pmid: "28298203"
title: "A terapia fotodinâmica com azul de metileno induz morte celular seletiva e massiva em células de câncer de mama humano."
authors: "Dos Santos AF, Terra LF, Wailemann RA, Oliveira TC, Gomes VM, Mineiro MF, Meotti FC, Bruni-Cardoso A, Baptista MS, Labriola L"
journal: "BMC cancer"
pubdate: "2017 Mar 15"
doi: "10.1186/s12885-017-3179-7"
source: "PMC Full Text"
A terapia fotodinâmica com azul de metileno induz morte celular seletiva e massiva em células de câncer de mama humano.
Autores
Dos Santos AF, Terra LF, Wailemann RA, Oliveira TC, Gomes VM, Mineiro MF, Meotti FC, Bruni-Cardoso A, Baptista MS, Labriola L
Periodico
BMC cancer (2017 Mar 15)
Conteudo
A terapia fotodinâmica com azul de metileno induz morte celular seletiva e massiva em células de câncer de mama humano
Contexto
O câncer de mama é a principal causa de mortalidade entre as mulheres. A doença apresenta alta recorrência, principalmente devido à eficácia incompleta do tratamento primário em eliminar todas as células cancerígenas. A terapia fotodinâmica (TFD), uma abordagem que causa destruição tecidual por luz visível na presença de um fotossensibilizador (Fs) e oxigênio, surge como uma terapia alternativa promissora que poderia ser usada como adjuvante à quimioterapia e à cirurgia para a cura do câncer. No entanto, a eficácia da TFD no tratamento de tumores mamários, bem como os mecanismos moleculares que levam à morte celular, permanecem pouco claros.
Métodos
Neste estudo, avaliamos o potencial de eliminação celular da TFD utilizando azul de metileno (MB-TFD) em três linhagens celulares epiteliais mamárias que representam condições não malignas e diferentes subtipos moleculares de tumores mamários. As células foram incubadas na ausência ou presença de MB e irradiadas ou não a 640 nm com 4,5 J/cm². Utilizamos uma combinação de abordagens de imagem e bioquímica para avaliar o envolvimento das vias clássicas de autofagia e apoptose na mediação da deleção celular induzida pela MB-TFD. O papel dessas vias foi investigado utilizando inibidores específicos, ativadores e silenciamento gênico.
Resultados
Observamos que a MB-TFD induz, de forma diferencial, morte celular massiva de células tumorais. As células não malignas foram significativamente mais resistentes à terapia em comparação com as células malignas. A análise morfológica e bioquímica das células em processo de morte apontou para mecanismos alternativos em vez da apoptose clássica. A autofagia induzida pela MB-TFD modulou a viabilidade celular dependendo do modelo celular utilizado. No entanto, o comprometimento de uma dessas vias não impediu o destino fatal das células tratadas com MB-TFD. Adicionalmente, ao utilizar um modelo de cultura 3D fisiológico que recapitula características relevantes da morfologia do tecido mamário normal e tumoral, descobrimos que a ação diferencial da MB-TFD na eliminação de células tumorais foi ainda maior do que a detectada em culturas 2D.
Conclusões
Finalmente, nossas observações ressaltam o potencial da MB-TFD como uma estratégia altamente eficiente que poderia ser usada como uma poderosa terapia adjuvante à cirurgia de tumores mamários, e possivelmente de outros tipos de tumores, para aumentar com segurança a taxa de erradicação da doença residual microscópica e, assim, minimizar a chance de recorrência tanto local quanto metastática.
Material suplementar eletrônico
A versão online deste artigo (doi:10.1186/s12885-017-3179-7) contém material suplementar, que está disponível para usuários autorizados.
Contexto
O câncer de mama é um problema de saúde mundial para as mulheres; é o primeiro em incidência e o segundo em mortalidade entre todos os tipos de câncer, mesmo com todos os avanços tecnológicos recentes. A intervenção precoce é impactante, mas um grande número de pacientes ainda apresenta recidiva mesmo após anos de aparente cura. Os desafios no combate à doença residem nas propriedades intrínsecas de resistência tumoral, na heterogeneidade molecular e na metástase. Os subtipos moleculares dos cânceres de mama são definidos com base na presença de receptores de estrogênio (RE), receptores de progesterona (RP) e receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). Cerca de 20% dos cânceres de mama são negativos para a expressão de RE, RP e HER2 (Câncer de Mama Triplo-Negativo; CMTN), exibindo características patológicas agressivas e altas taxas de metástase e recorrência. Para pacientes com CMTN, a única opção atual é a quimioterapia e/ou radioterapia não direcionada, a fim de prolongar a sobrevida das pacientes, mas isso não previne de forma confiável a doença secundária.
A terapia fotodinâmica (TFD) é um tratamento alternativo promissor para o controle de doenças malignas. A TFD baseia-se na foto-oxidação da matéria biológica; o tratamento envolve a absorção de um fotossensibilizador (Fs) seguida pela iluminação com luz de comprimento de onda apropriado, capaz de excitar o Fs e desencadear reações fotoquímicas que geram espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio singleto (1O2), e radicais que levam à morte celular. As vantagens da TFD em comparação com a cirurgia, quimioterapia ou radioterapia são a redução da morbidade a longo prazo e o fato de que a TFD não compromete outras opções de tratamento. Esta terapia tem sido utilizada como modalidade de tratamento experimental em muitos países para diversos tipos de câncer. Em particular para tumores não superficiais, a TFD parece promissora no tratamento de tipos de câncer com alta recorrência. De fato, foi demonstrado recentemente que a TFD em combinação com a cirurgia em câncer de pâncreas humano implantado ortotopicamente em um modelo de camundongo nude foi altamente eficaz na eliminação de doença microscópica no leito tumoral pós-cirúrgico, bem como na prevenção da recorrência local e metastática.
Por uma variedade de razões, que incluem a falta de estudos sobre sua eficácia e segurança, bem como informações mecanísticas detalhadas, a TFD não é um tipo comum de tratamento. Para superar esse cenário, muitos estudos utilizando a TFD concentram-se no aumento da eficiência do Fs ou no desenvolvimento de TFD baseada em alvos. No entanto, devido à complexidade dos sistemas biológicos e aos possíveis alvos biológicos desconhecidos, os detalhes de como a TFD opera ainda são elusivos. Várias abordagens também foram desenvolvidas utilizando derivados de fenotiazínio, como o azul de metileno (AM), como uma nova estratégia de tratamento, levando a um protocolo de TFD que é eficiente e também barato. Além do baixo custo e da disponibilidade comercial, o uso do AM também é interessante porque tem sido utilizado com segurança há décadas em outras aplicações clínicas.
Neste estudo, propusemo-nos a explorar a eficácia da TFD utilizando azul de metileno (AM) como fotossensibilizador (AM-TFD) em diferentes linhagens celulares de mama humana, bem como os mecanismos moleculares relacionados à morte celular. Demonstramos que a AM-TFD é seletiva na indução de destruição celular massiva de células malignas, especialmente células de TNBC. Observamos também que a apoptose não é a via predominante de morte celular induzida pela AM-TFD. Finalmente, utilizando um modelo de cultura celular tridimensional (3D), confirmamos a eficácia da AM-TFD em eliminar seletivamente células tumorais sem afetar células com características normais.
Métodos
Culturas celulares
A linhagem celular de mama humana não tumorigênica MCF-10A (ATCC CRL-10317™) foi mantida em meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient F-12 Ham (DMEM-F12; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) livre de vermelho de fenol, suplementado com 5% de soro equino inativado pelo calor (Vitrocell Embriolife, Campinas, São Paulo, Brasil), insulina (10 μg/ml; Sigma-Aldrich), cortisol (500 ng/ml; Sigma-Aldrich), enterotoxina de cólera (100 ng/ml; Sigma-Aldrich) e fator de crescimento epidérmico (20 ng/ml; Sigma-Aldrich). A linhagem celular de adenocarcinoma de mama humano MCF-7 (ATCC HTB-22™) foi mantida em meio DMEM-F12 (Sigma-Aldrich) livre de vermelho de fenol, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado pelo calor (Vitrocell Embriolife). A linhagem celular de adenocarcinoma de mama humano MDA-MB-231 (ATCC HTB-26™) foi cultivada em meio Roswell Park Memorial Institute Medium Modified (RPMI 1640; Sigma-Aldrich) livre de vermelho de fenol, suplementado com 10% de SFB (Vitrocell Embriolife). Todas as culturas foram mantidas a 37 °C em atmosfera saturada de água contendo 5% de CO2. Para os ensaios de cultura 3D, células (2x104/cm²) foram semeadas sobre géis de matriz extracelular rica em laminina (lrECM) — comercialmente disponível como Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) — em meio livre de vermelho de fenol suplementado com 2,5% de soro e 5% de lrECM, e mantidas por quatro dias após os tratamentos. Todos os ensaios em 2D também foram realizados em meio suplementado com 2,5% de soro.
Tratamento fotodinâmico
O sal de fenotiazínio, AM (Labsynth Products, São Paulo, Brasil), foi utilizado como fotossensibilizador para realizar o tratamento de TFD. As células foram incubadas por 2 h com 0,2, 2 ou 20 μM de AM, em meio livre de vermelho de fenol suplementado com 2,5% de SFB, e mantidas nessas condições tanto durante a irradiação quanto nos tempos pós-tratamento (1, 3 e 24 h). A microplaca inteira foi irradiada com um conjunto de diodos emissores de luz (LED), com comprimento de onda de emissão máxima em 640 nm, correspondendo a doses totais de luz de 4,5 J/cm². Experimentos de controle, tais como células não expostas ao fotossensibilizador nem à luz (controle); células não expostas ao fotossensibilizador, mas lavadas e expostas à luz (fototoxicidade); e células expostas apenas ao fotossensibilizador sem irradiação (toxicidade no escuro), foram realizados em todos os experimentos.
Ensaio de viabilidade celular e estudos morfológicos
4 × 10⁴ células/cm² foram plaqueadas e mantidas em condições de controle ou expostas à TFD-AM e, em seguida, coradas com os corantes de ligação ao DNA iodeto de propídio (IP, Sigma-Aldrich) e Hoechst 33342 (HO, Sigma-Aldrich) por 10 min. Após a incubação, a porcentagem de células viáveis e mortas foi determinada utilizando um microscópio de fluorescência invertido (Nikon Eclipse Ti, Quioto, Japão) com aumento de 20x. Culturas celulares tridimensionais foram transferidas para uma lâmina de vidro e visualizadas utilizando um microscópio confocal (módulos Axiovert 200 LSM 510 Laser e Confocor, Carl Zeiss, Göttingen, Alemanha) equipado com objetiva de imersão em água (40X). A fluorescência das células marcadas foi detectada utilizando laser de 461 nm e 545 nm para excitação de HO e IP, respectivamente. As culturas foram avaliadas de acordo com: o número total de células, determinado pela contagem dos núcleos corados com HO; e o número de células mortas, determinado pelo número de núcleos corados com IP ou por HO intensamente brilhante (cromatina condensada). Um mínimo de 500 células foi contado em cada condição experimental. Os resultados foram expressos como porcentagem de células mortas.
Quantificação intracelular de azul de metileno
1 × 10⁵ células/cm² foram plaqueadas e incubadas com 5 mL de meio contendo AM (20 μM) e mantidas por 1, 2, 4, 6 e 8 horas. Em cada ponto de tempo, o sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas duas vezes com PBS e, em seguida, 1 mL de SDS 50 mM foi adicionado para promover a lise da membrana celular. O sobrenadante foi coletado e a absorbância foi medida no comprimento de onda de absorção máxima da solução de AM utilizada (655 nm). A incorporação de AM foi determinada corrigindo a absorbância do AM pelo número de células remanescentes em cada poço após o período de incubação.
Geração intracelular de oxigênio singleto
As medições de oxigênio singleto foram realizadas em um instrumento Edinburgh F900 especialmente projetado (Edimburgo, Reino Unido), composto por um laser Rainbow OPO (Quantel Laser-France) de 10 Hz, 2 mJ/pulso, que foi bombeado por um laser Brilliant Nd-YAG (Quantel Laser-France) e equipado com um suporte para cubetas, um filtro de silício, monocromador, um fotomultiplicador (PMT) de infravermelho próximo (NIR) resfriado a nitrogênio líquido (R5509) (Hamamatsu Co., Bridgewater, NJ, EUA) e uma placa analisadora multiescalar rápida com 5 ns/canal (MSA-300; Becker & Hickl, Berlim, Alemanha). As células foram semeadas em placas de seis poços (4x10⁵ células/poço) e, após 24 h, foram incubadas com AM por 2 h. As células foram lavadas em PBS, removidas das placas utilizando solução de tripsina, centrifugadas e suspensas em solução salina de D₂O e foram diretamente excitadas a 664 nm dentro de uma cubeta de quartzo para fluorescência. Obtivemos espectros de emissão de ¹O₂ medindo as intensidades de emissão de 1200 a 1348 nm com passos de 1 a 5 nm. As intensidades do pico de emissão no infravermelho próximo (NIR) (centrado em 1275 nm) estão correlacionadas com a quantidade de ¹O₂ gerada.
Quantificação de glutationa
A glutationa reduzida (GSH) foi quantificada conforme descrito anteriormente por Kand’ár et al., com pequenas modificações. As células foram semeadas em placas de Petri (100 mm) a uma densidade inicial de 2,6 × 10⁶ células/placa de Petri. Após 48 h, as células foram lavadas em PBS, removidas das placas usando tripsina a 0,1%, centrifugadas e suspensas em água deionizada. Uma alíquota foi separada para contagem celular antes da lise com polidocanol a 0,15% (Sigma-Aldrich). Para a precipitação de proteínas, as amostras foram incubadas com ácido metafosfórico a 10% frio (10 min, 4 °C), centrifugadas (22.000 x g, 15 min, 4 °C) e os sobrenadantes foram coletados. O sobrenadante foi diluído 20 vezes em tampão fosfato 100 mM pH 8,9 contendo 0,1 mM de ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA, Sigma-Aldrich). Vinte microlitros desta amostra foram diluídos para 320 μL em um tampão fosfato 100 mM pH 8,0 contendo 0,1 mM de DTPA. A derivatização foi realizada adicionando 20 μL de ortoftalaldeído (OPA, Sigma-Aldrich) 148 mM a esta solução. A reação foi incubada a 25 °C por 15 min no escuro. As amostras foram então filtradas através de um filtro de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,22 μm e injetadas em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O produto GS-OPA foi separado em uma coluna VP-ODS/C8/Fenil (250 mm × 4,6 mm × 4,6 μm, Shimadzu, Quioto, Japão). O HPLC estava equipado com dois sistemas de fornecimento de solvente LC-20AT, amostrador automático SIL-20 AC HT, forno de coluna CTO-20HC, detector de fluorescência RF-20A e controlador de sistema CBM-20A (Shimadzu, Quioto, Japão). A separação foi alcançada usando uma eluição isocrática de 15% de metanol em 85% de Na2HPO4 25 mM (Merck, Darmstadt, Alemanha) pH 6. A taxa de fluxo foi constante em 0,5 mL/min a 37 °C. O GS-OPA fluorescente foi monitorado com ʎex 350 nm e ʎem 420 nm. A área do pico foi plotada em relação a uma curva padrão de GS-OPA externa previamente derivatizada com GSH puro (Sigma-Aldrich). Os resultados foram apresentados como pmol/célula.
Localização intracelular de MB
Utilizamos microscopia confocal para caracterizar a localização subcelular do MB. Para este fim, comparamos a fluorescência proveniente de culturas celulares incubadas simultaneamente na presença de MB e marcadores fluorescentes padrão de organelas. O MitoTracker Green (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) foi utilizado como marcador mitocondrial, o LysoTracker Green (Invitrogen) como marcador de lisossomos e o HO como marcador para o núcleo celular. As imagens confocais foram obtidas utilizando um microscópio de varredura a laser (LSM) - 510 da Zeiss, utilizando objetivas de imersão em água de 40x com A.N. 1,2 ou de imersão em óleo de 63x com A.N. 1,4. As configurações de laser e filtro foram: linhas de laser para MB = 633, Lyso = 488 e Hoechst 33342 = 364; divisor de feixe = HFT UV/488/543/633; filtros de emissão para MB: 651-704, Lyso = 501-554 e Hoechst 33342 = 435-485. As configurações de imagem foram: zoom = 1, dimensões = 512x512 pixels, profundidade de imagem = 16 bits, média de sinal = 2 e espessura da seção óptica = 2 μm. As imagens tiveram seu brilho e contraste ajustados para as figuras e foram analisadas com o software ImageJ (National Institutes of Health).
Detecção de vesículas ácidas em células vivas usando laranja de acridina
O laranja de acridina (AO) é uma base fraca que pode se acumular em espaços ácidos e emite fluorescência vermelha brilhante. A intensidade da fluorescência vermelha é proporcional ao pH dos compartimentos celulares ácidos. Para detectar e quantificar a formação de vesículas ácidas durante o processo de autofagia, 4x104 células/cm² foram plaqueadas e, em seguida, submetidas ou não à TFD com MB. As células foram então lavadas com PBS e coradas com AO (Sigma Aldrich) em uma concentração final de 5 μg/ml por 10 min a 37 °C no escuro. Após uma etapa de lavagem, as células vivas foram visualizadas usando um microscópio invertido para luz transmitida e epifluorescência (Axiovert 200, Carl Zeiss) equipado com uma objetiva C-APOCHROMAT 40×/1,20 M27 (Zeiss™). A fluorescência das vesículas coradas com AO foi detectada usando um conjunto de filtros 09 (Zeiss™) que fornece uma banda de passagem (BP) de excitação de 450-490 nm com passagem longa (LP) de emissão de 515 nm.
Inibição de vias de sinalização
4,0 × 10⁴ células/cm² foram plaqueadas e incubadas com cada inibidor na presença ou na ausência de MB por 2 h, em uma atmosfera umidificada com 5% de CO₂ a 37 °C. As células foram então submetidas ou não à irradiação luminosa, conforme descrito acima. A apoptose foi inibida utilizando um inibidor específico de caspase-3 (100 nM de Inibidor de Caspase-3 VI; Calbiochem, La Jolla, CA, EUA), um inibidor pan-caspase (20 μM de Z-VAD-FMK; Calbiochem) ou um inibidor de BAX (10 μM; Tocris, Ellisville, MO, EUA). A autofagia foi ativada utilizando o inibidor de mTOR rapamicina (20 nM; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) ou inibida utilizando o inibidor de PI3-quinase LY294002 (50 μM; Tocris), o inibidor de PI3K de classe III 3-MA (5 mM; Calbiochem), cloroquina (5 μM; Sigma-Aldrich) ou bafilomicina A1 (50 nM; Calbiochem). Analisamos a dose-resposta e a toxicidade de cada inibidor e utilizamos a maior concentração que não apresentou citotoxicidade nas condições de controle para cada linhagem celular.
Transfecção transiente de oligonucleotídeos
O siRNA utilizado neste estudo foi um siRNA pré-desenhado Silencer (Invitrogen) com a sequência 5’GCUCUGCCUUGGAACAUCAtt 3’. O “AllStars negative control siRNA” (Qiagen, Venlo, Países Baixos) foi utilizado como um controle negativo de siRNA de sequência aleatória (siCTR). A transfecção de siRNA foi realizada utilizando o carreador lipídico Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Os complexos lipídio-RNA foram formados em Opti-MEM (Invitrogen) em uma proporção de 0,6 μl de Lipofectamine para 0,45 μl de siRNA 20 μM, à temperatura ambiente por 20 min, e foram posteriormente adicionados às células em meio sem antibióticos para atingir um volume final de 300 μl para transfecção durante a noite. As células foram mantidas em cultura por um período de recuperação de 24 h antes da realização dos experimentos. A eficiência da transfecção/silenciamento foi validada por Western blot, com pelo menos 60% de inibição.
Western blots
Extratos de proteína total foram preparados a partir de cada cultura submetida aos tratamentos descritos acima. Quantidades iguais (100 μg) de proteína de cada extrato foram solubilizadas em tampão de amostra (60 mM Tris-HCl [pH 6,8], 2% SDS, 10% glicerol, 0,01% azul de bromofenol) e submetidas a SDS-PAGE (16%). As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF, incubadas com solução de tampão de bloqueio (Thermo Fisher Scientific) e 5% BSA 1:1, e então incubadas com os seguintes anticorpos: policlonal de coelho anti-BAX (2772), policlonal de coelho anti-BCL2 (2876) (todos da Cell Signaling Technology), policlonal de coelho anti-LC3 (L8918) e anticorpo monoclonal de camundongo anti-alfa-tubulina clone B-5-1-2 (T5168) (todos da Sigma-Aldrich) como controle de carregamento. As membranas foram então incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). A quimioluminescência aprimorada foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido). A densitometria quantitativa foi realizada usando o software ImageJ (National Institute of Health [NIH]). A densidade de volume das bandas quimioluminescentes foi calculada como densidade óptica integrada × mm² após a correção do fundo.
Ensaios de atividade de caspase-3, caspase-7, caspase-8 e caspase-9
4 × 10⁶ células foram coletadas e a atividade de caspase foi medida usando um ensaio fluorimétrico específico (BioVision Research Products, Mountain View, CA, EUA). As reações foram iniciadas a 37 °C incubando 50 μg de extratos de proteína total com um substrato de caspase específico (50 μM DEVD-AFC, 50 μM IETD-AFC ou 50 μM LEHD-AFC para caspase-3 e -7; -8 e -9, respectivamente; BioVision), seguindo as instruções do fabricante. A atividade da protease foi avaliada em um comprimento de onda de excitação de 400 nm e um comprimento de onda de emissão de 505 nm usando um espectrofluorômetro de placa de 96 poços (Spectra MAX M2; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). Extratos de proteína total de células Min6 expostas ao veículo ou a uma combinação de citocinas pró-inflamatórias, que induziram um grau significativo e bem documentado de apoptose, foram sempre incluídos como controle positivo para os ensaios de atividade de caspase-3, -7, -8 e -9, em cada experimento realizado. As atividades de caspase-3, -7, -8 e -9 foram expressas como unidades arbitrárias de fluorescência por 50 μg de proteína total (Pelo menos 3 experimentos independentes foram realizados em triplicata para cada condição).
Análise estatística
Todos os resultados foram analisados quanto à distribuição gaussiana e passaram no teste de normalidade. As diferenças estatísticas entre as médias dos grupos foram testadas por ANOVA de uma via seguida pelo pós-teste de Tukey para comparações múltiplas. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
A MB-PDT induz seletivamente a morte celular em células de câncer de mama, enquanto não afeta significativamente as células não malignas
A MB-PDT induz morte massiva em células tumorigênicas e afeta fracamente células do tipo normal. Curvas de tempo de viabilidade após MB-PDT de culturas celulares com 2 (a) ou 20 μM de MB (b) seguidas de irradiação de 4,5 J/cm² obtidas em 1 h, 3 h e 24 h pós-irradiação (n = 3 experimentos independentes) * p < 0,05 versus MCF-10A; # p < 0,05 versus MDA-MB-231. (c) Curvas de incorporação de MB em MDA-MB-231, MCF-7 e MCF-10A após 1, 2, 4, 6 e 8 h de incubação (n = 4 experimentos independentes). (d) Espectro de emissão de MCF-10A, MCF-7 e MDA-MB-231 sem MB (círculos brancos); e espectros de emissão de células expostas a 20 μM de MB por 2 h (quadrados cinzas). (e) Níveis celulares de GSH em células MDA-MB-231, MCF-7 e MCF-10A * p < 0,05 versus MCF-10A. Os resultados são apresentados como média ± e.p.m.
Levando em consideração a heterogeneidade dos tipos de câncer de mama mais comuns e também para testar os possíveis efeitos citotóxicos da MB-PDT em células do tipo normal, utilizamos as seguintes linhagens celulares epiteliais mamárias humanas: MCF-7, uma linhagem celular luminal A positiva para RE, RP e HER-2; MDA-MB-231, uma linhagem celular de TNBC; e MCF-10A, uma linhagem celular do tipo normal. A Figura 1 (a e b) mostra as curvas de tempo de morte celular após MB-PDT com 2 ou 20 μM de MB seguidas de irradiação com 4,5 J/cm². O tratamento teve consistentemente um impacto maior nas linhagens celulares malignas e apresentou um efeito máximo 24 h após a irradiação na presença de 20 μM de MB. As células de TNBC apresentaram a maior taxa de morte celular (24 h: 98,6% ± 0,5%), seguidas pelas células MCF-7 (93,0 ± 5,2%) e, em seguida, pelas células MCF-10A do tipo normal (52,2% ± 3,8%). Além disso, ao contrário do aumento exponencial na morte celular ao longo do tempo apresentado pelas outras linhagens celulares, na presença da maior concentração de MB, as células MDA-MB-231 atingiram o percentual máximo de destruição fotodinâmica em pontos de tempo anteriores (1 h).
Usando a menor concentração de MB, detectamos que as células do tipo normal foram ainda menos sensíveis à MB-PDT (24 h: 18,0% ± 7,2%). É importante notar que essa dose ainda induziu morte massiva nas linhagens celulares malignas no mesmo ponto de tempo (MDA-MB-231: 97,3% ± 0,7% e MCF-7: 78,3% ± 7,1%). Esses dados nos permitiram estabelecer uma janela de tempo para nossos estudos mecanísticos. É importante notar que as células submetidas apenas à irradiação (sem MB) ou apenas ao MB por até 24 h de incubação (para testar a toxicidade no escuro) não mostraram diferenças significativas na morte celular em comparação com as células não tratadas. Além disso, a sobrevivência de todas as linhagens celulares expostas a diferentes concentrações de MB ou apenas à luz foi semelhante aos valores obtidos para as condições de controle negativo (ver Arquivo Adicional 1: Figura S1).
Para analisar se a suscetibilidade distinta à MB-TFD foi devida a diferenças na captação de MB, medimos os níveis intracelulares de MB e não observamos diferenças estatísticas no conteúdo de Ps entre todas as linhagens celulares (Fig. 1c). Também avaliamos a capacidade de geração de 1O2 e detectamos níveis semelhantes desta molécula oxidante entre todas as linhagens celulares (Fig. 1d). Estes resultados levaram-nos a concluir que o menor efeito da MB-TFD não se deveu nem às concentrações intracelulares do Ps nem à quantidade de oxigênio singleto intracelular. Para avaliar se houve alguma resposta adaptativa ao estresse diferencial à MB-TFD, medimos a glutationa intracelular e encontramos níveis mais baixos de glutationa reduzida (GSH) nas células MDA-MB-231 (Fig. 1e). Isso indica que o mecanismo de controle de estresse dependente de glutationa pode ser importante para determinar a sensibilidade ao ambiente pró-oxidante gerado pela MB-TFD.
Relevância da apoptose na morte celular induzida por MB-TFD
A via da apoptose não é o principal mecanismo envolvido na morte celular por MB-TFD. (a) Imagem representativa de núcleos de células mamárias humanas tratadas com MB-TFD ou estaurosporina (células MDA-MB231) coradas com iodeto de propídio. Barra de escala: 20 μm (b) Curvas de tempo de viabilidade celular obtidas 1 h, 3 h e 24 h após a MB-TFD realizada na presença ou ausência de um inibidor pan-caspase (zVAD) ou um inibidor específico da caspase-3 (n = 3 experimentos independentes) * p < 0,05 versus MB-TFD. Os resultados são apresentados como média ± e.p.m.
Analisamos as alterações morfológicas típicas relacionadas à morte celular nos núcleos após o tratamento. A MB-TFD não induziu núcleos picnóticos e fragmentados nem condensação da cromatina em manchas pequenas, irregulares e circunscritas, padrões típicos de células apoptóticas em qualquer ponto temporal ou concentração de MB testada (Fig. 2a, e ver Arquivo Adicional 1: Figura S2). Como controle para a morfologia típica de núcleos apoptóticos, as células MDA-MB-231 foram tratadas com o conhecido indutor de apoptose estaurosporina. As diferenças entre a morfologia típica de núcleos em apoptose exibida pelas células tratadas com estaurosporina e a exibida nas células tratadas com MB-TFD levaram-nos a formular a hipótese de que a MB-TFD induziu a morte através de uma via não apoptótica.
A morte celular induzida por MB-TFD é independente da atividade da caspase. As células MDA-MB-231, MCF-7 e MCF-10A não foram tratadas (controle), foram apenas irradiadas (λ), apenas incubadas com MB (MB) ou tratadas (MB-TFD). Após 1 h, 3 h ou 24 h de irradiação, as células foram coletadas e lisadas em um tampão apropriado. (a) As atividades da caspase-8, (b) caspase-3 e -7 e (c) caspase-9 foram medidas por um ensaio fluorimétrico usando um substrato específico utilizando 50 μg de lisados de proteína total. (n = 3 experimentos independentes). * p < 0,05 versus o respectivo controle negativo. Os resultados são apresentados como média ± e.p.m.
No entanto, de acordo com a classificação atual das sub-rotas de morte celular, apenas a presença de características morfológicas específicas não é suficiente para estabelecer qual mecanismo está mediando a deleção celular. Assim, também avaliamos as características bioquímicas da apoptose. Analisamos as curvas de viabilidade após a TFD-AM na presença de Z-VAD-FMK, um inibidor pan-caspase, ou de um inibidor específico da caspase-3 (Fig. 2b). Surpreendentemente, nossos resultados demonstraram que ambos os inibidores exerceram um efeito citoprotetor nos momentos iniciais após a TFD-AM, mas não conseguiram prevenir completamente a morte celular nas células malignas. Também avaliamos a atividade das caspases iniciadoras 8 e 9, bem como das caspases executoras 3 e 7 (Fig. 3). Corroborando os ensaios de inibição, não foi detectado envolvimento da caspase-3 na morte celular induzida pela TFD-AM nem nas células MCF-10A nem nas células MCF-7. No entanto, um pico transitório significativo da atividade da caspase-8 foi observado nos momentos iniciais após a TFD-AM nas células MDA-MB-231 e nas células MCF-10A, 24 h após o tratamento.
A via de apoptose independente de caspase não interfere no destino celular após a TFD-AM. (a) Análise por WB da razão BCL2/BAX em células MDA-MB-231, MCF-7 e MCF-10A submetidas ou não à TFD-AM após 1 h, 3 h ou 24 h pós-irradiação. Os imunoblots mostrados são resultados representativos. O gráfico de barras correspondente resulta da análise de densitometria de todos os blots. Os resultados são apresentados como média ± e.p.m., (n = 3 experimentos independentes); * p < 0,05 versus controle. (b) Curvas de tempo de viabilidade obtidas após 1 h, 3 h e 24 h pós-TFD-AM na presença ou ausência de um inibidor farmacológico específico de BAX (n = 3 experimentos independentes) * p < 0,05 versus TFD-AM. Os resultados são apresentados como média ± e.p.m.
Esses resultados nos levaram a propor que uma via apoptótica independente de caspase poderia mediar a deleção celular induzida pela TFD-AM. Portanto, para determinar ainda mais a relevância da via de apoptose após a TFD-AM, avaliamos o equilíbrio entre proteínas anti e pró-apoptóticas da família B-Cell CLL/lymphoma 2 (BCL2). Como mostrado na Fig. 4a, nenhuma das condições experimentais testadas induziu uma diminuição na razão das proteínas BCL2 e BCL2-associated X protein (BAX). Também testamos o efeito de um inibidor específico de BAX na eficiência da TFD-AM (Fig. 4b). A viabilidade celular revelou que a inibição da formação de poros por BAX é prejudicial para todas as linhagens celulares, que podem então se tornar mais suscetíveis à TFD-AM. Ao todo, esses dados apresentaram evidências de que a via apoptótica independente de caspase não teve relevância no dano celular induzido pela TFD-AM.
A fluorescência do AM concentra-se nos lisossomos das células de câncer de mama
O MB localiza-se nos lisossomos das células MCF-10A, MCF-7 e MDA-MB-231. Imagens de microscopia confocal de células incubadas simultaneamente com LysoTracker green (LysoTG, verde), MB (vermelho) e Hoechst 33342, para coloração dos núcleos (azul). Os perfis de gráfico quantificam a intensidade da fluorescência vermelha, verde e azul a partir de uma linha reta no meio da célula. [MB] = 20 μM; [LysoTG] = 300 nM; núcleo (HO 3334 = 300 nM). Barra de escala: 10 μm
Para determinar a localização subcelular do MB em organelas envolvidas em mecanismos de morte celular, incubamos as células com MB em combinação com um marcador nuclear e um marcador lisossômico (LysoTG) ou mitocondrial (MitoTG). Todas as linhagens celulares apresentaram algum nível de colocalização dos sinais de fluorescência de LysoTG e MB. No entanto, nas células MDA-MB-231, o MB estava altamente concentrado nos lisossomos, apresentando uma sobreposição quase perfeita com a coloração de LysoTG (Fig. 5 e ver Arquivo Adicional 1: Figura S3a). Em contraste marcante, esse padrão de colocalização não foi observado para MB e MitoTG (ver Arquivo Adicional 1: Figura S3b). Essa descoberta representa uma localização lisossômica preferencial do MB, o que torna esse compartimento subcelular propenso a danos fotoquímicos induzidos pela TFD com MB em vez da mitocôndria ou do núcleo.
A autofagia induzida pela TFD com MB leva a um aumento na citoproteção apenas em MDA-MB-231 e MCF-10A
A autofagia induzida pela TFD com MB leva à citoproteção (MDA-MB-231 e MCF-10A) ou morte celular (MCF-7). (a) Imagens representativas da formação de vesículas ácidas em células submetidas à TFD com MB após 1 h, 3 h ou 24 h ou não tratadas (controle). Painéis superiores: MCF-10A; painéis centrais: MCF-7; e painéis inferiores: MDA-MB-231. Barra de escala: 10 μm. (b) Análise por WB da razão LC3-II/LC3-I após células tratadas com TFD com MB com 2 ou 20 μM de MB, irradiadas apenas após 1 h, 3 h ou 24 h, incubadas com 2 ou 20 μM de MB no escuro ou não tratadas (controle). Os imunoblots mostrados são resultados representativos. O gráfico de barras correspondente resulta da análise de densitometria de todos os blots. Os resultados são apresentados como média ± e.p.m., (n = 3); * p < 0,05 versus controle. (c) Curvas de tempo de viabilidade com 2 μM (MDA-MB-231) ou 20 μM (MCF-7 e MCF-10A) de MB obtidas após 1 h, 3 h e 24 h pós-irradiação na presença ou ausência de cloroquina (CQ), bafilomicina (Baf), LY294002 (LY), 3-MA ou rapamicina (RAPA). (n = 3 experimentos independentes). * p < 0,05 versus TFD com MB. (d) Curvas de tempo de viabilidade de células submetidas ou não ao silenciamento de ATG5 e, em seguida, à TFD com MB foram obtidas após 1 h, 3 h e 24 h (n = 3 experimentos independentes). * p < 0,05 versus TFD com MB. Painéis superiores: Análise por WB dos níveis da proteína ATG5. Os imunoblots mostrados são resultados representativos. O gráfico de barras correspondente resulta da análise de densitometria de todos os blots. Os resultados são apresentados como média ± e.p.m., (n = 3 experimentos independentes); * p < 0,05 versus controle.
Um grande número de diferentes tipos celulares inicia a autofagia após a fotoirradiação. Nossos resultados mostraram um aumento nas estruturas ácidas já em pontos temporais iniciais após a TFD-AM em células MDA-MB-231 (Fig. 6a). Além disso, um aumento significativo na razão LC3-II/LC3-I foi observado não apenas após a TFD-AM, mas também após os controles de irradiação ou incubação com AM isoladamente (Fig. 6b). Nas células MDA-MB-231, a formação de autofagossomos foi maior nos tempos iniciais após a TFD com 2 μM de AM. Esses dados mostraram que a autofagia foi induzida pelo tratamento, mas não pareceu estar relacionada à morte celular. Para determinar se o papel da autofagia na TFD-AM é um mecanismo de morte ou uma tentativa de resgatar células danificadas, avaliamos a viabilidade após a TFD-AM inibindo ou induzindo a autofagia. As células MDA-MB-231 e MCF-10A exibiram um aumento significativo na morte celular após a inibição da autofagia com todos os inibidores testados (Fig. 6c). Em contraste, o fluxo autofágico induzido pela rapamicina diminuiu a morte celular nas células MDA-MB-231 e MCF-10A expostas à TFD-AM. Esse efeito não foi observado nas células MCF-7, onde a indução da autofagia resultou, inclusive, em maior suscetibilidade celular à TFD-AM. Consistente com esses resultados, o silenciamento da autofagia por knockdown de ATG5 mediado por siRNA confirmou que essa via exerce um papel citoprotetor nas células MDA-MB-231 e MCF-10A, mas não nas células MCF-7 (Fig. 6d). Em conclusão, nossos resultados indicaram que a autofagia pode estar relacionada a uma resposta inicial de sobrevivência das células ao dano oxidativo gerado pela TFD-AM em células de TNBC e células de linhagem normal, mas não em células luminais A.
A cultura em esferoides aumenta a sensibilidade diferencial à TFD-AM de células malignas e de linhagem normal
Um ambiente tridimensional aumenta a sensibilidade diferencial entre células tumorigênicas e de linhagem normal. (a) Morfologia de células epiteliais mamárias em diferentes condições de cultura. Painéis superiores: micrografias de contraste de fase de células MDA-MB-231, MCF-7 e MCF-10A cultivadas em monocamada (2D); painéis inferiores: microscopia confocal de células MDA-MB-231, MCF-7 e MCF-10A cultivadas como esferoides (3D); os núcleos foram corados com Hoechst 33342 (azul); Barra de escala: 20 μm. (b) Curvas de tempo de viabilidade após TFD-AM de culturas 3D com 20 μM de AM seguidas de irradiação de 4,5 J/cm² obtidas em 1 h, 3 h e 24 h pós-irradiação (n = 3 experimentos independentes). *p < 0,05 versus MCF-10A. (c) Comparação do efeito citotóxico da TFD-AM entre culturas celulares 2D e 3D às 24 h pós-irradiação. *p < 0,05 versus MCF-10A 3D; #p < 0,05 MCF-10A 2D versus MCF-10A 3D. (n = 3 experimentos independentes). Os resultados são apresentados como média ± e.p.m.
A fim de validar nossos resultados em um modelo que recapitula a morfologia do epitélio glandular, comparamos as diferentes respostas em células cultivadas em superfícies plásticas (monocamadas 2D) ou sobre uma membrana basal comercial (3D). Quando cultivadas em um ambiente 3D, as células epiteliais mamárias formam estruturas multicelulares; as células com características normais organizam-se em ácinos polarizados e com crescimento interrompido contendo um lúmen, enquanto as células malignas formam massas tumorais desorganizadas e com crescimento excessivo (Fig. 7a). Portanto, esta estratégia fornece um ensaio fisiologicamente mais relevante para analisar o efeito de tratamentos contra células malignas.
O mesmo protocolo de fotocitotoxicidade por MB-TFD utilizado para células cultivadas em monocamadas foi realizado em culturas 3D. As curvas de resposta à dose utilizando 20 μM de MB seguidas de irradiação com 4,5 J/cm² mostraram que não houve inibição óbvia da viabilidade celular tanto 1 quanto 3 h após o tratamento com MB-TFD. No entanto, a morte celular aumentou significativamente após 24 h de TFD para ambas as linhagens de células de câncer de mama (MDA-MB-231: 87,1% ± 1,8%; MCF-7: 74,4% ± 1,5%) (Fig. 7b). É importante ressaltar que o efeito da MB-TFD em células cancerígenas cultivadas em 3D após 24 h não diferiu significativamente do efeito observado em 2D após a MB-TFD, mas as células com características normais cultivadas em 3D exibiram uma sensibilidade significativamente menor ao tratamento do que aquelas cultivadas em 2D (Fig. 7c).
Discussão
Neste estudo, demonstramos que a MB-TFD induziu morte celular maciça em duas linhagens de células de câncer de mama humano que apresentam diferentes propriedades invasivas. A maior sensibilidade à MB-TFD foi observada nas células MDA-MB-231, utilizadas como modelo de TNBC, um subtipo de tumor para o qual não existem tratamentos direcionados. Este efeito é muito relevante porque os tumores TNBC são o maior desafio no tratamento do câncer de mama atualmente. Com a MB-TFD, obtivemos quase 100% de morte celular nessas células malignas. Nossos resultados são significativamente melhores do que os obtidos em outros relatos utilizando TFD para o tratamento de células de câncer de mama. Outros FS utilizados em estudos anteriores, como a Mitoxantrona, apresentam toxicidade no escuro, o que não é desejado para a prática da TFD. Em nosso estudo utilizando MB, não observamos toxicidade no escuro, uma característica que pode aumentar a especificidade local e a segurança do tratamento.
Uma das vantagens da TFD sobre outros tratamentos contra o câncer é a possibilidade de gerar menos efeitos colaterais aos pacientes. Nossos resultados demonstraram a eficácia da MB-TFD em eliminar seletivamente as células de câncer de mama. Entre os poucos relatos encontrados na literatura, Shemesh e colaboradores mostraram recentemente uma pequena diferença de apenas 20% na morte celular entre células MCF-10A e MDA-MB-231 submetidas à TFD com verde de indocianina lipossomal. No presente trabalho, alcançamos uma diferença de até 80% na morte celular induzida por MB-TFD entre células malignas e células com características normais.
Como já foi demonstrado que o azul de metileno (MB) é um gerador clássico de 1O2, comparamos parâmetros como potencial oxidativo e capacidade antioxidante entre as linhagens celulares. A ação fotodinâmica do MB leva à produção de níveis semelhantes de 1O2 no microambiente intracelular, portanto, isso não é uma limitação para a eficiência da TFD com MB. Como uma terapia pró-oxidante, a TFD é capaz de causar o colapso dos sistemas antioxidantes, levando à morte celular. Entre os sistemas envolvidos na homeostase do equilíbrio redox intracelular, a glutationa desempenha um papel importante. Foi relatado que células de TNBC apresentam níveis mais baixos de GSH em comparação com células ER positivas; além disso, linhagens celulares que contêm baixos níveis de GSH tendem a ser muito mais sensíveis às terapias contra o câncer. Neste estudo, confirmamos que as células de TNBC apresentam os níveis intracelulares de GSH mais baixos entre as linhagens celulares estudadas, e que isso poderia estar relacionado à incapacidade dessas células de lidar com o estresse oxidativo induzido pela TFD com MB. Este resultado apontou a TFD com MB como uma estratégia potencial para eliminar efetivamente células malignas que carecem de alvos terapêuticos específicos, impactando propriedades metabólicas que diferem daquelas encontradas em tecidos normais.
Existem poucos estudos sistemáticos in vitro sobre os mecanismos moleculares induzidos pela TFD que comparam células mamárias malignas e semelhantes às normais. Esses relatos demonstraram que a apoptose é a principal via de morte celular ativada pela TFD. No entanto, argumentamos que, nesses estudos, características clássicas da apoptose não foram observadas após a TFD. Portanto, levantamos a hipótese de que a apoptose pode não ser o processo predominante que medeia a morte celular induzida pela TFD, mas apenas um subproduto de outros mecanismos ativados. Outros autores também afirmaram que o tipo predominante de morte celular depende do protocolo adotado, e que pode haver variações da apoptose à necrose dependendo, por exemplo, da dose de energia utilizada. Em nosso estudo, não observamos a presença de traços apoptóticos sob qualquer dose, tempo de tratamento ou intensidade de irradiação utilizada. Adicionalmente, a viabilidade celular não foi completamente restaurada com o uso de inibidores de caspase. Além disso, a ação da TFD com MB não poderia ser exercida exclusivamente pela apoptose, porque as células MCF-7 não expressam caspase-3. Adicionalmente, nenhum aumento nas atividades das caspases-7, -8 ou -9 foi detectado nas células MCF-7 após a TFD com MB. Nesse contexto, também não observamos diminuição na proporção de proteínas anti e pró-apoptóticas e que a inibição da formação do poro mitocondrial aumentou a sensibilidade das células à TFD com MB, apontando para uma provável via de morte celular independente da mitocôndria. Reforçando essa hipótese, mostramos que o MB não está localizado ou, como já relatado, pode estar em um estado reduzido nas mitocôndrias, sugerindo fortemente que essa organela, de fato, não é o alvo primário para o dano oxidativo da TFD com MB.
Dependendo de uma rede de sinais gerados em locais celulares específicos, as células podem responder de forma diferencial ao estresse. Estudos anteriores que exploraram a localização subcelular do AM indicaram que este FS apresenta uma tendência a se acumular nos lisossomos de células vivas. Relatamos aqui, pela primeira vez, evidências de padrões diferenciais de colocalização de lisossomos e AM em diferentes linhagens celulares epiteliais do mesmo tecido. Tendo em vista o início da morte celular específico da organela, esses dados podem contribuir para explicar a sensibilidade celular diferencial ao TFD-AM observada entre as três linhagens celulares analisadas.
Os dados sobre a localização lisossômica do AM nos levaram a explorar o envolvimento da autofagia no contexto da TFD-AM. A relação entre autofagia e morte celular na TFD ainda é extensivamente discutida na literatura. Alguns estudos apontaram essa via como responsável pelos danos celulares gerados por diferentes FS. Outros mostraram que esse tipo de morte celular ocorre apenas após a prevenção da apoptose clássica, como resultado de mutações em genes essenciais relacionados à apoptose, como BCL2 ou membros da família das caspases. Nossos dados mostraram uma intensificação da via autofágica após a TFD-AM, o que leva à citoproteção ou citotoxicidade de uma maneira dependente da célula. Isso é esperado, uma vez que as células MCF-7 são haploinsuficientes para Beclin-1, o que poderia ser a razão de sua maior sensibilidade à TFD-AM.
O fato de as células cancerígenas poderem morrer por meio de diferentes mecanismos é uma pista relevante na escolha e no design de terapias anticancerígenas baseadas em alvos moleculares. Descobrimos que, dependendo do tipo celular, múltiplas vias de morte celular podem ser ativadas após a TFD-AM. De fato, mostramos que a apoptose e a autofagia estão relacionadas, mas não são as principais vias indutoras de morte celular. Além disso, resultados preliminares do nosso grupo apontam algumas das vias de necrose regulada (isto é, necroptose) como mecanismos mais relevantes envolvidos na morte celular induzida por TFD-AM (dados não mostrados). Como um aspecto importante para uma terapia alternativa para o tratamento do câncer é ampliar o espectro de mecanismos de morte celular para contornar os diferentes mecanismos de resistência exibidos pelas células malignas, estamos atualmente concentrando nossos recursos para dissecar ainda mais as vias moleculares alternativas que levam à fotocitotoxicidade da TFD-AM.
Do ponto de vista oncológico, é de fundamental importância se uma terapia pode atingir o objetivo final de eliminar células tumorais, apesar da complexidade do microambiente tumoral. Culturas 3D permitem o restabelecimento de características bioquímicas e morfológicas que se assemelham às condições das células em seu ambiente in vivo. Como as culturas 3D apresentam a vantagem da formação de microambientes e exposição diferencial a fatores distintos, como nutrientes e oxigênio, essa abordagem representa um modelo robusto para o estudo da incorporação e bioatividade de fármacos. Além disso, foi demonstrado que ensaios 3D podem ser usados com sucesso para distinguir efetivamente as respostas de tecidos malignos e normais à terapia. Demonstramos que o AM é eficientemente incorporado na matriz gelatinosa complexa usada para as culturas celulares 3D; ele é capaz de entrar nas estruturas 3D e ser fotoativado, induzindo a morte celular isotropicamente por todos os esferoides. Nossos resultados indicam que, neste modelo, a TFD-AM também foi eficaz na indução da destruição de células cancerígenas, com uma seletividade ainda maior entre tumores e células semelhantes às normais. Esse aumento na resposta preferencial da TFD-AM em células tumorais pode ser devido ao efeito protetor exercido pela membrana basal organizada e pela polaridade tecidual observada nos ácinos formados pelas células MCF-10A.
Em suma, a TFD-AM é promissora como um adjuvante útil à cirurgia para eliminar células malignas residuais microscópicas no leito tumoral pós-cirúrgico e prevenir a recorrência local, bem como a metastática, sem afetar tecidos normais. Particularmente para o câncer de mama, a TFD não está sendo testada atualmente como uma terapia perioperatória como a descrita para o câncer de pâncreas (14-15); no entanto, todos os resultados apresentados neste trabalho nos apontaram a importância de buscar estudos adicionais nesta direção em um futuro próximo. A estratégia poderia ser de particular importância no TNBC, pois a recorrência metastática após a ressecção cirúrgica do tumor é uma causa importante e frequente de mortalidade do paciente.
Conclusões
Quando comparado a outros estudos de TFD em câncer de mama, alcançamos uma maior eficiência na morte seletiva de células cancerígenas sem citotoxicidade do AM no escuro. Além disso, demonstramos o efeito diferencial da TFD-AM em mais de uma linhagem celular, superando uma limitação importante em muitos estudos de TFD que utilizam apenas uma linhagem de células tumorais ou linhagens celulares de diferentes tecidos. Até onde sabemos, também mostramos pela primeira vez que células semelhantes às normais do epitélio mamário são muito mais resistentes à TFD-AM. Essas são características fundamentais para o uso seguro da terapia, reforçando o fato de que uma das vantagens da TFD sobre outras abordagens terapêuticas é a possibilidade de gerar menos efeitos colaterais aos pacientes. Finalmente, propomos que a TFD-AM poderia ser um adjuvante eficaz e seguro à cirurgia, levando a taxas mais baixas de recorrência local e à distância.
Arquivo adicional
Abreviações
1O2
Oxigênio singleto
2D
Bidimensional
3D
Tridimensional
AO
Laranja de acridina
BAX
Proteína BCL2 e proteína X associada a BCL2
BCL2
Linfoma de células B/leucemia 2
BP
Passa-banda
DMEM-F12
Meio de Eagle Modificado por Dulbecco/Nutriente F-12 Ham
DTPA
Ácido dietilenotriaminopentacético
ER
Receptores de estrogênio
GSH
Glutationa reduzida
HER2
Receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano
HO
Hoechst 33342
HPLC
Cromatografia líquida de alta eficiência
LED
Diodo emissor de luz
LP
Passa-longa
LSM
Microscópio de varredura a laser
LysoTG
Marcador lisossômico
MB
Azul de metileno
MB-PDT
TFD usando azul de metileno
MitoTG
Marcador mitocondrial
NIR
Infravermelho próximo
OPA
Ortoftalaldeído
PDT
Terapia fotodinâmica
PI
Iodeto de propídio
PMT
Tubo fotomultiplicador
PR
Receptores de progesterona
Ps
Fotossensibilizador
PVDF
Fluoreto de polivinilideno
RPMI
Meio Roswell Park Memorial Institute Modificado
siCTR
siRNA controle de sequência aleatória
TNBC
Câncer de mama triplo-negativo
Referências
Estatísticas de câncer, 2015
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Galluzzi L, Bravo-San Pedro JM, Vitale I, Aaronson S a, Abrams JM, Adam D, Alnemri ES, Altucci L, Andrews D, Annicchiarico-Petruzzelli M, Baehrecke EH, Bazan NG, Bertrand MJ, Bianchi K, Blagosklonny M V, Blomgren K, Borner C, Bredesen DE, Brenner C, Campanella M, Candi E, Cecconi F, Chan FK, Chandel NS, Cheng EH, Chipuk JE, Cidlowski J a, Ciechanover a, Dawson TM, Dawson VL, et al. Aspectos essenciais versus acessórios da morte celular: recomendações do NCCD 2015. Cell Death Differ. 2014;1:1–16.
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