pmid: "35910802"
title: "Nanovesículas derivadas de cúrcuma como novos nanobiológicos para terapia direcionada da colite ulcerativa."
authors: "Gao C, Zhou Y, Chen Z, Li H, Xiao Y, Hao W, Zhu Y, Vong CT, Farag MA, Wang Y, Wang S"
journal: "Theranostics"
pubdate: "2022"
doi: "10.7150/thno.73650"
source: "PMC Full Text"

Nanovesículas derivadas de cúrcuma como novos nanobiológicos para terapia direcionada da colite ulcerativa.

Autores

Gao C, Zhou Y, Chen Z, Li H, Xiao Y, Hao W, Zhu Y, Vong CT, Farag MA, Wang Y, Wang S

Periodico

Theranostics (2022)

Conteudo

Nanovesículas derivadas de cúrcuma como novos nanobiológicos para terapia direcionada da colite ulcerativa
Fundamentação: A colite ulcerativa (CU), um tipo típico de doença inflamatória intestinal (DII), é uma inflamação intestinal crônica idiopática. As estratégias terapêuticas convencionais concentram-se principalmente no reequilíbrio das citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias, enquanto o direcionamento para as barreiras intestinais danificadas, a microbiota intestinal desequilibrada e as respostas imunes da mucosa desreguladas na CU permanece um grande desafio. O objetivo deste estudo foi desenvolver nanovesículas derivadas de cúrcuma (TNVs) para alívio da colite e explorar os mecanismos subjacentes.
Métodos: As TNVs foram isoladas e purificadas por centrifugação diferencial. A capacidade de direcionamento foi avaliada no modelo de camundongo induzido por sulfato de sódio de dextrana (DSS) por meio do sistema de imagem IVIS. A eficácia anti-inflamatória foi estudada em macrófagos induzidos por lipopolissacarídeo (LPS) e em modelos de camundongo com colite aguda e crônica induzida por DSS. Além disso, a influência das TNVs na microbiota intestinal foi investigada por sequenciamento do microbioma do rRNA 16S e a condição da polarização de macrófagos após o tratamento com TNVs foi analisada por citometria de fluxo.
Resultados: As TNVs foram isoladas e caracterizadas como esferoides de tamanho nanométrico. O experimento de imagem IVIS indicou que as TNVs administradas por via oral poderiam se acumular nos locais inflamados do cólon e exibiram atividade anti-inflamatória superior tanto in vitro quanto in vivo. O sequenciamento do rRNA 16S sugeriu o papel importante das TNVs na regulação da microbiota intestinal. Além disso, as TNVs poderiam promover a transformação do fenótipo M1 para macrófagos M2 e restaurar a barreira epitelial intestinal danificada para exercer a eficácia anti-colite.
Conclusão: Coletivamente, a administração oral de TNVs exibiu excelente eficácia anti-inflamatória por meio da restauração da barreira intestinal danificada, regulação da microbiota intestinal e remodelação do fenótipo dos macrófagos. Este estudo lança luz sobre a aplicação de nanovesículas naturais semelhantes a exossomos para o tratamento da CU.
Colite ulcerativa (CU), um tipo principal de doença inflamatória intestinal (DII), representa uma condição inflamatória intestinal crônica e debilitante. A incidência de CU continua a aumentar mundialmente e tornou-se um problema de saúde global. Geralmente, fatores genéticos, ambientais, microbianos e imunológicos são atribuídos à patogênese da CU. Pacientes com CU geralmente manifestam dor abdominal, perda de peso, diarreia e até hematoquezia. As opções terapêuticas atuais incluem ácidos aminossalicílicos (AAS), glicocorticoides, imunossupressores e terapias biológicas emergentes, tipicamente incluindo agentes anti-TNF (fator de necrose tumoral), inibidores de citocinas pró-inflamatórias, agentes anti-adesão e inibidores da sinalização a jusante. Embora esses medicamentos possam aliviar os sintomas dos pacientes com CU, a resistência aos fármacos e seus efeitos colaterais, como reações adversas gastrointestinais, distúrbios autoimunes, doenças dermatológicas e até malignidades, limitam seriamente sua aplicação médica. Portanto, a descoberta e o desenvolvimento de medicamentos seguros, eficazes e de baixo custo são urgentemente necessários para os pacientes com CU.

Novos sistemas de liberação de fármacos têm sido cada vez mais explorados para a terapia direcionada da CU, com foco nas diferentes alterações de fatores durante a condição patológica. No entanto, sua avaliação de biossegurança e produção industrial em larga escala ainda requerem investigações extensas para serem aplicados na clínica. Recentemente, os exossomos, um tipo de vesículas membranosas de tamanho nanométrico secretadas no espaço extracelular, têm atraído investigações extensas. Evidências acumuladas sugerem que os exossomos desempenham várias atividades biológicas, particularmente na comunicação celular, e que vários agentes bioativos nos exossomos, como proteínas e microRNAs, são identificados como intimamente relacionados à patogênese da maioria das doenças humanas, com potencial para serem usados no diagnóstico, prognóstico e tratamento de doenças. No entanto, a produção e a aplicação de exossomos derivados de origem animal/celular ainda enfrentam obstáculos devido aos recursos limitados e à imunogenicidade. Recentemente, várias nanopartículas semelhantes a exossomos derivadas de plantas foram descobertas e relatadas por mediar a comunicação interespécies e exercer potenciais propriedades anticancerígenas e anti-inflamatórias. Estudos anteriores indicam que a utilização de plantas como nanofábricas para a preparação de exossomos médicos poderia fornecer uma plataforma nova e simples para o manejo de doenças.
Ervas frescas, como uma forma característica e especial da medicina chinesa, referem-se a matérias-primas sem qualquer processamento. Muitas ervas frescas possuem função mais forte ou propriedades únicas em comparação com as ervas secas. As ervas frescas têm recursos abundantes e uma longa experiência de aplicação clínica. Recentemente, nanopartículas semelhantes a exossomos derivadas de gengibre e ginseng foram relatadas por aliviar doenças inflamatórias, inibir a proliferação de tumores e promover a diferenciação de células-tronco. Assim, a combinação de ervas frescas e exossomos emergentes pode trazer uma abordagem segura e promissora para o tratamento de várias doenças, incluindo a CU.
A cúrcuma (Curcuma longa L.), uma famosa medicina chinesa de dupla finalidade medicinal e alimentar, tem recebido atenção crescente para o manejo da CU. Devido ao enriquecimento de moléculas bioativas nas nanopartículas semelhantes a exossomos derivadas de plantas, especulamos que as nanovesículas derivadas da cúrcuma (TNVs) possam ser utilizadas como uma nova terapêutica para várias doenças. Neste estudo, nanovesículas semelhantes a exossomos foram isoladas da cúrcuma fresca, e suas atividades anti-inflamatórias e mecanismos subjacentes foram investigados. Este estudo lança luz sobre a aplicação de nanovesículas naturais semelhantes a exossomos no tratamento da CU por via oral, o que abre portas para o tratamento de outros distúrbios.
Resultados
Caracterização das TNVs do rizoma fresco de cúrcuma
As TNVs foram isoladas do suco fresco de cúrcuma e purificadas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose (Figura 1A). Como mostrado na Figura 1B, as TNVs distribuíram-se principalmente nas interfaces de 8/30% e 30/45% do gradiente de sacarose, enquanto uma banda tênue foi observada na interface de 45/60%. A distribuição de tamanhos, o índice de polidispersidade (PDI) e os potenciais zeta das TNVs purificadas foram medidos por espalhamento de luz dinâmico (DLS). Os diâmetros foram de 191,7 ± 15,8, 243,9 ± 13,9 e 800,5 ± 66,2 nm, das interfaces superior para a inferior do gradiente de sacarose, respectivamente (Figura 1C). Os potenciais zeta foram de aproximadamente -15,0 mV em solução de PBS (Tabela S1). Para observar a morfologia das TNVs, amostras em concentração adequada foram contrastadas negativamente com solução de acetato de uranila a 1% e fotografadas por microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O resultado mostrou uma estrutura esférica uniforme e o tamanho foi consistente com os medidos por DLS (Figura 1D). Com base nesses achados, as TNVs localizadas na interface de 45/60% foram excluídas das análises posteriores devido ao menor rendimento e tamanho grande. É importante destacar que o rendimento das TNVs localizadas nas interfaces de 8/30% e 30/45% pode alcançar até 100 mg e 50 mg por 1000 g de cúrcuma fresca (Tabela S2). Um rendimento consistente foi observado entre diferentes lotes de cúrcuma, todos originários de Qianwei, Sichuan, China, representando um alto nível de produção de TNVs em comparação com a síntese de nanopartículas. Embora, independentemente do rendimento e da distribuição de tamanho, as TNVs das interfaces de 8/30% e 30/45% quase não apresentassem diferenças significativas, a capacidade de direcionamento foi avaliada posteriormente em um modelo de colite em camundongos.

A análise da composição lipídica por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) mostrou que as TNVs eram compostas principalmente de ácidos graxos (FA), diacilgliceróis (DAG), triacilgliceróis (TAG), fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE) (Figura S1A), que são componentes lipídicos comuns e não específicos da cúrcuma. Com base no sistema de entrega lipossomal existente, vários lipídios são importantes para auxiliar a formação de esferoides e o aprisionamento de fármacos em lipossomas de diferentes propriedades. Especulamos que esses lipídios nas TNVs contribuíram enormemente para a formação de nanovesículas e para manter sua estrutura esférica.

Em seguida, a composição proteica foi determinada por LC-MS/MS. O peso molecular dessas proteínas variou de 4 a 26 kDa. O banco de dados Gene Ontology (GO) (Figura S1B) revelou que as proteínas contidas nas TNVs correspondiam a proteínas envolvidas em funções moleculares, componentes celulares e processos biológicos. Além disso, cerca de 70% das proteínas das TNVs desempenhavam um papel fundamental nas vias metabólicas e na biossíntese de metabólitos secundários, de acordo com as anotações da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) (Figura S1C).
É bem conhecido que a cúrcuma seca contém grandes quantidades de curcuminoides, especialmente curcumina, demetoxicurcumina e bisdemetoxicurcumina, que exercem eficácia antioxidante, anti-inflamatória e anticancerígena superior. Portanto, os teores desses três compostos nos TNVs foram medidos por HPLC-MS (o espectro de massas é mostrado na Figura 1E) e os resultados são apresentados na Tabela S3. Em comparação com a cúrcuma seca, os teores foram muito baixos para exercer uma função biológica. Devido à baixa solubilidade dos curcuminoides e à diferença entre materiais medicinais frescos e secos, os componentes ativos dos TNVs devem ser explorados mais a fundo.
Distribuição in vivo dos TNVs
Para investigar a biodistribuição dos TNVs, foi administrado DSS a 3,5% para induzir colite aguda em camundongos por 7 dias. Após o estabelecimento bem-sucedido do modelo murino, camundongos em jejum receberam por via oral uma dose única de TNVs marcados com DiR (0,3 mg/mL). A intensidade de fluorescência nos camundongos foi imageada, os camundongos foram sacrificados e os tecidos do cólon foram coletados para imageamento de fluorescência usando um sistema de imagem IVIS Spectrum Series em diferentes momentos após a gavagem (2, 6, 12 e 24 h). Conforme mostrado na Figura 2A, a intensidade de fluorescência dos TNVs atingiu o máximo após administração intragástrica por 6 h, e então diminuiu gradualmente, chegando a desaparecer (Figura 2B-C). A distribuição dos TNVs 30-45% no cólon foi mais evidente do que a dos TNVs 8-30% em qualquer ponto temporal, portanto, os experimentos subsequentes foram realizados apenas com TNVs 30-45% e o nome TNVs no contexto refere-se aos TNVs 30-45%. A estabilidade dos TNVs nos fluidos gástrico e intestinal simulados foi avaliada em seguida. Conforme mostrado na Figura S2, o tamanho e o PDI dos TNVs em PBS, fluido gástrico simulado e fluido intestinal simulado foram 248,2 nm (0,165), 254,7 nm (0,208) e 341,1 nm (0,280), respectivamente. Os dados indicaram que o tamanho e o PDI dos TNVs quase não se alteraram e que os TNVs puderam manter-se estáveis no ambiente gástrico e intestinal hostil.
Em seguida, outro experimento de distribuição foi conduzido para observar a capacidade de direcionamento e as atividades anticolite dos TNVs. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos: grupo normal, grupo modelo (DSS a 3,5% por 7 dias) e grupo terapêutico TNVs (TNVs + DSS a 3,5% por 7 dias). No dia 8, TNVs marcados com DiR foram administrados por via oral aos camundongos. Após 6 h, os camundongos foram imageados usando um sistema IVIS Spectrum Series e a intensidade de fluorescência dos camundongos modelo foi a mais alta. As intensidades de fluorescência dos cólons ex vivo foram consistentes com as da seção abdominal, independentemente de os cólons conterem fezes ou não (Figura 2D-F). Em conjunto, os TNVs parecem acumular-se seletivamente na lesão inflamada do cólon para exercer sua atividade de direcionamento à inflamação e anticolite.
Mecanismos de captação celular e endocitose in vitro dos TNVs
A captação celular é um processo fundamental dos sistemas de liberação de fármacos para exercerem sua função. Os dados da Figura S3A-C revelaram que a intensidade de fluorescência aumentou em macrófagos Raw 264.7 e células NCM 460 tratadas com TNVs marcadas com DiO à medida que o tempo de coincubação aumentava. Além disso, a intensidade de fluorescência do grupo induzido por LPS foi mais forte do que a do grupo controle (Figura S4), indicando que as TNVs poderiam direcionar-se às células inflamatórias.

Para confirmar o mecanismo de captação celular das TNVs em macrófagos Raw 264.7 e células NCM 460, ambas as células foram tratadas com vários inibidores de endocitose, incluindo inibidores da endocitose mediada por caveolinas (Genisteína e Filipina), inibidor da endocitose mediada por clatrina (clorpromazina, CLP), inibidor da macropinocitose (cloridrato de amilorida, AMH), agente de remoção de colesterol (metil-beta-ciclodextrina, M-β-CD) e um agente de depleção de energia (NaN3). Paralelamente, o efeito da baixa temperatura na captação celular também foi estudado e ambas as células foram incubadas com TNVs marcadas com DiO a 4°C por 6 h. Como mostrado na Figura 3A-D, a captação celular das TNVs em macrófagos Raw 264.7 e células epiteliais intestinais NCM 460 foi afetada pela maioria dos inibidores e foi significativamente suprimida por AMH, Genisteína e Filipina. O tratamento com baixa temperatura também reduziu consideravelmente a captação celular em ambas as células. O efeito do CLP nas células Raw 264.7 foi maior do que nas células NCM 460, provavelmente atribuído à heterogeneidade da composição da superfície celular. O NaN3, um agente comum de depleção de ATP, exibiu eficácia mais evidente nas células NCM 460 do que nas Raw 264.7, o que pode estar associado à característica fagocítica dos macrófagos. No entanto, a M-β-CD praticamente não afetou a captação celular de ambas as células. Esses resultados indicaram que a captação das TNVs por macrófagos Raw 264.7 e células epiteliais intestinais NCM 460 foi multifacetada.

Atividade anti-inflamatória in vitro e efeitos de polarização de macrófagos das TNVs

Muitas citocinas pró-inflamatórias típicas estão envolvidas na patogênese da CU tanto em camundongos quanto em pacientes. Essas citocinas são produzidas e secretadas principalmente por macrófagos. Para avaliar a atividade anti-inflamatória, células Raw 264.7 foram estimuladas com LPS ou cotratadas com TNVs e LPS. Os níveis de TNF-α, Interleucina 6 (IL-6) e Proteína Quimioatraente de Monócitos 1 (MCP-1) elevados pelo LPS foram grandemente reduzidos pelas TNVs, quase ao nível do grupo normal (Figura 3E), sugerindo que as TNVs poderiam fornecer uma abordagem verde e eficaz para o manejo de distúrbios inflamatórios.
Como a polarização de macrófagos é um fator crítico durante condições inflamatórias e muitos tipos de câncer, o efeito das TNVs na polarização de macrófagos foi avaliado em células Raw 264.7. Os resultados de FACS (Figura 3F-G) mostraram que a taxa de cluster de diferenciação (CD)206+ (o marcador típico de macrófagos M2) aumentou de 37,8% para 51,4% após o tratamento com TNVs em macrófagos F4/80+CD11b+ estimulados com LPS e IFN-γ. As estatísticas na Figura 3G também indicaram uma taxa maior de CD206 positivo no grupo de tratamento. Coletivamente, o estado inflamatório pôde ser ajustado pelas TNVs através da promoção da diferenciação dos macrófagos para o fenótipo M2.
As TNVs atenuaram os sintomas relacionados à colite da colite aguda induzida por DSS
Guiados pelos resultados in vitro, a eficácia terapêutica das TNVs contra a CU foi investigada mais a fundo. O esquema do desenho experimental das TNVs contra a colite aguda está apresentado na Figura 4A. Devido ao dano na mucosa, à ruptura da barreira do epitélio intestinal e à desidratação no desenvolvimento da CU, o encurtamento do cólon é um parâmetro crítico para a avaliação da gravidade da inflamação. Na Figura 4B-C, observou-se diferença no comprimento do cólon entre o grupo saudável e o grupo desafiado com DSS, com 9,3 ± 0,85 e 5,5 ± 0,94 cm, respectivamente. O grupo controle positivo (5-ASA) apresentou um comprimento de cólon maior (6,7 ± 0,43 cm), indicando o valor terapêutico dos anti-inflamatórios não esteroidais convencionais contra a colite. O comprimento do cólon do grupo tratado com TNVs (8,2 ± 0,56 cm) foi muito maior do que o do grupo 5-ASA, sugerindo a excelente capacidade de proteção das TNVs à integridade da mucosa intestinal. Na Figura 4D, podemos ver que o peso corporal dos camundongos do grupo saudável manteve-se estável, enquanto os camundongos do grupo induzido por DSS sofreram perda de peso grave (quase 20% do peso inicial). Surpreendentemente, a perda de peso foi atenuada após o tratamento com 5-ASA e TNVs, especialmente no grupo tratado com TNVs (menos de 5%). O índice de atividade da doença (IAD), sistema de pontuação que considera o grau de perda de peso, a consistência das fezes e o sangramento fecal, reflete a atividade da colite na clínica. A maior pontuação do IAD no grupo de camundongos induzidos por DSS está apresentada na Figura 4E, e o IAD do grupo tratado com TNVs foi muito menor do que o dos grupos DSS e 5-ASA. A mieloperoxidase (MPO), uma proteína lisossomal dos neutrófilos, é um indicador-chave na promoção da infiltração de neutrófilos nos tecidos do cólon durante a inflamação intestinal. As TNVs conseguiram reduzir significativamente a atividade da MPO elevada pela exposição ao DSS (Figura 4F). Por fim, a alteração histológica foi realizada por meio da coloração com hematoxilina-eosina (H&E) dos tecidos do cólon. Os tecidos do cólon dos camundongos saudáveis apresentam células inflamatórias ocasionais e estrutura epitelial intacta. Após o tratamento com DSS, observou-se infiltração abundante de células inflamatórias, destruição das estruturas das criptas e grande perda de células caliciformes (Figura 4G). Os tecidos do cólon do grupo tratado com TNVs mostraram uma diminuição evidente nas características relacionadas à inflamação.
As TNVs inibiram a infiltração de macrófagos e alteraram a polarização dos macrófagos
Durante a CU, os neutrófilos são tipicamente ativados no local intestinal inflamado. Esse processo pode ser seguido por níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias típicas (IL-1β, MCP-1, TNF-α, IL-6, IL-12p70, IL-1α e IFN-β) no grupo DSS em comparação com os camundongos saudáveis (Figura 5A). As TNVs administradas por via oral conseguiram diminuir notavelmente a secreção dessas citocinas. A IL-10 é uma citocina anti-inflamatória bem reconhecida, cujos níveis foram muito mais elevados no grupo tratado com TNVs em comparação com o grupo DSS.
As células imunes desempenham um papel crítico e promovem lesões graves durante a RCU. Como se descobriu que as TNVs promovem a transformação de macrófagos M1 para o fenótipo M2 em células Raw 264.7, a diferenciação de macrófagos no tecido do cólon foi estudada em camundongos com colite aguda. Como visto na Figura 5B-C, a população de macrófagos F4/80+ CD11b+ da lâmina própria do cólon estava aumentada no grupo de camundongos DSS (27,9%). Conforme esperado, o grupo de tratamento com TNVs (15,0%) reduziu significativamente a população de macrófagos ativados. Mais importante ainda, o tratamento com TNVs diminuiu a taxa de células positivas para CD16/32, um marcador típico de macrófago M1 intestinal, e aumentou a taxa de células positivas para CD206, avaliada em macrófagos F4/80+ CD11b+. Em conclusão, nossos resultados ilustraram que as TNVs poderiam inibir a infiltração de macrófagos e a polarização para fenótipos M1, regulando assim a imunidade da mucosa intestinal.
As TNVs modularam a composição da microbiota intestinal
Evidências crescentes demonstram que o microbioma intestinal está intimamente envolvido na patogênese da RCU e o transplante de bactérias fecais é uma estratégia para a terapia da RCU. Portanto, investigou-se se o tratamento com TNVs modulou a composição da microbiota intestinal. Os resultados do sequenciamento do gene 16S do RNA ribossômico de amostras fecais mostraram que o tratamento com TNVs melhorou a riqueza e a diversidade bacteriana (Figura 6A-B). Os gráficos da análise de coordenadas principais (PCoA) revelaram que o grupo de tratamento com TNVs apresentou um perfil de microbiota intestinal distinto, em comparação com o grupo DSS (Figura 6C). Subsequentemente, a análise do gráfico de barras da comunidade mostrou a abundância relativa da microbiota no nível de filo e a análise do mapa de calor da comunidade apresentou a abundância relativa dos 50 principais gêneros de microbiota (Figura 6D-E). Os dados no nível de gênero indicaram que o tratamento com TNVs aumentou significativamente a abundância relativa de Akkermansia, Lactobacillus, Clostridia_UCG-014 e Bifidobacterium (Figura 6F), que estão significativamente diminuídos em pacientes com RCU. Além disso, as abundâncias relativas aumentadas de Bacteroides, Escherichia-Shigella, Helicobacter e Staphylococcus induzidas por DSS foram grandemente diminuídas após a administração oral de TNVs (Figura 6G). Coletivamente, as TNVs exerceram atividade terapêutica superior contra a colite através da modulação da microbiota intestinal.
As junções de oclusão (TJs) são essenciais para manter a integridade da barreira intestinal, e seus níveis de expressão diminuem gradualmente durante a RCU. O ensaio de imunofluorescência revelou que o tratamento com TNVs preveniu significativamente a diminuição de E-caderina, ZO-1 e ocludina, em comparação com o grupo DSS (Figura S6). Resultados semelhantes também foram observados em células HT-29 em monocamada (Figura S5A-B). Portanto, as TNVs exibiram atividade anti-colite através da regulação positiva da expressão de proteínas das junções de oclusão e da proteção da função de barreira intestinal.
Os dados de RNA-seq (Figura S7A-F) demonstraram que foi observada uma alteração significativa em muitos genes e houve uma mudança aparente nos genes de expressão diferencial (DEGs), independentemente do grupo saudável, modelo e tratamento com TNVs. A análise de enriquecimento KEGG entre o grupo controle e o grupo DSS mostrou que o número de genes relacionados à via de sinalização PI3K-Akt foi o mais alto, sugerindo que as moléculas a montante e a jusante da via de sinalização PI3K-Akt sofreram muitas alterações. Com base nesses dados, poderíamos rastrear e descobrir medicamentos anticolite direcionados a essa via. De acordo com a análise de enriquecimento KEGG entre os grupos DSS e TNVs, os 3 DEGs mais significativos foram interação citocina-receptor de citocina, linhagem de células hematopoiéticas e moléculas de adesão celular. Os 3 números mais altos foram via de sinalização PI3K-Akt, interação citocina-receptor de citocina e via de sinalização NF-κB. Com base nesses achados, os mecanismos anticolite subjacentes dos TNVs podem ser atribuídos à via de sinalização PI3K-Akt, interação citocina-receptor de citocina, moléculas de adesão celular e via de sinalização NF-κB, o que forneceu insights para explorar as moléculas funcionais nos TNVs.

Os TNVs aliviaram os sintomas relacionados à colite em camundongos com colite crônica induzida por DSS

O efeito terapêutico dos TNVs na colite crônica induzida por DSS foi estudado mais a fundo. Além dos grupos de camundongos saudáveis, os outros camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos (DSS, 5-ASA + DSS, TNVs + DSS) e passaram por três ciclos de tratamento (7 dias de DSS e 14 dias de água destilada). A ilustração esquemática do estabelecimento do modelo e do tratamento medicamentoso é apresentada na Figura 7A. Os parâmetros, incluindo comprimento do cólon, alteração do peso corporal, DAI, atividade da MPO colônica e manifestação patológica, foram registrados e apresentados. O encurtamento do cólon (Figura 7B-C), a perda de peso corporal (Figura 7D) e o DAI (Figura 7E) foram significativamente atenuados após o tratamento com TNVs. Além disso, os camundongos que receberam TNVs reduziram grandemente os níveis elevados de MPO pelo DSS (Figura 7F). Durante a colite crônica, as células imunes são ativadas para proliferar e se acumulam no baço, levando ao aumento do peso do baço. O coeficiente do baço aumentou, portanto, de 0,18 para 0,43 após três ciclos de administração de DSS (Figura 7G). Surpreendentemente, os TNVs preveniram o aumento do peso do baço e até mesmo o recuperaram ao nível dos camundongos saudáveis, demonstrando que a administração oral de TNVs poderia prevenir a esplenomegalia associada ao DSS. As lâminas de coloração H&E dos tecidos do cólon no experimento foram examinadas, com resultados que apoiam que o tratamento com TNVs atenuou proeminentemente a infiltração de células inflamatórias, a ruptura da estrutura do epitélio e a perda de células caliciformes (Figura 7H). Notavelmente, os camundongos do grupo de tratamento com 5-ASA apresentaram alívio dos sintomas relacionados à colite, mas os efeitos colaterais gastrointestinais da administração prolongada de 5-ASA não podem ser ignorados. Em resumo, os TNVs podem lançar luz sobre a eficácia terapêutica prévia e o potencial translacional para o tratamento da colite aguda e crônica.
A avaliação de biossegurança das TNVs em células, zebrafish e camundongos
A biossegurança, como pré-requisito para a tradução clínica de terapêuticas, não é exceção para as TNVs. Primeiramente, foi avaliado o efeito das TNVs em macrófagos Raw 264.7, células HT-29 e células NCM 460 (células epiteliais intestinais normais). Os dados de viabilidade celular mostraram que as TNVs não exibiram citotoxicidade óbvia contra essas 3 linhagens celulares, em concentrações de até 100 μg/mL (Figura 8A-C). Além disso, a biossegurança in vivo foi examinada por administração oral de longo prazo de TNVs em camundongos com colite crônica induzida por DSS. Os resultados de HE dos principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) em todos os grupos não mostraram alterações patológicas aparentes (Figura 8D). Os coeficientes dos órgãos, como um importante índice de toxicidade crônica, também foram calculados e não revelaram significância em todos os grupos (Figura 8E). As concentrações de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), ureia nitrogenada no sangue (BUN), creatinina (CREA) no soro de camundongos com colite crônica submetidos a diferentes tratamentos (Figura S8) estão todas dentro da faixa de referência normal, sugerindo a boa biocompatibilidade das TNVs. Finalmente, a taxa de sobrevivência do zebrafish foi avaliada com tratamento com TNVs na concentração predeterminada por 24 h. Os dados mostraram que as TNVs não afetaram a sobrevivência do zebrafish, mesmo em uma concentração de até 500 μg/mL (Figura 8F). No geral, os achados acima demonstram que as TNVs administradas por via oral têm excelente desempenho de segurança, o que é apropriado para a subsequente tradução clínica.
Discussão
A CU, uma inflamação intestinal idiopática e recorrente, aflige milhares de pacientes e trouxe grande ônus para a economia e o sistema de saúde pública, devido à ampla prevalência e à falta de terapêuticas potentes. Além dos agentes terapêuticos convencionais, novos medicamentos biológicos foram desenvolvidos e testados em ensaios clínicos. No entanto, a eficácia moderada e os possíveis efeitos colaterais limitaram sua aplicação adicional. Recentemente, uma grande quantidade de sistemas de liberação de fármacos sintetizados foi explorada para a terapia da CU. Embora possam se acumular nos locais inflamados do cólon e exibir atividade anti-inflamatória potencial, o uso de solventes orgânicos, a incapacidade de produção em larga escala e as questões de segurança ainda permanecem desafios formidáveis. Aqui, as TNVs foram obtidas a partir de cúrcuma fresca, uma erva medicinal-alimentar comum, com um processo de preparação sem adição de solventes orgânicos e que pode ser facilmente produzido em escala industrial. Portanto, as TNVs podem fornecer uma abordagem simples, versátil, barata e segura para a terapia da CU.
Evidências emergentes indicam que o microbioma intestinal desempenha um papel crucial na patogênese de muitas doenças humanas, incluindo a colite ulcerativa (CU). Nosso trabalho demonstrou que o tratamento com TNVs melhorou significativamente a riqueza e a diversidade bacteriana, aproximando-se até mesmo dos níveis observados em camundongos normais. A abundância reduzida de Lactobacillus, Bifidobacterium e Clostridium também foi aumentada pela administração oral de TNVs. No entanto, nossos estudos atuais estão limitados a camundongos, sendo necessária validação adicional em pacientes com CU. Além disso, os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs), um conjunto de metabólitos gerados pela microbiota intestinal, demonstraram estar intimamente associados a um risco reduzido de CU. Trabalhos futuros também poderão focar nos metabólitos da microbiota intestinal e nas espécies bacterianas específicas moduladas pela administração de TNVs.

Os fatores imunológicos contribuíram significativamente para o início e a progressão da CU. Entre eles, os macrófagos exibem grande plasticidade e podem se diferenciar em muitos subtipos celulares. Os macrófagos M1 apresentam atividade pró-inflamatória, enquanto os macrófagos M2 exercem atividade anti-inflamatória. Estudos recentes sugerem que a polarização dos macrófagos do fenótipo M1 para o M2 poderia ser utilizada para prevenir a lesão tecidual causada pela inflamação. Notavelmente, o tratamento com TNVs inibiu a expressão de CD16/32 e elevou a expressão de CD206 na lâmina própria do cólon. Além dos dois fenótipos de macrófagos bem estabelecidos, outros fenótipos foram subagrupados, e seus mecanismos na prevenção e no tratamento da CU poderão ser estudados mais a fundo. Ademais, outras células imunes, como neutrófilos, células dendríticas, células T auxiliares (Th) 1/2/17 e células T reguladoras (Tregs), exercem um efeito fundamental na inflamação. Ainda é preciso determinar se os TNVs regulam a expressão e a proporção dessas células imunes.

A curcumina, um dos principais constituintes ativos extraídos dos rizomas secos de cúrcuma, apresenta múltiplas funções farmacológicas. A dose de administração oral de curcumina contra colite na literatura variou de 50 a 200 mg/kg. A dose de curcumina em nosso experimento com camundongos foi equivalente a 1,6 mg/kg, valor muito baixo para atingir o nível terapêutico (Tabela S2). Consequentemente, os componentes ativos nos TNVs contra a colite induzida por DSS podem ser atribuídos a outros constituintes, como proteínas ou RNA.

Conclusão
Neste estudo, TNVs foram isoladas, purificadas e caracterizadas como um tipo de vesículas esféricas uniformes e de tamanho nanométrico, compostas por lipídios, proteínas, mRNA e pequenas moléculas. Ensaios in vitro demonstraram que as TNVs podem reduzir a expressão de citocinas inflamatórias e promover a transformação de M1 para M2. De forma importante, as TNVs aliviaram os sintomas relacionados à colite por meio da restauração da barreira do epitélio intestinal, regulação da composição e abundância relativa da microbiota intestinal e remodelação do microambiente imunológico. De modo geral, as TNVs naturais, com grande potencial para produção em larga escala, podem lançar luz sobre uma abordagem segura, viável e eficaz para o tratamento da CU.
Materiais e Métodos
Produtos químicos e reagentes
Cúrcuma fresca foi coletada em Qianwei, Sichuan, China. Sacarose foi adquirida da Aladdin (Xangai, China). Todos os reagentes de cultura celular, incluindo soro fetal bovino (FBS), meio McCoy's 5a, Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), meio RPMI 1640, Penicilina/Estreptomicina (P/S) e tripsina-EDTA 0,25%, foram adquiridos da Gibco. Comprimidos de salina tamponada com fosfato (PBS) foram obtidos da Takara. Perclorato de 3,3ʹ-dioctadeciloxacarbocianina (DiO), iodeto de 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindotricarbocianina (DiR) foram fornecidos pela Bridgen Biotechnology Co., Ltd. Hoechst 33342, Alexa Fluor 488 e 568 foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific. Anticorpos primários anti-ZO-1, anti-ocludina e anti-E-caderina eram da Bioss Biotechnology Co., Ltd (Pequim, China). Interleucina-4 (IL-4) e Interferon-γ (IFN-γ) recombinantes murinos foram obtidos da Peprotech. Sal sódico de sulfato de dextrana (DSS, PM 36-50 kDa, grau para colite) foi fornecido pela MP Biomedicals. Kits de ELISA (TNF-α, IL-6, MCP-1 de camundongo) e o Painel de Inflamação para Camundongo LEGENDplex™ (13-plex) foram adquiridos da Biolegend.
Isolamento e purificação das TNVs
Cúrcuma fresca foi lavada com água corrente e homogeneizada em um triturador. Para remover as partículas grandes de tecido e fibras, o suco de cúrcuma foi obtido por centrifugação diferencial a 1.000 g, 2.000 g, 3.000 g e 10.000 g por 10, 20, 30 e 60 min, respectivamente. Em seguida, o suco obtido foi centrifugado a 150.000 g por 1,5 h, sendo o sedimento ressuspenso por ultrassom e disperso em PBS. Para a purificação das TNVs, a suspensão foi transferida para soluções de gradiente descontínuo de sacarose (8%, 30%, 45% e 60%) e centrifugada a 150.000 g por 1,5 h. Três tipos de TNVs de diferentes bandas foram coletados. As concentrações de proteína das TNVs obtidas foram determinadas utilizando um kit de ensaio de proteína BCA e armazenadas a -80°C para uso posterior.
Caracterização das TNVs
Para a caracterização das TNVs, a distribuição de tamanho, o índice de polidispersão (PDI) e o potencial zeta foram determinados por DLS (Malvern, Worcestershire, WR, Reino Unido). Para observar a morfologia das TNVs, as amostras correspondentes foram coradas com acetato de uranila a 1% (p/v) e imageadas sob TEM (JEM-2100F, Tóquio, Japão).
Análise composicional das TNVs
Análise lipidômica
As TNVs foram submetidas à análise lipidômica utilizando sistema de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada a espectrometria de massas por tempo de voo em tandem (UPLC/TOF-MS). As amostras foram separadas em coluna HSS T3 (150 mm × 2,1 mm, 3 µm; Waters, Milford, EUA); as fases móveis foram 2 mM de formato de amônio e 0,05% de ácido fórmico em água (A) e acetonitrila/isopropanol (1:1, v/v) (B). O programa de gradiente foi: 0-2 min, 2% B; 2-7 min, 2-70% B; 7-14 min, 70-90% B; 14-16 min, 90-100% B; 16-20 min, 100% B. Foram injetados 3 μL de amostra, com fluxo de 0,30 mL/min. A temperatura da coluna foi ajustada para 40°C. A aquisição dos espectros de massa foi realizada nos modos de varredura de íons positivos (ESI+) e negativos (ESI-). As voltagens do capilar de eletropulverização foram definidas em 5500 V (ESI+) e -4500 V (ESI-), a faixa de varredura TOF-MS foi de 70-1000 m/z e a temperatura da fonte de íons foi ajustada para 550°C.
Análise proteômica
As TNVs foram enviadas para a Shanghai Omicsolution Co., Ltd. em gelo seco. As proteínas das TNVs foram analisadas por LC-MS/MS. A amostra foi separada em coluna Acclaim PepMap C18. O programa de eluição foi: 0-60 min, proporção da fase móvel B (0,1% de ácido fórmico em acetonitrila) variando de 4% a 50%. O fluxo foi de 0,3 mL/min e a temperatura da coluna foi de 40°C. Os principais parâmetros dos modos MS e MS/MS foram os seguintes: (1) MS: faixa de varredura (m/z), 350-1600; resolução 60.000; (2) HCD-MS/MS: resolução 150.000. Por fim, o software PEAKS Studio versão X foi utilizado para processar os espectros de massa.
Determinação do conteúdo de curcuminoides nas TNVs
Para extrair os curcuminoides, as TNVs foram misturadas vigorosamente com 9 volumes de metanol e, em seguida, centrifugadas para obtenção do sobrenadante para análise por LC-MS. As amostras foram separadas utilizando coluna Hypersil gold C18 (Thermo Fisher) com temperatura da coluna a 40°C. A fase móvel consistiu em 0,1% de ácido fórmico (v/v) em água (A) e acetonitrila (B). O programa de gradiente foi: 0-2 min, 5% B; 2-25 min, 5-100% B; 25-30 min, 100% B. O fluxo foi de 0,4 mL/min e o volume de injeção foi de 2 μL. Para a análise por ESI-HRMS, utilizou-se o modo de íons positivos ESI. Os principais parâmetros do ESI foram: voltagem do spray de íons, 4,5 kV; temperatura do capilar, 380°C; voltagem do capilar, 35 V. Todos os dados quantitativos deste estudo foram adquiridos utilizando o modo de varredura MS completa.
Estabilidade das TNVs nos fluidos gástrico e intestinal simulados
Fluidos gástricos simulados (SGF) e fluidos intestinais simulados (SIF) foram preparados de acordo com a USP. A fórmula do SGF foi 80 mM de HCl, 35 mM de NaCl, 0,3% de pepsina, pH 1,2 e a do SIF foi 15 mM de NaOH, 50 mM de KH2PO4, 1% de pancreatina, pH 6,8. As TNVs foram dispersas em SGF e SIF na concentração de 0,1 mg/mL. Após incubação a 200 rpm, 37°C por 2 h, o tamanho das partículas das TNVs em ambos os fluidos foi medido por DLS.
Animais e linhagens celulares
Camundongos ICR (fêmeas e machos, 6-8 semanas de idade) foram adquiridos da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de Macau. Todos os estudos com animais foram conduzidos seguindo as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Macau.
Macrófagos murinos Raw 264.7, células epiteliais colônicas NCM 460 e HT-29 foram obtidos da American Type Culture Collection. As células Raw 264.7 foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% (v/v) de SFB. As células NCM 460 e HT-29 foram cultivadas em meio RPMI 1640 e meio McCoy's 5a, respectivamente, ambos contendo 10% (v/v) de SFB e 100 UI/mL de penicilina/estreptomicina. Todas essas células foram cultivadas em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37°C.
Avaliação da citotoxicidade in vitro
Para avaliar a citotoxicidade das TNVs nas células Raw 264.7, NCM 460 e HT-29, foram realizados ensaios com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Primeiramente, as células foram semeadas em uma placa de 96 poços com densidade de 1 × 104 células/poço e incubadas durante a noite para adesão. Em seguida, as TNVs foram diluídas em diferentes concentrações com o meio completo correspondente e adicionadas aos poços. Após incubação por 24 h, os meios contendo TNVs foram substituídos por solução de MTT a 0,5 mg/mL. Após 4 h, as soluções de MTT foram descartadas e, em seguida, 100 μL de DMSO foram adicionados aos poços para dissolver o precipitado. Após agitação por 10 min, as placas foram lidas em um leitor de microplacas multimodo FlexStation 3 a 490 e 570 nm.
Ensaios de captação celular e mecanismo de endocitose
Para observar a captação celular de TNVs marcadas com DiO em células NCM 460 e Raw 264.7, ambas as células foram semeadas a uma densidade de 2 × 105 células/poço em placa de 24 poços e incubadas com TNVs marcadas com DiO por 1, 3 e 6 h. Subsequentemente, as células foram tripsinizadas ou raspadas para formar uma suspensão de células únicas e, em seguida, lavadas três vezes com PBS frio. Por fim, as amostras celulares foram analisadas por citômetro de fluxo (Beckman Cytoflex, EUA). Adicionalmente, ambas as células foram semeadas em placas confocais, incubadas com TNVs marcadas com DiO, lavadas com PBS e coradas com Hoechst 33342 para localização nuclear. As captações celulares das TNVs foram imageadas por microscópio Leica TCS SP8.
Para investigar o mecanismo de endocitose das TNVs em células Raw 264.7 e NCM 460, foram utilizados múltiplos inibidores de endocitose. Em comparação com o ensaio de captação celular acima, ambas as células foram pré-tratadas com vários inibidores por 1 h. Os inibidores e concentrações foram os seguintes: 5 μM de metil-β-ciclodextrina (M-CD), 5 μg/mL de filipina, 10 μg/mL de clorpromazina (CLP), 2 mM de azida de sódio (NaN3), 3 mM de cloridrato de 5-(N,N-dimetil)amilorida (AMH) e 200 μM de genisteína. Além disso, o efeito da baixa temperatura na captação de TNVs por ambas as células também foi estudado. O procedimento de tratamento celular subsequente foi semelhante ao ensaio de captação celular. Finalmente, as células foram analisadas usando citômetro de fluxo e capturadas por microscópio Leica TCS SP8.
Atividade anti-inflamatória das TNVs in vitro
Para estudar a atividade anti-inflamatória das TNVs, células Raw 264.7 foram semeadas a uma densidade de 1 × 10⁵ células/poço em placas de 24 poços e incubadas com TNVs (25 μg/mL), LPS (1 μg/mL) ou meio branco. Após incubação por 24 h, os sobrenadantes foram coletados e os níveis de vários fatores pró-inflamatórios (TNF-α, IL-6, MCP-1) foram determinados utilizando kits de ensaio imunoenzimático (ELISA) correspondentes, de acordo com as instruções do fabricante.
O efeito das TNVs na polarização de macrófagos
Células Raw 264.7 foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 10⁶ células/poço. Foram utilizados 100 ng/mL de LPS e 20 ng/mL de IFN-γ para tratar as células por até 48 h para gerar macrófagos M1. De forma semelhante, 20 ng/mL de IL-4 foram utilizados para estimular as células a gerar macrófagos M2. Para identificar o efeito das TNVs na polarização de macrófagos, as TNVs foram co-tratadas com indutor M1 ou M2. Por fim, as células foram coletadas, bloqueadas e coradas com anticorpos (marcadores de superfície como F4/80, CD11b, CD206) para análise por citometria de fluxo.
A coloração por imunofluorescência das proteínas de junção oclusiva em células monocamada HT-29
Células HT-29 foram semeadas em placa confocal a uma densidade de 2,0 × 10⁴, e então cultivadas em incubadora a 5% de CO₂, 37°C. Os meios de cultura foram substituídos a cada dois dias e a monocamada celular foi formada após 10 dias. Em seguida, a monocamada foi tratada com TNVs e depois fixada, corada e capturada por microscópio confocal para observar o nível de expressão das proteínas de junção oclusiva.
A eficácia terapêutica das TNVs em camundongos com colite aguda induzida por DSS
Antes do experimento, camundongos ICR com 6-8 semanas de idade foram alojados e aclimatados por 7 dias. DSS a 3,5% dissolvido na água de beber foi administrado aos camundongos por 12 dias. Posteriormente, 10 mg/kg de TNVs, 100 mg/kg de 5-ASA ou PBS foram administrados por via oral aos camundongos diariamente, e os camundongos controle receberam apenas água de beber normal. Os sintomas relacionados à colite, incluindo consistência das fezes, peso corporal e sangramento fecal, foram monitorados e registrados diariamente durante o período experimental. No 12º dia, os camundongos foram sacrificados e o cólon inteiro foi coletado. As fezes foram coletadas para análise do microbioma. Cólons distais de 1,0 cm foram fixados em paraformaldeído a 4% e utilizados para avaliação histológica e coloração por imunofluorescência. Outros tecidos do cólon foram utilizados para análise por citometria de fluxo e medição da atividade de MPO e dos níveis de citocinas.
Isolamento de células da lâmina própria e análise por FACS da população de macrófagos
Após o experimento animal, as células foram isoladas da lâmina própria do cólon de camundongos submetidos a diferentes tratamentos, de acordo com um relato anterior. Resumidamente, os cólons foram excisados, cortados ao longo do eixo intestinal, lavados duas vezes com PBS frio e cortados em pequenos pedaços. Em seguida, os pequenos pedaços de cólon foram incubados em HBSS sem Ca/Mg contendo 2 mM de EDTA por três vezes a 37°C por 10 min sob agitação. Depois disso, os tecidos foram digeridos com meio RPMI contendo 20% de SFB, 1 mg/mL de colagenase A e 0,05 mg/mL de DNAase a 37°C por 10 min sob agitação a 200 rpm. Posteriormente, o processo de digestão foi interrompido; as suspensões foram centrifugadas e filtradas em filtros celulares de 100 μm e 40 μm para obter as suspensões de células mononucleares. Por fim, as suspensões de células mononucleares foram bloqueadas e coradas com anticorpos (marcadores de superfície como CD11b, F4/80, CD16/32, CD206) para análise por citometria de fluxo.
Análise do microbioma
Amostras de fezes de camundongos foram enviadas em gelo seco para a Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd. para análise do microbioma. Resumidamente, o DNA genômico foi extraído utilizando o kit E.Z.N.A.® soil DNA. Em seguida, o DNA extraído foi separado em gel de agarose, e o espectrofotômetro UV-vis NanoDrop 2000 foi utilizado para determinar a concentração e a pureza do DNA. Os pares de primers 338F e 806R foram utilizados para amplificar a região hipervariável V3-V4 do gene 16S rRNA bacteriano por meio de um termociclador ABI GeneAmp® 9700 PCR. Os amplicons purificados foram sequenciados na plataforma de sequenciamento Illumina MiSeq utilizando a química PE300. A análise relacionada dos dados de sequenciamento do microbioma do 16S rRNA foi realizada utilizando a Majorbio Cloud Platform (www.majorbio.com).
A eficácia terapêutica dos TNVs em camundongos com colite crônica induzida por DSS
O modelo de colite crônica induzida por DSS foi estabelecido de acordo com um método anterior. Os camundongos foram submetidos a 3 ciclos de tratamento com DSS para induzir colite crônica, cada um consistindo em 1 semana de DSS a 3% seguida por 2 semanas de água potável. Os camundongos foram divididos em 4 grupos: grupo controle (sem qualquer tratamento); grupo modelo, grupo 5-ASA e grupo de tratamento com TNVs. 5-ASA e TNVs foram administrados por via oral a cada intervalo do ciclo, em dias alternados. Durante o período experimental, o peso corporal, a consistência das fezes e o sangramento fecal foram monitorados e registrados. Diferentemente da colite aguda, os principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão e rim) foram excisados, pesados e fixados para exame histológico. Os níveis de ALT, AST, BUN e CREA no soro também foram medidos por analisador bioquímico automático.
Estudo de biodistribuição dos TNVs
Administração oral de TNVs marcadas com DiR foi realizada em camundongos com colite aguda induzida por DSS. Subsequentemente, a distribuição das TNVs foi capturada e imageada pelo sistema de imagem IVIS (Caliper PerkinElmer, Hopkinton, EUA) no ponto de tempo predeterminado. Após isso, os camundongos correspondentes foram sacrificados e seus cólons foram excisados para imageamento ex-vivo. Para estudar mais detalhadamente o efeito terapêutico das TNVs, os camundongos que receberam tratamento medicamentoso também receberam TNVs marcadas com DiR para observar a distribuição da intensidade de fluorescência nos cólons.
Ensaio de atividade da MPO colônica
Os cólons coletados acima foram lavados com PBS frio e então homogeneizados em tampão fosfato de potássio 50 mM frio contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio. A MPO no sobrenadante foi detectada adicionando-se 0,167 mg/mL de dicloridrato de o-dianisidina e 0,005% de H2O2. As alterações na absorbância a 450 nm foram registradas ao longo de 5 min.
Coloração por imunofluorescência
Para a coloração por imunofluorescência, as células e os cortes congelados de cólon foram fixados em paraformaldeído a 4%, permeabilizados com Triton X-100 a 0,1%, bloqueados para proteínas inespecíficas em BSA/PBS a 1% por 1 h e incubados por 12 h a 4°C com anticorpos primários anti-ZO-1, anti-Ocludina e anti-E-caderina nas diluições adequadas. As placas confocais e as lâminas foram então lavadas com PBS e incubadas com Alexa Fluor 488 e/ou Alexa Fluor 568 e Hoechst 33342 durante a noite a 4°C. Finalmente, a monocamada celular corada por fluorescência e os cortes de cólon foram imageados e capturados usando o microscópio Leica TCS SP8.
Coloração histológica
Os cólons dos camundongos e outros órgãos principais foram fixados em paraformaldeído a 4%, então incluídos em parafina, seccionados com 6 μm de espessura e corados com H&E. As imagens foram capturadas usando um Microscópio Biológico Nikon Eclipse Ci com Câmera DS-RI2.
Análise estatística
A análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism 7.0. As diferenças estatísticas foram determinadas pelo teste t de Student não pareado ou ANOVA de uma via com teste post hoc de Bonferroni. Os dados foram apresentados como média ± DP. Valor de P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo, e ns significa não significativo.
Material Suplementar
Abreviaturas
5-ASA
ácido 5-aminossalicílico
AMH
cloridrato de amilorida
CD
grupo de diferenciação
CLP
clorpromazina
DSS
sulfato de dextrana sódico
DLS
espalhamento dinâmico de luz
DAG
diacilgliceróis
DiO
3,3'-dioctadeciloxacarbocianina
DiR
iodeto de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina
DAI
índice de atividade da doença
DMEM
meio Eagle modificado por Dulbecco
ELISA
ensaio de imunoabsorção enzimática
FACS
classificação de células ativadas por fluorescência
FA
ácidos graxos
FBS
soro fetal bovino
GO
Ontologia Genética
HE
hematoxilina-eosina
IBD
doença inflamatória intestinal
IL-6
Interleucina 6
KEGG
Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto
LPS
lipopolissacarídeo
LC-MS
cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas
MTT
brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
M-β-CD
metil-beta-ciclodextrina
MCP-1
proteína quimioatraente de monócitos 1
MPO
mieloperoxidase
OTU
unidades taxonômicas operacionais
PC
fosfatidilcolina
PE
fosfatidiletanolamina
PCoA
análise de coordenadas principais
P/S
penicilina/estreptomicina
PBS
solução salina tamponada com fosfato
PDI
índice de polidispersão
SCFAs
ácidos graxos de cadeia curta
SGF
fluidos gástricos simulados
SIF
fluidos intestinais simulados
TNF
fator de necrose tumoral
TEM
microscópio eletrônico de transmissão
TAG
triacilgliceróis
TJs
junções oclusivas
Th
tipo T auxiliar
Tregs
células T reguladoras
UC
colite ulcerativa
UPLC/TOF-MS
cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas por tempo de voo
Desvendando a patogênese da doença inflamatória intestinal
Compreendendo e prevenindo o aumento global da doença inflamatória intestinal
Atualização sobre a etiologia, patogênese e diagnóstico da colite ulcerativa
Alvos terapêuticos atuais e emergentes para DII
Azatioprina, 6-mercaptopurina na doença inflamatória intestinal: farmacologia, eficácia e segurança
Segurança da terapia anti-fator de necrose tumoral na doença inflamatória intestinal
Farmacoterapias de primeira e segunda linha para pacientes com colite ulcerativa moderada a gravemente ativa: uma metanálise de rede atualizada
Estratégias de liberação de fármacos na terapia da doença inflamatória intestinal
Sistemas de liberação de fármacos nanoparticulados direcionados à inflamação para o tratamento da doença inflamatória intestinal
Evolução e translação clínica de nanomateriais para liberação de fármacos
Vesículas extracelulares: biologia e oportunidades terapêuticas emergentes
Lançando luz sobre a biologia celular das vesículas extracelulares
Papel emergente das vesículas extracelulares em doenças inflamatórias
Diagnóstico por vesículas extracelulares
Vesículas extracelulares para liberação de fármacos
Teranóstica de exossomos: biologia e medicina translacional
Nanovetores derivados de toranja utilizam uma via de tráfego de leucócitos ativados para entregar agentes terapêuticos a sítios tumorais inflamatórios
Nanopartículas derivadas de gengibre comestível: Uma nova abordagem terapêutica para a prevenção e tratamento da doença inflamatória intestinal e do câncer associado à colite
Nanopartícula derivada de brócolis inibe a colite em camundongos ativando a proteína quinase ativada por AMP em células dendríticas
MicroRNAs exossomais derivados de plantas moldam a microbiota intestinal
Nanopartículas derivadas de ginseng alteram a polarização de macrófagos para inibir o crescimento do melanoma
Potencial terapêutico de nanopartículas semelhantes a vesículas derivadas de cebolinho em doenças inflamatórias mediadas pelo inflamassoma NLRP3
Nanopartículas semelhantes a exossomos de alho revertem a obesidade induzida por dieta rica em gordura via eixo intestino/cérebro
Capacidade antioxidante e conteúdo fitoquímico de ervas e especiarias nas formas seca, fresca e em pasta de ervas misturadas
Influência da secagem na qualidade do sabor da hortelã-verde (Mentha spicata L.)
Exossomos de plantas como novas nanoplataformas para transferência de microRNA estimulam a diferenciação neural de células-tronco in vitro e in vivo
Papéis terapêuticos da curcumina: lições aprendidas de ensaios clínicos
Indução com enema de NCB-02 (curcumina) para colite ulcerativa distal leve a moderada - Um estudo piloto randomizado, controlado por placebo
Citocinas na doença inflamatória intestinal
Polarização de macrófagos induzida por quimiocinas em condições inflamatórias
Encurtamento dos telômeros na mucosa colônica de pacientes com colite ulcerativa
O índice simples de atividade clínica da colite do paciente (P-SCCAI) pode detectar a atividade da doença na colite ulcerativa (CU) em remissão: uma comparação do P-SCCAI com o SCCAI baseado no clínico e marcadores biológicos
Atividade da mieloperoxidase do intestino grosso em um modelo equino de colite aguda
Estresse oxidativo e lesões carbonílicas na colite ulcerativa e no câncer colorretal associado
Estado atual da via dos macrófagos M1 e M2 como alvos farmacológicos para a doença inflamatória intestinal
A microbiota colônica está associada à inflamação e às alterações epigenômicas do hospedeiro na doença inflamatória intestinal
Genes e vias microbianas na doença inflamatória intestinal
A microbiota intestinal na DII
Junções oclusivas nas doenças inflamatórias intestinais e no câncer colorretal associado à doença inflamatória intestinal
Indução e ativação de populações imunes adaptativas durante as fases aguda e crônica de um modelo murino de colite experimental
Epidemiologia e fatores de risco para DII
A carga global da DII: de 2015 a 2025
Uma revisão de ponta sobre terapias novas e emergentes para o tratamento da DII
Preocupações e efeitos colaterais da azatioprina durante a terapia de indução e manutenção com adalimumabe em pacientes japoneses com doença de Crohn: uma subanálise de um ensaio clínico randomizado prospectivo [Estudo DIAMOND]
Compreensão do paciente sobre os riscos e benefícios das terapias biológicas na doença inflamatória intestinal: percepções de uma análise em larga escala de plataformas de mídia social
Sistemas de liberação de fármacos direcionados mediados por receptores para o tratamento da doença inflamatória intestinal: oportunidades e estratégias emergentes
Nanotecnologia para a medicina moderna: próximo passo rumo à translação clínica
Microbiota intestinal na patogênese da doença inflamatória intestinal
Regulação epitelial e imunológica intestinal mediada por ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) e sua relevância para as doenças inflamatórias intestinais
Uma nanoterapia com peptídeo pró-resolução para o tratamento localizado da doença inflamatória intestinal por meio da regulação do microambiente pró-inflamatório e da microbiota intestinal
Polarização de macrófagos
Mecanismos celulares e moleculares da curcumina na prevenção e tratamento de doenças
A curcumina alivia a colite induzida por DSS por meio da inibição da ativação do inflamassoma NLRP3 e da produção de IL-1β
Identificação, isolamento e análise de tecidos linfoides associados ao intestino humano
A reína regula a ativação redox-mediada dos inflamassomas NLRP3 na inflamação intestinal por meio da comunicação cruzada ativada por macrófagos
Modelos murinos de inflamação intestinal aguda e crônica induzidos quimicamente
A subunidade NRBF2 do complexo PI3KC3 é necessária para a depuração de células apoptóticas para restringir a inflamação intestinal
Ilustração esquemática do procedimento de preparação e eficácia anticolítica das TNVs. As TNVs exercem potente atividade anti-inflamatória através da restauração da barreira intestinal danificada, modulação da microbiota intestinal e alteração do ambiente imune aberrante da mucosa, especialmente remodelando a condição de polarização dos macrófagos.
Isolamento e caracterização de nanovesículas derivadas de cúrcuma (TNVs). A. Esquema de isolamento e purificação. B. Imagem representativa das TNVs purificadas após centrifugação em gradiente de sacarose. C. Distribuição de tamanho das TNVs de várias bandas entre diferentes concentrações de sacarose. D. Microscopia eletrônica de transmissão das TNVs entre solução de sacarose 30-45%. E. Espectro LC-MS dos curcuminoides nas TNVs.
Distribuição in vivo e ex vivo de TNVs marcadas com DiR. A. Imagem de corpo inteiro dos camundongos em 2, 6, 12 e 24 h após administração oral de TNVs originadas da banda de 8%-30% (esquerda) e 30%-45% (direita). B. Distribuição das TNVs marcadas com DiR no trato gastrointestinal em diferentes pontos de tempo. C. Distribuição das TNVs marcadas com DiR nos cólons distais em diferentes pontos de tempo. D. Imagem de corpo inteiro dos camundongos (saudáveis, induzidos por DSS e tratados com TNVs) em 6 h com tratamento com TNVs marcadas com DiR. E-F. Estatísticas de acúmulo e eficiência radiante das TNVs marcadas com DiR no cólon contendo fezes e sem fezes dissecado de camundongos em diferentes condições. Os dados são apresentados como média ± DP, n = 3. Significância como *P < 0,05.

Mecanismos de internalização celular in vitro, propriedades anti-inflamatórias e o efeito sobre a polarização de macrófagos das TNVs. A-B. Imagens de fluorescência representativas da captação celular de TNVs marcadas com DiO em células NCM 460 e macrófagos Raw 264.7 após co-incubação por 6 h e tratamento adicional com diferentes inibidores por 1 h. C-D. Intensidade de fluorescência da captação celular de TNVs marcadas com DiO em células NCM 460 e macrófagos Raw 264.7 determinada por citometria de fluxo. E.
Atividades anti-inflamatórias in vitro das TNVs em macrófagos Raw 264.7. As concentrações de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6 e MCP-1) foram quantificadas usando ensaio ELISA. F-G. Análise por citometria de fluxo da expressão de CD206 em macrófagos Raw 264.7. Os dados são apresentados como média ± DP, n = 3. Significância como *P < 0,05.
Os TNVs aliviaram os sintomas relacionados à colite em camundongos com colite aguda induzida por DSS. A. O fluxograma representa o estabelecimento do modelo de colite em camundongos e o desenho do tratamento medicamentoso. B-C. Imagens representativas dos cólons e comprimento médio do cólon dos diferentes grupos. D. Alteração do peso corporal expressa como porcentagem do peso no dia zero. E. DAI, F. Atividade de MPO colônica, G. Cortes histológicos representativos dos cólons distais corados com H&E (aumento de 4× e 10×). Dados apresentados como médias ± DP, n = 8. O princípio de determinação do índice de atividade da doença (DAI) é a soma da perda de peso corporal (0- <1%, 1- 15%, 2- 510%, 3- 10~20%, 4- > 20%), consistência das fezes (0- normal, 2- fezes moles, 4- diarreia) e sangramento retal (0- normal, 2- achado positivo, 4- sangramento visível).

Os TNVs atenuaram as respostas inflamatórias intestinais e remodelaram a diferenciação de macrófagos na lâmina própria colônica. A. Produção das citocinas TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1, IL-12p70, IL-1α, IFN-β e IL-10 nos tecidos do cólon. B-C. Análise por FACS de macrófagos F4/80+CD11b+ e a taxa de positividade de CD16/32 e CD206 com gate em macrófagos F4/80+CD11b+ da lâmina própria colônica nos diferentes grupos. Os dados são apresentados como médias ± DP; n = 5. Significância como *P < 0,05.

Os TNVs regularam a composição da microbiota intestinal. A-B. Estimativa da riqueza de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) observadas na comunidade microbiana e diversidade alfa (índices de Chao e Shannon). C. Gráfico de PCoA ilustrando a diversidade beta da microbiota intestinal. D. Abundância relativa da microbiota intestinal. A taxonomia em nível de filo é apresentada como porcentagem do total de sequências. E. Mapa de calor da abundância relativa da taxonomia em nível de gênero para cada camundongo. F-G. Abundância relativa de táxons benéficos e prejudiciais representativos. Os dados são apresentados como médias ± DP; n = 8. Significância como *P < 0,05.

Os TNVs atenuaram os sintomas relacionados à colite em camundongos com colite crônica induzida por DSS. A. O fluxograma representa o estabelecimento do modelo de colite em camundongos e o desenho do tratamento medicamentoso. B-C. Imagens representativas dos cólons e comprimento médio do cólon dos diferentes grupos. D. Alteração do peso corporal expressa como porcentagem do peso no dia zero. E. Atividade de MPO colônica, F. DAI, G. Coeficiente do baço e H. cortes histológicos dos cólons distais corados com H&E (aumento de 4×). Dados apresentados como médias ± DP, n = 5. Significância como *P < 0,05.

Avaliação da biossegurança in vitro e in vivo dos TNVs. A-C. Viabilidades das células Raw 264.7, NCM 460 e HT-29 após incubação com TNVs em diferentes concentrações por 24 h, n = 6. D. Coloração H&E de cortes dos principais órgãos de camundongos Coloração H&E de cortes dos principais órgãos de camundongos tratados com TNVs. E. Os coeficientes dos órgãos, n = 5, e F. A taxa de sobrevivência do peixe-zebra após tratamento com TNVs em diferentes concentrações por 24 h, n = 15. Dados apresentados como médias ± DP.