pmid: "39456787"
title: "A combinação de azul de metileno e carboplatina in vitro desencadeia a morte de células de câncer de ovário."
authors: "da Veiga Moreira J, Schwartz L, Jolicoeur M"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2024 Oct 13"
doi: "10.3390/ijms252011005"
source: "PMC Full Text"

A combinação de azul de metileno e carboplatina in vitro desencadeia a morte de células de câncer de ovário.

Autores

da Veiga Moreira J, Schwartz L, Jolicoeur M

Periodico

International journal of molecular sciences (2024 Oct 13)

Conteudo

A Combinação de Azul de Metileno e Carboplatina In Vitro Desencadeia a Morte de Células de Câncer de Ovário

O câncer de ovário apresenta um prognóstico grave e altas taxas de mortalidade, necessitando da exploração de vias terapêuticas alternativas, particularmente diante da resistência à quimioterapia à base de platina. Os tratamentos convencionais frequentemente ignoram as implicações metabólicas do câncer, mas pesquisas recentes destacaram o papel fundamental das mitocôndrias na patogênese do câncer e na resistência a medicamentos. Este estudo investiga o panorama metabólico do tratamento do câncer de ovário, concentrando-se na modulação da atividade mitocondrial usando azul de metileno (AM). Investigando duas linhagens celulares de câncer epitelial de ovário (CEO), OV1369-R2 e OV1946, que exibem respostas díspares à carboplatina, buscamos identificar nós metabólicos, especialmente aqueles ligados à disfunção mitocondrial, que contribuem para a quimiorresistência. Utilizando a ARPE-19, uma linhagem celular epitelial retiniana normal, como modelo de controle, nosso estudo revela a captação celular distinta do AM, com a ARPE-19 absorvendo de 5 a 7 vezes mais AM do que a OV1946 e a OV1369-R2. O tratamento com 50 µM de AM (AM-50) reduziu efetivamente a proliferação de ambas as linhagens celulares de câncer de ovário. Além disso, o AM-50 exibiu a capacidade de suprimir a glutaminólise e o efeito Warburg em culturas de células cancerígenas. Em relação à energética mitocondrial, o AM-50 estimulou o consumo de oxigênio, interrompeu as vias glicolíticas e induziu a depleção de ATP na linhagem celular quimiossensível OV1946. Essas descobertas destacam o potencial da exposição prolongada ao AM como uma estratégia para melhorar a resposta quimioterápica em células de câncer de ovário. A capacidade do AM de estimular o consumo de oxigênio e aumentar a atividade mitocondrial posiciona-o como um candidato promissor para a terapia do câncer de ovário, lançando luz sobre as pressões metabólicas exercidas sobre as mitocôndrias e sua modulação pelo AM, contribuindo assim para uma compreensão mais profunda da desregulação mitocondrial e dos fundamentos metabólicos da proliferação de células cancerígenas.

1. Introdução
   O câncer de ovário apresenta um desafio significativo na oncologia, ostentando a maior taxa de letalidade entre os cânceres ginecológicos. Impressionantes 70% dos casos de câncer epitelial de ovário (CEO) são diagnosticados em estágio avançado, sendo que a maioria se mostra não responsiva à quimioterapia atual à base de platina. Apesar das respostas iniciais em até 80% das pacientes, a resistência aos fármacos desenvolve-se inevitavelmente, levando à recidiva e à mortalidade. Os tratamentos padrão para o câncer de ovário resistente à platina, como a doxorrubicina lipossomal peguilada, o paclitaxel e o topotecano, oferecem eficácia limitada. Para abordar isso, vários modelos pré-clínicos, incluindo culturas 2D, 3D e ex vivo de CEO, foram propostos para avaliar a sensibilidade à carboplatina. Sob uma perspectiva metabólica, a quimiorresistência no câncer de ovário está associada aos dois fenômenos principais a seguir: o efeito Warburg, caracterizado por uma glicólise aeróbica aprimorada, e a glutaminólise intensificada. Embora essas características metabólicas sejam comuns em células cancerígenas, elas são particularmente pronunciadas em células de câncer de ovário quimiorresistentes. Na última década, a pesquisa explorou extensivamente o metabolismo das células cancerígenas, concentrando-se no envolvimento mitocondrial, conforme proposto por Otto Warburg, que descreveu o câncer como uma doença metabólica impulsionada pela disfunção mitocondrial, levando ao aumento do anabolismo e à diminuição do catabolismo. O azul de metileno (AM), um agente antibacteriano estabelecido há muito tempo, foi empregado para estimular a cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e a atividade da fosforilação oxidativa (OXPHOS), resultando em uma diminuição da produção de lactato. Estudos recentes em células de ovário de hamster chinês (CHO) enfatizaram ainda mais o papel fundamental das mitocôndrias na regulação do fluxo de carbono. Com base nesses conhecimentos, nosso estudo explora o potencial do AM como um candidato ao tratamento do câncer, visando interromper a reprogramação das células cancerígenas dependentes da glicólise por meio do aumento da atividade mitocondrial. Selecionamos duas linhagens de CEO, OV1369-R2 e OV1946, com respostas diferentes à carboplatina, sendo que a OV1369-R2 demonstrou resistência e a OV1946 apresentou sensibilidade intermediária. Utilizando ARPE-19 como modelo de controle epitelial retiniano normal, nossas descobertas demonstram a eficácia do AM na indução de células de câncer de ovário, especialmente quando combinado com a cisplatina. Esses resultados ressaltam a energética mitocondrial como uma vulnerabilidade crítica nas células cancerígenas e sugerem que a exposição in vitro de "longo prazo" (48 h a 72 h) ao azul de metileno pode superar a quimiorresistência em células de câncer de ovário.

2. Resultados
   2.1. A Ingestão Celular de Azul de Metileno está Associada a uma Menor Quantidade de ATP em Células de Câncer de Ovário
   A avaliação da captação de AM revelou uma absorção significativamente maior pela linhagem celular de controle normal ARPE-19 em comparação com as linhagens celulares cancerígenas OV1369-R2 e OV1946 (Figura 1A). Normalizado pelo número de células, a ARPE-19 acumulou AM a uma taxa de 11,13 ± 1,43 µM/(milhões de células·h), aproximadamente 5 a 7 vezes maior do que a OV1369-R2 (1,55 ± 0,46 µM/(milhões de células·h)) e a OV1946 (2,20 ± 0,21 µM/(milhões de células·h)) (p ≤ 0,05). A permeabilidade reduzida das membranas das células cancerígenas, incluindo as mitocôndrias, sugere uma internalização limitada de AM em seu citoplasma ou mitocôndrias, consistente com sua preferência pela glicólise aeróbica, uma característica marcante do efeito Warburg. Investigações adicionais sobre o impacto do AM na energética celular concentraram-se no conteúdo total de ATP após 24 h de incubação com AM-50. Os resultados revelaram um efeito inibitório significativo do AM nos níveis de ATP das células cancerígenas (Figura 1B). Sob condições normais de crescimento, a OV1369-R2 e a OV1946 exibiram maior conteúdo de ATP intracelular por célula em comparação com os controles, com valores de 4,90 ± 0,12 e 1,21 ± 0,04 µM/milhões de células, respectivamente (p ≤ 0,001). No entanto, elas apresentaram maior sensibilidade ao tratamento com AM-50, resultando em uma redução notável de 88% e 71% nos níveis totais de ATP, respectivamente. Em contraste, a ARPE-19 respondeu de forma diferente ao AM-50, exibindo um aumento de 60% no conteúdo de ATP, subindo de 0,74 ± 0,01 µM/milhões de células para 1,18 ± 0,04 µM/milhões de células após o tratamento (p ≤ 0,001). Essa relação inversa entre o efeito inibitório do AM na demanda energética das células cancerígenas e a absorção do corante mitocondrial estimula uma exploração mais aprofundada sobre seus potenciais efeitos inibitórios na proliferação de células cancerígenas.

2.2. A Proliferação de Células Cancerígenas é Sensível ao Azul de Metileno
O impacto de diferentes condições de tratamento na proliferação e na indução de apoptose foi avaliado na linhagem celular normal ARPE-19 e nas linhagens celulares cancerígenas OV1369-R2 e OV1946 após cultura durante a noite e subsequente incubação de 24 h. As condições incluíram controle de veículo (meio de cultura OSE), MB-50, CPN-50 e a combinação de MB-50 e CPN-50 (IC50s fornecidos na Figura S1). A análise por citometria de fluxo por separação celular ativada por fluorescência (FACS) foi realizada para avaliar os efeitos do tratamento na proliferação e apoptose celular. Como mostrado na Figura 2A, nem a ARPE-19 nem a OV1369-R2 exibiram sensibilidade significativa ao CPN-50 e ao MB-50, confirmando a quimiorresistência conhecida da OV1369-R2 e a sensibilidade intermediária da OV1946. No entanto, ambas as linhagens de células cancerígenas mostraram sensibilidade significativa ao MB-50 quando combinado com CPN-50 (p ≤ 0,05 e p ≤ 0,001 para OV1369-R2 e OV1946, respectivamente). A OV1946 demonstrou a maior sensibilidade ao MB-50 (p ≤ 0,001), resultando em apenas 46 ± 3% de proliferação em comparação com 72 ± 7% para a OV1369-R2 (p ≤ 0,01) e 79 ± 9% para a ARPE-19 após 24 h de tratamento. A combinação de MB-50 e CPN-50 não aumentou significativamente o efeito do MB-50 na proliferação de células cancerígenas. Em relação à indução de apoptose, o MB-50 exibiu um efeito modesto em todas as três linhagens, que não foi significativamente diferente das condições de controle (Figura 2B). No entanto, a OV1946 apresentou níveis de apoptose ligeiramente mais altos, porém não significativos, particularmente sob condições de MB-50, independentemente de estar combinada com CPN-50 ou não. Os valores de p ajustados ≤ 0,05 foram considerados significativos e as notações * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01) e *** (p ≤ 0,001) foram utilizadas.

2.3. O Efeito Warburg e a Glutaminólise São Inibidos na Linhagem Celular Quimiossensível
Compreender os efeitos metabólicos do azul de metileno na inibição da proliferação de células cancerígenas foi um objetivo fundamental deste estudo. Examinamos a variação em cinco metabólitos extracelulares críticos para o metabolismo das células cancerígenas durante um período de cultura de 24 h (Figura 3A–C). A glicose e a glutamina, substratos essenciais no metabolismo central do carbono, fornecem recursos de carbono para a síntese de biomassa. Células em proliferação exibem alta produção de lactato por meio da glicólise aeróbica/efeito Warburg e produção de glutamato via glutaminólise, características bem documentadas de células cancerígenas. Para avaliar o impacto do azul de metileno e da carboplatina, definimos o efeito Warburg (WE) como a produção líquida de lactato (LAC)/consumo líquido de glicose (GLC) (∆LAC/∆GLC) e a glutaminólise (∆GLU/∆GLN) como a produção líquida de glutamato extracelular (GLU)/consumo líquido de glutamina (GLN) às 24 h após o tratamento. As linhagens de câncer de ovário ARPE-19 e OV1946 exibiram modulação semelhante de WE e glutaminólise sob as condições de proliferação (Figura 3D,E). Sob MB-50, o WE foi fortemente inibido em ARPE-19 (−49 ± 9%) e OV1946 (−54 ± 2%), e menos sob CPN-50 isolado, −17 ± 7% e −18 ± 5%, respectivamente (p ≤ 0,001). A condição de combinação não teve efeito adicional significativo nessas duas linhagens celulares em comparação com o MB-50 isolado. No entanto, a OV1369-R2 mostrou uma leve regulação positiva sob MB-50 isolado e em combinação com CPN-50, mas aumentou 94% ± 20% sob CPN-50 isolado. A glutaminólise foi significativamente inibida sob MB-50 em ARPE-19 (−77 ± 1%) e OV1946 (−63 ± 1%), mas regulada positivamente em OV1369-R2 (+38 ± 4%). Esse comportamento distinto da OV1369-R2 ressalta a importância do metabolismo central do carbono na resposta ao tratamento de células cancerígenas. A glutaminólise foi mais regulada positivamente sob CPN-50 do que sob MB-50 na OV1369-R2 (p ≤ 0,01), sendo atenuada quando combinada com MB-50. Esse desacoplamento metabólico após tratamentos com carboplatina ou azul de metileno sugere o papel do metabolismo mitocondrial na resistência a medicamentos ou nas características adaptativas intrínsecas das células cancerígenas. Além disso, a reprogramação metabólica, especialmente a sustentação da glicólise aeróbica e da glutaminólise, é uma marca registrada das células cancerígenas, particularmente das células-tronco cancerígenas (CSCs).

2.4. A exposição de longo prazo ao azul de metileno induz aumento da apoptose em células de câncer de ovário
Após um ensaio de proliferação de 24 h com 50 µM de azul de metileno (MB-50), as linhagens celulares de câncer de ovário OV1369-R2 e OV1946 exibiram sensibilidade ao azul de metileno, sem efeito significativo quando combinado com 50 µM de carboplatina (MB-50 + CPN-50) (Figura 2). Para investigar melhor o potencial do MB-50 na indução de apoptose nas células OV1369-R2, um tratamento inicial de 24 h foi seguido por lavagem e reincubação em meio de cultura OSE normal por mais 24 h, totalizando 48 h de incubação de "longo prazo". A análise por citometria de fluxo (FACS) demonstrou uma capacidade replicativa reduzida em todas as três linhagens celulares, mesmo após o retorno às condições normais de crescimento (Figura 4A). Ambas as linhagens de células cancerígenas apresentaram viabilidade significativamente reduzida, especialmente sob a combinação MB-50 + CPN-50 (p ≤ 0,001). Notavelmente, a OV1946 permaneceu altamente sensível, com menos de 4% ± 0,1 das células remanescentes em comparação com o controle (p ≤ 0,001). Essa diminuição na viabilidade foi associada a um aumento significativo na população de células apoptóticas em ambas as células OV1369-R2 e OV1946 sob a condição de combinação MB-50 + CPN-50 (Figura 4B) (p ≤ 0,05). O aumento da apoptose foi relatado nas células OV1946, resultando em uma população apoptótica de 47 ± 6% (p ≤ 0,05), em comparação com 19 ± 3% nas células OV1369-R2 e 7 ± 1% nas células ARPE-19 (Figura 4B).

2.5. O Azul de Metileno Induz um Aumento Significativo na Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) em Culturas de Células Cancerígenas
Para elucidar os efeitos do azul de metileno (AM) e sua combinação com a carboplatina (CPN) na respiração de células cancerígenas, monitoramos a taxa de consumo de oxigênio (OCR) ao longo de três dias sob condições padrão de crescimento (5% de CO2, 37 °C) e vários tratamentos medicamentosos (AM-50, CPN-50, AM-50 + CPN-50). A adição de AM às 24 h provocou uma resposta rápida e significativa em todas as três linhagens celulares — ARPE-19, OV1369-R2 e OV1946 —, evidenciada por um aumento acentuado na OCR. Em particular, a OV1369-R2 apresentou uma elevação notável de uma respiração celular basal de 16 ± 3 fmol/mm²/s antes da adição de AM para um pico de 128 ± 10 fmol/mm²/s. Subsequentemente, a OCR estabilizou-se por 20 h sob tratamento com AM-50 antes de declinar abaixo dos limites de detecção, provavelmente devido à pressão metabólica exercida pelo AM na via respiratória mitocondrial ou na energética da fosforilação oxidativa (OxPhos). Por outro lado, a CPN-50 não exibiu efeitos discerníveis na OCR nas linhagens celulares ARPE-19 e OV1369-R2 (Figura 5A,B). No entanto, a combinação de AM-50 e CPN-50 aumentou notavelmente a OCR na linhagem celular OV1369-R2. Tendências semelhantes foram observadas na linhagem celular OV1946, embora com uma resposta de OCR menos pronunciada em comparação com a OV1369-R2 ou ARPE-19 (Figura 5A–C). Notavelmente, a OV1946 demonstrou sensibilidade à CPN, com redução da OCR abaixo dos limites de detecção a partir de 45 h em diante. Vale ressaltar que os valores de OCR para todas as três linhagens celulares tratadas com azul de metileno, com ou sem carboplatina, declinaram abaixo dos níveis iniciais de OCR. Embora esse declínio possa decorrer, em parte, da morte celular e da apoptose induzida, isso não explica totalmente a dinâmica observada, uma vez que a rápida diminuição na OCR observada 20 h após a adição de AM superou o declínio na viabilidade celular.

3. Discussão
   Investigações anteriores conduzidas pela nossa equipe de pesquisa elucidaram o envolvimento crucial das mitocôndrias na determinação da alocação de recursos de carbono entre a privação de energia (catabolismo) e a síntese de blocos de construção de biomassa (anabolismo). Para replicar o microambiente inflamatório típico do câncer, submetemos células de ovário de hamster chinês (CHO) a choques osmóticos em cultura. Esses choques induziram uma aceleração do efeito Warburg nas células CHO e uma diminuição notável na capacidade mitocondrial (h = ∆p/∆Ψm). Essas alterações metabólicas alinham-se às assinaturas características descritas por Otto Warburg em células cancerígenas. Em nosso estudo atual, nossas descobertas corroboram um efeito de glicólise aeróbica/Warburg pronunciado nas linhagens de células cancerígenas OV1369-R2 e OV1946, com a OV1946 exibindo um efeito particularmente robusto (Figura 3C). Além disso, ambas as linhagens de células cancerígenas demonstraram taxas elevadas de glutaminólise em comparação com a linhagem de células epiteliais normais ARPE-19. Essa glutaminólise intensificada reflete a maior demanda por recursos de nitrogênio pelas células cancerígenas para a síntese de nucleotídeos e proteínas. As mitocôndrias utilizam amônio e glutamato derivados da glutaminólise para a conversão de intermediários do ciclo de Krebs e síntese de biomassa. Consequentemente, esse desequilíbrio metabólico inclinado para o anabolismo nas células cancerígenas leva a uma demanda energética aumentada e a uma abundância de ATP celular livre (Figura 1B). Uma estratégia para redirecionar a energética celular em células cancerígenas e promover o catabolismo mitocondrial envolve o uso de azul de metileno (AM). Como um potente agente redox, o AM permanece não metabolizado pelas células e é consumido principalmente pelas mitocôndrias. Seu papel notável reside em servir como uma cadeia de transporte de elétrons (CTE) alternativa. Nossos resultados demonstram que o AM induz uma maior capacidade de respiração celular, mesmo em linhagens de células cancerígenas, desafiando a noção predominante de atividade mitocondrial prejudicada em células cancerígenas (Figura 5B,C). A interrupção do equilíbrio energético celular por meio do tratamento com AM-50 leva a uma redução significativa nos níveis totais de ATP celular em ambas as linhagens de células cancerígenas, OV1369-R2 e OV1946, enquanto o ATP total é aumentado na linhagem de células normais ARPE-19 (Figura 1B). Isso sugere que as células ARPE-19 podem aumentar a síntese mitocondrial de ATP em resposta ao alto fluxo de AM mitocondrial (Figura 1A,B), em contraste com as células cancerígenas. Além disso, nossos resultados revelam uma correlação direta entre a taxa de captação de AM pelas células e a inibição do efeito Warburg e da glutaminólise. Ambos os fenômenos metabólicos são notavelmente suprimidos na ARPE-19 e na OV1946, as duas linhagens celulares que exibem maior consumo de AM (Figura 3A,C–E). Por outro lado, a tendência oposta é observada na OV1369-R2, a linhagem celular quimiorresistente. Curiosamente, o efeito do AM em células cancerígenas quimiorresistentes guarda semelhança com experimentos de microgravidade conduzidos em culturas de células cancerígenas linfoblásticas. Nesse estudo, os pesquisadores demonstraram o efeito anticancerígeno da microgravidade simulada com média temporal (taSMG) em células de linfoma de Hodgkin (LH) humano em cultura. Consistentes com nossas descobertas, eles relataram uma diminuição nos níveis de ATP intracelular, o que, por sua vez, levou a um aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e autofagia pronunciada nas células de LH. Posteriormente, avaliamos a indução de apoptose em populações celulares após tratamentos de curto prazo (24 h) e longo prazo (48 h) com CPN-50, AM-50 ou sua combinação (AM-50 + CPN-50). Os resultados demonstraram uma resposta apoptótica maior nas linhagens de células cancerígenas sob a condição AM-50 + CPN-50 (Figura 4B). Considerando que a apoptose é um processo energeticamente exigente para as células, juntamente com a diminuição na produção de ATP e lactato a partir da glicólise (Figura 3A–C), a redução observada na proliferação celular a longo prazo sob o tratamento com AM-50 + CPN-50 é racionalizada (Figura 4A). A apoptose intensificada nas linhagens de células cancerígenas pode ser atribuída a uma deficiência energética que não consegue atender às demandas anabólicas dessas células. Essa deficiência é particularmente pronunciada nas células OV1946, que exibem maior sensibilidade ao CPN-50 e ao AM-50. Além disso, a apoptose aumentada nas células OV1369-R2 sob o provável "efeito sinérgico" do AM-50 e CPN-50 esclarece o papel fundamental das mitocôndrias na quimiorresistência (Figura 4B). A elevação concomitante do efeito Warburg e da glutaminólise após o tratamento com CPN-50 na OV1369-R2 representa marcadores críticos de quimiorresistência e função mitocondrial. Essa resposta ao tratamento com CPN-50 ressalta uma das vulnerabilidades da célula cancerígena: a regulação do potencial redox mitocondrial. Consequentemente, o desenvolvimento de terapias fotodinâmicas utilizando AM em combinação com a produção mitocondrial de oxigênio singleto ganhou impulso.
4. Materiais e Métodos
   4.1. Análise Estatística
   Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 3). A análise estatística foi realizada com Python 3.8 e Excel 2409. Valores de p ajustado ≤ 0,05 foram considerados significativos e as notações * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01) e *** (p ≤ 0,001) foram utilizadas para a comparação em relação ao grupo controle por ANOVA seguida de testes post hoc HSD de Tukey.
   4.2. Linhagens Celulares e Meio de Cultura
   Duas linhagens de células de câncer epitelial de ovário, OV1369-R2 e OV1946, derivadas de ascite de pacientes e provenientes da coleção OvCAN, foram utilizadas neste estudo com a permissão explícita do Comitê de Ética em Pesquisa do CHUM (Centre Hospitalier de l’Université de Montréal) (BD 04.002). A linhagem de células epiteliais retinianas normais, ARPE-19, foi adquirida da ATCC (CRL-2302) e empregada como um modelo de controle adequado. OV1369-R2 e OV1946 exibiram resistência e resposta intermediária, respectivamente, ao tratamento com carboplatina em culturas 2D. As três linhagens celulares foram mantidas em meio OSE completo (Wisent, Cat. 316-030-CL, Saint-Jean-Baptiste, QC, Canadá) com a adição de 10% de soro fetal bovino (Wisent, Cat. 080-150, Saint-Jean-Baptiste, QC, Canadá), 250 µg/mL de Anfotericina B (Wisent, Cat. 450-105-QL, Saint-Jean-Baptiste, QC, Canadá) e 50 mg/mL de Gentamicina (Wisent, Cat. 450-135-XL, Saint-Jean-Baptiste, QC, Canadá). Antes do início dos experimentos, as células foram incubadas a 37 °C em um ambiente controlado a 21% de O2 e 5% de CO2.
   4.3. Tratamentos com Azul de Metileno e Carboplatina
   Várias concentrações de azul de metileno (AM), de 0 a 50 μM, foram testadas nas três linhagens celulares para observar suas respostas dentro de um período de 24 h (ver Informações Suplementares). Entre elas, a dose de 50 μM de AM (AM-50) resultou em uma redução de 50% na viabilidade na OV1946, a linhagem celular mais responsiva, levando-nos a escolher esta concentração para experimentos subsequentes. Para os ensaios com carboplatina (Sigma, Cat. C2538, Markham, ON, Canadá), uma dose consistente de 50 μM (CPN-50) foi selecionada para permitir a comparação direta com os efeitos do AM-50. Notavelmente, a CPN-50 excede significativamente os respectivos valores de IC50 da carboplatina para cada linhagem celular, a saber, OV1369-R2 (9,8 ± 1,0 μM) e OV1946 (3,4 ± 0,18 μM). Resumidamente, para garantir a adesão ideal às placas, as células foram incubadas por 16 h em condições normais de crescimento antes de iniciar os experimentos. Subsequentemente, o meio de cultura foi substituído por AM-50, CPN-50 ou pela combinação de AM-50 e CPN-50. As células foram incubadas por mais 24 h antes da realização dos ensaios de viabilidade, apoptose e metabolômica.
   4.4. Análise por Citometria de Fluxo
   A viabilidade celular foi avaliada primeiramente utilizando o kit de ensaio MTT (Sigma, Cat. 11465007001, Markham, ON, Canadá), seguido de análise por citometria de fluxo (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá) para reduzir o potencial de interferência colorimétrica do azul de metileno (Laboratoire Chimie-plus, Saint-Paul-de-Varax, França). A viabilidade foi quantificada normalizando as contagens de eventos para as Precision Count Beads™ (BioLegend, Cat. 424902, Cedarlane, Burlington, ON, Canadá) na suspensão celular. As populações de células apoptóticas foram avaliadas de forma semelhante utilizando Apotracker™ Green (BioLegend, Cat. 427402, QC, Canadá) e normalizadas para a contagem total de células. A coloração por citometria de fluxo envolveu a incubação de 300 nM de Apotracker™ Green por milhão de células em uma solução de 100 µL de PBS. A detecção foi realizada utilizando o canal Alexa Fluor® 488 (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá), e todos os dados de citometria de fluxo foram analisados com o software FlowJo™ v10.10 (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá).

4.5. Ensaio de ATP
A medição quantitativa dos níveis de ATP celular livre foi realizada utilizando o ATP Bioluminescent Assay Kit (Sigma, Cat. FLAA, Markham, ON, Canadá). O ensaio envolveu a adição de coquetel de ensaio de luciferina e luciferase ao extrato celular lisado, e a emissão de luz resultante foi diretamente proporcional à concentração de ATP intracelular. A determinação dos níveis de ATP livre em cada condição de crescimento, bem como após o tratamento com azul de metileno, foi realizada por referência a uma curva padrão de ATP.

4.6. Ensaio de Consumo de Oxigênio
As taxas de consumo de oxigênio foram monitoradas continuamente nas três linhagens celulares sob várias condições utilizando o dispositivo Resipher (Lucid Scientist, Atlanta, GA, EUA). O sensor de oxigênio foi colocado em 100 µL de cultura celular dentro de placas Falcon de 96 poços especialmente adaptadas (Corning, Cat. 353072, Corning, NY, EUA). As medições da taxa de consumo de oxigênio (OCR) começaram após 5 h, uma vez que os níveis de oxigênio no meio atingiram a saturação superficial. Essas leituras de OCR refletiram a troca dinâmica de oxigênio entre o meio e a atividade celular. Para avaliar o impacto de diferentes fármacos na respiração celular, eles foram introduzidos após 24 h de incubação, permitindo a avaliação de seus efeitos no consumo de oxigênio.

4.7. Medição de Metabólitos
O consumo de glicose, glutamina e fosfato, bem como a produção de lactato e glutamato, foram avaliados medindo-se suas concentrações nos meios de cultura celular antes (meio OSE) e após o tratamento. Os meios de cultura foram coletados 24 h após os tratamentos, e as concentrações de metabólitos foram determinadas utilizando o Roche Cedex® Bio Analyzer (REF: 06395554001, Laval, QC, Canadá). Todos os calibradores necessários, incluindo glicose (REF: 06343732001, Laval, QC, Canadá), glutamina (REF: 07395655001, Laval, QC, Canadá), glutamato (REF: 07395582001, Laval, QC, Canadá), fosfato (REF: 06990070001, Laval, QC, Canadá) e lactato (REF: 06343759001, Laval, QC, Canadá), foram obtidos da Roche e utilizados de acordo com os protocolos do fabricante.

5. Conclusões
   O câncer de ovário apresenta desafios significativos devido às suas altas taxas de mortalidade e resposta limitada às terapias padrão. Nossa investigação destaca o papel crucial do metabolismo mitocondrial no desenvolvimento da quimiorresistência à quimioterapia à base de platina. A atividade aumentada da glutaminólise e o efeito Warburg em células quimiorresistentes ressaltam a necessidade de visar a energética mitocondrial para um tratamento eficaz do câncer de ovário. O azul de metileno, atuando como um estimulante mitocondrial, exibe eficácia notável na inibição da proliferação de células cancerígenas ao modular o metabolismo central de carbono. Particularmente notável é seu efeito potente na linhagem celular OV1369-R2 resistente à carboplatina, oferecendo uma via terapêutica promissora para o câncer de ovário resistente à platina. Além disso, o azul de metileno aumenta a respiração e a capacidade respiratória das células cancerígenas, revitalizando a energética mitocondrial vital tanto para a sobrevivência celular quanto para a apoptose. Nossas descobertas somam-se às crescentes evidências que destacam o papel fundamental das alterações metabólicas que afetam as mitocôndrias no desenvolvimento do câncer e podem apresentar uma nova via potencial para mitigar a resistência à quimioterapia. Ao aliviar essa pressão metabólica e melhorar a função mitocondrial, o azul de metileno revela novas perspectivas para tratamentos inovadores contra o câncer de ovário. Em resumo, nosso estudo fornece insights valiosos sobre os mecanismos metabólicos que impulsionam o potencial replicativo aprimorado das células cancerígenas e a desregulação da energética mitocondrial. Ele ressalta o potencial do azul de metileno como uma estratégia terapêutica adjuvante contra o câncer de ovário e defende a realização de mais estudos in vitro e in vivo para compreender melhor os mecanismos moleculares subjacentes à morte de células de câncer de ovário induzida pelo azul de metileno.

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Materiais Suplementares
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Contribuições dos Autores
J.d.V.M. realizou os experimentos; J.d.V.M. escreveu o manuscrito; L.S. e M.J. contribuíram para o desenho do estudo e revisaram o manuscrito. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Declaração do Conselho de Revisão Institucional
O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa do Centre Hospitalier de l’Université de Montréal (código de protocolo BD 04.002, renovado em 15 de junho de 2023).

Declaração de Consentimento Livre e Esclarecido
Não aplicável.

Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados que fundamentam este estudo não estão disponíveis publicamente no momento. Os autores estão avaliando atualmente a possibilidade de patentear as descobertas e os protocolos apresentados no manuscrito.

Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Referências
Estatísticas Globais de Câncer 2020: Estimativas GLOBOCAN de Incidência e Mortalidade Mundial para 36 Tipos de Câncer em 185 Países
Mecanismos moleculares de resistência à quimioterapia à base de platina no câncer de ovário (Revisão)
Câncer epitelial de ovário
Eficácia e Segurança do Avelumabe para Pacientes com Câncer de Ovário Recorrente ou Refratário
Sensibilidade à carboplatina em linhagens celulares de câncer epitelial de ovário: O impacto dos sistemas de modelo
Resposta à carboplatina em modelos pré-clínicos para câncer de ovário: Comparação de monocamadas 2D, esferoides, tumores ex vivo e modelos in vivo
O Metabolismo das Células de Carcinoma
Sobre a origem das células cancerígenas
Metabolismo alterado da glutamina no câncer de ovário resistente à platina
Capítulo 3—Resistência a medicamentos em cânceres ginecológicos: Descobertas e mecanismos subjacentes
Identificação de Metabólitos no Ovário Normal e Sua Transformação no Câncer de Ovário Primário e Metastático
Dependência da glutamina no metabolismo celular
Além do efeito Warburg: Um tratamento eficaz contra o câncer visando o metabolismo específico do tumor e o pH desregulado
O Status Redox das Células Cancerígenas Suporta Mecanismos por trás do Efeito Warburg
Visar a dinâmica do oxigênio singleto mitocondrial oferece novas perspectivas para terapias metabólicas eficazes contra o câncer
A diminuição do priming mitocondrial determina a quimiorresistência de células-tronco do câncer de cólon
Visar o Complexo I Mitocondrial supera a quimiorresistência no câncer pancreático com alto OXPHOS
Visar as mitocôndrias como uma estratégia terapêutica potencial contra a quimiorresistência no câncer
A Resistência é Fútil: Visar a Energética e o Metabolismo Mitocondrial para Superar a Resistência a Medicamentos no Tratamento do Câncer
O Efeito do Azul de Metileno e seu Metabólito—Azure I—Sobre Parâmetros Bioenergéticos de Mitocôndrias de Cérebro de Camundongo Íntegro
Atividade antimicrobiana do azul de metileno e azul de toluidina O ligados covalentemente a uma superfície de polímero de silicone modificado
Uso do Ácido Cítrico como Agente Antimicrobiano ou Potencializador ou como Agente Anticancerígeno
Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana Mediada por Azul de Metileno Contra Isolados Clínicos de Bactérias Gram-Negativas Extensivamente Resistentes a Medicamentos Causadoras de Infecções Nosocomiais na Tailândia, Um Estudo In Vitro
A combinação de ácido lipoico com azul de metileno reduz o efeito Warburg em células CHO: Da ativação do ciclo do TCA ao aumento da produção de anticorpos monoclonais
Derivação e caracterização de linhagens celulares pareadas de câncer de ovário seroso primário e recorrente
A Biologia do Câncer: A Reprogramação Metabólica Impulsiona o Crescimento e a Proliferação Celular
Reprogramação metabólica da glicólise para a captação de ácidos graxos e beta-oxidação em células cancerígenas resistentes à platina
A hiperosmolaridade desencadeia o efeito Warburg em células de ovário de hamster chinês e revela uma potência mitocondrial reduzida
A Teoria Metabólica Mitocondrial pode explicar melhor a origem e o manejo do câncer do que a Teoria da Mutação Somática?
A microgravidade induz autofagia via disfunção mitocondrial em células de linfoma de Hodgkin humano
A terapia fotodinâmica com azul de metileno induz morte celular seletiva e massiva em células de câncer de mama humano
Terapia Fotodinâmica mediada por azul de metileno em linhagens celulares de retinoblastoma humano
A Terapia Metabólica com Azul de Metileno Restringe o Crescimento de Tumores Ovarianos In Vivo
(A) Ingestão diferencial de azul de metileno (AM) pelas linhagens celulares ARPE-19, OV1369-R2 e OV1946. A ARPE-19 exibiu maior ingestão de AM em comparação com as linhagens cancerígenas, com um acúmulo aproximadamente 5 vezes e 7 vezes maior do que a OV1369-R2 e a OV1946, respectivamente. (B) Modulação dos níveis de ATP livre em resposta ao tratamento com AM. As células ARPE-19 mostraram um aumento no conteúdo de ATP após o tratamento com AM, enquanto tanto a OV1369-R2 quanto a OV1946 exibiram um efeito inibitório do AM nos níveis de ATP. O valor de p ajustado ≤ 0,05 foi considerado significativo e as notações * (p ≤ 0,05) e *** (p ≤ 0,001) foram utilizadas.
Sensibilidade de células cancerígenas ao tratamento com azul de metileno e carboplatina. (A) As células foram incubadas por 24 h sob diferentes condições: 50 µM de azul de metileno (AM-50), 50 µM de carboplatina (CPN-50) e a combinação de AM-50 e CPN-50. A condição “CONTROLE” incluiu o solvente de AM e CPN, todos em meio de cultura OSE. A combinação de AM-50 e CPN-50 não mostrou um efeito significativo em comparação com o AM-50 isolado. Notavelmente, a OV1946 mostrou sensibilidade à CPN-50, enquanto a ARPE-19 e a OV1369-R2, conhecidas por serem resistentes ao tratamento com carboplatina, não mostraram. (B) A indução de apoptose foi observada de forma limitada sob condições de tratamento de 24 h para todas as três linhagens celulares. A população de células apoptóticas foi ligeiramente maior na linhagem celular intermediária quimiossensível OV1946. O valor de p ajustado ≤ 0,05 foi considerado significativo e as notações * (p ≤ 0,05) e *** (p ≤ 0,001) foram utilizadas.
Glutaminólise e efeito Warburg em células de câncer de ovário. (A–C) O perfil metabólico glicolítico das células foi avaliado sob várias condições de tratamento, e as concentrações de glicose, lactato, glutamina, glutamato e fosfato no meio de cultura foram medidas após um período de tratamento de 24 h. (D,E) O tratamento com azul de metileno exerce efeitos inibitórios tanto no efeito Warburg quanto na glutaminólise nas linhagens celulares ARPE-19 e na linhagem quimiossensível OV1946. Especificamente, o AM reduz significativamente o efeito Warburg, conforme indicado pela diminuição da produção de lactato e do consumo de glicose. Além disso, o AM suprime a glutaminólise, levando a uma redução na produção de glutamato e no consumo de glutamina. Essas alterações metabólicas são consistentes com a inibição observada da proliferação celular. Em contraste, a linhagem celular quimiorresistente OV1369-R2 exibiu uma resposta oposta ao tratamento com AM. Nesse caso, o AM aumentou ligeiramente o efeito Warburg e regulou positivamente a glutaminólise. Notavelmente, a combinação de AM com carboplatina (CPN-50) não aumentou significativamente o efeito Warburg. O efeito oposto foi observado na glutaminólise, com um efeito significativo da combinação de fármacos (p ≤ 0,01). Os valores de p ajustados ≤ 0,05 foram considerados significativos e as notações ** (p ≤ 0,01) e *** (p ≤ 0,001) foram utilizadas.

A combinação de azul de metileno e carboplatina desencadeia a via apoptótica em células de câncer de ovário. As células foram tratadas por 24 h com 50 µM de azul de metileno (AM-50), 50 µM de carboplatina (CPN-50) ou uma combinação de AM-50 e CPN-50. Após o tratamento, as células foram lavadas e incubadas por mais 24 h em meio de cultura OSE normal. A condição "CONTROLE" continha os solventes usados para o azul de metileno e a carboplatina no meio de cultura OSE. Isso ilustra o impacto desses tratamentos na viabilidade celular (A) e nas populações de células apoptóticas (B), demonstrando que a combinação de AM-50 e CPN-50 reduz significativamente a viabilidade das células cancerígenas (A) e aumenta a apoptose (B) em comparação com os tratamentos individuais e controles. Os valores de p ajustados ≤ 0,05 foram considerados significativos e as notações * (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01) e *** (p ≤ 0,001) foram utilizadas.

Taxa de consumo de oxigênio (OCR) nas linhagens celulares ARPE-19, OV1369-R2 e OV1946. (A) As células ARPE-19 mostraram um aumento acentuado na OCR após o tratamento com 50 µM de azul de metileno (AM-50) e um aumento adicional quando combinado com 50 µM de carboplatina (CPN-50). (B) As células OV1369-R2 exibiram um aumento significativo na OCR após o tratamento com AM-50, com um aumento ainda maior quando combinado com CPN-50, indicando maior sensibilidade ao tratamento combinado. (C) Nas células OV1946, o tratamento com AM-50 resultou em um aumento moderado na OCR em comparação com as células OV1369-R2. No entanto, a combinação de AM-50 e CPN-50 levou a uma OCR maior do que o AM-50 isolado.