pmid: "37242613"
title: "Nanoencapsulação de azul de metileno para maior fototoxicidade em células de câncer de pele e penetração cutânea em associação com sonoforese."
authors: "Soares Lima T, Silva de Oliveira MS, Reis AVF, Petrilli R, Eloy JO"
journal: "Pharmaceutics"
pubdate: "2023 Apr 29"
doi: "10.3390/pharmaceutics15051371"
source: "PMC Full Text"

Nanoencapsulação de azul de metileno para maior fototoxicidade em células de câncer de pele e penetração cutânea em associação com sonoforese.

Autores

Soares Lima T, Silva de Oliveira MS, Reis AVF, Petrilli R, Eloy JO

Periodico

Pharmaceutics (2023 Apr 29)

Conteudo

Nanoencapsulação de Azul de Metileno para Aumento da Fototoxicidade em Células de Câncer de Pele e Penetração Cutânea em Associação com Sonoforese

A terapia fotodinâmica (TFD) utilizando azul de metileno (AM) como fotossensibilizador surgiu como um tratamento alternativo para cânceres de pele, como o carcinoma espinocelular (CEC). Para aumentar a penetração cutânea do fármaco, algumas estratégias são utilizadas, como a associação de nanocarreadores e métodos físicos. Assim, abordamos aqui o desenvolvimento de nanopartículas à base de poli-Ɛ-caprolactona (PCL), otimizadas com o delineamento fatorial de Box–Behnken, para aplicação tópica de AM associada à sonoforese. As nanopartículas de AM foram desenvolvidas utilizando a técnica de dupla emulsão-evaporação do solvente e a formulação otimizada resultou em um tamanho médio de 156,93 ± 8,27 nm, índice de polidispersão de 0,11 ± 0,05, eficiência de encapsulamento de 94,22 ± 2,19% e potencial zeta de −10,08 ± 1,12 mV. A avaliação morfológica por microscopia eletrônica de varredura mostrou nanopartículas esféricas. Estudos de liberação in vitro mostram um burst inicial compatível com o modelo matemático de primeira ordem. A nanopartícula apresentou geração satisfatória de espécies reativas de oxigênio. O ensaio de MTT foi utilizado para avaliar a citotoxicidade e a CI50; valores de 79,84; 40,46; 22,37; 9,90 µM foram obtidos, respectivamente, para a solução de AM e a nanopartícula de AM sem e com irradiação de luz após 2 h de incubação. A análise por microscopia confocal mostrou alta captação celular para a nanopartícula de AM. Em relação à penetração na pele, observou-se uma maior concentração de AM na epiderme + derme, correspondendo a 9,81 e 5,27 μg/cm² na penetração passiva e 24,31 e 23,81 μg/cm² após a sonoforese, para a solução de AM e a nanopartícula de AM, respectivamente. Até onde sabemos, este é o primeiro relato de encapsulamento de AM em nanopartículas de PCL para aplicação em câncer de pele utilizando TFD.

Introdução
O câncer de pele é um dos tipos de câncer mais comuns em todo o mundo. Sua alta prevalência e incidência o tornam um importante problema de saúde. A categoria mais comum de câncer de pele é a classificada como não melanoma (CPNM), subdividida em carcinoma basocelular (CBC), que se forma nas células basais, e carcinoma espinocelular (CEC), que se origina de células malignas em rápida proliferação na epiderme. O CEC tem atraído atenção nos últimos anos por seu potencial agressivo de causar metástase para locais distantes ou linfonodos e pelo aumento significativo em sua taxa de ocorrência entre 1976 e 2010. Os fatores de risco para seu desenvolvimento surgem de uma combinação de fatores ambientais e genéticos, sendo a causa mais comum a exposição prolongada à luz ultravioleta (UV). Tradicionalmente, o tratamento de primeira linha para os CPNMs tem sido modalidades cirúrgicas, como excisão, cirurgia micrográfica de Mohs e eletrodissecação com curetagem. No entanto, essa terapia depende de várias variáveis, como as comorbidades do paciente, o tamanho da área afetada, a multiplicidade de lesões e até mesmo a possibilidade de formação de grandes cicatrizes pós-cirúrgicas. Nesse contexto, há grande relevância na busca por novas terapias que visem melhorar a qualidade do tratamento para os pacientes.

Historicamente, a terapia fotodinâmica (TFD) tem sido utilizada para tratar uma variedade de doenças; no entanto, suas características de tratamento minimamente invasivo, combinadas com a especificidade de aplicação e a baixa toxicidade cumulativa, mostraram-se adequadas para uma abordagem alternativa eficiente para tratar ou limitar cânceres resistentes. Além disso, a TFD, ao utilizar a via tópica para a aplicação de seu fotossensibilizador, consegue agregar vantagens como a diminuição dos efeitos colaterais e o aumento da concentração localizada do fármaco nas camadas da pele. Seu mecanismo de ação baseia-se na ativação de um agente fotossensibilizante por luz em um comprimento de onda específico, resultando na geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), principalmente oxigênio singleto, que causam danos aos componentes celulares, resultando na morte das células cancerígenas. O azul de metileno (AM), um corante pertencente à família das fenotiazinas, é um dos fotossensibilizadores mais utilizados devido à sua alta geração de EROs e propriedades cicatrizantes. No contexto de doenças cancerígenas, o AM já foi utilizado no câncer de mama, melanoma, câncer de pulmão e no próprio CEC. Em conjunto, com base em estudos in vitro, in vivo e pré-clínicos, o AM provou ser um agente promissor que pode ser utilizado para o tratamento do CEC.
Como a administração tópica do fotossensibilizador parece ser uma das etapas mais importantes da TFD, há a necessidade de garantir que suas características físico-químicas sejam preservadas; além de uma farmacocinética favorável, o alto suprimento de oxigênio singleto também é importante para evitar a agregação do fármaco. Além disso, o tratamento não deve apresentar efeitos colaterais que possam ser prejudiciais às células normais. Outro ponto relevante é a barreira cutânea. É de conhecimento geral que este é o maior órgão do corpo humano, servindo como a primeira linha de defesa contra microrganismos e substâncias estranhas. Sua camada mais superficial, a epiderme, desempenha esse papel fundamental por meio do estrato córneo (EC). O EC é uma matriz espessa de queratinócitos intercalados com lipídios, portanto, moléculas hidrofílicas de alto peso molecular têm dificuldade de penetração. Diante de problemas físico-químicos e biológicos, o desenvolvimento de novos sistemas de liberação de fármacos para preservar suas características e melhorar a penetração na pele é altamente recomendado.

Nesse contexto, os nanocarreadores poliméricos têm sido uma plataforma em ascensão para aplicação direcionada ao câncer. Esses nanossistemas apresentam vantagens como boa capacidade de transporte de fármacos, tamanho de partícula controlável e biodegradabilidade, além do ajuste no perfil de liberação e direcionamento eficaz. Além disso, o método de dupla emulsificação e evaporação de solvente é adequado para o encapsulamento de moléculas hidrofílicas, como o azul de metileno (AM). Sabe-se que o encapsulamento de pequenas moléculas hidrofílicas permanece um desafio; devido à sua boa solubilidade em água e baixo peso molecular, o AM pode apresentar interações fracas com as estruturas poliméricas que formam as nanopartículas, causando baixa eficiência de encapsulamento, vazamento indesejado e uma rápida liberação inicial. Mesmo com esses obstáculos, o AM já foi encapsulado com sucesso em matrizes poliméricas.

Na administração cutânea de fármacos, as nanopartículas poliméricas podem se acumular nos folículos pilosos, formando um reservatório de fármaco que proporciona liberação sustentada/controlada. Vários estudos já utilizaram essas plataformas poliméricas e relataram melhoria tanto nas camadas mais superficiais quanto nas mais profundas da pele. Ainda assim, para aumentar a entrega de nanopartículas tópicas, métodos físicos são extensivamente utilizados para desestabilizar o EC. A sonoforese é uma técnica que utiliza ultrassom, que pode ser de baixa ou alta frequência, em contato com a pele, sendo um pré-tratamento minimamente invasivo. Aqui, mostramos pela primeira vez o uso de nanopartículas de PCL contendo AM associadas à sonoforese para TFD de câncer de pele. Mais importante ainda, no presente estudo, levantamos a hipótese de que a sonoforese pode aumentar a penetração cutânea de nanopartículas poliméricas carregadas com AM.
Em um esforço para melhorar os efeitos da TFD pelo azul de metileno, este estudo sintetizou nanopartículas de policaprolactona (PCL) que foram otimizadas pelo delineamento de Box–Behnken e caracterizadas quanto ao tamanho, eficiência de encapsulamento, perfil de liberação, geração de espécies reativas de oxigênio, fotocitotoxicidade e captação celular. Além disso, um estudo de penetração cutânea foi proposto para investigar a associação entre sonoforese e nanopartículas como uma abordagem mais eficaz para uma melhor entrega cutânea de AM.

Materiais e Métodos
2.1. Material
O metanol foi obtido da J.T. Baker (Phillipsburg, PA, EUA) e o diclorometano (DCM) da NEON (Suzano, SP, Brasil). Álcool polivinílico, azul de metileno, poli-ε-caprolactona (PCL), rodamina 123, brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT), dimetilsulfóxido (DMSO), 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Meio Essencial Mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), tripsina, meio de montagem Fluoromount®, solução antibiótica/antimicótica e paraformaldeído foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O cloreto de potássio (KCl) foi obtido pela Synth (Diadema, SP, Brasil). Filtros de PTFE (25 mm, 0,45 μm, Allcrom®, São Paulo, SP, Brasil) foram obtidos da Allcrom®. A linhagem celular humana de carcinoma espinocelular A431 foi obtida do Banco de Células do Rio de Janeiro (Brasil).

2.2. Desenvolvimento de Nanopartículas e Delineamento Fatorial
A preparação das NPs seguiu a técnica clássica de dupla emulsificação e evaporação de solvente descrita anteriormente. Primeiramente, 2 mg de AM foram dissolvidos em 2 mL de solução aquosa contendo álcool polivinílico (PVA) e, em seguida, adicionados a uma solução de diclorometano (DCM) contendo a policaprolactona. Posteriormente, a mistura foi emulsificada por sonicação com ultrassom de sonda (QSonica Sonicators Q500, Newtown, CT, EUA) por 3 min a 30% de amplitude sob banho de gelo. Logo após, a emulsão primária foi gotejada em 25 mL da solução de PVA a 1% e, então, reemulsificada sob as mesmas condições de sonicação anteriores. Finalmente, o DCM foi evaporado sob agitação magnética à temperatura ambiente em capela de exaustão por 1 h. As etapas de emulsificação foram monitoradas por microscopia óptica.
Para verificar e otimizar os parâmetros de resposta das formulações, utilizou-se o método de delineamento de Box–Behnken usando o software Minitab® 19.0 (Minitab, Filadélfia, PA, EUA). O BBD apresentou três fatores em três níveis (alto, médio e baixo) que geraram equações polinomiais de segunda ordem e gráficos de superfície de resposta. Com isso, investigou-se a relação entre as variáveis independentes: razão fase orgânica/fase aquosa da 1ª emulsificação (X1), porcentagem de PVA na 1ª emulsificação (X2) e quantidade de policaprolactona (X3) e seus impactos nas variáveis dependentes: tamanho de partícula (Y1), índice de polidispersão (Y2) e porcentagem de encapsulamento (Y3) das formulações. O modelo polinomial gerado consiste em: onde Yi representa a variável dependente; B0 a interceptação, X1, X2 e X3 as variáveis independentes e B1 a B33 seus respectivos coeficientes de regressão.
Assim, a otimização foi realizada por meio da abordagem de desejabilidade, na qual a análise das variáveis independentes de 15 formulações visou alcançar um menor tamanho de partícula e PDI, juntamente com uma maior eficiência de encapsulamento.

2.3. Caracterização Físico-Química
2.3.1. Análise de Tamanho de Partícula, Índice de Polidispersão (PdI) e Potencial Zeta
Alíquotas de nanopartículas (100 μL) foram diluídas em 900 μL de solução de cloreto de potássio (KCl) 1 M e analisadas em células com 1 cm de caminho óptico usando espalhamento de luz dinâmico (DLS) no equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments) a 25 °C para medições de tamanho de partícula e PdI. O potencial zeta foi determinado no mesmo equipamento com cubetas apropriadas, com base na mobilidade eletroforética das partículas dispersas quando submetidas a um campo elétrico.

2.3.2. Eficiência de Encapsulamento de MB (EE%)
Para o cálculo da eficiência de encapsulamento, utilizou-se o método indireto descrito por Crisóstomo et al. com adaptações. Nele, a quantidade de fármaco livre é calculada e correlacionada com sua quantidade teórica. Para isso, é necessário centrifugar uma alíquota da formulação (1 mL) em um tubo Amicon® 50 kDa a 3000× g por 10 min. Posteriormente, o centrifugado é diluído em água destilada (1:10) e lido em espectrofotômetro em um comprimento de onda de 570 nm. Os resultados de absorbância obtidos foram plotados na equação da reta resultante da curva de calibração do fármaco, para quantificação da porção livre. O cálculo da porcentagem de encapsulamento é então representado pela Equação (2): onde [MB]total representa a concentração teórica total de MB nas nanopartículas e [MB]free representa a concentração de fármaco livre.

2.3.3. Avaliação da Morfologia por Microscopia Eletrônica de Varredura
O diâmetro médio e a morfologia das NPs foram examinados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) utilizando um Microscópio Eletrônico de Varredura Quanta 450 FEG-FEI, com resolução nominal de 1 nm. Alíquotas da formulação foram colocadas em um suporte de amostra de alumínio, sobre uma fita de carbono, secas à temperatura ambiente e revestidas com ouro por pulverização catódica (sputter coating), a fim de aumentar a condutividade da superfície. As imagens de MEV foram capturadas a 150.000× e 10 kV.

2.4. Liberação de Fármaco In Vitro
A liberação in vitro foi avaliada comparando a solução de azul de metileno com a formulação de nanopartículas, utilizando o método de liberação passiva. Assim, 1 mL das amostras foi colocado em contato com 7 mL de PBS pH 7,4 a 37 °C em béqueres vedados e mantidos sob agitação constante em incubadora com agitação orbital a 150 rpm. Os experimentos foram conduzidos em quadruplicata com amostras independentes para cada tempo de coleta. A cada 1, 3, 5, 8, 10, 24 h, 2 mL de cada amostra foram colocados em um tubo Amicon® de 50 kDa e centrifugados por 10 min a 4000× g. O filtrado foi diluído com água destilada (1:3) e lido em espectrofotômetro a 663 nm. A porcentagem de AM liberada de cada amostra é representada graficamente em função do tempo para avaliar o perfil de liberação do fármaco. Além disso, a cinética de liberação foi avaliada (DDSOLVER), submetendo os dados obtidos no teste à cinética de ordem zero (Equação (3)), cinética de primeira ordem (Equação (4)), e os seguintes modelos também foram utilizados: Higuchi (Equação (5)), Weibull (Equação (6)) e Hopfenberg (Equação (7)). Observando os coeficientes de correlação linear entre os modelos, com base em suas respectivas equações abaixo:

2.5. Geração de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs)
O 1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) foi utilizado como indicador para detectar a produção de EROs pelo azul de metileno em solução ou encapsulado em nanopartículas poliméricas. Resumidamente, 200 µL da solução (240 µg/mL em DMSO) e da nanopartícula de azul de metileno (80 µg/mL) foram colocados em uma placa de 96 poços e adicionados a 100 µL de solução de DPBF (concentração final: 30 µM em DMSO) sob condições de ausência de luz. Imediatamente, representando o tempo 0, a absorbância das amostras a 410 nm foi registrada usando um leitor de microplacas. Logo após, a placa foi submetida à irradiação luminosa (630 nm, 6,7 J/cm², 0,001841 W/cm²) por 3 min, seguida pelo registro da absorbância até 30 min de irradiação. Grupos controle de DPBF, DMSO e nanopartículas sem azul de metileno foram utilizados para remover possíveis interferências.

2.6. Estudos Celulares
2.6.1. Cultura Celular
Para avaliar a fotocitotoxicidade e a captação celular da nanopartícula carregada com AM, foi utilizada uma linhagem celular humana (carcinoma de células escamosas) A431. As células foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de solução antibiótica/antimicótica, a 37 °C com 5% de CO₂, de acordo com as recomendações da American Type Culture Collection (ATCC).

2.6.2. Fotocitotoxicidade e Citotoxicidade
O ensaio de fotocitotoxicidade foi avaliado pelo método MTT. As células da suspensão foram semeadas em placas de 96 poços (1 × 10⁴ células/poço) e deixadas para fixação por 24 h a 37 °C. Após isso, foram lavadas com solução salina e os tratamentos (solução de azul de metileno, nanopartícula de azul de metileno e nanopartícula branca) foram aplicados nas concentrações de 0,05; 0,5; 5; 12,5; 25 e 50 µM. Após a aplicação do tratamento, as placas foram incubadas por 5 min ou 2 h (tempos de pré-irradiação) em uma incubadora a 37 °C e, em seguida, as células foram expostas à iluminação por laser vermelho (630 nm, 6,7 J/cm², 0,001841 W/cm²) por 60 min. Após 1 h, os tratamentos foram removidos, os poços lavados, meio DMEM incompleto foi aplicado e as placas foram novamente incubadas por 24 h a 37 °C. Subsequentemente, 170 µL de meio de cultura incompleto foram aplicados juntamente com 30 µL de solução de MTT (250 µg/mL), seguidos de incubação (4 h a 37 °C). Posteriormente, após o descarte da solução de meio de cultura com MTT, dimetilsulfóxido (DMSO) foi aplicado aos poços para dissolver os cristais de formazan. A absorbância foi lida a 562 nm e a concentração capaz de matar 50% das células (IC50) foi obtida através das curvas de concentração-efeito, considerando a densidade óptica do controle negativo (células não tratadas) como 100%. Finalmente, a citotoxicidade no escuro foi avaliada da mesma forma para os grupos de tratamento sem irradiação luminosa. A temperatura foi monitorada durante o período de irradiação.

2.6.3. Captação Celular
Fotomicrografias foram registradas por microscópio confocal de fluorescência (LSM 700, Zeiss) para avaliar a captação de nanopartículas pela linhagem celular A431. A formulação de nanopartículas foi preparada sem AM e com o marcador fluorescente mitocondrial, Rodamina 123 (40 µg/mL). Assim, para estudos confocais, 5 × 10⁵ células/poço foram aplicadas em lamínulas estéreis de 22 mm/22 mm colocadas em microplacas de 6 poços e incubadas por 24 h sob as mesmas condições mencionadas acima. Após a adesão celular, protegidos da luz, 1900 μL de meio incompleto foram inoculados e 100 μL de amostras de nanopartículas foram adicionados para incubação por 1, 3, 6 ou 24 h a 37 °C com uma atmosfera de 5% de CO2.

Após a incubação, os poços foram lavados três vezes com solução salina a 0,9% (1 mL) e, em seguida, as células foram fixadas com paraformaldeído a 1% (2 mL) por 15 min. Após esse tempo, foram realizadas três lavagens com solução salina a 0,9% para posterior adição de 900 μL de solução de DAPI (0,3 μg/mL) para coloração do núcleo celular. As lamínulas foram lavadas novamente e, a fim de preservar a fluorescência, foram colocadas sobre uma lâmina histológica contendo meio de montagem Fluoromount®. Utilizamos λex = 488 nm e λem = 575 nm para a Rodamina 123 e λex = 340 nm e λem = 488 nm para o DAPI. As imagens foram processadas usando o software Zeiss ZEN Blue Edition 3.4.

2.7. Estudos de Penetração Cutânea In Vitro
2.7.1. Quantificação de AM em Pele de Orelha Suína por Espectrofotometria UV-Vis
Para quantificar o AM nas camadas da pele, foi empregado um método desenvolvido anteriormente com modificações. Pedaços de pele de orelha suína obtidos em um matadouro local (Fortaleza, Ceará), com uma área de 0,95 cm², foram utilizados para desenvolver uma matriz de calibração em triplicata. Nos estudos de recuperação, a pele foi contaminada com concentrações conhecidas de AM e, após a secagem da solução, a extração foi realizada utilizando metanol. Nesse processo, as amostras foram submetidas a mistura em vórtex por 2 min e, em seguida, colocadas em um ultraturrax por 3 min a 7000 rpm. Para potencializar a extração, as amostras foram colocadas em banho de ultrassom por 45 min e centrifugadas a 4000 rpm por 20 min. Por fim, foram filtradas com um filtro de PTFE de 0,45 µm. Para a quantificação das amostras, utilizou-se espectrofotometria UV-Vis com leitura na faixa de 663 nm. A fim de analisar a interferência dos componentes da pele no método espectrofotométrico, foi realizado um varredura espectral seguindo a mesma metodologia sem a aplicação da solução-mãe de azul de metileno. O cálculo de recuperação foi realizado utilizando a absorbância do AM extraído da pele em relação à absorbância do AM em metanol. Os resultados foram apresentados em porcentagem de recuperação.

2.7.2. Quantificação do AM nas Camadas da Pele e no Compartimento Receptor
A pele de orelhas suínas foi cuidadosamente dissecada com um bisturi e o tecido adiposo subcutâneo foi removido com tesouras cirúrgicas. Cortes de pele com quaisquer feridas, sangramentos, doenças de pele, cortes ou orifícios na superfície foram descartados. Uma área de aproximadamente 0,95 cm² foi cortada e montada no aparelho de célula de Franz (n = 5) com o estrato córneo voltado para o compartimento doador. A resistividade da pele foi calculada de acordo com o tópico 2.6.3.1 e apenas amostras com resistividade inicial superior a 35 kΩ cm² foram utilizadas. A solução de AM e a nanopartícula de AM (80 μg/mL) foram adicionadas ao compartimento doador (1 mL) e o compartimento receptor foi preenchido com 15 mL de PBS (pH 7,4). As células de Franz montadas foram deixadas sob agitação magnética a 150 rpm por 16 h a 32 °C.

Ao final do experimento, o aparelho foi desmontado e as peles foram lavadas superficialmente com água destilada e secas. Para a extração do AM no estrato córneo, utilizou-se o protocolo de tape stripping com fita adesiva Scotch Book Tape n° 845, 3 M. Com isso, 15 pedaços de fita adesiva foram aderidos ao estrato córneo e removidos imediatamente após, descartando-se sempre a primeira fita, enquanto as outras foram colocadas em um tubo falcon contendo 5 mL de metanol. Para a extração do AM na epiderme viável e na derme, utilizou-se a pele remanescente do tape stripping, cortada em pequenos pedaços e colocada em um tubo falcon contendo 5 mL de metanol. Por fim, o PBS presente no compartimento receptor também foi coletado.
Para a quantificação, todas as amostras foram agitadas em vórtex por 2 min. As amostras de epiderme viável + derme seguiram etapas adicionais em ultraturrax por 3 min a 7000 rpm, banho de ultrassom por 45 min e centrifugação a 4000 rpm por 20 min, nessa ordem, respectivamente. Por fim, todas as amostras foram filtradas através de um filtro de PTFE de 0,45 µm e armazenadas para serem quantificadas conforme descrito no tópico 2.6.1.

2.7.3. Pré-tratamento da Pele com Sonoforese
Medições da Condutividade Elétrica da Pele
A integridade da pele e o efeito do pré-tratamento com ultrassom foram avaliados medindo a resistividade da pele antes e depois da sonoforese. Para isso, eletrodos de disco de Ag/AgCl de 4,0 mm foram introduzidos nos compartimentos doador e receptor das células de difusão de Franz, preenchidos com PBS (pH 7,4). Adotou-se uma potência de 100 mV (RMS) e frequência de 10 Hz utilizando um equipamento gerador de sinal e foi aplicada uma corrente alternada. A intensidade da corrente elétrica capaz de atravessar a pele foi medida utilizando um multímetro. A resistividade da pele foi calculada usando a lei de Ohm multiplicada pela área de pele exposta (0,95 cm²), visando valores em torno de 1 kΩ cm² após a sonoforese.

Aplicação de Ultrassom
Os experimentos foram realizados em células de Franz montadas com pele de orelha suína, conforme descrito acima. O compartimento doador foi preenchido com 2 mL de PBS contendo 1% de SDS como meio de acoplamento, enquanto o compartimento receptor foi preenchido com 15 mL de PBS (pH 7,4). O ultrassom (QSonica Sonicators Q500, operando a uma frequência de 20 kHz equipado com uma sonda de 13 mm de diâmetro) foi posicionado no compartimento doador, a 5 mm da superfície da pele. O tempo de exposição foi de 1 min, com pulso de 5 s "ligado" e 5 s "desligado" e amplitude de 20%, até que a resistividade da pele de 1 kΩ cm² fosse atingida. Esta etapa foi monitorada a fim de evitar um aumento abrupto na temperatura. Após a sonicação, a resistividade da pele foi medida, e o conteúdo dos compartimentos receptor e doador foi substituído para continuar a avaliação da penetração do MB nas camadas da pele após a aplicação da sonoforese.

2.8. Análise Estatística
A liberação in vitro foi analisada pelo teste ANOVA de duas vias com pós-teste de Bonferroni no software GraphPad Prism. Os resultados in vitro de citotoxicidade e penetração cutânea foram analisados por ANOVA de uma via, com teste post hoc de Bonferroni no mesmo software. Os dados foram estimados como média ± desvio padrão e as diferenças estatísticas (* p < 0,05) das comparações de médias são relatadas.

Resultados e Discussão
3.1. Planejamento Fatorial e Caracterização Físico-Química das Nanopartículas
A entrega de substâncias hidrofílicas, como o azul de metileno (MB), é desafiadora, especialmente quando focada na aplicação tópica, pois a natureza hidrofílica impede a chegada dos fármacos às camadas mais profundas da pele. Além disso, fármacos hidrofílicos também são difíceis de encapsular. Nesse contexto, nanopartículas poliméricas têm sido amplamente utilizadas para a encapsulação de fármacos, com diversas vantagens, incluindo proteção contra degradação, liberação sustentada e melhor entrega cutânea. A dupla emulsão e evaporação do solvente é um método amplamente utilizado para encapsular moléculas hidrofílicas. É evidente, no entanto, que vários fatores podem afetar essa encapsulação, incluindo a proporção entre as fases orgânica e aquosa, o peso molecular e a quantidade de polímero e o uso de surfactantes. Neste trabalho, o Delineamento de Box–Behnken (BBD) visou obter uma formulação otimizada, estabelecendo relações entre as respostas e um conjunto de parâmetros que podem interferir direta ou indiretamente com um número mínimo de ensaios experimentais.

A Tabela 1 apresenta os resultados das interações entre as variáveis independentes: proporção fase orgânica/fase aquosa da 1ª emulsificação (X1), porcentagem de álcool polivinílico (PVA) da 1ª emulsificação (X2) e quantidade de policaprolactona (X3) e os impactos nas variáveis dependentes: tamanho de partícula (Y1), índice de polidispersão (Y2) e eficiência de encapsulação (Y3), além dos resultados de potencial zeta. Os valores mínimos e máximos para Y1, Y2, Y3 compreendem entre 160–278,06 nm, 0,097–0,3323 e 94,37–99,44%, respectivamente.

Para uma melhor compreensão da influência das variáveis independentes e para estudar os efeitos de cada fator e sua interação nas respostas consideradas, o presente estudo utilizou uma regressão múltipla que gerou uma equação polinomial de segunda ordem em um modelo quadrático completo e gráficos de superfície de resposta, conforme mostrado nas Equações (8)–(10) e na Figura 1.

As equações obtidas nos permitem tirar conclusões através da magnitude dos coeficientes e de seu sinal matemático. Um sinal positivo significa um efeito sinérgico, um sinal negativo significa um efeito antagônico. X1, X2 e X3 representam os resultados obtidos para a alteração de uma variável por vez. X1X2, X1X3, X2X3, X1², X2² e X3² representam suas interações simultaneamente. Para o tamanho de partícula, a interação entre os termos X1X2, X1X3, X1², X2² e X3² parece denotar um efeito favorável na obtenção da resposta desejada. Com base nos valores do coeficiente de correlação (R²), houve um ajuste satisfatório da regressão ao modelo de resposta de tamanho de partícula com um valor de 0,8890.
A partir da Equação (8) e da Figura 1, é evidente que, ao aumentar a razão entre a fase orgânica/fase aquosa juntamente com a porcentagem de PVA, o tamanho das nanopartículas diminui. Isso pode ser explicado principalmente pelo fato de que a adição de surfactantes em emulsões desempenha um papel fundamental em sua estabilidade, aumentando seu revestimento superficial, formando uma película protetora ao redor das gotículas, levando à formação de tamanhos menores e impedindo sua coalescência. Na etapa de evaporação do solvente, essas características tornam-se importantes, pois o volume da emulsão pode diminuir, aumentando consequentemente sua viscosidade, deixando o tamanho final da gotícula maior, resultando em uma NP maior. Utilizando a mesma metodologia de síntese, Iqbal et al., 2015 encontraram comportamentos semelhantes com relação ao PVA ao desenvolver nanopartículas de PCL. Em seu estudo, observou-se que o tamanho das nanopartículas diminuiu ao aumentar a concentração de PVA de 0,05 para 0,2%. Além disso, um maior volume de solvente orgânico para dissolver o polímero evita a formação de uma emulsão primária viscosa, resultando em uma redução mais eficaz no tamanho da partícula durante a segunda etapa do processo de emulsificação.

O índice de polidispersão (PDI) indica a homogeneidade dos grupos de tamanho das nanopartículas. Um valor de PDI próximo de 0 significa que o sistema possui grupos que indicam uma distribuição de tamanho estreita, enquanto próximo de 1, uma ampla distribuição de tamanho. Na Equação (9), nota-se que o termo isolado X3 e sua interação X2X3, além da interação entre X1X2, X1², X2², favorecem a resposta, embora os termos isolados X1 e X2 sejam antagônicos. O modelo matemático apresentou um ajuste satisfatório, mostrando R² de 0,9029.

Os resultados apresentados na Figura 1 revelam que, assim como para o tamanho da partícula, a razão entre a fase orgânica/fase aquosa e sua relação com o PVA parecem ter impactos positivos para a redução do PDI. Da mesma forma, o aumento da concentração de surfactante pode levar à formação de nanopartículas de tamanho uniforme, resultando em faixas de PDI mais estreitas. Neste estudo, foi alcançado um PDI médio de 0,18, o que está em concordância com Shaikh, Kala e Nivsarkar, que encontraram uma variação de 0,018 a 0,192 ao otimizar nanopartículas de PLGA carregadas com Doxorrubicina.

Com relação ao aprisionamento de MB nas NPs, os resultados apresentados na Tabela 1 mostraram que a eficiência de encapsulamento foi alta, com média de 96,61%. A Equação polinomial (10) mostra o efeito das variáveis independentes, onde se observa que o termo isolado X1 e sua interação com X3, além de X2² e X3², têm efeitos negativos na resposta. O modelo matemático obtido apresentou um ajuste regular com R² de 0,6305.
De acordo com a Figura 1, sugere-se uma relação entre a porcentagem de PVA e a quantidade de PCL, onde valores de 0,8 a 0,9% de surfactante e 50 a 60 mg de polímero resultam em maior encapsulamento do fármaco. Um dos fatores que pode explicar o alto encapsulamento é a estrutura da nanopartícula, com uma provável formação de nanocápsulas no processo de síntese. Com uma estrutura núcleo-casca definida, as propriedades de encapsulamento do fármaco dentro do núcleo são aumentadas. O azul de metileno, por sua vez, solubilizado na fase aquosa interna, foi revestido pela camada polimérica, que protege o fármaco de fatores mecânicos, físicos e químicos que poderiam degradá-lo. Além disso, estudos afirmam que o método de emulsificação-evaporação com solvente duplo possui uma eficiência média de encapsulamento de fármaco de 65% a 75%, o que poderia corroborar este estudo. Finalmente, um estudo anterior obteve 56,2 ± 3,2% de encapsulamento de AM em nanopartículas de fosfato de cálcio com aplicação em terapia fotodinâmica.

O potencial zeta é um parâmetro que fornece informações sobre o potencial eletrostático de partículas em solução e descreve sua estabilidade em um sistema coloidal. Partículas com valores superiores a +30 mV/−30 mV são consideradas estáveis. No entanto, esses valores estão sujeitos a alterações dependendo das características físico-químicas dos componentes utilizados na preparação das NPs, além do pH, concentração, força iônica da solução e a natureza dos ligantes de superfície. Neste estudo, as nanopartículas de AM obtiveram valores negativos em todas as medições, com uma média de −4,73 mV, principalmente devido à presença de grupos carboxila terminais existentes no PCL. Essa tendência negativa do potencial zeta ao utilizar PCL já foi relatada em estudos como o conduzido por Badri et al., no qual os valores encontrados variaram de −6,51 mV a −7,0 mV. Neste estudo, os autores também observaram uma relação inversamente proporcional entre a concentração de PVA e o potencial zeta, na qual houve uma diminuição de 7,38 mV para 4,45 mV ao aumentar a concentração de surfactante de 2,5 mg/ml para 20,0 mg/ml, o que pode explicar por que o potencial zeta da nanopartícula de AM não excede valores superiores a −30 mV. Embora o potencial zeta forneça pistas sobre a estabilidade do coloide, ele não é o único fator responsável. A estabilidade do sistema depende das forças atrativas de van der Waals e das forças repulsivas eletrostáticas; o potencial zeta fornece apenas a última mencionada, sendo comum encontrar coloides estáveis com valores baixos.
A formulação otimizada de NPs carregadas com MB foi prevista utilizando a abordagem de desejabilidade no software. O objetivo foi formular NPs com tamanho de partícula e PDI mínimos, juntamente com a máxima EE%. A Tabela 2 mostra os valores otimizados reais dos níveis X1, X2 e X3, os resultados estimados e obtidos para cada resposta e os respectivos erros relativos. O resultado para a desejabilidade foi de 0,8115, o que indica a adequação dos modelos matemáticos aos dados experimentais, uma vez que a escala varia entre d = 0 (para um valor de resposta inaceitável) e d = 1 (para um valor completamente desejável). Em geral, os valores medidos obtidos foram satisfatórios em relação aos valores calculados a partir do delineamento de Box–Behnken. O PDI (Y2) apresentou o ajuste mais adequado, com um erro relativo de 2,56%, enquanto o tamanho de partícula (Y1) conseguiu obter valores ainda melhores do que o esperado. Assim, a formulação mostrou-se adequada para estudos futuros.

Morfologia e Distribuição de Tamanho de Partícula das Nanopartículas
As NPs foram investigadas quanto à forma, morfologia de superfície e tamanho por MEV. De acordo com a Figura 2, a forma esférica foi observada como a morfologia predominante e o tamanho de partícula foi inferior a 100 nm. Observou-se, no entanto, que os valores de tamanho encontrados no MEV são menores do que aqueles relatados no gráfico de distribuição de partículas, o que pode ocorrer devido à agregação das partículas na análise de DLS. Além disso, espera-se que o tamanho obtido por DLS seja maior em comparação com o MEV, uma vez que o primeiro fornece o diâmetro hidrodinâmico e o segundo o tamanho real. Para a administração tópica de fármacos, é importante que a NP seja de tamanho reduzido, promovendo uma maior área de superfície em contato com a pele, facilitando a penetração cutânea de agentes terapêuticos. Também foi possível monitorar a formação da emulsão dupla (A/O/A) na etapa anterior à evaporação do solvente. Por fim, pode-se afirmar que a formação de nanopartículas poliméricas foi bem-sucedida.

3.2. Estudo de Liberação de Fármaco In Vitro
O estudo de liberação in vitro teve como objetivo comparar os perfis de liberação da solução aquosa de azul de metileno e da formulação otimizada da nanopartícula. O mecanismo de liberação é caracterizado por um burst inicial, ou seja, uma liberação rápida do fármaco no meio, tanto para o grupo da solução quanto para a nanopartícula. Embora estudos de liberação in vitro com nanopartículas de azul de metileno sejam escassos na literatura, Gutiérrez-Valenzuela et al., trabalhando com várias concentrações de AM, já demonstraram que o perfil de liberação deste fármaco tende a ser mais rápido. Como mostrado na Figura 3A, na primeira hora, observa-se uma liberação média de 85,88% para a solução, indicando, assim, que a liberação de AM pela solução é quase imediata, devido à natureza hidrofílica do fármaco. A nanopartícula é capaz de aprisionar o fármaco de forma um pouco mais eficaz, com valores de liberação de fármaco de 57,67%. Com base na hidrofilicidade do AM e em seu tamanho reduzido, espera-se que ele possa “escapar” da nanopartícula e se acumular na fase aquosa da formulação, aumentando sua liberação por burst inicial. Outra hipótese seria a ocorrência de nanoencapsulamento próximo à superfície das NPs. Após isso, entre o intervalo de 8 a 24 h, observou-se um platô, indicando possivelmente que todo o AM foi liberado, para ambos os grupos. Isso pode ser explicado pela difusão do AM através do polímero que compõe a nanopartícula. Para a solução, observou-se um aumento nos valores da porcentagem de AM liberado em função do tempo, com um leve decaimento após o ponto de 5 h. Foi possível observar uma diferença estatisticamente significativa entre a solução e a nanopartícula nos tempos de 1 h e 5 h (p < 0,05), enfatizando, assim, que embora a nanopartícula também apresente uma liberação pronunciada, ela ainda é capaz de modular e prolongar a meia-vida do fármaco e potencialmente reduzir seus efeitos colaterais, especialmente nas primeiras horas.

Os parâmetros e o gráfico do estudo de cinética de liberação são apresentados na Tabela 3 e na Figura 3B. Dada a relação obtida com base nos valores percentuais de liberação de AM em função do tempo, o modelo de primeira ordem apresentou o melhor coeficiente de correlação, com R² = 0,97. Este modelo refere-se a um sistema cuja taxa de liberação é apenas uma função da concentração remanescente do fármaco, como agentes ativos solúveis incorporados em uma matriz porosa, na qual a quantidade de fármaco liberada é proporcional à quantidade de fármaco remanescente na matriz, o que dialoga diretamente com o nanocarreador polimérico desenvolvido neste estudo e a natureza hidrofílica do AM.
Estudos anteriores de encapsulamento de AZ em nanopartículas de PLGA já relataram esse perfil de liberação rápida, como Cannavà et al., que obtiveram a liberação total de AZ em 24 h em nanopartículas não associadas à ciclodextrina anfifílica não iônica (SC6OH). Trabalhando com o mesmo polímero e combinando técnicas de emulsificação simples e dupla, Gutiérrez-Valenzuela et al. obtiveram liberação acima de 80% de AZ nas primeiras 4 h para todas as formulações testadas.

3.3. Geração de Espécies Reativas de Oxigênio
A geração de espécies reativas de oxigênio pelo azul de metileno foi estudada pelo decaimento da absorbância do DPBF. Em ambientes ricos em EROs, particularmente na presença de oxigênio singleto, o DPBF pode reagir quantitativamente com 1O2 para formar o-dibenzoilbenzeno, perdendo assim sua capacidade de absorver ou emitir luz visível. O azul de metileno é amplamente utilizado na literatura como um fotossensibilizador padrão para calcular o rendimento quântico de outras substâncias, já que sua produção de EROs é suficientemente conhecida. Ainda assim, na terapia fotodinâmica, a substância a ser utilizada como fotossensibilizador deve gerar EROs de maneira satisfatória, mas não de forma exacerbada que possa danificar células saudáveis. Aqui, um perfil de decaimento da absorbância do DPBF semelhante foi observado entre os grupos de solução de AZ e de nanopartículas, nos primeiros 3 min. A velocidade de produção de EROs pela nanopartícula neste período pode ser explicada pelo AZ não encapsulado. Após esse tempo, a nanopartícula mostra uma influência menor no decaimento da absorbância, o que pode inferir uma geração de EROs mais gradual e menos pronunciada do que a solução, um resultado esperado, uma vez que o AZ está encapsulado em uma matriz polimérica. No entanto, deve-se notar que o encapsulamento não comprometeu a geração de EROs. Ao final de 30 min de irradiação, o DPBF apresentou uma absorbância de cerca de 48,67% em comparação com a absorbância inicial para a nanopartícula e 26,31% para a solução. Curiosamente, para obter a curva de decaimento do DPBF com a solução, foi necessário concentrá-la cerca de 3 vezes, com uma concentração final de 240 µg/mL, contrastando com a concentração de 80 µg/mL da nanopartícula. Essa descoberta pode revelar um maior potencial da nanopartícula, que, além da geração controlada de EROs, requer uma quantidade menor de AZ para atuar de forma semelhante à solução. Seong e Jin (2015), trabalhando com AZ encapsulado em nanopartículas de fosfato de cálcio, obtiveram resultados semelhantes, onde a nanopartícula obteve uma geração de EROs mais controlada em comparação com a solução quando dispersa em N,N-dimetilformamida. Em outro estudo, nanocáscaras de ouro peguiladas contendo azul de metileno exibiram uma produção de EROs significativamente maior do que a solução de AZ.

3.4. Fotocitotoxicidade e Citotoxicidade In Vitro
A TFD é uma técnica menos invasiva para a terapia do câncer e pode ser aprimorada se combinada com a proteção do agente fotossensibilizante por meio da nanoencapsulação. A Figura 4 e a Figura 5 demonstram a respectiva viabilidade celular de cada formulação (MB em solução, MB em nanopartícula e nanopartícula em branco) em suas respectivas concentrações e exposição ou não à luz em células A431. O efeito fototérmico relacionado à irradiação de luz foi considerado desprezível, uma vez que a temperatura durante a aplicação da TFD não se alterou.

Neste estudo, três aspectos principais podem ser discutidos: a contribuição da encapsulação, o aumento no tempo de incubação e a influência da luz no aumento da citotoxicidade do MB. Primeiramente, nota-se que a citotoxicidade é dependente da concentração para todas as situações testadas, e as diferenças estatisticamente significativas entre a solução e a nanopartícula são evidenciadas principalmente nas concentrações intermediárias de 0,5; 5; 12,5; 25 µM. No tempo de incubação de 5 min, observa-se um comportamento semelhante de ambos os grupos testados sem a aplicação de luz, com valores de viabilidade de 104,21; 101,94; 75,56; 66,42% e 102,98; 85,40; 76,48; 67,50% para MB em solução e MB em nanopartícula, respectivamente, nas concentrações supracitadas. Na literatura, é relatado que o fotossensibilizador não deve ser tóxico no escuro; consequentemente, podemos inferir que a nanoencapsulação não perturbou os mecanismos de toxicidade do MB nem os amplificou.

A exposição à luz, por outro lado, aumentou a citotoxicidade dos grupos, intensificando especialmente o MB em solução, atingindo valores de 90,87; 47,00; 46,96; 40,70% contra 82,21; 60,77; 54,18; 51,76% da nanopartícula. Ainda assim, ao comparar a influência da luz apenas no grupo de nanopartículas, foi encontrada uma diferença estatisticamente significativa em todas as concentrações intermediárias, sendo a mais forte em 5 µM, onde a viabilidade celular caiu de 85,40 para 60,77% (Figura 4). Embora o efeito da luz já fosse esperado como gatilho para a produção de espécies reativas de oxigênio, o desempenho negativo da nanopartícula em relação à solução pode ser explicado pelo seu tempo reduzido de contato com a célula. Para avaliar essa hipótese, os testes foram repetidos simulando as condições anteriores, alterando apenas o tempo de incubação dos tratamentos para 2 h.
A Figura 5 mostra os resultados com um tempo de incubação de 2 h. Observa-se a manutenção da resposta dose-dependente relatada anteriormente, juntamente com o aumento significativo na morte celular pela exposição à luz em todas as concentrações. No entanto, neste período de incubação, um fato relevante a ser discutido é a influência menos evidente da luz na fototoxicidade da nanopartícula. Sabe-se que, quando encapsulado, o AM pode ser entregue de forma mais eficiente ao seu alvo, sem sofrer degradação ou perder sua atividade fotodinâmica como ocorre em seu estado livre, aumentando seus efeitos fotocitotóxicos. Além disso, fármacos fotossensibilizadores (PS) apresentam certa toxicidade no escuro, e esta se intensifica com o aumento do tempo de incubação. Este conjunto de fatores pode nos ajudar a compreender o comportamento e a influência da aplicação de luz juntamente com a modulação do tempo de incubação. Isso pode ser demonstrado numericamente na Tabela 4, quando ao comparar o tempo de incubação de 5 min e 2 h, a CI50 sofre uma queda brusca de aproximadamente sete vezes com a aplicação de luz para o primeiro, enquanto no último essa queda é de apenas duas vezes. Por fim, a geração de espécies reativas de oxigênio deve ser o principal mecanismo de citotoxicidade do AM. Como demonstrado no tópico 3.3, a nanopartícula gera ERO de maneira controlada e prolongada, o que corrobora o resultado de maior citotoxicidade da nanopartícula quando estendemos o tempo de incubação para 2 h.
O resultado está em concordância com um estudo realizado por Gontijo et al., que demonstrou maior citotoxicidade em concentrações mais elevadas de AM, utilizando a mesma linhagem celular. No entanto, neste caso, as nanopartículas mostraram-se muito mais citotóxicas em todas as concentrações, enquanto houve uma piora no desempenho da solução, o que foi estatisticamente evidenciado nas concentrações de 0,5 e 5 µM, onde a viabilidade celular atingiu valores de 95,18 e 73,44% para a solução e 62,32 e 56,09% para a nanopartícula, respectivamente. O pior desempenho da solução pode ser explicado por uma possível degradação e redução enzimática no ambiente biológico, tornando a atividade fotodinâmica do AM livre insignificante. Esta questão já foi abordada em um estudo onde nanopartículas de fosfato de cálcio foram desenvolvidas para proteção enzimática do AM (CaP-5AM). Nesse estudo, os comportamentos de redução do AM livre e do CaP-5AM foram confirmados pelo monitoramento da diminuição da absorção em 663 nm. Enquanto, na solução de AM livre, houve uma diminuição de aproximadamente 100% na intensidade de absorção, o CaP-5AM apresentou uma diminuição mínima ao longo de meia hora. Além disso, nota-se também que o aumento no tempo de incubação favorece a nanopartícula, pois isso estimula a captação celular pela célula, fazendo com que o AM atue de forma mais eficaz no citoplasma. Assim, nota-se a importância do encapsulamento na proteção da atividade fotodinâmica do AM. Por fim, as nanopartículas em branco foram utilizadas como controle para avaliar a citotoxicidade da nanoestrutura e grupos de células sem qualquer tipo de tratamento foram utilizados como controle de toxicidade da luz. Em ambos os casos, a influência na viabilidade celular não foi de grande magnitude, com valores variando de 93,03 a 77,46%.

A partir da quantificação da viabilidade celular, foi possível calcular a CI50 para os diferentes grupos (Tabela 4). A nanopartícula com irradiação de luz destaca-se com a melhor CI50 no período de incubação de 2 h, sendo uma possível escolha para potencializar a TFD e diminuir seus efeitos colaterais em tratamentos com longos tempos de aplicação.

3.5. Captação Celular
Nanopartículas marcadas com Rodamina 123 foram incubadas com células A431 nos tempos de 1, 3, 6 e 24 h. Os resultados da microscopia confocal (Figura 6) mostraram aumento da captação celular ao longo do tempo, com seu pico entre 3 e 6 h. Este fato ajuda a explicar o aumento na foto/citotoxicidade observado anteriormente, quando o tempo de incubação das nanopartículas foi aumentado para 2 h. Próximo a 24 h, pode-se observar uma diminuição na fluorescência, o que pode indicar a degradação da nanopartícula pela própria célula. Além disso, pontos fluorescentes acumulam-se principalmente no citoplasma celular, informação que está em linha com diversos estudos na literatura nos quais a grande maioria das nanopartículas com aplicação em terapia contra o câncer acumula-se no citoplasma.

3.6. Estudos de Penetração Cutânea In Vitro
Primeiramente, para quantificar o azul de metileno (AM) na pele, utilizou-se espectrofotometria UV-vis. Foi realizado um varredura espectral de amostras de pele com e sem aplicação de AM extraído em metanol para verificar se os componentes da pele interferiam na quantificação. Os resultados demonstraram que, na região entre 570 e 670 nm, não há interferência da pele que pudesse prejudicar a quantificação do AM, uma vez que proteínas e outros componentes teciduais apresentam seu pico de absorbância entre 200 e 300 nm. Além disso, a fim de verificar a sensibilidade da técnica de quantificação, sua porcentagem de recuperação foi medida por meio da contaminação da pele com concentrações conhecidas do fármaco. Os resultados mostraram uma média de 96,92%.

Sabe-se que as formulações tópicas são limitadas pela baixa permeabilidade cutânea. Especificamente, o estrato córneo (EC), a camada mais externa da pele, atua como uma barreira ao ambiente externo. Nesse contexto, a medição da resistividade é um parâmetro importante para inferir a penetração de substâncias na pele, uma vez que valores baixos significam alguma alteração estrutural, facilitando esse processo. Aqui, os valores de resistividade obtidos sem a aplicação de sonoforese estão próximos de 85,94 kΩ cm², o que indica a preservação da estrutura da pele. Ao utilizar o ultrassom como pré-tratamento, a resistividade caiu para aproximadamente 1 kΩ cm², indicando defeitos ultraestruturais nas regiões lipídicas do estrato córneo.

A Figura 7 mostra a quantificação de AM no estrato córneo e na epiderme viável após 16h de estudo com penetração passiva e aplicação de sonoforese. A quantidade de AM permeada na fase receptora ficou abaixo do limite de quantificação do método, sugerindo um transporte transdérmico muito baixo. Na penetração passiva do AM, há uma superioridade da solução em relação à nanopartícula, tanto no estrato córneo quanto na epiderme viável, com valores de 4,10 ± 0,87, 9,81 ± 1,24, 2,46 ± 0,59 e 5,27 ± 1,29 μg/cm², respectivamente. Sabe-se que a natureza hidrofílica deste fármaco não favorece o transporte através do EC lipídico, o que acaba dificultando a penetração cutânea. Além disso, o uso de nanopartículas poliméricas tópicas é menos difundido do que sistemas lipídicos como lipossomas, sendo improvável a penetração de nanopartículas poliméricas intactas através da barreira do estrato córneo.
No geral, a sonoforese é um método físico conhecido por melhorar a administração de fármacos tanto tópica quanto transdermicamente. No entanto, os mecanismos promovidos pela energia ultrassônica ainda são discutidos na literatura. A cavitação, os efeitos térmicos e os mecanismos relacionados à convecção parecem ser a forma mais comum de aumentar a penetração cutânea. Aqui, ao utilizá-la como pré-tratamento, a quantidade de azul de metileno (MB) atingiu níveis mais elevados de penetração cutânea, apresentando valores de 9,85 ± 2,60 e 24,30 ± 2,88 para a solução, e 12,71 ± 2,55 e 23,80 ± 4,77 μg/cm² para a nanopartícula, no estrato córneo e na epiderme viável, respectivamente. Com relação às nanopartículas, esse aumento foi ainda mais significativo quando comparado à penetração passiva. Por exemplo, para o grupo da solução, a penetração cutânea do MB foi, respectivamente, 9,81 ± 1,24 e 24,30 ± 2,88 μg/cm² na epiderme viável antes e após a aplicação da sonoforese. Ao comparar diretamente esses valores, obtém-se um aumento na penetração cutânea de aproximadamente 2,47 vezes. A nanopartícula, por outro lado, levou a uma penetração de MB de 5,27 ± 1,29 e 23,80 ± 4,77 μg/cm², respectivamente, na epiderme viável antes e após a aplicação da sonoforese, o que significa um aumento de 4,51 vezes, o que se torna interessante, pois é nessa camada que podemos encontrar tumores de carcinoma espinocelular (CEC). Se estendermos a análise ao estrato córneo, veremos uma diferença ainda maior de 2,4 contra 5,16 vezes para os mesmos grupos. Além disso, uma alternativa para melhorar ainda mais o desempenho da nanopartícula seria sua incorporação em uma matriz de gel, aumentando assim o tempo de contato entre a formulação e a pele. A penetração cutânea da nanopartícula é semelhante à da solução quando associada à sonoforese, como mostrado na Figura 7B, sem diferença estatística significativa.

Aqui, a combinação de sonoforese e nanotecnologia provou ser eficiente. Enquanto a primeira causa alterações na estrutura cutânea, as NPs, devido à sua maior área superficial, acumulam-se nos apêndices cutâneos, como os folículos pilosos, que podem contornar a formidável barreira do estrato córneo. Atualmente, o MB tem obtido melhores resultados de penetração quando associado a nanocarreadores, como no estudo de Garcia et al., que, ao desenvolver cristais líquidos e comparar as fases cristalinas lamelar e hexagonal, obteve maior entrega cutânea de MB com a fase lamelar, atingindo valores de 9,79 ± 1,22 a 15,70 ± 1,54 μg/cm² em 6 h. Trabalhando com outro fotossensibilizador conhecido, o uso da sonoforese aumentou a penetração dérmica da ftalocianina de zinco, resultando em redução da viabilidade de células de melanoma.

Conclusões
A estratégia de delineamento fatorial de Box–Behnken provou ser uma estratégia excelente e economicamente viável para a obtenção de formulações otimizadas. Neste trabalho, desenvolvemos e otimizamos com sucesso nanopartículas de PCL contendo azul de metileno, que alcançaram uma alta eficiência de encapsulamento, baixo índice de polidispersão e um tamanho de partícula ideal, os quais são essenciais para uma melhor penetração cutânea. Os resultados obtidos na microscopia eletrônica de varredura confirmaram a formação de nanoestruturas esféricas. A liberação in vitro da nanopartícula demonstrou um perfil de liberação inicial (burst) compatível com o modelo de primeira ordem, o que pode ser uma característica positiva para o tratamento simultâneo de TFD + sonoforese. Em relação à avaliação da citotoxicidade e sua captação celular, os resultados alcançados foram promissores, onde a morte celular de A431 foi maior ao combinar a formulação com irradiação de luz LED vermelha e os efeitos puderam ser potencializados aumentando o tempo de incubação. Também foi demonstrado que o possível mecanismo de ação da nanopartícula de AM é através da geração de espécies de oxigênio, de forma controlada e gradual. Além disso, a captação celular da nanopartícula aumentou com o tempo e foi maior entre 3 e 6 h. Mostramos que a combinação entre nanopartícula e sonoforese aumentou a penetração cutânea do AM e, ainda assim, nenhuma quantidade significativa foi encontrada no compartimento receptor, indicando que a formulação destina-se apenas à aplicação tópica. Portanto, esperamos que as nanopartículas de AM sejam igualmente ou mais eficientes no tratamento do carcinoma espinocelular, o que será investigado in vivo em estudos futuros.

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Contribuições dos autores
Conceituação, J.O.E., R.P. e T.S.L.; Metodologia, T.S.L., M.S.S.d.O. e A.V.F.R.; Análise formal, T.S.L., J.O.E. e R.P.; Recursos, J.O.E.; Redação — rascunho original, T.S.L. e A.V.F.R.; Redação — revisão e edição, J.O.E. e R.P; Supervisão, J.O.E.; Administração do projeto, J.O.E.; Aquisição de financiamento, J.O.E. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Não aplicável.

Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados apresentados neste estudo estão disponíveis mediante solicitação ao autor correspondente.

Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências
Câncer de pele
A aplicação combinada da terapia fotodinâmica e nanotecnologia no tratamento do câncer de pele: Uma revisão
Nanopartículas para administração tópica de fármacos: Potencial para o tratamento do câncer de pele
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Determinantes do sucesso da penetração/permeação cutânea de nanotransportadores: Em busca da formulação perfeita
Penetração de fármacos através da pele, uma membrana complexa controladora de taxa
Avaliação objetiva da disposição de nanopartículas na pele de mamíferos após exposição tópica
Aplicação terapêutica bifuncional de ultrassom de baixa frequência associado a micelas carregadas com ftalocianina de zinco
Gráficos de superfície de resposta de nanopartículas carregadas com AM usando a razão fase orgânica/fase aquosa da primeira emulsificação (X1), porcentagem de álcool polivinílico da primeira emulsificação (X2) e quantidade de policaprolactona (X3) como variáveis independentes.
(A) Gráfico de distribuição de tamanho de partícula usando DLS (B) Imagem de microscopia eletrônica de varredura de nanopartículas contendo AM (C) Observação por microscopia óptica da dupla emulsão durante o processo de preparação da formulação otimizada.
(A) Perfil de liberação in vitro comparando a solução e a nanopartícula de AM (B) Gráfico contemplando a modelagem dos dados de dissolução da nanopartícula no modelo de primeira ordem (C) Estudo do decaimento da absorbância de DPBF na presença da solução e da nanopartícula de azul de metileno, com irradiação (630 nm, 6,7 J/cm², 0,001841 W/cm²) em intervalos de tempo de 3 min, até 30 min de irradiação luminosa.
Viabilidade celular da formulação otimizada, solução de azul de metileno e nanopartícula em branco, com e sem luz, com um tempo de incubação de 5 min. Teste ANOVA de uma via com pós-teste de Bonferroni entre os grupos. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

Viabilidade celular da formulação otimizada, solução de azul de metileno e nanopartícula em branco, com e sem luz, com um tempo de incubação de 2 h. Teste ANOVA de uma via com pós-teste de Bonferroni entre os grupos. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

Captação celular de nanopartículas marcadas com Rodamina 123 e DAPI nos tempos 1, 3, 6 e 24 h por microscopia confocal.

Representação gráfica da quantificação de AM em solução e nanopartícula no estrato córneo (EC) e epiderme viável e derme (EV + D) sem (A) ou com aplicação de sonoforese (B) em pele de orelha suína após estudo de penetração por 16 h. * p < 0,05; **** p < 0,0001.

Delineamento experimental de Box–Behnken mostrando várias corridas e suas relações entre os fatores independentes X1, X2 e X3 com seus valores reais e respectivas respostas dependentes Y1, Y2 e Y3 das NPs preparadas, juntamente com seus potenciais zeta.

Nº das Formulações X1(Fase Orgânica/Fase Aquosa da 1ª Emulsificação) X2(%PVA 1ª Emulsificação) X3(Quantidade de Policaprolactona (mg)) Y1Tamanho (nm) Y2IPD Y3Eficiência de Encapsulamento (%) Potencial Zeta (mV) 1 3 0,5 45 278,06 ± 1,40 0,33 ± 0,01 96,05 ± 0,04 −4,19 ± 0,17 2 5 0,5 45 223,90 ± 1,72 0,15 ± 0,01 96,82 ± 0,03 −4,31 ± 0,20 3 3 1 45 252,33 ± 2,41 0,27 ± 0,01 94,93 ± 0,01 −3,80 ± 0,23 4 5 1 45 211,53 ± 1,24 0,17 ± 0,01 98,63 ± 0,11 −3,56 ± 0,21 5 3 0,75 30 262,76 ± 1,48 0,28 ± 0,01 95,63 ± 0,01 −3,20 ± 0,10 6 5 0,75 30 183,40 ± 1,10 0,17 ± 0,01 94,37 ± 0,03 −8,93 ± 0,10 7 3 0,75 60 271,83 ± 5,91 0,23 ± 0,02 98,59 ± 0,01 −11,96 ± 0,26 8 5 0,75 60 230,16 ± 1,50 0,11 ± 0,01 99,44 ± 0,07 −5,87 ± 0,15 9 4 0,5 30 234,96 ± 0,61 0,20 ± 0,01 95,19 ± 0,09 −5,15 ± 0,35 10 4 1 30 228,13 ± 2,65 0,12 ± 0,01 96,01 ± 0,02 −2,79 ± 0,06 11 4 0,5 60 260,20 ± 1,63 0,15 ± 0,01 95,26 ± 0,02 −2,50 ± 0,12 12 4 1 60 206,80 ± 2,35 0,12 ± 0,01 96,67 ± 0,31 −3,66 ± 0,11 13 4 0,75 45 212,63 ± 3,59 0,19 ± 0,01 97,85 ± 0,06 −3,23 ± 0,04 14 4 0,75 45 171,60 ± 2,19 0,11 ± 0,01 97,81 ± 0,02 −3,46 ± 0,38 15 4 0,75 45 160,43 ± 1,56 0,09 ± 0,02 96,04 ± 0,02 −4,28 ± 1,01

Valores previstos na otimização do software Minitab® e os valores reais obtidos para a formulação otimizada de nanopartículas contendo azul de metileno.

Fator Nível Otimizado X1: Razão fase orgânica/fase aquosa 1ª emulsificação 4,59 X2: Porcentagem de PVA (%) na 1ª emulsificação 0,82 X3: Quantidade de policaprolactona (mg) 52,42 Resposta Valor estimado Valor obtido Erro relativo (%) Y1: Tamanho da partícula (nm) 186,76 156,93 ± 8,26 15,97 Y2: Índice de Polidispersão 0,11 0,11 ± 0,05 2,56 Y3: Eficiência de encapsulamento (%) 98,39 94,22 ± 2,19 4,23
Parâmetros cinéticos da liberação de MB a partir da nanopartícula.
Modelos Matemáticos Ordem Zero Primeira Ordem Higuchi Weibull Hopfenberg Parâmetro(s) R2 0,75 R2 0,97 R2 0,85 R2 0,96 R2 0,94 K0 10,04 K1 0,71 KH 34,29 α 0,83 0,12 β 0,60 3,38 0,40
IC50 da solução e das nanopartículas contendo MB com ou sem irradiação de luz nos tempos de incubação de 5 min e 2 h.
Amostras IC50 (µM)Tempo de Incubação: 5 min IC50 (µM)Tempo de Incubação: 2 h Solução-MB 49,26 79,83 Solução-MB + Irradiação de luz 7,36 40,45 Nanopartícula-MB 213,79 22,37 Nanopartícula-MB + Irradiação de luz 26,81 9,90