pmid: "29333119"
title: "Fitoterápicos Oridonin e Ponicidin mostram efeitos aditivos combinados com irradiação no câncer de pâncreas"
authors: "Liermann J, Naumann P, Fortunato F, Schmid TE, Weber KJ, Debus J, Combs SE"
journal: "Radiology and oncology"
pubdate: "2017 Dec"
doi: "10.1515/raon-2017-0048"
source: "PMC Full Text"

Fitoterápicos Oridonin e Ponicidin mostram efeitos aditivos combinados com irradiação no câncer de pâncreas

Autores

Liermann J, Naumann P, Fortunato F, Schmid TE, Weber KJ, Debus J, Combs SE

Periodico

Radiology and oncology (2017 Dec)

Conteudo

Fitoterápicos Oridonina e Ponicidina Mostram Efeitos Aditivos Combinados com Irradiação em Câncer Pancreático in Vitro

Resumo
Contexto
A quimiorradiação do câncer pancreático localmente avançado não metastático pode levar à operabilidade secundária por redução da massa tumoral. Aqui, analisamos os efeitos radiomoduladores da oridonina e da ponicidina em câncer pancreático in vitro. Ambos os agentes são diterpenoides ent-caurânicos, extraídos de Isodon rubescens, uma planta bem conhecida na Medicina Tradicional Chinesa. Efeitos citotóxicos foram recentemente demonstrados em diferentes entidades tumorais para ambos os agentes.
Materiais e métodos
As linhagens celulares de câncer pancreático AsPC-1, BxPC-3, Panc-1 e MIA PaCa-2 foram pré-tratadas com oridonina ou ponicidina e irradiadas com 2 Gy a 6 Gy. A sobrevivência a longo prazo foi determinada por ensaio clonogênico. Os efeitos no ciclo celular e a intensidade de γH2AX como indicador de quebras de fita dupla do DNA foram investigados por citometria de fluxo. Western blotting foi utilizado para estudar as proteínas de reparo de quebras de fita dupla do DNA Ku70, Ku80 e XRCC4.
Resultados
Oridonina e ponicidina levam a uma redução dependente da dose na sobrevivência clonogênica e a um aumento de γH2AX. Combinados com irradiação, observamos efeitos aditivos e uma parada prolongada em G2/M. Nenhuma alteração relevante nos níveis das proteínas de reparo de quebras de fita dupla do DNA foi detectada.
Conclusões
O pré-tratamento com oridonina ou ponicidina seguido de irradiação leva a uma redução adicional na sobrevivência das células de câncer pancreático in vitro, presumivelmente explicada por uma parada prolongada induzida em G2/M. Ambos os agentes parecem induzir quebras de fita dupla do DNA, mas não interagem com a via de junção de extremidades não homólogas (NHEJ).

Introdução
O câncer pancreático é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. A ressecção cirúrgica ainda é a modalidade de tratamento e o fator prognóstico mais importantes, mas no estágio avançado da doença, apenas 10–20% de todos os tumores primários ainda são operáveis. Além da doença primariamente metastática e, portanto, paliativa em estágio IV, 30-40% de todos os casos são tumores localmente avançados, mas não metastáticos, que poderiam se beneficiar do tratamento neoadjuvante. Relatamos recentemente que aproximadamente um terço desses tumores localmente avançados se tornam ressecáveis por uma quimiorradiação neoadjuvante combinada e, assim, recuperam uma opção de terapia curativa. Para aumentar ainda mais a eficácia da radioterapia no câncer pancreático, são necessários novos quimioterápicos que possam sensibilizar o tecido do câncer pancreático à radiação.
Os diterpenoides oridonina e ponicidina são ambos extratos de Isodon rubescens, uma planta usada na Medicina Tradicional Chinesa, conhecida por suas propriedades anti-inflamatórias e antitumorais no tratamento de câncer de esôfago e de cárdia. Recentemente, propriedades antineoplásicas da oridonina e ponicidina foram publicadas. No câncer de pâncreas, a oridonina induz apoptose e leva a uma parada na fase G2/M do ciclo celular. Além disso, a oridonina inibe o fator nuclear-kB. A ponicidina também é conhecida por induzir apoptose, mas, até onde sabemos, não há dados sobre a ponicidina no câncer de pâncreas.
Potencial radiossensibilização pôde ser observada em células V79 de hamster chinês pela oridonina. Além deste estudo, não encontramos nenhuma publicação sobre radiomodulação induzida por oridonina ou ponicidina.
Por serem produtos de ocorrência natural, não são conhecidos efeitos colaterais graves em humanos para ambas as substâncias, o que as qualifica como potenciais novos fármacos quimioterápicos. Dados de um ensaio in vivo para oridonina usada em leucemia aguda parecem confirmar essa hipótese. Aqui, analisamos os efeitos radiomoduladores da oridonina e ponicidina em células de câncer de pâncreas in vitro por ensaio clonogênico, análise do ciclo celular, expressão de γH2AX e análise da expressão de proteínas de reparo do DNA.
Material e métodos
Cultura celular e irradiação
As linhagens celulares de câncer de pâncreas AsPC-1, BxPC-3 e MIA PaCa-2 foram cultivadas em meio RPMI-1640, e a linhagem Panc-1 em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Os meios continham 10% de SFB e 1% de penicilina/estreptomicina. As células foram cultivadas a 37°C em 5% de CO2. As linhagens AsPC-1 e Panc-1 foram adquiridas da CLS cell line service GmbH, Alemanha, e as células BxPC-3 e MIA PaCa-2 da LGC Standards GmbH (ATCC), Alemanha. A oridonina foi obtida da Sigma-Aldrich Corporation, EUA, e a ponicidina da Shanghai Zhanshu Chemical Technology Co., Ltd., China. Ambos os reagentes foram dissolvidos em DMSO e armazenados a −80°C.
As células foram irradiadas com raios X (X-RAD 320, Precision X-Ray, Inc., EUA) operado a 320 kV e 12,5 mA. A taxa de dose média foi de 1,1 Gy/min. O filtro utilizado consistiu em 1,5 mm de Al, 0,25 mm de Cu e 0,75 mm de Sn. Os frascos de cultura de tecido, nos quais as células foram cultivadas, foram colocados sobre uma placa de PMMA de 1 cm de altura.
Ensaio clonogênico
Para avaliar a sobrevivência celular a longo prazo, um número definido de células foi semeado em frascos de cultura de tecido de 25 cm² e incubado por 24 horas. As contagens celulares foram ajustadas para os diferentes esquemas de tratamento. As linhagens celulares AsPC-1, BxPC-3 e Panc-1 foram tratadas com oridonina, ponicidina ou DMSO (controle) por 24 horas, conforme indicado, e irradiadas posteriormente uma vez com 2 Gy ou 6 Gy. A dose de cada substância e a intensidade da irradiação foram estabelecidas por meio de pré-experimentos para atingir uma taxa de sobrevivência de 20-70% após o tratamento isolado. As células MIA PaCa-2 foram pré-tratadas com doses mais baixas de oridonina e ponicidina devido à maior sensibilidade aos reagentes. De 8 a 9 dias (o tempo varia entre as linhagens celulares) após o tratamento, as células foram fixadas em etanol 70% e coradas com azul de metileno a 0,2%. As colônias, definidas como contendo pelo menos 50 células, foram contadas manualmente sob microscópio óptico, e a eficiência de plaqueamento, definida como o quociente entre as colônias contadas e as células plaqueadas, foi determinada. A fração de sobrevivência foi definida como a razão entre a eficiência de plaqueamento de cada experimento e a do seu controle. As células foram plaqueadas em triplicata para compensar erros de pipetagem, e pelo menos três experimentos independentes foram realizados.

Determinação da radiossensibilidade
Para analisar os tratamentos combinados, as frações de sobrevivência foram normalizadas em relação aos valores do tratamento isolado com o reagente correspondente, utilizando a razão entre a eficiência de plaqueamento do tratamento combinado e a do tratamento isolado com o reagente. As curvas dose-resposta foram criadas utilizando o modelo linear-quadrático.

Os efeitos da combinação foram analisados definindo-se a aditividade de acordo com Steel e Peckham. Para esse fim, foi calculada uma curva dose-resposta que representa o curso da curva controle medida em um pré-efeito semelhante ao efeito do tratamento isolado com o reagente ("curva controle teórica"). Os efeitos aditivos foram definidos como a área entre a curva controle medida e a curva teórica. Os efeitos supra-aditivos foram definidos como abaixo da curva controle teórica, e os efeitos radioprotetores, como acima da curva controle medida. A toxicidade independente foi definida como uma curva idêntica à curva controle medida (para mais informações, consulte a Figura Suplementar 1).

Análise do ciclo celular
Uma vez que o impacto na distribuição do ciclo celular estava regredindo 24 horas após o pré-tratamento, foi escolhido um tempo de exposição mais curto à oridonina e à ponicidina em comparação com os outros experimentos. Simultaneamente, a dosagem foi aumentada para compensar a redução no tempo de exposição. As linhagens celulares Panc-1 e MIA PaCa-2 foram pré-tratadas por duas horas com oridonina, ponicidina ou DMSO (controle) e irradiadas conforme indicado. Para induzir um dano menos letal do que o esperado com 6 Gy, foi escolhida uma dose de irradiação de 4 Gy. As células foram então fixadas em etanol gelado e as fitas de RNA foram clivadas pela RNase A (AppliChem GmbH, Alemanha) nos seguintes momentos: início do tratamento, antes da irradiação, 12 e 24 horas após a irradiação. Em seguida, as células foram coradas com iodeto de propídio (Sigma-Aldrich Corporation, EUA) e a quantidade de iodeto de propídio por célula foi quantificada em um citômetro de fluxo (FACScan, Becton Dickinson and Company, EUA). Pelo menos 104 células não selecionadas (ungated) foram analisadas pelo BD CellQuest Pro 4.0.2 (Becton Dickinson and Company, EUA) e as diferentes fases do ciclo celular foram determinadas usando o software ModFit LT 3.0 (Verity Software House, Inc., EUA). Pelo menos dois experimentos independentes foram realizados.

γH2AX-quantificação
Uma vez que os ensaios clonogênicos revelaram sensibilidade diferente entre as células AsPC-1, BxPC-3 e Panc-1, por um lado, e as células MIA PaCa-2, por outro, foram realizados experimentos adicionais com as linhagens celulares Panc-1 e MIA PaCa-2. Para quantificar a indução de quebras de fita dupla do DNA, as células Panc-1 e MIA PaCa-2 foram pré-tratadas com oridonina, ponicidina ou DMSO (controle) por 24 horas e irradiadas uma vez, conforme indicado. Em diferentes momentos após a irradiação, as células MIA PaCa-2 e Panc-1 foram fixadas usando PFA a 1% e etanol gelado. As células foram então coradas com um anticorpo anti-γH2AX (art. nº 16-202A, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) e a intensidade pan-nuclear foi medida usando um citômetro de fluxo. Os resultados foram normalizados criando-se uma razão entre a intensidade medida e a intensidade das amostras controle. Pelo menos três experimentos independentes foram realizados.

Western Blot
As linhagens celulares Panc-1 e MIA PaCa-2 foram tratadas com oridonina, ponicidina ou DMSO (controle) por 24 horas. Em seguida, os lisados celulares foram obtidos utilizando tampão de lise (10 mM HEPES pH 7,4, 5 mM CHAPS, 5 mM DTT) e inibidores (PMSF, Pepstatina, Leupeptina, Aprotinina). A concentração de proteínas foi determinada pelo ensaio de proteínas de Bradford e 20 μg a 30 μg de proteína foram utilizados para os Western blots. Foi realizada eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS utilizando géis de poliacrilamida a 12% com voltagem de 160 V e amperagem de 250 mA. Uma transferência úmida foi realizada (80 V, 60 mA) para transferir as proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno. A membrana foi bloqueada com Roti-Block (Carl Roth. GmbH & Co. KG, Alemanha). Os anticorpos primários β-actina (art. n.º 4967), GAPDH (art. n.º 2118), Ku70 (art. n.º 4588) e Ku80 (art. n.º 2753) foram adquiridos da Cell Signaling Technology Inc., EUA. O anticorpo XRCC4 (art. n.º sc-271087) e os anticorpos secundários (art. n.º sc-2380, sc-2379) foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology, Inc., EUA. A diluição foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Os filmes de raios X foram escaneados e a densidade das bandas proteicas foi determinada com o software ImageJ 1.47V (National Institute of Health, EUA). A densidade foi normalizada criando-se uma razão entre a banda da proteína e a da proteína de referência (housekeeping) para evitar diferenças mínimas na quantidade de proteína carregada. Em seguida, outra razão entre o valor do tratamento e seu controle foi calculada, permitindo quantificar as densidades e as diferenças entre os tratamentos. Pelo menos dois experimentos independentes foram realizados.
Análise estatística
Os resultados de cada experimento foram gerados conforme descrito acima. A análise estatística dos resultados foi realizada com o teste t não pareado bicaudal utilizando o Microsoft® Excel® 2008 para Mac 12.3.6 (Microsoft Corporation, EUA). As curvas de dose-controle e as figuras foram calculadas e geradas com o SigmaPlot 12.0 (Systat Software Inc., EUA). Os resultados são apresentados como valores médios ± desvio padrão. P < 0,05 foi considerado como diferença significativa entre os resultados comparados. *P < 0,05, **P < 0,005, ***P < 0,001.
Resultados
A oridonina e a ponicidina reduzem a sobrevivência clonogênica e apresentam efeitos aditivos quando combinadas com irradiação
Para investigar a sobrevivência a longo prazo, as células foram tratadas com oridonina ou ponicidina em uma dose baixa de 0,5 μg/ml e dose alta de 2,5 μg/ml (Figura 1A). Como as células MIA PaCa-2 apresentaram maior sensibilidade tanto à oridonina quanto à ponicidina, utilizamos 0,1 μg/ml e 0,5 μg/ml como dose baixa e alta, respectivamente, nessas células. As células MIA PaCa-2 mostraram uma redução significativa na sobrevivência clonogênica para uma fração de 51% quando tratadas com a dose mais baixa de oridonina e, portanto, foram muito mais sensíveis do que as outras linhagens celulares, com uma fração de sobrevivência média de 88% nas células AsPC-1, BxPC-3 e Panc-1 (Figura Supl. 2). Curiosamente, a ponicidina foi mais eficaz do que a oridonina: 2,5 μg/ml de ponicidina levaram a uma fração de sobrevivência média de 12%. A mesma quantidade de oridonina mostrou uma fração de sobrevivência quase três vezes maior, de 32%, nas células AsPC-1, BxPC-3 e Panc-1 (Figura Supl. 3).
Sobrevivência clonogênica das células Panc-1 tratadas com irradiação e/ou oridonina (ORI) e ponicidina (PON), conforme indicado. (A) curvas de sobrevivência e (B) radiossensibilidade a diferentes doses com curva controle medida e teórica, de acordo com Steel e Peckham para células Panc-1. Os resultados são apresentados como valores médios +/− desvio padrão. Pelo menos três experimentos independentes foram realizados.
Uma redução adicional dependente da dose na sobrevivência pôde ser observada pela combinação com irradiação. A fração de sobrevivência média de 88% após tratamento único com dose baixa de oridonina pôde ser ainda mais atenuada por irradiação adicional com 2 Gy ou 6 Gy para médias de 63% e 13%, respectivamente.
Utilizando esses resultados, investigamos a radiossensibilidade de acordo com o modelo de Steel e Peckham, conforme descrito na seção de métodos. A dose mais alta de oridonina e ponicidina levou a efeitos aditivos em quase todas as linhagens celulares investigadas quando combinada com irradiação de 2 Gy ou 6 Gy, enquanto a dose mais baixa mostrou apenas toxicidade independente (Figura 1B e Figura Supl. 4). Não foram observados radioproteção nem supra-aditividade.
Parada em G2/M após tratamento combinado de radiação e oridonina ou ponicidina
Para determinar as alterações no ciclo celular, as quatro linhagens de câncer pancreático foram tratadas com oridonina ou ponicidina isoladamente, bem como em combinação com irradiação. As fases do ciclo celular foram analisadas 12 e 24 horas após a irradiação. O pré-tratamento com oridonina (Figura 2A) ou ponicidina (Figura 2B) induziu uma clara parada em G2/M das linhagens AsPC-1 e Panc-1 após 12 horas, com até 36% (Figura 2 e Figura Supl. 5). A fração G2/M dos tratamentos combinados não foi tão alta quanto a observada após irradiação isolada, mas aumentou com o tempo, levando ao fato de que 24 horas após a irradiação ainda havia uma clara parada em G2/M nas linhagens AsPC-1, BcPC-3 e Panc-1 quando tratadas com a terapia combinada. As células MIA PaCa-2 apresentaram uma clara parada em G2/M 24 horas após o tratamento combinado com ponicidina, mas não com oridonina (Figura Supl. 5). Não observamos uma fração sub-G1 como indicador de apoptose.

Ensaio de ciclo celular das células Panc-1 tratadas com irradiação e/ou (A) oridonina (ORI) e (B) ponicidina (PON), conforme indicado. Os resultados são apresentados como valores médios +/− desvio padrão. *P<0,05, **P<0,005, asterisco referindo-se à quantidade de células na fase G2/M. Pelo menos dois experimentos independentes foram realizados.

Oridonina e poncidina induzem um aumento da intensidade pan-nuclear de γH2AX

A potencial influência da oridonina ou ponicidina no reparo de quebras de fita dupla do DNA foi analisada medindo-se a intensidade pan-nuclear de γH2AX de células pré-tratadas por citometria de fluxo. Tanto a oridonina (Figura 3A) quanto a poncidina (Figura 3B) levaram a um aumento de aproximadamente 2,5 vezes na intensidade de γH2AX logo após o tratamento, independentemente do nível de dose específico (7,5 μg/mL vs. 15 μg/mL). Houve um aumento de γH2AX após irradiação isolada, mas as maiores intensidades de γH2AX foram observadas nos tratamentos combinados. A intensidade de γH2AX já diminuiu 10 horas após o tratamento. Não pudemos observar diferença na redução relativa da intensidade de γH2AX entre irradiação isolada e tratamentos combinados.

Intensidade de γH2AX das células Panc-1 e MIA PaCa-2 tratadas com irradiação e/ou (A) oridonina (ORI) e (B) ponicidina (PON), conforme indicado. Os resultados são apresentados como valores médios +/− desvio padrão. *P<0,05, **P<0,005, ***P<0,001, n.s.=não significativo. Pelo menos três experimentos independentes foram realizados.

Oridonina e ponicidina não influenciam a expressão de proteínas de reparo do DNA relacionadas à via de junção de extremidades não homólogas (NHEJ)

Para determinar a influência da oridoinina ou ponicidina no reparo de quebras de fita dupla do DNA, células Panc-1 e MIA PaCa-2 foram tratadas com cada um dos agentes e três proteínas principais da via NHEJ, a saber, XRCC4, Ku70 e Ku80, foram detectadas por Western Blot. O pré-tratamento com oridoinina ou ponicidina levou a uma leve redução da expressão de XRCC4, mas não houve alteração considerável na expressão das proteínas Ku70 e Ku80 nas células MIA PaCa-2. As células Panc-1 não apresentaram efeito significativo na expressão da proteína XRCC4, mas um aumento dose-dependente de Ku70 e Ku80 após o pré-tratamento com oridoinina ou ponicidina (Figura 4).
Western Blots de células Panc-1 e MIA PaCa-2 tratadas com (A) oridoinina (ORI) e (B) ponicidina (PON) conforme indicado. Um Western Blot representativo é mostrado. Pelo menos dois experimentos independentes foram realizados. NHEJ = non-homologous end-joining.
Discussão
O objetivo deste estudo foi investigar os dois fitoterápicos oridoinina e ponicidina quanto à sua capacidade de potencializar os efeitos da irradiação em células de câncer pancreático. Em comparação com outras entidades tumorais, as células de câncer pancreático são mais resistentes à quimioterapia e à radioterapia e, portanto, agentes radiossensibilizantes são altamente relevantes clinicamente.
Para investigar a eficácia do tratamento, a sobrevida a longo prazo foi determinada por ensaios clonogênicos. Alterações na distribuição do ciclo celular e a intensidade de γH2AX como indicador de quebras de fita dupla do DNA foram investigadas por citometria de fluxo, uma vez que os efeitos da radioterapia baseiam-se predominantemente na indução de quebras de fita dupla do DNA. Western blotting foi utilizado para estudar proteínas-chave da via NHEJ do reparo de quebras de fita dupla do DNA. Até onde sabemos, somos os primeiros a testar a ponicidina em combinação com irradiação, enquanto potenciais efeitos radiossensibilizantes da oridoinina já puderam ser observados em células V79 de hamster chinês.
Após o tratamento com oridoinina ou ponicidina, observamos uma redução dose-dependente da sobrevida clonogênica em todas as linhagens celulares de câncer pancreático testadas AsPC-1, BxPC-3, MIA PaCa-2 e Panc-1. Em comparação com a oridoinina, doses iguais de ponicidina foram mais eficazes na redução da sobrevida clonogênica. Resultados semelhantes foram observados por Hsieh et al. em ensaios de sobrevida clonogênica da linhagem celular de câncer de mama MCF-7, que também testaram ambos os agentes em ensaios de proliferação com resultados comparáveis de oridoinina e ponicidina. Com base nesses dados, inferimos que a ponicidina pode ser um agente citostático mais potente do que a oridoinina.
Após o tratamento combinado com irradiação e diferentes concentrações de oridoinina ou ponicidina, observamos uma redução aumentada da sobrevida clonogênica. A análise das potenciais interações revelou uma tendência a efeitos aditivos para a concentração mais elevada de oridoinina, bem como de ponicidina. Efeitos supra-aditivos que fornecem evidência de radiossensibilização real não puderam ser observados.
Os ensaios de ciclo celular do presente estudo mostraram que tanto a oridonina quanto a ponicidina levam a um acúmulo de células na fase G2/M do ciclo celular. A combinação de irradiação e oridonina ou ponicidina leva a uma parada ainda mais prolongada em G2/M. As células que ficam retidas nessa fase geralmente apresentam lesões no DNA, como quebras de fita dupla do DNA ou forquilhas de replicação bloqueadas, que precisam ser reparadas antes de passar pelo ponto de verificação G2/M. Uma parada em G2/M induzida por oridonina foi previamente relatada por Qi et al. para a linhagem celular de câncer pancreático Panc-1, juntamente com uma supressão das proteínas reguladoras do ciclo celular ciclina B1 e cdc2. Em nosso estudo, focamos nas quebras de fita dupla do DNA como mecanismo subjacente, especialmente após a combinação com irradiação. Portanto, não investigamos alterações nas proteínas de regulação do ciclo celular, mas experimentos adicionais devem identificar o modo preciso de parada na fase G2/M induzida por oridonina e ponicidina. Como a indução de apoptose foi relatada tanto para oridonina quanto para ponicidina, esperávamos um pico sub-G1 na análise do ciclo celular, mas não observamos nenhum pico no ruído sub-G1. Curiosamente, os ensaios de ciclo celular de Qi et al. para células PANC-1 tratadas com oridonina também não mostraram nenhum pico sub-G1.
A quantificação pan-nuclear de γH2AX analisada revelou uma intensidade de γH2AX duas vezes maior após o tratamento com oridonina ou ponicidina. Esse aumento no nível de γH2AX foi independente do nível de dose específico de oridonina e ponicidina. Combinados com irradiação, tanto a oridonina quanto a ponicidina levam a uma quantidade ainda maior de γH2AX. A determinação pan-nuclear de γH2AX é apenas um indicador indireto da indução de quebras de fita dupla do DNA, mas é comparável à quantificação de focos de γH2AX, que é conhecida por ser altamente suspeita para a indução de quebras de fita dupla do DNA. Consequentemente, a oridonina e a ponicidina, assim como a irradiação, parecem induzir quebras de fita dupla do DNA. Além dos possíveis efeitos sobre as proteínas da fase do ciclo celular, como sugerido por Qi et al., a indução de quebras de fita dupla do DNA é uma boa explicação para a parada em G2/M observada. Um aumento já descrito de γH2AX em células BxPC-3 tratadas com oridonina e uma concentração aumentada de γH2AX em células de câncer de mama expostas à irradiação estão de acordo com nossos dados atuais.
Ao comparar as intensidades de γH2AX em diferentes momentos, o nível de γH2AX dos esquemas de tratamento combinado diminuiu de forma bastante semelhante ao do tratamento apenas com irradiação. Portanto, temos que concluir que a oridonina e a ponicidina não reduzem significativamente a capacidade de reparo das quebras de fita dupla do DNA. Para verificar isso, proteínas do reparo de quebras de fita dupla do DNA foram detectadas por Western Blot. Como se sabe que as células de câncer de pâncreas apresentam apenas fraca atividade da via de recombinação homóloga, concentramo-nos nas proteínas-chave da NHEJ. Não houve alterações relevantes na quantidade de Ku70, Ku80 ou XRCC4 nas células tratadas com oridonina ou ponicidina, apoiando a hipótese de que a oridonina e a ponicidina não reduzem os mecanismos de reparo de quebras de fita dupla do DNA. Estudos adicionais devem investigar se a oridonina ou a ponicidina interferem com proteínas da via de recombinação homóloga do reparo de quebras de fita dupla do DNA, como RAD51 ou o complexo MRE11/RAD50/NBS1.

Recentemente, Wang et al. demonstraram efeitos sinérgicos de um derivado da oridonina e paclitaxel por meio do aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) e subsequente indução de apoptose. Cao et al. observaram um efeito sinérgico de cetuximabe e oridonina por meio do aumento dos níveis de ROS e inibição do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Sabe-se que a ativação de ROS é um dos principais efeitos da irradiação no tratamento do câncer. Esses achados reforçam a ideia de esquemas de tratamento combinado com oridonina e irradiação.

Na próxima etapa, ambas as substâncias devem ser testadas em combinação com as quimioterapias padrão atuais, como gencitabina ou FOLFIRINOX. Por fim, são necessários dados in vivo para revelar se a eficácia da irradiação em pacientes com câncer de pâncreas pode ser melhorada pela oridonina e ponicidina.

Conclusões
Os dados atuais demonstram novos aspectos dos dois interessantes fitoterápicos oridonina e ponicidina. In vitro, ambas as substâncias são altamente eficazes contra células de câncer de pâncreas, especialmente quando combinadas com irradiação. Portanto, tanto a oridonina quanto a ponicidina são agentes promissores na terapia do câncer de pâncreas. Nossos dados justificam investigações adicionais in vivo, especialmente em combinação com irradiação ou quimioterapia padrão, como FOLFIRINOX ou gencitabina e nab-paclitaxel.

Declaração: Nenhum potencial conflito de interesses foi divulgado.

Detalhes do Material Suplementar

Referências
Estatísticas do câncer
Terapia neoadjuvante para câncer de pâncreas
Terapia pré-operatória/neoadjuvante no câncer de pâncreas: uma revisão sistemática e meta-análise das porcentagens de resposta e ressecção
Desfecho após quimiorradiação neoadjuvante e correlação com o estado nutricional em pacientes com câncer de pâncreas localmente avançado
Diterpenoides ent-caurânicos de Isodon rubescens var. lushanensis
Visão molecular dos efeitos multifuncionais da oridonina
Avanços recentes na base molecular dos mecanismos antineoplásicos da oridonina
Diterpenoides ent-caurânicos de Rabdosia rubescens e seus efeitos citotóxicos em linhagens celulares de câncer humano
Oridonina inibe o crescimento de células BxPC-3 por meio de apoptose celular
A nanosuspensão de oridonina foi mais eficaz do que a oridonina livre na parada do ciclo celular em G2/M e na apoptose na linhagem celular de câncer pancreático humano PANC-1
Oridonina induz apoptose em células de câncer pancreático SW1990 via indução de p38 MAPK dependente de p53 e caspase
Oridonina potencializa a atividade antitumoral da gencitabina no câncer pancreático por meio da via de sinalização MAPK-p38
Oridonina, um diterpenoide purificado de Rabdosia rubescens, inibe a proliferação de células de neoplasias linfoides associada ao bloqueio das vias de sinalização do NF-kappa B
Ponicidina, um diterpenoide ent-caurânico derivado de um constituinte do suplemento herbal PC-SPES, Rabdosia rubescens, induz apoptose por ativação da caspase-3 e eventos mitocondriais em células de câncer de pulmão in vitro
Ponicidina inibe o crescimento de células de leucemia monocítica por indução de apoptose
Ponicidina inibe o crescimento celular em células de carcinoma hepatocelular por indução de apoptose
Ponicidina induz apoptose via vias de sinalização JAK2 e STAT3 no carcinoma gástrico
Efeito da oridonina, um diterpenoide de Rabdosia, na radiossensibilização com misonidazol
Oridonina, um diterpenoide extraído de ervas medicinais, tem como alvo a proteína de fusão AML1-ETO e apresenta potente atividade antitumoral com baixos efeitos adversos na leucemia t(8;21) in vitro e in vivo
Prevendo valores realistas de EBR para esquemas de radioterapia clinicamente relevantes
Mecanismos exploráveis na combinação radioterapia-quimioterapia: o conceito de aditividade
Vias moleculares: superando a resistência à radiação por meio do direcionamento das vias de resposta a danos no DNA
Controle diferencial do crescimento, progressão do ciclo celular e expressão de NF-kappaB em células de câncer de mama humano MCF-7, MCF-10A e MDA-MB-231 por ponicidina e oridonina, diterpenoides da erva chinesa Rabdosia rubescens
Morte celular induzida por dano ao DNA: de lesões específicas no DNA à resposta a danos no DNA e apoptose
Expressão da histona H2AX fosforilada em linhagens celulares cultivadas após exposição a raios X
Detecção quantitativa de quebras de fita dupla no DNA induzidas por (125)IdU com anticorpo gama-H2AX
O dano ao DNA induzido por oridonina envolve parada do ciclo celular na fase G2/M em células MCF-7 humanas
A inibição do reparo por junção de extremidades não homólogas prejudica o crescimento do câncer pancreático e aumenta a resposta à radiação
Geridonina e paclitaxel atuam sinergicamente para inibir a proliferação de células de câncer gástrico por meio da regulação da via PTEN/PI3K/Akt mediada por ROS
O tratamento combinado de oridonina com cetuximabe apresenta efeitos anticancerígenos sinérgicos no carcinoma espinocelular de laringe: envolvimento da inibição do EGFR e ativação da via JNK mediada por espécies reativas de oxigênio