (masculino ou feminino), cor da pele (branca, preta, parda ou outra), anos de escolaridade (0–4, 5–8, 9–11 ou ≥12 anos), renda familiar (quintis de salários mínimos), consumo regular de álcool (não bebedores, <2 doses/dia e ≥2 doses/dia; 1 dose = 15 g de álcool), atividade física no lazer (<150 ou ≥150 min/semana), tabagismo atual (0, 1–10, 11–20 ou >20 cigarros/dia) e IMC (em kg/m²; baixo peso: <18,5; peso normal: 18,5–24,9; sobrepeso: 25–29,9; ou obeso: ≥30). O peso e a altura, utilizados no cálculo do IMC, foram medidos utilizando critérios padrão.

Dados resumidos

ICBP
A iniciativa ICBP conduziu uma metanálise de 29 GWASs para pressão arterial, incluindo >69.000 indivíduos de ascendência europeia e 2,5 milhões de SNPs genotipados ou imputados. As análises foram realizadas utilizando um modelo genético aditivo e foram ajustadas para idade, idade ao quadrado, IMC, uso de medicação anti-hipertensiva, variáveis específicas do estudo e fator de inflação de controle genômico. Solicitamos diretamente aos investigadores do ICBP dados resumidos sobre a associação de SNPs com PAS e PAD.

Metanálise de GWASs para concentração de homocisteína
A metanálise incluiu dados de 10 GWASs sobre a concentração de homocisteína com um total de 44.147 indivíduos de ascendência europeia. As análises foram realizadas em unidades de DP ajustadas por sexo e idade da concentração de homocisteína transformada pelo logaritmo natural e utilizando um modelo genético aditivo. O controle genômico foi utilizado em cada coorte antes da metanálise. Extraímos dados sobre a associação de SNPs com a concentração de homocisteína diretamente de van Meurs et al.

GLGC
O GLGC incluiu 60 estudos de coorte e caso-controle com dados de GWAS ou Metabochip e dados de colesterol HDL, colesterol LDL e triacilglicerol para 188.577 indivíduos de ascendência europeia. As análises foram realizadas utilizando um modelo genético aditivo e foram ajustadas para idade, sexo, variáveis específicas do estudo e fator de inflação de controle genômico. Indivíduos que faziam uso de medicamentos hipolipemiantes foram excluídos. Os dados sobre a associação de SNPs com colesterol HDL, colesterol LDL e triacilglicerol foram baixados de http://csg.sph.umich.edu/abecasis/public/lipids2013/.

MAGIC
O MAGIC incluiu 23 estudos de coorte com dados de GWAS e hemoglobina glicada (HbA1c) em 38.238 indivíduos de ascendência europeia e 20 estudos de coorte com dados de GWAS e insulina de jejum em 35.920 indivíduos de ascendência europeia. As análises foram realizadas utilizando um modelo genético aditivo e foram ajustadas para idade, sexo, variáveis específicas da coorte e fator de inflação de controle genômico (λ). Os dados sobre a associação de SNPs com HbA1c e insulina de jejum foram baixados de http://www.magicinvestigators.org/downloads/.

GIANT
O GIANT incluiu 114 estudos de múltiplos desenhos com GWAS ou Metabochip e dados de IMC de 38.238 indivíduos de ancestralidade europeia e 101 estudos de múltiplos desenhos com GWAS ou Metabochip e dados de circunferência da cintura (CC) de 210.088 indivíduos de ancestralidade europeia. As análises de IMC foram realizadas utilizando um modelo genético aditivo e foram ajustadas para idade, idade ao quadrado, variáveis específicas do estudo e fator de inflação de controle genômico (λ). As análises de CC foram ajustadas para sexo, IMC, variáveis específicas do estudo e fator de inflação de controle genômico (λ). Os dados sobre a associação de SNPs com IMC e CC foram baixados de http://www.broadinstitute.org/collaboration/giant/index.php/GIANT_consortium_data_files.

Análise de dados
Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982
Modelos de regressão multinomial foram usados para verificar se a distribuição do genótipo MTHFR C677T estava associada às covariáveis (sexo, cor da pele, anos de escolaridade, renda familiar, consumo regular de álcool, atividade física no lazer, tabagismo e IMC). A homocisteína foi transformada em log, devido à sua distribuição positivamente assimétrica, e padronizada (unidades de DP). As associações brutas e ajustadas (para variáveis sociodemográficas e de estilo de vida) da concentração de log homocisteína padronizada com PAS e PAD foram avaliadas usando regressão linear convencional de mínimos quadrados ordinários (MQO) (Figura 1).

Plano de análise. Dados individuais da Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982 foram usados para estimar a associação da concentração de homocisteína com PAS e PAD [modelo "bruto" não ajustado e ajustado para potenciais fatores de confusão (modelo "ajustado*")] e para investigar a associação da concentração de homocisteína geneticamente aumentada com PAS e PAD [análise de RM; modelo "bruto" não ajustado e ajustado para ancestralidade genômica (modelo "ajustado**")]. Dados resumidos do ICBP e de GWAS de homocisteína foram combinados para investigar mais a fundo a associação da concentração de homocisteína geneticamente aumentada com PAS e PAD (análise de RM) usando como VI o SNP MTHFR C677T (abordagem de SNP único) ou 18 SNPs associados à concentração de homocisteína (abordagem de múltiplos SNPs). PAD, pressão arterial diastólica; GWAS, estudo de associação genômica ampla; Hcy, homocisteína; ICBP, Consórcio Internacional para Pressão Arterial; VI, variável instrumental; IVW, ponderação pelo inverso da variância; RM, randomização mendeliana; MTHFR, metilenotetrahidrofolato redutase; MQO, regressão linear de mínimos quadrados ordinários; PAS, pressão arterial sistólica; SNP, polimorfismo de nucleotídeo único; 2SLS, regressão de mínimos quadrados em 2 estágios.
A análise de RM da associação da concentração logarítmica padronizada de homocisteína com a PAS e a PAD foi realizada utilizando regressão de mínimos quadrados em dois estágios (2SLS), que é uma técnica de estimação por VI. No primeiro estágio, a concentração de homocisteína é submetida a uma regressão em relação à VI. O segundo estágio consiste em submeter os valores da PAS e da PAD a uma regressão em relação aos valores previstos do primeiro modelo. A variante MTHFR C677T foi codificada no modelo genético aditivo de acordo com o número de cópias do alelo T. Os resultados das regressões por MQO e 2SLS foram comparados utilizando o teste de Durbin-Wu-Hausman (DWH) (Figura 1).
Para controlar a estratificação populacional, as análises foram ajustadas para os 10 principais componentes principais informativos de ancestralidade (calculados utilizando um subconjunto de 655.046 SNPs autossômicos selecionados por desequilíbrio de ligação).
Dados resumidos
Para explorar ainda mais o potencial efeito causal da concentração de homocisteína na PAS e na PAD, também analisamos dados resumidos do ICBP. Todos os alelos de efeito dos SNPs foram harmonizados para refletir os alelos que aumentam a homocisteína.
Duas abordagens foram aplicadas aos dados do ICBP, aqui referidas como abordagens de "SNP único" e "múltiplos SNPs" (Figura 1). Na abordagem de SNP único, apenas o SNP MTHFR C677T (rs1801133) foi utilizado como VI, o qual possui um papel funcional bem estabelecido na concentração de homocisteína. Os coeficientes β e os EPs da VI foram calculados utilizando o método de ponderação pelo inverso da variância (IVW) [descrito por Burgess et al.], da seguinte forma:
onde X é a alteração média na concentração logarítmica padronizada de homocisteína por alelo de efeito adicional do MTHFR C677T e Y é a alteração média na PAS ou PAD (mm Hg) por alelo de efeito adicional do MTHFR C677T com EP σy.
Na abordagem de múltiplos SNPs, todos os SNPs associados à concentração de homocisteína no maior GWAS disponível foram utilizados, independentemente de evidências de um impacto funcional do SNP na concentração de homocisteína (n = 18 SNPs). As características desses SNPs e sua associação com os fenótipos estudados estão resumidas na Tabela Suplementar 1. Os dados dos 18 SNPs foram utilizados 1) para estimar o efeito médio dos SNPs na concentração de homocisteína, na PAS e na PAD, utilizando um modelo de meta-análise de efeitos fixos com pesos pelo inverso da variância e a heterogeneidade da associação entre os SNPs, medida por I2, e 2) para investigar o efeito da concentração de homocisteína geneticamente aumentada na PAS e na PAD (estimação por VI).
A estimação por VI para a abordagem de múltiplos SNPs baseou-se em 2 métodos. O primeiro foi o método IVW, no qual as estimativas de VI para cada SNP (indexado por k) foram combinadas em um modelo de meta-análise de efeitos fixos, da seguinte forma:
Caso ≥1 SNPs influencem a PAS ou PAD independentemente da concentração de homocisteína (pleiotropia horizontal) e tais efeitos diretos não se anulem, as premissas da RM são violadas e as estimativas de VI do método IVW serão viesadas. Para levar em conta a pleiotropia horizontal, um segundo método de estimativa de VI foi utilizado na abordagem de múltiplos SNPs, o método de regressão MR-Egger, proposto recentemente por Bowden et al.
A regressão MR-Egger é uma adaptação da regressão de Egger, na qual um modelo de regressão é ajustado usando coeficientes de regressão para associações SNP-desfecho (PAS ou PAD) como variável dependente e coeficientes de regressão para SNP-exposição (homocisteína) como variável independente, ponderados pelo inverso da variância das associações SNP-desfecho. Nesse método, o intercepto refletirá o efeito pleiotrópico horizontal médio entre as variantes genéticas e a inclinação será uma estimativa válida do efeito causal, desde que a premissa InSIDE (Força do Instrumento Independente do Efeito Direto) seja mantida, o que requer que não haja correlação entre as associações SNP-exposição e os efeitos diretos dos SNPs no desfecho. O bootstrapping (10.000 iterações) foi utilizado para derivar ICs de 95% corrigidos para o intercepto e a inclinação da MR-Egger usando o método de percentil.
Como análise de sensibilidade, para explorar melhor a questão da pleiotropia horizontal, os mesmos VIs (tanto para SNP único quanto para as abordagens de múltiplos SNPs com o método IVW) foram usados para investigar a associação da concentração de homocisteína geneticamente aumentada com os seguintes fenótipos: colesterol HDL, colesterol LDL, triacilglicerol, insulina de jejum, HbA1c, IMC e CC.
Todas as análises foram realizadas com o software Stata 12.1 (StataCorp). O comando ivregress do Stata foi utilizado para modelos de regressão 2SLS.
Questões éticas
Todas as fases do Estudo de Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982 foram aprovadas pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Pelotas, que é afiliado ao Conselho Federal de Medicina do Brasil. O consentimento livre e esclarecido por escrito foi obtido dos sujeitos participantes na visita de 2004–2005.
RESULTADOS
Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982
Um total de 3701 indivíduos apresentaram dados completos de genotipagem, pressão arterial e bioquímicos. A maioria dos indivíduos autodeclarou-se branca, completou 9–11 anos de escolaridade formal, consumia até 2 doses de álcool/dia, era inativa durante o tempo de lazer, não fumante ou apresentava IMC normal (Tabela 1).
Características sociodemográficas e de estilo de vida dos participantes da Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982, 2004–2005
n (%) Sexo  Masculino 1860 (50,3)  Feminino 1841 (49,7) Cor da pele  Branca 2768 (74,8)  Preta 597 (16,1)  Parda 196 (5,3)  Outra 140 (3,8) Anos de escolaridade  0–4 302 (8,2)  5–8 1042 (28,2)  9–11 1817 (49,1)  ≥12 540 (14,6) Renda familiar, quintil  1 (mais pobre) 774 (20,9)  2 754 (20,4)  3 723 (19,5)  4 712 (19,2)  5 (mais rico) 738 (19,9) Consumo de álcool  Não bebedores 1203 (32,5)  <2 doses/d 1864 (50,4)  ≥2 doses/d 634 (17,1) Atividade física no lazer  Inativo (<150 min/sem) 2595 (70,1)  Ativo (≥150 min/sem) 1106 (29,9) Tabagismo  Não fumantes 2745 (74,2)  1–10 cigarros/d 513 (13,9)  11–20 cigarros/d 375 (10,1)  >20 cigarros/d 68 (1,8) IMC  Abaixo do peso 216 (5,8)  Peso normal 2407 (65,1)  Sobrepeso 770 (20,8)  Obeso 305 (8,3) Total 3701 (100,0)
O SNP MTHFR C677T estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg (P = 0,49) e foi associado à cor da pele (P < 0,001), mas essa associação desapareceu após o ajuste para os 10 principais componentes principais informativos de ancestralidade (P = 0,91). Nenhuma das covariáveis testadas foi associada à variante MTHFR C677T após esse ajuste (Tabela 2).
Distribuição genotípica de acordo com as covariáveis na Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982, 2004–2005
rs1801133, % n CC CT TT P1 P2 Sexo 0,13 0,09  Masculino 1860 49,6 41,6 8,8  Feminino 1841 46,3 44,3 9,4 Cor da pele <0,001 0,91  Branca 2768 44,8 45,3 9,8  Preta 597 60,8 33,2 6,0  Parda 196 54,1 38,8 7,1  Outra 140 45,7 43,6 10,7 Anos de escolaridade 0,24 0,85  0–4 302 48,3 41,7 9,9  5–8 1042 49,5 41,6 8,9  9–11 1817 48,5 42,5 8,9  ≥12 540 42,6 47,8 9,6 Renda familiar, quintil 0,23 0,57  1 (mais pobre) 774 47,7 42,6 9,7  2 754 52,5 39,9 7,6  3 723 47,4 43,7 8,9  4 712 46,8 43,4 9,8  5 (mais rico) 738 45,1 45,3 9,6 Consumo de álcool 0,70 0,81  Não bebedores 1203 49,3 41,3 9,4  <2 doses/d 1864 47,1 43,9 9,1  ≥2 doses/d 634 48,0 43,4 8,7 Atividade física no lazer 0,20 0,45  Inativo (<150 min/sem) 2595 44,0 44,8 11,2  Ativo (≥150 min/sem) 1106 48,3 42,8 8,9 Tabagismo 0,27 0,59  Não fumantes 2745 47,3 43,7 9,0  1–10 cigarros/d 513 52,5 37,6 9,9  11–20 cigarros/d 375 45,9 44,8 9,3  >20 cigarros/d 68 47,0 45,6 7,4 IMC 0,73 0,76  Abaixo do peso 216 48,6 42,6 8,8  Peso normal 2407 47,5 43,6 8,9  Sobrepeso 770 49,2 40,5 10,3  Obeso 305 47,9 44,3 7,9 Total 3701 47,9 43,0 9,1
P1: Valores de P para heterogeneidade (regressão logística multinomial).
P2: Valores de P ajustados para os 10 principais componentes principais informativos de ancestralidade (regressão logística multinomial).
Os homens apresentaram concentrações mais elevadas de homocisteína (9,0 μmol/L; IC 95%: 8,9; 9,2 μmol/L) e valores mais altos de PAS (123,4 mm Hg; IC 95%: 122,8; 124,1 mm Hg) e PAD (75,6 mm Hg; IC 95%: 75,0; 76,1 mm Hg) do que as mulheres (homocisteína: 7,1 μmol/L; IC 95%: 7,0; 7,2 μmol/L; PAS: 111,2 mm Hg; IC 95%: 110,6; 111,8 mm Hg; e PAD: 71,2 mm Hg; IC 95%: 70,7; 71,7 mm Hg). As seguintes características também foram positivamente associadas à concentração de homocisteína e à PAS e/ou PAD: baixo nível educacional, alto consumo de álcool e ser fisicamente ativo. O tabagismo foi positivamente associado à concentração de homocisteína e negativamente à PAD. A renda familiar, a cor da pele e o IMC foram associados à PAS e à PAD, mas não à concentração de homocisteína (Tabela 3).

Homocisteína, PAS e PAD de acordo com covariáveis na Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982, 2004–20051
n Homocisteína, μmol/L PAS, mm Hg PAD, mm Hg Sexo  Masculino 1860 9,0 (8,9; 9,2) 123,4 (122,8; 124,1) 75,6 (75,0; 76,1)  Feminino 1841 7,1 (7,0; 7,2) 111,2 (110,6; 111,8) 71,2 (70,7; 71,7) Cor da pele  Branca 2768 8,0 (7,9; 8,1) 116,9 (116,4; 117,5) 73,3 (72,9; 73,7)  Preta 597 8,0 (7,8; 8,2) 119,0 (117,7; 120,2) 74,1 (73,1; 75,1)  Parda 196 8,0 (7,6; 8,4) 118,5 (116,4; 120,6) 73,4 (71,6; 75,2)  Outra 140 8,1 (7,7; 8,6) 117,9 (115,3; 120,4) 72,7 (70,8; 74,6) Anos de escolaridade  0–4 302 8,6 (8,3; 9,0) 117,5 (115,8; 119,2) 72,9 (71,6; 74,3)  5–8 1042 8,2 (8,0; 8,4) 118,0 (117,0; 118,9) 72,9 (72,2; 73,7)  9–11 1817 7,8 (7,7; 7,9) 117,6 (116,9; 118,3) 73,9 (73,3; 74,4)  ≥12 540 8,0 (7,8; 8,2) 115,4 (114,2; 116,5) 73,0 (72,2; 73,8) Renda familiar, quintil  1 (mais pobre) 774 8,1 (7,9; 8,3) 116,2 (115,1; 117,2) 72,7 (71,9; 73,6)  2 754 8,0 (7,8; 8,2) 117,6 (116,5; 118,7) 73,5 (72,6; 74,3)  3 723 7,9 (7,7; 8,1) 117,4 (116,3; 118,6) 73,3 (72,5; 74,1)  4 712 8,0 (7,8; 8,1) 118,1 (117,0; 119,1) 73,7 (72,9; 74,5)  5 (mais rico) 738 8,1 (7,9; 8,3) 117,7 (116,6; 118,7) 73,8 (73,0; 74,6) Consumo de álcool  Não bebedores 1203 7,7 (7,6; 7,9) 115,7 (114,9; 116,5) 73,2 (72,6; 73,9)  <2 doses/dia 1864 8,0 (7,9; 8,1) 117,1 (116,5; 117,8) 73,3 (72,9; 73,8)  ≥2 doses/dia 634 8,7 (8,4; 8,9) 121,9 (120,8; 123,0) 74,8 (73,9; 75,6) Atividade física no lazer  Inativo (<150 min/semana) 2595 7,8 (7,7; 7,9) 116,1 (115,6; 116,6) 73,8 (72,8; 74,9)  Ativo (≥150 min/semana) 1106 8,5 (8,3; 8,6) 120,7 (119,9; 121,6) 73,5 (73,2; 73,9) Tabagismo  Não fumantes 2745 7,9 (7,8; 8,0) 117,5 (116,9; 118,0) 73,9 (73,4; 74,3)  1–10 cigarros/dia 513 8,2 (7,9; 8,4) 116,9 (115,7; 118,2) 72,5 (71,5; 73,5)  11–20 cigarros/dia 375 8,8 (8,5; 9,1) 116,9 (115,4; 118,5) 71,3 (70,1; 72,4)  >20 cigarros/dia 68 8,5 (7,7; 9,3) 119,8 (115,7; 123,8) 73,4 (70,4; 76,3) IMC  Abaixo do peso 216 8,2 (7,9; 8,6) 110,1 (108,2; 111,8) 69,5 (68,1; 70,9)  Peso normal 2407 8,0 (7,9; 8,1) 115,6 (115,1; 116,2) 72,1 (71,7; 72,5)  Sobrepeso 770 8,1 (7,9; 8,3) 121,4 (120,3; 122,5) 75,8 (75,0; 76,7)  Obeso 305 8,0 (7,7; 8,3) 126,1 (124,2; 128,0) 80,1 (78,6; 81,5) Total 3701 8,0 (7,9; 8,1) 117,4 (116,9; 117,8) 73,4 (73,0; 73,8)
Os valores são médias com IC de 95% entre parênteses, salvo indicação em contrário. PAD, pressão arterial diastólica; PAS, pressão arterial sistólica.
Os valores são médias geométricas da concentração logarítmica de homocisteína.
O SNP MTHFR C677T explicou 5,3% da variância na concentração de homocisteína (estatística F = 208, P = 6 × 10−46). O alelo T foi associado a concentrações mais elevadas de homocisteína em ambos os sexos. Homens com genótipos TT e CT apresentaram, em média, uma concentração logarítmica de homocisteína 1,3 e 0,2 DP maior, respectivamente, em comparação com homens com genótipo CC. Nas mulheres, essa diferença foi de ∼ 0,7 e 0,2 DP. Não houve evidência clara de associação do MTHFR C677T com a PAS ou PAD (Figura 2).
Valores médios padronizados (IC 95%) para log da homocisteína, PAS e PAD de acordo com os genótipos de MTHFR C677T (rs1801133) em homens e mulheres combinados (A), homens (B) e mulheres (C): Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982, 2004–2005. Os valores foram ajustados para os 10 principais componentes principais informativos de ancestralidade. Um total de 1774 indivíduos apresentaram o genótipo CC (922 homens e 852 mulheres), 1590 apresentaram o genótipo CT (774 homens e 816 mulheres) e 337 apresentaram o genótipo TT (164 homens e 173 mulheres). PAD, pressão arterial diastólica; HCY, homocisteína; PAS, pressão arterial sistólica.

Na regressão de MQO não ajustada, um aumento de 1 unidade de DP na concentração de log da homocisteína foi associado a aumentos médios de 0,9 mm Hg (IC 95%: 0,4, 1,4 mm Hg) na PAS e de 1,0 mm Hg (IC 95%: 0,6, 1,4 mm Hg) na PAD. Na análise específica por sexo, os coeficientes foram de 0,7 mm Hg (IC 95%: 0,0, 1,4 mm Hg) para PAS e 0,9 mm Hg (IC 95%: 0,3, 1,4 mm Hg) para PAD entre os homens, e 1,2 mm Hg (IC 95%: 0,6, 1,8 mm Hg) para PAS e 1,2 mm Hg (IC 95%: 0,7, 1,7 mm Hg) para PAD entre as mulheres. O ajuste para variáveis socioeconômicas e de estilo de vida não alterou substancialmente essas estimativas (Figura 3).

Diferença média na PAS e PAD por unidade padronizada de log da homocisteína. Os resultados observacionais foram estimados usando regressão linear (mínimos quadrados ordinários) (n = 3701 indivíduos da Coorte de Nascimentos de Pelotas) [modelo bruto, ajustado para variáveis sociodemográficas (modelo ajustado 1) e ajustado para variáveis sociodemográficas e de estilo de vida (modelo ajustado 2)]. Os resultados de RM foram estimados para dados individuais da Coorte de Nascimentos de Pelotas de 1982 (n = 3701 adultos jovens) usando regressão de mínimos quadrados de 2 estágios [bruto e ajustado para componentes principais da ancestralidade genômica (ajustado por ACP)] e para dados resumidos do ICBP (n >69.000 adultos) usando o método IVW para as abordagens de SNP único e múltiplos SNPs, e o método de regressão MR-Egger apenas para a abordagem de múltiplos SNPs. PAD, pressão arterial diastólica; ICBP, Consórcio Internacional para Pressão Arterial; IVW, ponderação pela variância inversa; RM, randomização mendeliana; ACP, análise de componentes principais; PAS, pressão arterial sistólica; SNP, polimorfismo de nucleotídeo único.
De acordo com a análise de VI de dados em nível individual (regressão 2SLS), os coeficientes para um aumento de 1 DP na concentração logarítmica de homocisteína foram de −1,8 mm Hg (IC 95%: −3,9; 0,4 mm Hg) para PAS e 0,1 mm Hg (IC 95%: −1,5; 1,7 mm Hg) para PAD. Na análise específica por sexo, os coeficientes foram de −0,2 mm Hg (IC 95%: −2,5; 2,1 mm Hg) em homens e −2,3 mm Hg (IC 95%: −5,9; 1,3 mm Hg) em mulheres para PAS, e 0,7 mm Hg (IC 95%: −1,1; 2,5 mm Hg) em homens e −0,2 mm Hg (IC 95%: −3,1; 2,8 mm Hg) em mulheres para PAD. O ajuste para componentes principais informativos de ancestralidade alterou levemente essas estimativas (Figura 3). Nenhum dos resultados da análise de RM dos dados de Pelotas foi significativamente diferente de zero. Com relação à comparação entre os coeficientes de regressão de MQO e 2SLS, houve alguma evidência de que os coeficientes diferiram para PAS ao considerar a amostra total (P = 0,01, teste DWH), mas não para PAD (P = 0,24, teste DWH).

Dados resumidos
A análise dos dados do ICBP indicou que os SNPs rs154657 e rs234709 estavam negativamente associados à PAS e/ou PAD. O SNP rs1801133 (MTHFR C677T) foi o único SNP que esteve positivamente associado à PAD. A heterogeneidade entre os SNPs foi alta para a associação com a concentração de homocisteína (I² = 94%, P < 0,001) e moderada para a associação com PAS (I² = 40%, P-heterogeneidade = 0,04) e PAD (I² = 41%, P = 0,04) (Figura 4).

Gráfico de floresta (forest plot) da diferença média na concentração de homocisteína, PAS e PAD por alelo de efeito de 18 SNPs. O efeito de todos os SNPs foi combinado em um efeito global usando metanálise de efeitos fixos (com pesos de variância inversa). Os dados resumidos foram extraídos do maior estudo de associação genômica ampla de homocisteína disponível e do International Consortium for Blood Pressure. CBS, cistationina beta-sintase; CPS1, carbamoil-fosfato sintase 1; CUBN, cubilina; PAD, pressão arterial diastólica; DPEP1, dipeptidase 1; FANCA, grupo de complementação A da anemia de Fanconi; FUT2, fucosiltransferase 2; GTPBP10, proteína 10 de ligação a GTP; Hcy, homocisteína; HNF1A, homeobox A HNF1; MMACHC, acidúria metilmalônica tipo cblC; MTHFR, metilenotetrahidrofolato redutase; MTR, 5-metiltetrahidrofolato-homocisteína metiltransferase; MUT, metilmalonil-CoA mutase; NOX4, NADPH oxidase 4; PAS, pressão arterial sistólica; SLC17A3, transportador de solutos família 17 membro 3; SNP, polimorfismo de nucleotídeo único.
Na análise de RM utilizando a variante MTHFR C677T como VI (abordagem de SNP único), a homocisteína não foi associada à PAS (β = 0,6 mm Hg/DP log homocisteína; IC 95%: −0,8, 1,9 mm Hg/DP log homocisteína), mas foi positivamente associada à PAD (β = 1,1 mm Hg/DP log homocisteína; IC 95%: 0,2, 1,9 mm Hg/DP log homocisteína). Quando os 18 SNPs foram combinados na abordagem de múltiplos SNPs, a concentração de homocisteína geneticamente aumentada não foi associada à PAS ou à PAD, nem no método IVW (PAS: β = −0,6 mm Hg; IC 95%: −1,3, 0,1 mm Hg; PAD: β = −0,3 mm Hg; IC 95%: −0,8, 0,1 mm Hg) nem no método de regressão MR-Egger (PAS: β = −0,2 mm Hg; IC 95%: −1,9, 1,5 mm Hg; PAD: β = 0,7 mm Hg; IC 95%: −0,4, 1,7 mm Hg) (Figura 3).
A Figura 5 mostra que não houve relação de dose-resposta entre o efeito dos SNPs nos desfechos (PAS ou PAD) ou na concentração de homocisteína. Além disso, os interceptos do método de regressão MR-Egger não forneceram evidências claras de um efeito dos SNPs na PAS ou na PAD independentemente da concentração de homocisteína [intercepto: −0,03 (IC 95%: −0,15, 0,09) mm Hg para PAS e −0,08 (IC 95%: −0,16, 0,00) mm Hg para PAD], indicando que é improvável que os achados da abordagem de múltiplos SNPs (especialmente para a PAS) possam ser explicados por pleiotropia horizontal (Figuras 3 e 5).
Gráfico de dispersão da diferença na PAS e PAD de acordo com a concentração de homocisteína (n = 18 SNPs) estimado utilizando dados do Consórcio Internacional para Pressão Arterial. Cada ponto de dados representa os βs para as associações SNP–pressão arterial (eixo y) e SNP–homocisteína (eixo x). As linhas ajustadas foram derivadas do método IVW (linha tracejada) e do método de regressão MR-Egger (linha contínua). PAD, pressão arterial diastólica; Hcy, homocisteína; IVW, ponderação pelo inverso da variância; RM, randomização mendeliana; PAS, pressão arterial sistólica; SNP, polimorfismo de nucleotídeo único.
Na análise de RM de outras características (lipídios sanguíneos e características glicêmicas e antropométricas), nenhuma associação foi observada quando o SNP MTHFR C677T foi utilizado como VI; no entanto, quando a abordagem de múltiplos SNPs foi considerada, houve uma associação positiva com o colesterol LDL (Figura Suplementar 1).
DISCUSSÃO
No geral, nossos achados apoiaram uma associação positiva entre a concentração de homocisteína e a pressão arterial em adultos jovens na análise observacional convencional. No entanto, na análise de RM, não houve evidências convincentes de que a concentração de homocisteína geneticamente aumentada estivesse associada à pressão arterial, especialmente para a PAS.
Semelhante a estudos anteriores, nossas descobertas a partir da análise de regressão convencional corroboram que a concentração de homocisteína está positivamente associada à PAS e à PAD entre adultos jovens. Essa associação é biologicamente plausível. Alguns dos mecanismos pelos quais a homocisteína poderia influenciar a pressão arterial incluem estresse oxidativo, inflamação e inibição da síntese de óxido nítrico, o que pode resultar em rigidez arterial e comprometimento da vasodilatação dependente do endotélio. No entanto, como a concentração de homocisteína está associada a características sociodemográficas, de estilo de vida e metabólicas, é difícil concluir a partir de análises observacionais convencionais se a homocisteína é uma causa ou apenas um marcador de risco de doenças cardiovasculares (DCVs).

Ensaios clínicos randomizados iniciais mostraram que intervenções para redução da homocisteína poderiam melhorar a pressão arterial. Contudo, os resultados de ensaios maiores não forneceram evidências de qualquer melhoria na PAS e na PAD após a suplementação com ácido fólico, mesmo que a concentração de homocisteína tenha sido substancialmente reduzida.

Para melhorar a inferência causal na associação entre homocisteína e pressão arterial, utilizamos a RM para avaliar se uma variante genética que está funcionalmente associada a concentrações mais elevadas de homocisteína também está associada à pressão arterial. Os estudos de RM exploram o fato de que a segregação de alelos durante a meiose é análoga ao processo de randomização em ensaios clínicos randomizados, com a vantagem de que a “randomização de alelos” ocorre na concepção e, portanto, reflete a exposição ao longo da vida a um fator de risco (por exemplo, aumento das concentrações de homocisteína).

A análise de RM de dados em nível individual de 3701 adultos jovens brasileiros não forneceu evidências claras de um papel causal da concentração de homocisteína na PAS e na PAD. Além disso, o teste DWH forneceu evidências de uma diferença entre as estimativas de MQO e 2SQ para a PAS, sugerindo que a estimativa de MQO foi uma superestimativa do efeito causal (possivelmente devido a fatores de confusão residuais). No entanto, devido aos grandes ICs resultantes da incerteza inerente à análise de VI e ao tamanho da nossa amostra, esses resultados não foram conclusivos.

A análise de RM de dados do ICBP, incluindo mais de 69.000 adultos mais velhos, não indicou evidências claras de uma associação da homocisteína com a PAS, mas apontou um possível efeito positivo da concentração de homocisteína na PAD. Contudo, é importante enfatizar que essa descoberta foi amplamente influenciada pelo SNP MTHFR C677T e não foi consistente entre os outros SNPs associados à homocisteína.
A RM é uma ferramenta poderosa para inferência causal, desde que as seguintes premissas sejam atendidas: 1) a variante genética deve estar associada à exposição de interesse, 2) deve ser independente de fatores de confusão entre exposição e desfecho, e 3) deve afetar o desfecho apenas por meio da exposição. Em relação à primeira premissa, uma VI forte é essencial para reduzir a imprecisão e, especialmente, para evitar o viés de instrumento fraco na análise de RM. Em um cenário de RM de amostra única, no qual todas as informações sobre a exposição e o desfecho provêm da mesma amostra (como na análise com dados da coorte de Pelotas), instrumentos fracos tendem a enviesar as estimativas em direção à estimativa observacional (MQO). Em nosso cenário de RM de 2 amostras (primeira amostra: GWAS de homocisteína; segunda amostra: ICBP), na presença de viés de instrumento fraco, as estimativas de RM provavelmente seriam enviesadas em direção ao nulo, uma vez que as 2 amostras apresentaram apenas sobreposição parcial (<22% dos participantes do ICBP faziam parte dos GWAS de homocisteína). Na RM de amostra única, nossa VI (MTHFR C677T) foi associada à concentração de homocisteína, com R2 = 5,3% e estatística F = 208 (P = 6 × 10−46; modelo bruto), indicando que é improvável que o viés de instrumento fraco esteja influenciando substancialmente nossas análises ao utilizar dados da coorte de Pelotas. Na RM de 2 amostras, apenas SNPs associados à concentração de homocisteína em níveis de significância genômica (P < 5 × 10−8) foram incluídos nas análises.

Como a amostra de Pelotas é multiétnica e altamente miscigenada, poderia haver confusão devido à estratificação populacional. De todas as covariáveis consideradas, apenas a cor da pele foi associada ao SNP, e essa associação foi completamente atenuada após o ajuste para componentes principais informativos de ancestralidade. Esse ajuste é conhecido por ser uma estratégia eficiente para controlar o viés de estratificação populacional. Notavelmente, esse ajuste não alterou substancialmente a força das associações. Tanto o ICBP quanto os GWAS de homocisteína foram restritos a indivíduos de ancestralidade europeia e utilizaram procedimentos para controlar a estrutura populacional.
As premissas da RM também poderiam ser violadas no caso de pleiotropia horizontal (ou seja, a variante genética afeta o desfecho por meio de vias não mediadas pela exposição, ou a variante genética está em desequilíbrio de ligação com outra variante que, por si só, tem efeitos pleiotrópicos no desfecho). Embora a presença de pleiotropia não possa ser totalmente descartada, abordamos isso usando duas estratégias principais: 1) restringimos nossas análises a um SNP (rs1801133) com papéis funcionais bem descritos no metabolismo da homocisteína, mas conhecido por influenciar outros fenótipos, como o folato, que poderiam influenciar os desfechos de forma independente; e 2) ampliamos nossa análise para todos os SNPs associados à concentração de homocisteína nos maiores GWAS disponíveis, independentemente do conhecimento sobre seu impacto funcional, o que nos permitiu investigar se a influência potencial da homocisteína nos desfechos era consistente entre diferentes SNPs. Para a segunda abordagem, utilizamos um método desenvolvido recentemente, a regressão MR-Egger, que pode avaliar e considerar (ao custo de reduzir o poder estatístico) os efeitos pleiotrópicos horizontais das variantes genéticas sob a premissa InSIDE.

Outra questão que deve ser considerada é que, apenas para a análise de dados resumidos, as informações para SNP-homocisteína e SNP-pressão arterial vieram de fontes diferentes. Essa abordagem, conhecida como RM de 2 amostras, pressupõe que as duas amostras vieram de populações comparáveis. As amostras tanto do consórcio de GWAS de homocisteína quanto do ICBP se sobrepunham parcialmente e eram comparáveis em termos de ancestralidade genômica (todos os indivíduos de ancestralidade europeia dos Estados Unidos e da Europa). A proporção de mulheres foi maior nos GWAS de homocisteína (82%) em comparação com os dados do ICBP (a maioria dos estudos tinha 50–60% de mulheres). Em ambos os consórcios, a maioria dos países não havia implementado políticas de fortificação com ácido fólico na época da coleta de dados.

Como mencionado anteriormente, é impossível descartar empiricamente de forma completa que os resultados da RM não estejam sendo impulsionados por violações das premissas de VI. Nesse sentido, foi proposto que achados nulos da RM podem ser mais confiáveis do que achados não nulos, com base na lógica de que é menos provável que as violações de VI se compensem perfeitamente, porque existe apenas um valor nulo, enquanto existem infinitas possibilidades não nulas. Embora os resultados da PAD tenham sido inconclusivos, os achados para a PAS sugeriram consistentemente a ausência de um efeito causal (forte) em todas as diferentes abordagens, incluindo evidências de uma diferença entre MQO e M2E em um cenário de 1 amostra (no qual o viés de instrumento fraco tende a aproximar essas estimativas).
Em conclusão, a concentração de homocisteína está associada à PAS e à PAD tanto em homens quanto em mulheres na análise de regressão convencional. As análises de RM não sustentam um papel causal da homocisteína na PAS em adultos jovens do sul do Brasil, mas os resultados para a PAD foram menos conclusivos. Os achados em adultos mais velhos (dados do ICBP) corroboraram os resultados para a PAS, mas não foi possível descartar um efeito causal positivo da homocisteína instrumentalizada geneticamente sobre a PAD; no entanto, essa associação foi amplamente impulsionada por um único SNP e não foi consistente entre outros SNPs associados à homocisteína. No geral, nossos achados indicam que a homocisteína é mais provavelmente um marcador do que uma causa do aumento da pressão arterial, especialmente para a PAS.
Abreviações utilizadas: CBS, cistationina β-sintase; CVD, doença cardiovascular; DBP, pressão arterial diastólica; DWH, Durbin-Wu-Hausman; GIANT, Investigação Genética de Traços Antropométricos; GLGC, Consórcio Global de Genética de Lipídios; GWAS, estudo de associação genômica ampla; HbA1c, hemoglobina glicada; ICBP, Consórcio Internacional para Pressão Arterial; IV, variável instrumental; IVW, ponderação pelo inverso da variância; MAGIC, Consórcio de Meta-análises de Traços Relacionados à Glicose e Insulina; MR, randomização mendeliana; MTHFR, metilenotetrahidrofolato redutase; OLS, mínimos quadrados ordinários; SBP, pressão arterial sistólica; SNP, polimorfismo de nucleotídeo único; WC, circunferência da cintura; 2SLS, mínimos quadrados de 2 estágios.
REFERÊNCIAS
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‘Mendelian randomization’: can genetic epidemiology contribute to understanding environmental determinants of disease?
Clustered environments and randomized genes: a fundamental distinction between conventional and genetic epidemiology
Mendelian randomization: genetic anchors for causal inference in epidemiological studies
Homocysteine and coronary heart disease: meta-analysis of MTHFR case-control studies, avoiding publication bias
Effect modification by population dietary folate on the association between MTHFR genotype, homocysteine, and stroke risk: a meta-analysis of genetic studies and randomised trials
Homocysteine-lowering interventions for preventing cardiovascular events
Efeitos da redução dos níveis de homocisteína com vitaminas do complexo B sobre doenças cardiovasculares, câncer e mortalidade por causas específicas: metanálise de 8 ensaios randomizados envolvendo 37.485 indivíduos
Ehret GB, Munroe PB, Rice KM, Bochud M, Johnson AD, Chasman DI, Smith AV, Tobin MD, Verwoert GC, Hwang SJ, et al; International Consortium for Blood Pressure Genome-Wide Association Studies. Variantes genéticas em novas vias influenciam a pressão arterial e o risco de doenças cardiovasculares. Nature 2011;478:103–9.
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Hiperhomocisteinemia provocada pela depleção de folato: efeitos na função arterial coronariana e carotídea
A suplementação de ácido fólico por 3 semanas reduz a pressão de pulso e a rigidez das grandes artérias, independentemente do genótipo MTHFR
O tratamento a longo prazo para redução da homocisteína com ácido fólico mais piridoxina está associado à diminuição da pressão arterial, mas não à melhora da vasodilatação dependente do endotélio da artéria braquial ou da rigidez da artéria carótida: um estudo de 2 anos, randomizado e controlado por placebo
A redução da homocisteína com vitaminas do complexo B não tem efeito sobre a pressão arterial em idosos
Redução da homocisteína em pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico para prevenir acidente vascular cerebral recorrente, infarto do miocárdio e morte: o estudo clínico randomizado Vitamin Intervention for Stroke Prevention (VISP)
Efeito da suplementação de vitaminas do complexo B e ácidos graxos n-3 PUFA por 5 anos na pressão arterial em pacientes com DCV
Randomização mendeliana: a epidemiologia genética pode ajudar a corrigir as falhas da epidemiologia observacional?
Problemas com a estimativa de variáveis instrumentais quando a correlação entre os instrumentos e a variável explicativa endógena é fraca
Um levantamento de instrumentos fracos e identificação fraca no método generalizado dos momentos
Variáveis instrumentais com instrumentos fracos
Delineamento eficiente para estudos de randomização mendeliana: estimadores de variáveis instrumentais de subamostra e de 2 amostras
Ácidos graxos ômega-3 para claudicação intermitente
Uso de dados publicados na randomização mendeliana: um projeto para a identificação eficiente de fatores de risco causais
Desafios metodológicos na randomização mendeliana