pmid: "34769168"
title: "A vitamina B mitiga a dilatação da aorta torácica em camundongos com síndrome de Marfan ao restaurar a via canônica do TGF-β."
authors: "Huang TH, Chang HH, Guo YR, Chang WC, Chen YF"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2021 Oct 29"
doi: "10.3390/ijms222111737"
source: "PMC Full Text"

A vitamina B mitiga a dilatação da aorta torácica em camundongos com síndrome de Marfan ao restaurar a via canônica do TGF-β.

Autores

Huang TH, Chang HH, Guo YR, Chang WC, Chen YF

Periodico

International journal of molecular sciences (2021 Oct 29)

Conteudo

A Vitamina B Atenua a Dilatação da Aorta Torácica em Camundongos com Síndrome de Marfan ao Restaurar a Via Canônica do TGF-β

A formação de aneurisma da aorta torácica (AAT) é um processo multifatorial que resulta em diversas manifestações clínicas e respostas a medicamentos. Identificar os fatores críticos e suas funções na patogênese da síndrome de Marfan (SM) é importante para explorar a medicina personalizada para a SM. Polimorfismos na metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR), metionina sintase (MTR) e metionina sintase redutase (MTRR) têm sido correlacionados com a gravidade da AAT em pacientes com SM. No entanto, a relação detalhada entre o ciclo do folato-metionina e a patogênese da SM permanece obscura. Camundongos Fbn1C1039G/+ foram relatados como um modelo de doença da SM. Para estudar o papel do ciclo do folato-metionina na SM, camundongos Fbn1C1039G/+ foram tratados oralmente com metionina ou uma mistura de vitamina B (VITB), incluindo vitaminas B6, B9 e B12, por 20 semanas. A VITB reduziu a frequência cardíaca e a circunferência da aorta ascendente em camundongos Fbn1C1039G/+. Nossos dados mostraram que os genes Mtr e Smad4 foram suprimidos em camundongos Fbn1C1039G/+, enquanto o tratamento com VITB restaurou a expressão desses genes aos níveis normais. Além disso, a VITB restaurou a sinalização canônica do fator de crescimento transformador β (TGF-β) e promoveu a maturação do colágeno mediada por Loxl1 na túnica média da aorta. Este estudo fornece um método potencial para atenuar a patogênese da SM que pode ter um efeito sinérgico com tratamentos medicamentosos para pacientes com SM.

Introdução
A síndrome de Marfan (SM) é um distúrbio hereditário do tecido conjuntivo que é frequentemente causado pela mutação da fibrilina 1 (Fbn1) e pela consequente degeneração da matriz extracelular (MEC). Como o aneurisma da aorta torácica (AAT) e a dissecção da aorta torácica (DAT) são as principais causas de mortalidade em pacientes com SM, os tamanhos da aorta são acompanhados de perto durante o diagnóstico e tratamento. A AAT, no entanto, é uma condição multifatorial que apresenta uma ampla variedade de gravidades clínicas. Pesquisadores têm estudado diferentes aspectos da patologia da SM por décadas para explorar terapias personalizadas.
Há muito tempo assume-se que a sinalização do fator de crescimento transformador β (TGF-β) desempenha um papel central na patologia da SMF. J. Habashi relatou pela primeira vez que a sinalização de TGF-β estava regulada positivamente em pacientes com Marfan e em camundongos Marfan de 12 meses de idade (Fbn1C1039G/+). Além disso, o TAA no modelo de camundongo Fbn1C1039G/+ foi revertido pela inibição direta do TGF-β ou pela supressão da via de sinalização não canônica do TGF-β a jusante. Bloqueadores dos receptores de angiotensina II (BRAs) e estatinas atenuaram o TAA em estudos pré-clínicos ao suprimir a via de sinalização não canônica do TGF-β, sendo estas terapias promissoras para pacientes com SMF. No entanto, estudos recentes examinaram a origem da patologia do TAA. H. Wei et al. examinaram a relação causal entre a via de sinalização do TGF-β e o TAA em camundongos Fbn1C1039G/+ de 8 semanas de idade e descobriram que tanto as vias de sinalização canônica quanto a não canônica do TGF-β não apresentaram diferenças em comparação com camundongos do tipo selvagem. Por outro lado, Jason R. Cook e colegas relataram que um anticorpo neutralizante de TGF-β foi prejudicial no estágio inicial da síndrome de Marfan e propuseram que o TGF-β poderia desempenhar papéis completamente diferentes durante a progressão da doença. A via de sinalização canônica do TGF-β, por outro lado, desempenha um papel inteiramente diferente na patologia do TAA. O modelo de camundongo SMF com haploinsuficiência de Smad4 (genótipo Smad4+/−: Fbn1C1039G/+) apresentou um aneurisma aórtico maior e uma taxa de mortalidade mais elevada do que o modelo de camundongo SMF. A deficiência de Smad4 nas células musculares lisas (CMLs) induziu TAA através da regulação positiva de proteases, catepsina S e metaloproteinase 12 (Mmp12). Portanto, a regulação positiva da via de sinalização do TGF-β dependente de Smad4 nas CMLs protegeu contra a formação e dissecção de aneurisma aórtico. Além disso, estudos recentes mostraram que a expressão de lisil oxidases, a jusante das vias canônica e não canônica do TGF-β, estava altamente correlacionada com a patogênese do TAA. A mutação de Lox causa TAA e TAD graves em pacientes clínicos. Em um modelo de camundongo SMF, a inibição de Lox por β-aminopropionitrila (BAPN) causou rapidamente desintegração e dissecção aórtica; portanto, as lisil oxidases preservaram a integridade aórtica ao promover a maturação e a reticulação da MEC.
O ciclo do folato tem sido correlacionado com doenças cardiovasculares porque pode regular a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e modificar a metilação do DNA. Um dos metabólitos do ciclo folato-metionina, a homocisteína, atuou como um agonista parcial do receptor de angiotensina II em aneurismas da aorta abdominal. Em relação ao ciclo do folato na TAA da Síndrome de Marfan (MFS), o mecanismo de ação permanece obscuro. Estudos clínicos mostraram que polimorfismos nas enzimas do ciclo do folato, metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR), metionina sintase (MTR) e metionina sintase redutase (MTRR), estão relacionados à gravidade do aneurisma e ao potencial de dissecção em pacientes com MFS. Embora tenham levantado a hipótese de que a hiperhomocisteinemia seja a causa da diversidade clínica, essa hipótese não foi validada em um modelo de camundongo com MFS e hiperhomocisteinemia induzida por uma dieta restrita em cobalamina.
Este é o primeiro estudo a investigar o efeito da hiperhomocisteinemia induzida por metionina na TAA em camundongos com MFS. Além disso, examinamos pela primeira vez a interação entre o ciclo do folato e a patologia da MFS tratando camundongos com MFS com uma nova mistura de vitamina B (VITB). Usando uma técnica precisa de corte de tecido aórtico e PCR quantitativo, pudemos determinar o efeito terapêutico da VITB e o possível mecanismo dessa ação. O resultado sugeriu que um suplemento potencial, o complexo de vitamina B, poderia potencializar os efeitos de medicamentos de uso clínico em pacientes com MFS.
Resultados
2.1. A TAA foi Associada a Níveis Insuficientes de Smad4, Mtr e Mtrr em Camundongos Fbn1C1039G/+ (MFS)
Para avaliar o fenótipo da doença, medimos o tamanho tanto da raiz aórtica quanto da aorta ascendente. Também medimos as raízes aórticas de camundongos MFS e WT de 6 meses de idade por ecocardiografia. O diâmetro do seio de camundongos MFS foi significativamente maior do que o de camundongos WT (Figura Suplementar S1A). Para medir o tamanho da aorta ascendente proximal, as aortas torácicas, desde a raiz aórtica até a aorta ascendente proximal, foram incluídas em parafina, a direção foi ajustada e a localização foi confirmada. O diâmetro da aorta ascendente de camundongos MFS foi significativamente maior do que o de camundongos WT (Figura Suplementar S1B). Em seguida, investigamos a associação entre genes patológicos da TAA e genes do ciclo do folato com qPCR. A via de sinalização TGF-β é a via patológica central na MFS. Um relatório anterior indicou que polimorfismos nas enzimas do ciclo do folato, MTHFR, MTR e MTRR, estavam relacionados à gravidade do aneurisma e ao potencial de dissecção em pacientes com MFS. Os resultados mostraram que Smad4, Mtr e Mtrr foram suprimidos nas TAAs de MFS em comparação com as TAAs de WT. A supressão de Smad4 nas TAAs de MFS foi confirmada posteriormente por imunocoloração de Smad4 e expressão gênica regulada por Smad4, como Serpine1 (Figura 1A,B). Os níveis de expressão de RNA de Mtr e Mtrr foram ambos positivamente correlacionados com os níveis de expressão de Smad4 no tecido de TAA de camundongos MFS (Figura 1C).

2.2. Os Efeitos do Tratamento com Metionina e VITB na Homocisteína Plasmática e na Frequência Cardíaca em Camundongos Fbn1C1039G/+ (MFS)
Foi relatado que polimorfismos nos genes Mtr e Mtrr estão associados à gravidade do TAA em pacientes com SMF, e que níveis elevados de homocisteína plasmática são um fator chave. No entanto, não observamos alterações na homocisteína plasmática em camundongos com SMF quando observamos alterações nos níveis de expressão de Mtr e Mtrr. Para estudar os efeitos da homocisteína na gravidade do TAA, induzimos hiperhomocisteinemia tanto em camundongos com SMF quanto em camundongos WT com tratamento com 1% de metionina na água de beber (Figura 2A). Para abordar o ciclo metabólico do folato, desenvolvemos ainda o VITB, composto pelas vitaminas B6, B9 e B12, e tratamos os camundongos com SMF com VITB para estudar o efeito potencial na formação do TAA. Ao mesmo tempo, o ATE foi escolhido para comparação, pois pode reduzir a pós-carga cardíaca e ser utilizado na prática clínica. Descobrimos que o tratamento com metionina aumentou a frequência cardíaca dos camundongos com SMF, mas não dos camundongos WT. Tanto o tratamento com VITB quanto com ATE reduziram a frequência cardíaca, e eles puderam ser combinados em camundongos com SMF (Figura 2B). Além disso, a pressão arterial também foi registrada usando o método de manguito caudal (Figura Suplementar S2A,B). Embora a pressão arterial no grupo de tratamento com metionina estivesse ligeiramente mais alta na pressão arterial sistólica em comparação com os outros grupos, não houve diferença significativa (Figura Suplementar S2B).

2.3. Os Efeitos do Tratamento com Metionina e VITB no TAA em Camundongos Fbn1C1039G/+ (SMF)
Examinamos o comprimento da lâmina elástica externa (EEL) nas aortas ascendentes dos camundongos (Figura 3A). O tratamento com VITB reduziu significativamente a circunferência do aneurisma aórtico de Marfan, enquanto nem o tratamento com metionina nem com ATE apresentaram diferenças (Figura 3B). A espessura da parede aórtica foi calculada matematicamente pelos comprimentos da EEL e da lâmina elástica interna. A elasticidade aórtica foi avaliada quantificando a degradação das fibras elásticas com coloração VVG. Os camundongos com SMF apresentaram uma média aórtica significativamente mais espessa e menos elasticidade do que os camundongos WT. No entanto, nenhum dos regimes restaurou a espessura e a elasticidade da média (Figura 3C,D).

2.4. O VITB Restaurou a Expressão de Smad4 e Promoveu a Deposição de Colágeno Mediada por Loxl1 no TAA
Juntamente com as fibras elásticas, as fibras de colágeno fornecem resistência estrutural na aorta torácica. Alguns autores relataram que as lisil oxidases estabilizam o TAA por meio da ligação cruzada de proteínas da MEC e da mediação da deposição de colágeno em pacientes com MFS e camundongos. Portanto, coramos cortes com coloração de picrosirius e fotografamos as lâminas sob luz polarizada para corar as fibras de colágeno da túnica média. Nossos resultados mostram que camundongos MFS apresentam áreas de deposição de colágeno significativamente maiores na túnica média aórtica do que camundongos WT. O tratamento com VITB elevou a proporção de deposição de colágeno em comparação com o controle de veículo (Figura 4A,B). A lisil oxidase é um dos efetores a jusante da via de sinalização do TGF-β. Examinamos a expressão gênica da via de sinalização do TGF-β e dos genes do ciclo do folato que mostraram fortes associações em nossos dados anteriores. O tratamento com VITB restaurou a expressão de Smad4 e elevou a expressão de Loxl1 em comparação com o controle de veículo. O nível de expressão de Loxl1 foi positivamente correlacionado com a proporção de deposição de colágeno na túnica média aórtica (Figura 5A,B).

Discussão
A via de sinalização do TGF-β desempenha um papel crítico na formação de TAA, mas a origem da patologia da MFS permanece controversa. Os efeitos da regulação do TGF-β também parecem ser alterações dependentes da fase. Muitos fatores envolvidos na progressão da doença do TAA, incluindo enzimas do ciclo do folato, ainda não estão claros. Neste estudo, observamos primeiramente uma diminuição na expressão de Smad4 em camundongos MFS de 6 meses de idade. Encontramos uma correlação positiva entre a expressão gênica de Smad4 e os genes envolvidos no ciclo do folato. Essas descobertas nos fornecem novas informações para explicar a diversidade clínica dos pacientes juntamente com polimorfismos genéticos em enzimas do ciclo do folato. Nossos dados mostraram que o tratamento com VITB elevou a expressão de Smad4 e de genes no ciclo do folato. No entanto, o mecanismo detalhado requer investigação adicional.

Acreditamos que a homocisteína elevada contribui pouco para a patogênese dos TAAs, embora seja um importante fator de risco para a indução de aneurismas da aorta abdominal em outros modelos de doenças. Dietas restritas tanto em metionina quanto em cobalamina induziram hiperhomocisteinemia em camundongos Fbn1C1039G/+, mas não aceleraram a dilatação aórtica. Além disso, nossa dosagem de tratamento com VITB não foi alta o suficiente para reduzir a concentração plasmática de homocisteína, mas ainda assim atenuou o tamanho da dilatação aórtica. Esses resultados sugerem que os efeitos terapêuticos da VITB foram independentes da homocisteína.
Considerando o tamanho menor dos TAAs e a maior deposição de colágeno na túnica média aórtica após o tratamento com VITB, levantamos a hipótese de que a via canônica do TGF-β desempenhou um papel protetor. Em um modelo de camundongo com MFS haploinsuficiente para Smad4 (S4+/−: Fbn1C1039G/+), os camundongos desenvolvem TAD juntamente com a ativação da via não canônica do TGF-β. Em um modelo de camundongo com deficiência de Smad4 específica para células musculares lisas, a falta da proteína Smad4 induziu a superexpressão de MMP12 e diminuiu a expressão de proteínas da MEC e da lisil oxidase. Em nosso estudo, observamos a regulação positiva de MMP12 em camundongos com MFS, que foi regulada negativamente pelo tratamento com VITB (dados não mostrados). Não encontramos nenhuma diferença na degradação da elastina entre o grupo tratado com VITB e o grupo controle com veículo. Uma explicação possível é que as fibras elásticas possuem um longo tempo de renovação. Assim, o reparo das fibras elásticas leva mais tempo do que o das fibras de colágeno após a formação dos TAAs. Embora não tenham sido observadas alterações na elasticidade, a elevação dos genes Smad4 e Loxl1 sugeriu que a estrutura aórtica foi fortalecida. Relatos anteriores indicaram que mutações na lisil oxidase estão associadas à dissecção aórtica. Nossos resultados mostraram que a lisil oxidase estava positivamente correlacionada com a proporção de colágeno na túnica média aórtica. Embora alguns estudos tenham proposto que a deposição de colágeno torna a túnica média aórtica mais rígida e piora as propriedades biomecânicas, a falta de fibras de colágeno maduras induziu o início mais precoce da dissecção aórtica em doenças como a síndrome de Ehlers-Danlos. Além disso, a inibição da deposição de colágeno por meio da inibição da lisil oxidase exacerbou o aneurisma aórtico na MFS e causou dissecção aórtica. Portanto, acreditamos que o colágeno estabiliza os aneurismas aórticos em situações patológicas. Assim, o tratamento com VITB tem potenciais efeitos terapêuticos na estabilização do TAA e pode ser capaz de prevenir a dissecção ao restaurar a via canônica do TGF-β (Figura 6).

Conclusões
Este estudo descreveu a correlação positiva entre os genes de folato-metionina e os genes canônicos do Tgfβ na aorta ascendente de camundongos Fbn1C1039G/+. E a vitamina B, incluindo B6, B9 e B12, afetou a patologia do TAA ao regular a maturação do colágeno, mas não a concentração global de homocisteína. O mecanismo específico da interação da vitamina B com a matriz extracelular ainda precisa de investigação adicional. No entanto, este estudo fornece um método potencial para aliviar a dilatação da aorta torácica na MFS.
Materiais e Métodos
5.1. Animais Experimentais
Camundongos Fbn1C1039G/+ foram adquiridos do Jackson Laboratory (B6.129-Fbn1tm1Hcd/J, #012885). Os experimentos foram realizados com pelo menos sete camundongos machos Fbn1C1039G/+ e seus controles da mesma ninhada (tipo selvagem, WT) em cada grupo. O protocolo animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Taipei Medical University e do National Defense Medical Center.

5.2. Grupos de Tratamento
Para testar se a hiperhomocisteinemia afeta a manifestação de TAA, utilizamos 1% de metionina na água de beber para induzir o modelo. Além disso, o atenolol foi adicionado à água de beber (0,5 g/L) como tratamento medicamentoso padrão. Para a dosagem de vitamina B, uma meta-análise concluiu que uma terapia à base de folato reduz efetivamente os níveis plasmáticos de homocisteína em humanos. Usando o método de conversão de dosagem, determinamos a seguinte dosagem de medicamentos e grupos experimentais.

Camundongos WT de quatro semanas de idade (n = 8–11 por grupo) foram tratados por via oral com: (1) metionina (pureza ≥98%; 1% na água de beber) (M9625, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) ou (2) veículo controle por 20 semanas. Camundongos Fbn1C1039G/+ de quatro semanas de idade (n = 7–15 por grupo) foram tratados por via oral com: (1) metionina (1% na água de beber), (2) metionina (1% na água de beber) e VITB (pureza ≥97%, 25,7 μg/dia de folato via gavagem; pureza ≥96%, 0,865 mg/L de cianocobalamina na água de beber; e pureza ≥98%, 86,5 mg/L de piridoxina na água de beber) (F7876, C3607, P5669, Sigma-Aldrich), (3) metionina (1% na água de beber) e atenolol (ATE; pureza ≥98%, 0,5 g/L na água de beber) (A7655, Sigma-Aldrich), (4) metionina (1% na água de beber), ATE (0,5 g/L na água de beber) e VITB (25,7 μg/dia de folato via gavagem; 0,865 mg/L de cianocobalamina na água de beber; e 86,5 mg/L de piridoxina na água de beber) (F7876, C3607, P5669, Sigma-Aldrich), ou (5) veículo controle por 20 semanas. Os tecidos foram coletados dos camundongos com 24 semanas de idade.

5.3. Ecocardiografia
As aortas torácicas dos camundongos foram examinadas por ecocardiografia com 24 semanas de idade. A ecocardiografia foi realizada pela Taiwan Mouse Clinic. Os camundongos foram anestesiados por inalação de isoflurano e os pelos do peito foram removidos. A vista paraesternal de eixo longo foi examinada por ultrassom (Vevo3100). O diâmetro da raiz aórtica foi medido em intervalos diastólicos.

5.4. Experimento de Frequência de Pulso por Manguito de Cauda
Os experimentos de frequência de pulso foram realizados pela Taiwan Mouse Clinic quando os camundongos tinham 24 semanas de idade. Os camundongos foram transferidos para uma sala silenciosa e independente para o experimento. Usando um Sistema de Análise de Pressão Arterial BP-2000 Series II, a frequência de pulso e a pressão arterial foram medidas a partir das caudas dos camundongos sem anestesia ou quaisquer métodos invasivos.

5.5. Coleta de Tecidos
O sangue de camundongo (500–700 μL) foi coletado em um tubo com 100 μL de EDTA (0,05 M). Após centrifugação a 3000 rpm por 10 min a 4 °C, o plasma foi coletado e aliquotado antes do armazenamento a −80 °C. Para coletar o tecido da aorta, utilizou-se 5 mL de solução salina gelada para perfusão do ventrículo esquerdo até a artéria renal. O coração, a aorta torácica e a aorta abdominal foram cuidadosamente excisados com um bisturi, e o tecido fresco foi colocado em uma placa preenchida com solução salina gelada. Tecidos da aorta ascendente distal até o arco aórtico foram excisados para análise de RNA. Todos os ramos e a adventícia foram removidos dos tecidos aórticos e, em seguida, os tecidos aórticos foram colocados em solução RNAlater (AM7030, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA) e armazenados a −20 °C. Para análise histológica, tecidos da raiz aórtica até a aorta proximal foram cuidadosamente separados do tecido cardíaco. A aorta foi mantida o mais intacta possível e colocada em formalina a 10% (Burnett) para 24 h de fixação. As aortas bem fixadas foram armazenadas em etanol a 70% por pelo menos 24 h antes da desidratação e inclusão em parafina.

5.6. Análise de RNA
O RNA foi extraído dos tecidos da aorta ascendente e do arco aórtico usando o reagente TRIzol™ (15596018, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado usando o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (4368813, Applied Biosystems, Waltham, MA, EUA). A PCR quantitativa (qPCR) em tempo real foi realizada com Power SYBR™ Green PCR Master Mix (4367359, Applied Biosystems™) e analisada com um sistema de PCR em tempo real QuantStudio3 (Applied Biosystems) sob condições padrão. Todas as reações de amplificação foram realizadas em triplicata para cada amostra de RNA. A quantidade de cDNA de entrada total foi calculada usando a hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (Hprt) como controle interno.

5.7. Corte Transversal em Parafina e Coloração de Verhoeff–Van Gieson
A orientação da raiz aórtica afeta significativamente os resultados da análise histológica. Incluímos o tecido aórtico em um gel de agarose a 4% antes da inclusão em parafina. Cortes transversais de parafina de três micrômetros foram examinados lâmina por lâmina durante o seccionamento para corrigir a orientação vertical dos tecidos aórticos. Determinamos precisamente a posição da junção sinotubular (JST) e confirmamos o tamanho correto de cada corte. Cada lâmina continha três cortes transversais com intervalos de 9 μm na seção da JST para análise posterior. Reagentes de coloração de Verhoeff-van Gieson (VVG) modificados (26369-01~05, Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, EUA) foram usados para corar as fibras elásticas nos tecidos aórticos. Os comprimentos da lâmina elástica interna e externa (LEE) foram medidos pelo software ImageJ. O diâmetro aórtico e a espessura da média aórtica foram calculados com fórmulas. A elasticidade aórtica foi examinada calculando o número de fibras elásticas que sofreram ruptura. A presença de duas extremidades livres de elastina próximas foi considerada uma ruptura.
5.8. Coloração com Picrosirius Red e Quantificação da Deposição de Colágeno
Cortes transversais de parafina de três micrômetros foram submetidos à coloração com picrosirius red (24901, Polysciences Inc., Warrington, PA, EUA) seguindo procedimentos padrão. As lâminas coradas com sucesso foram fotografadas sob um microscópio com filtro polarizador. A área de birrefringência na túnica média aórtica foi quantificada pelo software ImageJ.

5.9. Imunocoloração de Smad4
O tampão de recuperação de antígeno (pH = 6, DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) foi utilizado para desmascarar o antígeno. A coloração por imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada incubando os cortes com anticorpos primários anti-Smad4 (1:100) por 18–24 h a 4°C e detectada utilizando anticorpos secundários biotinilados e um Kit LSAB (DakoCytomation).

5.10. Ensaio Colorimétrico de Homocisteína
Amostras de plasma foram obtidas de camundongos com 24 semanas de idade. Amostras com hemólise ou precipitação foram excluídas. Os níveis plasmáticos de homocisteína foram determinados por um kit de ensaio colorimétrico (E-BC-K143, Elabscience, Houston, Tx., EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

5.11. Análise Estatística
Os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão (DP) de pelo menos três amostras independentes. As comparações entre dois grupos foram realizadas utilizando testes t de Welch bicaudais e não pareados. As diferenças estatísticas foram consideradas significativas quando p < 0,05. Os asteriscos indicam * p < 0,05; ** p < 0,01; e *** p < 0,001.

Nota do Editor: A MDPI mantém-se neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Materiais Suplementares
Os seguintes itens estão disponíveis online em .

Contribuições dos Autores
T.-H.H. analisou a maioria dos experimentos e redigiu parte do manuscrito; H.-H.C. analisou os dados experimentais e forneceu sugestões críticas; Y.-R.G. forneceu suporte técnico e sugestões; W.-C.C. projetou os experimentos e revisou o manuscrito final; Y.-F.C. projetou os experimentos, analisou e interpretou os resultados, e escreveu o manuscrito. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento
Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (número da concessão MOST105-2320-B-038-022-MY3 para Y.F.C.) e pela Universidade Médica de Taipei (número da concessão DP2-109-21121-01-O-02-04 e DP2-110-21121-01-K-01-04 para Y.F.C.). Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia (número da concessão MOST105-2320-B-038-022-MY3 para Y.F.C.) e pela Universidade Médica de Taipei (número da concessão DP2-109-21121-01-O-02-04 e DP2-110-21121-01-K-01-04 para Y.F.C.).

Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Médica de Taipei e do Centro Médico de Defesa Nacional. (IACUC Nº 19-334, 22 de outubro de 2021.)

Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados
Não aplicável.

Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências
Evidências de uma contribuição crítica da haploinsuficiência na patogênese complexa da síndrome de Marfan
Alteração fenotípica das células musculares lisas vasculares precede a elastólise em um modelo de camundongo com síndrome de Marfan
Terapia da síndrome de Marfan
O resultado benéfico da terapia com losartana depende do tipo de mutação no FBN1 na síndrome de Marfan
Síndrome de Marfan: Da patogênese molecular ao tratamento clínico
A desregulação da ativação do TGF-beta contribui para a patogênese na síndrome de Marfan
Losartana, um antagonista de AT1, previne aneurisma da aorta em um modelo de camundongo com síndrome de Marfan
Estatinas reduzem o crescimento de aneurisma da aorta torácica em camundongos com síndrome de Marfan via inibição da via de sinalização ERK (quinase regulada por sinal extracelular) induzida por Ras
A aortopatia em um modelo de camundongo com síndrome de Marfan não é mediada pela sinalização alterada do fator de crescimento transformador beta
Efeitos dimórficos da sinalização do fator de crescimento transformador beta durante a progressão do aneurisma da aorta em camundongos sugerem uma terapia combinatória para a síndrome de Marfan
A sinalização não canônica do TGFbeta contribui para a progressão do aneurisma da aorta em camundongos com síndrome de Marfan
A deficiência de Smad4 em células musculares lisas inicia a formação de aneurisma da aorta
Mutações no LOX predispõem a aneurismas e dissecções da aorta torácica
Mutação de perda de função no LOX causa aneurisma e dissecção da aorta torácica em humanos
Níveis elevados de expressão de lisil oxidases protegem contra a progressão do aneurisma da aorta na síndrome de Marfan
Mecanismos e potenciais alvos terapêuticos para o ácido fólico em doenças cardiovasculares
A suplementação com ácido fólico retarda o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas modulando os níveis de metilação do DNA de MCP1 e VEGF in vivo e in vitro
A homocisteína interage diretamente e ativa o receptor tipo I de angiotensina II para agravar a lesão vascular
Polimorfismos genéticos como fatores de risco para prever as manifestações cardiovasculares na síndrome de Marfan. Papel dos polimorfismos genéticos das enzimas do metabolismo do ácido fólico na síndrome de Marfan
A homocisteína moderadamente elevada não contribui para o aneurisma da aorta torácica em camundongos
Variabilidade fenotípica das manifestações cardiovasculares na síndrome de Marfan. Possível papel da hiperhomocisteinemia e do polimorfismo genético C677T da MTHFR
Terapêuticas visando os fatores determinantes de aneurismas da aorta torácica e dissecções agudas da aorta: Insights a partir de genes predisponentes e modelos de camundongos
Aumento da deposição de colágeno e expressão elevada do fator de crescimento do tecido conjuntivo na dissecção da aorta torácica humana
Síndrome de Ehlers-Danlos tipo IV
Respostas centrais e sistêmicas à hiperhomocisteinemia induzida por metionina em camundongos
A doxiciclina em longo prazo é mais eficaz que o atenolol para prevenir aneurisma da aorta torácica na síndrome de Marfan através da inibição da metaloproteinase da matriz-2 e -9
Redução da homocisteína sanguínea com suplementos à base de ácido fólico: Metanálise de ensaios randomizados
Um guia prático simples para conversão de dose entre animais e humanos
Evidência de aortopatia em camundongos com haploinsuficiência de Notch1 em background Nos3-nulo
Correlação positiva entre a expressão insuficiente de RNA de Smad4, Mtr e Mtrr em aortas ascendentes de camundongos MFS com 6 meses de idade. (A) Análise de qPCR em tempo real de genes envolvidos na via TGF-β e no metabolismo do ciclo do folato em tecidos aórticos com a adventícia removida (WT, n = 6; MFS, n = 9). (B) Imunocoloração de Smad4 da aorta ascendente proximal. Barra de escala, 100 μm. (C) Correlação positiva entre a expressão de RNA de Smad4, Mtr e Mtrr do tecido aórtico MFS (n = 9). Os dados são apresentados como média ± DP. NS, sem diferença significativa. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

O efeito do tratamento com metionina e VITB na homocisteína plasmática e na frequência cardíaca. (A) Homocisteína plasmática em camundongos WT e MFS com diferentes regimes (n = 3–5 por grupo). (B) As contagens da frequência cardíaca foram medidas por manguito caudal em camundongos WT e MFS com diferentes regimes (n = 5–11 por grupo). Os dados são apresentados como média ± DP. * p < 0,05, ** p < 0,01.

Os efeitos do tratamento com metionina e VITB no aneurisma da aorta torácica em camundongos MFS de 6 meses de idade. (A) Seção representativa com coloração de Verhoeff-Van Gieson da aorta ascendente (AsAo) de MFS e WT. A elastina foi corada em preto; o colágeno foi corado em vermelho. Barra de escala, 100 μm. (B) Comprimento da lâmina elástica externa (EEL) da AsAo em camundongos WT e MFS com diferentes regimes (n = 3–9 por grupo). (C) Espessura medial da AsAo em camundongos WT e MFS com diferentes regimes (n = 3–9 por grupo). (D) Contagens de ruptura de fibras elásticas em camundongos WT e MFS com diferentes regimes (n = 3–6 por grupo). Os dados são apresentados como média ± DP. * p < 0,05, ** p < 0,01.

VITB aumentou a deposição de colágeno no aneurisma da aorta ascendente de camundongos MFS. (A) Seção representativa com coloração de Picro-Sirius da aorta ascendente sob luz polarizada. As fibras de colágeno apresentam birrefringência sob luz polarizada. A linha tracejada vermelha indica o limite da média aórtica. O asterisco indica o lado luminal da aorta. Barra de escala, 100 μm. (B) Quantificação da deposição de colágeno em camundongos WT e MFS com diferentes regimes (n = 3–6 por grupo). Os dados são apresentados como média ± DP. * p < 0,05, ** p < 0,01.

VITB restaurou a expressão de Smad4 e promoveu a deposição de colágeno mediada por Loxl1 em TAA. (A) Análise de qPCR em tempo real da expressão gênica da via TGF-β, enzimas metabólicas do ciclo do folato e lisil oxidases em tecidos aórticos com a adventícia removida (n = 4–6 por grupo). (B) Correlação positiva entre a expressão de RNA de Loxl1 e a deposição de colágeno na média aórtica de todos os grupos (n = 20). Os dados são apresentados como média ± DP. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005.
A VITB mitiga a dilatação de TAA em modelo de camundongo com SGM. A via do TGF-β desempenha um papel central na formação de TAA na SGM. A insuficiência de Smad4 resulta na falta de controle da metaloproteinase e em menor maturação da MEC em camundongos com SGM de 6 meses de idade (esquerda). O tratamento com VITB (direita) resgatou a expressão de Smad4 para o nível normal e elevou a expressão da lisil oxidase. A maturação do colágeno induzida pelas lisil oxidases poderia fortalecer a parede aórtica e retardar a dilatação de TAA. A maturação do colágeno pode proporcionar integridade estrutural e proteger a aorta contra a dissecção.