pmid: "32038557"
title: "Papilomavírus Humano E6 e E7: As Marcas do Câncer Cervical e Alvos para Terapia"
authors: "Pal A, Kundu R"
journal: "Frontiers in microbiology"
pubdate: "2019"
doi: "10.3389/fmicb.2019.03116"
source: "PMC Full Text"

Papilomavírus Humano E6 e E7: As Marcas do Câncer Cervical e Alvos para Terapia

Autores

Pal A, Kundu R

Periodico

Frontiers in microbiology (2019)

Conteudo

E6 e E7 do Papilomavírus Humano: As Marcas Registradas do Câncer Cervical e Alvos para Terapia
O câncer cervical induzido pelo papilomavírus humano (HPV) é um grande problema de saúde entre mulheres dos setores pobres/subdesenvolvidos do mundo. Ele é responsável por uma alta taxa de mortalidade devido ao diagnóstico tardio e ao prognóstico desfavorável. O estabelecimento inicial e a progressão subsequente dessa forma de câncer são completamente dependentes de dois oncogenes principais, E6 e E7, que são expressos constitutivamente, levando à tumorigênese. Assim, a manipulação desses genes representa a forma mais bem-sucedida de terapia para o câncer cervical. No presente artigo, foram revisadas informações sobre as dimensões estruturais, funcionais e clínicas da atividade de E6 e E7. A organização genômica e a estrutura proteica de E6 e E7 foram discutidas, seguidas pelo mecanismo pelo qual estabelecem as seis principais marcas registradas do câncer nos tecidos cervicais para a propagação tumoral. A seção posterior deste artigo de revisão aborda os diferentes modos de terapêutica que atuam desregulando a atividade de E6 e E7. Uma vez que E6 e E7 são os biomarcadores de uma célula de câncer cervical e são os responsáveis por impulsionar a progressão do câncer, as abordagens terapêuticas direcionadas a E6 e E7 demonstraram ser altamente eficientes em termos de remoção focada de células malignas com proliferação anormal. Terapêuticas que incluem diferentes formas de vacinas até técnicas avançadas de edição genômica, que suprimem a atividade de E6 e E7, mostraram-se capazes de reduzir com sucesso a população de células de câncer cervical infectadas pelo HPV. A imunoterapia mediada por células T é outra forma de tratamento bem-sucedida e emergente para erradicar células tumorigênicas infectadas pelo HPV. Além disso, terapêuticas utilizando compostos naturais de plantas ou de outros repositórios naturais, ou seja, abordagens fitoterapêuticas, também foram revisadas aqui, as quais comprovam seu potencial anticancerígeno por meio de efeitos inibitórios sobre E6 e E7. Portanto, a repressão de E6 e E7 por qualquer um desses métodos é uma abordagem significativa para a terapia do câncer cervical, descrita em detalhes nesta revisão, juntamente com uma visão das vias de sinalização e do mecanismo molecular de ação de E6 e E7.
O câncer cervical continua a aumentar como uma preocupação global, com cerca de 570.000 casos diagnosticados e 311.000 mortes registradas no ano de 2018. Embora essa forma de câncer tenha começado a mostrar um declínio nos países desenvolvidos, ainda é a causa do maior número de mortes por câncer entre mulheres em cerca de 43 países menos desenvolvidos. Cerca de 85% de todas as mortes por câncer cervical provêm desses países de baixa renda, sendo 18 vezes maior do que nos países desenvolvidos. Essa incongruência na taxa de mortalidade entre os países desenvolvidos e os em desenvolvimento/subdesenvolvidos deve-se à falta de conscientização adequada, programas de rastreamento, inacessibilidade a diagnósticos adequados e procedimentos de tratamento eficientes, juntamente com uma maior exposição aos fatores de risco que levam ao câncer cervical. Além do principal fator de risco – a infecção pelo papilomavírus humano (HPV) –, condições precárias de higiene, tabagismo, uso de contraceptivos orais, exposição ao dietilestilbestrol (DES) e predisposição genética são particularmente comuns entre mulheres de baixo nível socioeconômico. Tal cenário clínico definitivamente exige uma abordagem terapêutica direcionada, barata e acessível. A abordagem terapêutica direcionada tem como alvo o principal fator responsável pelo câncer cervical, ou seja, a infecção por HPV. Embora a infecção por HPV não possa induzir isoladamente a carcinogênese cervical, ela é um pré-requisito primário para a maioria dos casos de câncer cervical. Esta revisão discute detalhadamente o genoma do papilomavírus humano e seus principais oncogenes E6 e E7, ou seja, os construtores das seis marcas registradas do câncer, juntamente com uma visão mais aprofundada das implicações clínicas da interrupção de E6 e E7 por meio de técnicas modernas de edição genômica ou métodos fitoterápicos. Assim, este artigo tenta abranger todas as características estruturais e as funções biológicas dos oncogenes E6 e E7, juntamente com seu papel como alvo terapêutico, ajudando a reunir um conhecimento abrangente sobre E6 e E7.
Papilomavírus Humano e Câncer Cervical
Os papilomavírus humanos da família Papillomaviridae pertencem a uma categoria de pequenos vírus de DNA circular de fita dupla, não envelopados, medindo 50–55 nm de diâmetro. A categoria inclui 300 genótipos diferentes, dos quais 200 são conhecidos por serem prejudiciais à humanidade. A partir da comparação da sequência de nucleotídeos das ORFs L1 de 118 tipos de papilomavírus, os papilomavírus foram classificados pela equipe de em gêneros, espécies, tipos e subtipos. Incluindo as modificações propostas por, os papilomavírus humanos foram agrupados em cinco gêneros: alfa (65 tipos, incluindo HPV16, 18, 31, 33, etc.), beta (53 tipos, incluindo HPV5, 9, 49, etc.), gama (98 tipos, incluindo HPV4, 48, 50, etc.), mu (3 tipos, incluindo HPV1, HPV63 e HPV 204) e nu (HPV41; www.hpvcenter.se, acessado em 19 de dezembro de 2019). Entre eles, os alfa-papilomavírus são o grupo de papilomavírus mais comumente focado, pois são conhecidos por serem responsáveis por 5% das ocorrências de câncer em todo o mundo. Eles são subdivididos em tipos cutâneos ou mucosos, com base em sua capacidade de infectar as células epiteliais da pele ou o revestimento interno dos tecidos, respectivamente, e em tipos de baixo risco ou alto risco, dependendo de sua associação com câncer cervical ou lesões pré-cancerosas. Os HPVs de alto risco incluem HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59 do gênero alfa mucoso, classificados como carcinógenos do Grupo 1; enquanto o HPV68 é considerado um provável carcinógeno humano do grupo 2A, com evidências humanas limitadas. Por outro lado, HPV26, 30, 34, 53, 66, 67, 69, 70, 73, 82, 85 e 97 são considerados possíveis carcinógenos do grupo 2B pela Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC), com relatos epidemiológicos limitados. Entre os tipos de alto risco, o HPV 16 é, sem dúvida, o genótipo mais frequentemente detectado em 60,5% dos casos de câncer cervical, seguido pelo HPV18.
Felizmente, os cânceres infectados pelo HPV tornaram-se preveníveis com a descoberta de vacinas profiláticas. Existem três dessas vacinas acessíveis nas farmácias: Cervarix (GlaxoSmithKline), Gardasil (Merck Inc.) e Gardasil 9 (Merck Inc.), que podem ter como alvo 2, 4 ou 9 tipos diferentes de HPV, respectivamente. Ao mesmo tempo, a tabela de mortalidade por câncer cervical, no entanto, não reflete o sucesso clínico desse processo de vacinação. A explicação plausível é a indisponibilidade dessas vacinas nos países subdesenvolvidos, que são os principais responsáveis pelo percentual de mortalidade. Além disso, as mulheres da parcela financeiramente desfavorecida da população não são expostas a procedimentos suficientes de rastreamento e diagnóstico, devido a muitas barreiras socioculturais e financeiras. Como as vacinas profiláticas só podem atuar nas fases iniciais, elas não conseguem prevenir o desenvolvimento do câncer cervical nessa categoria desfavorecida da população devido ao diagnóstico tardio. A comunidade científica está, portanto, concentrando-se no desenvolvimento de terapias para combater o câncer cervical que já se estabeleceu no corpo das mulheres. Isso pode ser facilitado pelo direcionamento dos principais oncogenes da carcinogênese induzida pelo HPV, ou seja, E6 e E7. A inibição de E6 e E7 pode ajudar a suprimir o desenvolvimento do câncer cervical mesmo em estágios avançados.

Genoma do Papilomavírus Humano e Sua Integração no Genoma Celular do Hospedeiro

A estrutura do genoma do HPV e os oncogenes são discutidos nesta seção com referência ao tipo de alto risco HPV16 (Figura 1). O genoma do HPV16 é uma fita de nucleotídeos de 7,9 kb, segmentada em três seções: a região codificadora de genes precoces (E), a região codificadora de genes tardios (L) e a região longa de controle (LCR), também chamada de região não codificante (NCCR) ou região regulatória upstream (URR). Esses segmentos gênicos são divididos por dois sítios de poliadenilação (pA): pA precoce (AE) e pA tardio (AL). A extremidade 5′ começa com a região codificadora de genes precoces, que possui seis quadros de leitura aberta, denominados E1, E2, E4, E5, E6 e E7. Sabe-se que E1 e E2 regulam a replicação do genoma viral e a transcrição das proteínas precoces, enquanto E5–E7 são os indutores da oncogênese. Sabe-se que E5 auxilia na diferenciação dos queratinócitos e na evasão imunológica durante os estágios posteriores, enquanto E6 e E7 assumem o controle de vários pontos de verificação celulares para estabelecer as características do câncer. Portanto, esta revisão concentra-se apenas na importância das oncoproteínas E6 e E7, denominadas “oncojogadoras” nesta revisão. A seção codificadora de genes tardios tem duas partes: L1 e L2. L1 codifica uma proteína principal do capsídeo viral, enquanto L2 codifica uma estrutura menor do capsídeo viral. Embora o trecho de 850 pb da LCR não contenha nenhuma sequência codificadora de proteínas, ele contém a origem de replicação e numerosos sítios de ligação de fatores de transcrição para a transcrição facilitada pela RNA polimerase II.
(A) Estrutura e organização do genoma do HPV16. (B) Integração do genoma do HPV no genoma do hospedeiro por meio da ruptura do gene E2, levando à expressão dos oncogenes E6 e E7. (C) Estrutura da oncoproteína E6. (D) Estrutura da oncoproteína E7.
A infecção pelo HPV começa na camada basal do epitélio escamoso estratificado, onde inicialmente E1 e E2 assumem o controle da replicação do DNA viral em um baixo número de cópias. Mais tarde, quando as células basais se diferenciam para formar a camada suprabasal do epitélio, a replicação do genoma viral muda para o modo de alto número de cópias. Em seguida, os vírions são liberados na descamação epitelial, causando infecção nas células vizinhas. O genoma do HPV pode se integrar ao genoma do hospedeiro ou permanecer na forma epissomal, sendo que 83% dos casos de câncer cervical HPV-positivo mostram evidências de integração do genoma do HPV na célula hospedeira. No caso de integração do genoma viral ao genoma do hospedeiro, frequentemente ocorre a ruptura do sítio do gene E2. O gene E2 é responsável por reprimir E6 e E7, fazendo com que E6 e E7 sejam ativados após a integração do genoma viral ao genoma do hospedeiro. Ao longo da infecção, a atividade de E6 e E7 é responsável pela multiplicação do genoma viral com a ajuda da maquinaria celular, conforme revelado por várias análises de interactoma. Eles podem enganar as células para que se tornem oncogênicas no processo de replicação viral. Portanto, o desenvolvimento de tumores mediado pelo HPV pode ser definido como um dano colateral da infecção viral.
Papilomavírus Humano E6 e E7 – os Oncoplayers
As oncoproteínas virais E6 e E7 do HPV desempenham o papel fundamental na condução das células em direção à oncogênese. Em seu processo de replicação do genoma viral, elas podem induzir todas as características de uma célula cancerosa, ou seja, proliferação celular descontrolada, angiogênese, invasão, metástase e atividade irrestrita da telomerase, juntamente com a evasão da apoptose e da atividade dos supressores de crescimento. Vários estudos in vitro e com xenotransplantes também mostraram que as células cancerosas entram em senescência ou sofrem apoptose na ausência da atividade de E6 e E7, comprovando assim a necessidade absoluta de E6 e E7 para a persistência do câncer mediado pelo HPV.
Tanto E6 quanto E7 são transcritos policistronicamente a partir de um único promotor localizado na extremidade 3′ da região regulatória upstream (URR). A transcrição de E6/E7 está sob a regulação de vários fatores de transcrição, como AP1 e SP1, que atuam ligando-se à região URR.
O E7 foi o primeiro oncogene a ser descoberto, entre todos os oncogenes do HPV. É uma fosfoproteína relativamente pequena, com cerca de 100 aminoácidos, com três regiões conservadas 1/2/3 (CR1/2/3). Uma pequena porção da CR1 e quase toda a CR2 da extremidade amino-terminal apresentam similaridade de sequência com as proteínas E1A do adenovírus (Ad) e o antígeno T grande do SV40. O domínio CR2 é composto por uma sequência pouco conservada, seguida pela região CR3. A região CR3 na extremidade carboxi-terminal é conservada e codifica um domínio dedo de zinco contendo dois motivos CXXC separados por 29 resíduos de aminoácidos. É responsável pela dimerização dependente de zinco e por mediar a interação do E7 com proteínas celulares responsáveis pela regulação do ciclo celular e apoptose (p21 e pRb).

Por outro lado, o E6 é uma proteína relativamente maior, com 150–160 aminoácidos, codificando uma proteína de 18 kDa. Está organizado em dois domínios de ligação a dedo de zinco por quatro motivos Cys-X-X-Cys, que se descobriu serem responsáveis pela oncogenicidade da proteína. O domínio carboxi-terminal contém um motivo de ligação a PDZ responsável pela interação com várias proteínas celulares. De todos os tipos de interações celulares que as oncoproteínas sofrem, a interação mais significativa é aquela em que o E6 pode degradar a p53 e, no caso do E7, a inibição da proteína pRb.

Além do E6 e E7, o E5 também desempenha um papel vital no processo de oncogênese. O E5 é uma proteína hidrofóbica de 83 aminoácidos associada à membrana e ao retículo endoplasmático. Inicialmente, o E5 do BPV foi identificado como um oncogene; posteriormente, o E5 do HPV16 também se mostrou oncogênico, podendo induzir transformação carcinogênica juntamente com o E6. Sabe-se que induz proliferação celular aberrante por meio da ativação do EGFR mediada por ligante, inibe a apoptose pela degradação dos receptores Fas e prevenção da formação do domínio de morte, e ajuda as células carcinogênicas a escapar da armadilha imunológica para progredir em direção à malignidade (revisado por).

Manipulando as Características do Câncer

O E6 e o E7 podem conduzir uma célula à malignidade, contribuindo para as seis principais características do câncer, por meio de várias vias moleculares. Nesta seção, são descritos detalhes aprofundados sobre as vias visadas pelos oncogenes E6 e E7 para induzir cada uma das características fenotípicas do câncer.

Evasão dos Supressores de Crescimento

Tanto o E6 quanto o E7 contribuem para alcançar a proliferação descontrolada por meio da desregulação dos supressores de crescimento. O E6 tem como alvo um importante supressor de crescimento, a p53, enquanto a pRb é um dos principais alvos do E7, entre poucos outros. Isso foi ilustrado esquematicamente na Figura 2.

Manipulação da p53 mediada por E6 e inibição da proteína pRb mediada por E7, levando à proliferação celular sustentada e resistência à barreira apoptótica.
A inibição de p53 mediada por E6 permite várias alterações celulares que tornam uma célula oncogênica, sendo uma delas a indução de proliferação celular descontrolada ao evadir os pontos de verificação celulares. A proteína de peso molecular de 53 kD, p53, é a proteína supressora de tumor mais bem caracterizada até hoje e é frequentemente chamada de “guardiã do genoma”, pois decide o destino de uma célula durante condições de estresse. Quando a célula sofre estresse na forma de dano oxidativo ou outras formas, ela atua como um fator de transcrição para transcrever os genes necessários para a parada do ciclo celular ou apoptose. Por outro lado, o homólogo de murine double minute 2 (MDM2), uma ubiquitina ligase E3, ajuda a mantê-la em um nível basal em uma célula saudável. Assim, a perturbação de p53 por E6 é significativa para garantir a proliferação celular contínua.

Descobriu-se que E6 degrada p53 por ubiquitinação com a ajuda de E6AP (proteína associada a E6, também conhecida como UBE3A). O HPV E6 pode se ligar à sequência consenso LxxLL no domínio conservado de E6AP para formar um complexo heterotrimérico de E6/E6AP/p53, levando finalmente à degradação de p53. Isso força as células a uma divisão celular descontrolada, evadindo os pontos de verificação preventivos. Vários experimentos in vivo mostraram que a interação com E6AP é uma necessidade absoluta para desenvolver tumorigenicidade em várias formas tumorais.

Da mesma forma, a inibição da proteína do retinoblastoma (pRb) mediada por E7 também é um passo significativo para alcançar a proliferação celular desenfreada. A interação pRb–E2F é um ponto de verificação obrigatório para que as células progridam pela transição da fase G1 para S. Quando as células não estão preparadas para entrar na fase S, a proteína pRb permanece ligada à família de fatores de transcrição E2F para impedi-los de transcrever os genes necessários na fase S. Em células infectadas por HPV, E7 direciona pRb para ubiquitinação, levando à liberação dos fatores de transcrição E2F, que transcrevem ciclina E, ciclina A e p16INK4A, um inibidor de CDK4/6, forçando as células a uma entrada prematura na fase S. O inibidor de CDK p16INK4A (proteína supressora de tumor) é um alvo importante do HPV E7 para regular o ciclo celular. O HPV E7 desencadeia a expressão de p16INK4A não apenas pela desintegração de pRb, mas também por desrepressão epigenética através de KDM6B (desmetilase 6B específica para H3K27).

Sabe-se também que o HPV-E7 interage com o complexo DREAM (dimerization partner, RB-like, E2F4 e MuyB) e atua a jusante da via de p53. O complexo DREAM ajuda a suprimir a atividade de genes relacionados ao ciclo celular quando não são necessários. O motivo LxCxE do HPV E7 pode se ligar ao p130 do complexo DREAM para induzir a degradação proteassomal do complexo DREAM. Portanto, essa interrupção do complexo DREAM mediada por E7 é indispensável para a progressão do ciclo celular no câncer cervical.
Células infectadas pelo HPV apresentam coexpressão de E6 e E7, o que estabelece o ambiente perfeito para a sinalização proliferativa sustentada. O estímulo anômalo de crescimento criado pela desintegração de pRb mediada por E7 poderia ser estabilizado por p53, que também é prejudicado por E6, levando à evasão de todos os pontos de verificação antitumorigênicos para conduzir as células à divisão celular de forma descontrolada.

E6 e E7 do HPV têm como alvo outro oncogene vital, c-myc, que tem sido apontado como uma proteína marcadora para várias formas de câncer, incluindo o câncer cervical. Quando desregulado por E6/E7, descobriu-se que ele interrompe a proliferação celular, a apoptose e a transformação celular. Foi demonstrado o fato mais notável de que a integração do genoma do HPV ocorre dentro do lócus MYC (banda cromossômica 8q24), por meio de experimentos de FISH (hibridização in situ por fluorescência). Esta é a razão pela qual a expressão de c-myc é frequentemente alterada em células de câncer cervical infectadas pelo HPV. A desregulação de c-myc leva à interrupção de Cdks, ciclinas e fatores de transcrição E2F, já que myc é capaz de induzir complexos ciclina/Cdk com a ajuda da quinase ativadora de Cdk (CAK) e das fosfatases Cdc25. Além disso, descobriu-se que Myc reverte a atividade inibidora de Cdk de p21 e p27. Além disso, tanto E6 quanto E7 podem interagir com c-myc para causar a ativação do promotor hTERT, contribuindo assim para a imortalidade das células cancerosas.

Para garantir a proliferação celular contínua, as células infectadas pelo HPV precisam também contornar o ponto de verificação do fuso mitótico, o que também é realizado por E6 e E7 em conjunto. E6 depende da via dependente de p53, enquanto E7 evade o ponto de verificação do fuso de maneira independente de p53, com a ajuda de pRb. Isso foi comprovado por um estudo, no qual foi demonstrado que células deficientes em Rb permanecem paradas no ponto de verificação da montagem do fuso.

Como resultado da alteração de vários reguladores do ciclo celular, os complexos Ciclina-CDK são os principais atores do ciclo celular que são dramaticamente transformados em células de câncer cervical infectadas pelo HPV. As associações Ciclina D1-CDK4 e Ciclina D1-CDK2 são reduzidas em células que expressam E6 e são completamente abolidas em células que expressam tanto E6 quanto E7. Isso tem sido associado aos níveis reduzidos de p21 e aos níveis ativados de p16.

Resistindo à Morte Celular

Quando uma célula é desafiada com qualquer forma irreparável de dano celular por fatores extrínsecos ou intrínsecos, as células optam por morrer de forma programada (ou seja, apoptose) ou de forma não programada (ou seja, autofagia ou necrose, etc.). Isso faz parte da medida protetora natural exercida pelo sistema imunológico do corpo para eliminar as células cancerosas. Portanto, para estabelecer a malignidade, as células infectadas pelo HPV dependem de E6 juntamente com E7 para escapar da proteção apoptótica.
Em nível molecular, a apoptose é um ato entre dois grupos de proteínas: proteínas pró-apoptóticas e anti-apoptóticas, que atuam por meio de duas vias interconectadas: a via extrínseca e a via intrínseca da apoptose. As oncoproteínas do HPV interrompem ou modulam essas vias para ajudar a célula cancerosa a escapar da proteção imune inata. Verificou-se que a E6 bloqueia a apoptose tanto de maneira dependente de p53 quanto independente de p53. A E6 não apenas de HPVs de alto risco, mas também de HPVs de baixo risco ou cutâneos pode interagir diretamente com BAK, levando à degradação de BAK in vivo. Além disso, o modo intrínseco de apoptose mediado por BAK também pode ser bloqueado pela E6 por meio da interação p53-E6AP. Um estudo de 1999 mostrou que, quando a E6 é silenciada, os níveis de p53 aumentam, resultando na ativação do promotor de PUMA, o que faz com que Bax conduza a célula à apoptose por meio da perda do potencial de membrana mitocondrial. Também se observa que a E6 funciona independentemente de p53, pois também pode impedir o modo extrínseco de apoptose mediado por TNF por meio do domínio PDZ da E6, que pode se ligar ao TNFR1 e impedir que TRADD interaja com ele. A E6 pode interferir na via programada de apoptose por meio de vários outros alvos, como FADD e caspase-8, que são diretamente direcionados para ubiquitinação. Outra atividade marcante da E6 foi a ativação do promotor da survivina, que também pode impedir a ocorrência de apoptose. Verificou-se que a E7 do HPV não tem esse efeito; em vez disso, mostrou atividade pró-apoptótica mínima, que foi anulada pelas consequências fortemente anti-apoptóticas da atividade da E6. Além da modulação apoptótica, uma observação digna de nota foi feita, na qual a edição baseada em TALEN da E7 do HPV induziu necrose em células de câncer cervical, o que se mostrou ter melhor resposta terapêutica.
Sinalização Proliferativa Sustentada
Uma célula normal entra e progride pelo ciclo celular e fases de divisão em resposta aos vários sinais promotores de crescimento, que são produzidos e liberados de forma controlada. Esses sinais são detectados pelas quinases receptoras presentes na superfície celular e transmitidos para o interior das células por meio de várias vias ramificadas. Essas vias são os meios para regular a dinâmica celular relacionada à sobrevivência ou ao metabolismo energético. No caso de uma célula cancerosa, essas vias de sinalização são desreguladas por diversos meios, o que leva à manutenção da proliferação irrestrita. Uma dessas importantes vias de sinalização que auxiliam na sobrevivência e proliferação celular é mediada pelo Ras oncogênico. A versão mutada do Ras ajuda a conduzir as células à progressão tumoral por meio de vias efetoras a jusante, como as vias PI3K (fosfoinositídeo 3-quinase)-PKB (proteína quinase B)/Akt e MAPK (MAP quinase). Descobriu-se que a E6 ativa a via MAPK por meio de análise imuno-histoquímica de culturas organotípicas em raft. Além disso, descobriu-se que E6 e E7 têm uma profunda implicação na via mTOR para regular a proliferação celular também. Células que expressam E7 do HPV16 foram encontradas em autofagia mesmo em condições ricas em nutrientes. Quando os nutrientes eram limitados, as células que expressam E7, ao contrário das células normais, ainda continuavam a proliferar e, por fim, levavam à morte celular independente de caspase, um processo denominado “resposta sentinela trófica”. Mas, na presença de E6, isso pode ser evitado, pois sabe-se que E6 ativa a sinalização mTORC1 para aumentar a síntese proteica mesmo na ausência de fatores de crescimento. Mesmo na ausência de sinais nutricionais suficientes, E6 pode ativar mTORC1 por meio das quinases upstream PDK1 e mTORC2. PDK1 está localizada a jusante da via de sinalização PI3K e é ativada por meio de vários receptores associados à membrana, como ERBB, INSR (receptor de insulina), IGFR (receptor do fator de crescimento semelhante à insulina) e RPTKs (receptores tirosina quinase). Esses receptores então interagem com múltiplas proteínas adaptadoras de sinalização, como GRB2 (proteína 2 ligada ao receptor do fator de crescimento) e SHC (domínio de homologia 2 de Src) para desencadear a cascata a jusante de AKT e mTORC1. Um relatório mostrou que células que expressam E6 hiperativam e aumentam a internalização de RPTKs fosforilados, mesmo na ausência de fatores nutricionais. Isso leva ao aumento do crescimento e proliferação celular dependentes de mTORC1 mesmo na ausência de fatores de crescimento, auxiliando com sucesso na progressão tumoral.
Possibilitando a Imortalidade Replicativa
A cada nova rodada de replicação, os telômeros encurtam em comprimento como parte do envelhecimento celular. Portanto, no caso de uma célula cancerosa, as células precisam impedir o encurtamento dos telômeros para sustentar a progressão tumoral. A telomerase é a enzima responsável pela replicação das extremidades cromossômicas; assim, ela é superexpressa em células cancerosas e inativa em células saudáveis normais. Nos cânceres cervicais infectados pelo HPV, as oncoproteínas E6 e E7 conseguem expressar a hTERT (transcriptase reversa da telomerase humana – a unidade catalítica da enzima telomerase) de forma constitutiva para estabelecer a imortalidade replicativa. Foi relatado que a E6 ativa o promotor da hTERT com a ajuda da ubiquitina ligase celular E6AP, juntamente com c-myc, Sp1 e NFX1. A NFX1 é um repressor negativo da hTERT e, portanto, é degradada por E6/E6AP para ativar o promotor da hTERT, enquanto os outros dois, ou seja, c-myc e Sp1, funcionam como reguladores positivos e, assim, são ativados por E6. A expressão constitutiva da hTERT mediada por E6 também é estabelecida por regulação epigenética. Várias histonas metilases e desmetilases são manipuladas de acordo para aumentar a marca ativadora H3K4Me3 e diminuir a marca repressora H3K9Me2. Um estudo notável também mostrou que a E6 aumenta a fosforilação da serina 2 da RNA polimerase II para promover a transcrição da hTERT, que, na ausência de E6, permanece reprimida por USF1/USF2.
Indução da Angiogênese
Um requisito fundamental para a tumorigênese é o recrutamento da circulação sanguínea para as células em transformação a partir da vasculatura existente, um processo denominado “angiogênese”. Esse mecanismo é mantido por um equilíbrio entre indutores e inibidores da angiogênese. As proteínas E6 e E7 auxiliam as células infectadas pelo HPV a obter nutrientes e oxigênio dos tecidos circundantes por meio da angiogênese, regulando a expressão e a atividade dos indutores e inibidores. A principal alteração notável na expressão dos supressores tumorais p53 e pRb, mediada por E6 e E7, respectivamente, tem sido associada aos moduladores da angiogênese. Uma análise por microarray demonstrou que três genes regulados por p53 alteram sua expressão em células transformadas com E6 e E7, incluindo trombospondina-1, maspina (inibidores da angiogênese) e VEGF (fator de crescimento endotelial vascular – indutor da angiogênese). A trombospondina-1 e a maspina atuam como inibidores da angiogênese e são reguladas positivamente por p53. Assim, uma vez que p53 é degradado com sucesso por E6, os inibidores da angiogênese não são funcionais. O VEGF é um conhecido indutor da angiogênese, regulado negativamente por p53 através do HIF-1α, e na ausência de p53 (isto é, mediada por E6), torna-se ativado e auxilia na angiogênese. A IL-8 (interleucina-8) também apresentou aumento em resposta à expressão de E6 e E7 no mesmo estudo. Sabe-se que a IL-8 é um importante indutor da angiogênese. A regulação do VEGF por E6 pode ocorrer por um mecanismo independente de p53, através da ativação do fator de transcrição Sp1. O promotor do VEGF contém um sítio de ligação para AP1, que pode ser ativado por E7. Um relato recente também demonstrou uma regulação positiva de RRM2 por E7, que atua induzindo a angiogênese via ROS-ERK1/2-HIF-1α-VEGF.
Ativação da Invasão e Metástase
Os oncogenes E6 e E7 demonstraram induzir a transição epitélio-mesenquimal (TEM), um processo necessário para que as células tumorais invadam a corrente sanguínea e metastatizem em outros locais do corpo. Utilizando a linhagem celular epitelial MDCK como modelo in vitro, o estudo demonstrou que a expressão ectópica de E6/E7 pode induzir a formação de células epiteliais com formato de paralelepípedo a partir de células mesenquimais fusiformes. Além disso, também foi demonstrado que E6 e E7 podem ativar fatores de transcrição indutores da TEM, como Slug, Twist, ZEB1 e ZEB2, seguido por um aumento no potencial migratório e invasivo das células. Os marcadores da TEM, como a E-caderina (marcador de células epiteliais), apresentaram diminuição, enquanto a N-caderina, fibronectina e vimentina, marcadores mesenquimais, aumentaram em resposta a E6 e E7. Além de E6 e E7, também foi relatado que E5 regula positivamente o VEGF através de EGFR, MEK/ERK1 e 2, juntamente com PI3K/Akt, o que induz invasão celular e metástase.
Terapêuticas com Alvo nos Oncoatores E6 e E7
Conforme discutido na seção anterior, E6 e E7 são as principais oncoproteínas que impulsionam o processo de tumorigênese cervical mediada pelo HPV por meio do estabelecimento de todas as seis marcas registradas do câncer. Assim, E6 e E7 representam os alvos mais eficazes para terapêuticas, pois podem garantir a erradicação de todas as células cancerígenas cervicais ao derrubar qualquer uma ou todas as marcas do câncer. A próxima seção desta revisão discute as várias abordagens usadas na pesquisa clínica atual para direcionar E6/E7 para terapias de câncer cervical eficazes e mais seguras e foi representada graficamente na Figura 3.
Diferentes abordagens terapêuticas usadas para direcionar a expressão e atividade de E6/E7 para impedir que estabeleçam as marcas registradas do câncer cervical.
Vacinas Direcionadas às Oncoproteínas E6/E7 do Papilomavírus Humano
Além das vacinas profiláticas, que podem ativar o sistema imunológico do corpo para prevenir a ocorrência do câncer cervical, a pesquisa clínica moderna está focando no desenvolvimento de vacinas terapêuticas, que podem ser usadas para tratar o câncer mesmo em estágios malignos avançados. Diferentemente das vacinas preventivas, que são desenvolvidas contra as proteínas do capsídeo L1 ou L2 que são inativadas ou deletadas durante a integração do genoma do HPV no genoma celular, as vacinas terapêuticas têm como alvo as oncoproteínas E6 e E7, que são expressas por um período mais longo no ciclo de vida do HPV e representam a marca registrada mais significativa de qualquer célula infectada pelo HPV. Portanto, as vacinas profiláticas falham em funcionar uma vez que o HPV se estabelece, mas as vacinas terapêuticas podem direcioná-las mesmo nos estágios mais avançados. As vacinas terapêuticas pretendem conferir imunidade mediada por células para matar as células infectadas em vez de introduzir anticorpos neutralizantes no sistema, como as vacinas profiláticas. As vacinas terapêuticas podem ser categorizadas com base em sua fonte de desenvolvimento, como vetor bacteriano ou viral vivo, peptídeo ou proteína, e baseadas em ácido nucleico ou células (revisado por). Várias dessas vacinas estão sendo pesquisadas e atualmente estão em ensaios clínicos (fase I/II/III) para câncer cervical. Vacinas como ADXS11-OO1 (Lm-LLo-E7), INO-3112, HPV16-SLP e TA-CIN + GPI-0100 foram preparadas para direcionar as proteínas E6/E7 do HPV16/18 para tratar os cânceres cervicais em estágio avançado. Elas estão passando por ensaios clínicos ou já os concluíram. Algumas das vacinas também foram preparadas especificamente para infecção persistente por HPV e lesão intraepitelial escamosa de baixo grau, como PDS0101 e ProCervix, ou especificamente para lesão intraepitelial cervical (NIC)/lesão intraepitelial escamosa de alto grau, como GX-188E, pNGVL4a-CRT/E7 (detox), PepCan + Candin, etc. (revisado por).
Tecnologias de Edição de Genoma para Direcionar E6/E7
Com o advento das ferramentas de edição genômica, a região HPV-E6/E7 do genoma do HPV ou seus respectivos mRNAs podem ser especificamente direcionados para curar o câncer cervical. As técnicas de edição gênica utilizadas para abordagens terapêuticas começaram com o uso de oligonucleotídeos antissenso, ribozimas, DNAzimas, siRNA (RNA interferente pequeno), shRNA (RNA em grampo curto) e assim por diante. Estudos recentes desenvolveram técnicas mais robustas para silenciar eficientemente a expressão de E6/E7, como as nucleases de dedo de zinco (ZFN), as nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs) e a endonuclease guiada por RNA associada a repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR/Cas9). Isso pode ajudar a reduzir a taxa de mortalidade do câncer cervical, uma vez que os estágios avançados do câncer, que continham o genoma do HPV integrado e não podiam ser tratados, agora podem ser abordados com as tecnologias avançadas de manipulação gênica.

Terapia Baseada em Ácidos Nucleicos
A terapia baseada em ácidos nucleicos baseia-se no uso de moléculas de DNA ou RNA antissenso para interromper a expressão e/ou atividade dos genes E6 e E7, o que poderia prevenir a progressão desse câncer. Elas incluem o uso de oligonucleotídeos antissenso, oligonucleotídeos catalíticos e interferência de RNA. Por um lado, os oligonucleotídeos catalíticos (isto é, DNAzimas e ribozimas) podem clivar o mRNA alvo, enquanto os oligonucleotídeos antissenso e as moléculas de RNA interferente pequeno (siRNA) levam à inibição traducional dos transcritos alvo.

Ribozimas
As ribozimas são enzimas de RNA, capazes de hibridizar com a sequência alvo e clivá-la com a ajuda de seu núcleo catalítico. Embora sejam abundantemente encontradas na natureza, podem ser sintetizadas artificialmente para direcionar especificamente os genes causadores de doenças, como E6/E7. Existem várias formas delas, mas as recombinantes sintetizadas são geralmente ribozimas em grampo ou ribozimas cabeça de martelo por natureza. Por exemplo, estudos mostraram que ribozimas cabeça de martelo direcionadas aos transcritos de HPV16 E6/E7 resultaram em perda de crescimento celular in vitro e crescimento tumoral em camundongos nude in vivo após apoptose. Outro estudo mostrou uma ribozima direcionada a E6AP em células HeLa para aumentar a resposta apoptótica e o dano ao DNA induzido por mitomicina-C.

Oligonucleotídeos Antissenso
Os oligonucleotídeos antissenso são sequências de cerca de 20 nucleotídeos sintetizadas de forma complementar ao mRNA alvo. Isso resulta na inibição da tradução para evitar a síntese de proteínas que agravam a doença. Esses oligonucleotídeos antissenso podem interromper fisicamente a ligação entre o ribossomo e o mRNA ou ativar a RNase H endógena para clivar o mRNA alvo. Várias tentativas foram feitas para sintetizar oligonucleotídeos antissenso eficazes, como oligonucleotídeos antissenso fosfodiéster, ou análogos fosforotioato seguidos por modificações de metilfosfonato, etilfosfonato ou ligações peptídicas no período inicial, que mostraram maior suscetibilidade a nucleases. Assim, a ciência moderna desenvolveu oligonucleotídeos antissenso altamente eficazes e resistentes a nucleases, incluindo ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), oligômeros morfolino fosforodiamidato (PMOs) e ácidos nucleicos bloqueados (LNAs), que restauram a capacidade de recrutamento da RNase H. Vários estudos relataram o uso de oligonucleotídeos antissenso direcionados a diferentes regiões dos transcritos E6/E7 com diversos métodos de entrega, os quais mostraram resultados promissores na inibição da progressão do câncer tanto in vitro quanto in vivo (revisado por). Demonstrou-se que eles induzem apoptose por meio da regulação positiva de p53 e pRb, resultando na redução da aparência neoplásica. Oligonucleotídeos antissenso direcionados a regiões do E6AP também demonstraram potencial inibitório tumoral. Um estudo inovador desenvolveu um oligonucleotídeo antissenso combinado a um complexo fotorreativo de Ru (rutênio), capaz de direcionar E6 em células SiHa infectadas por HPV 16, resultando na inibição eficiente do crescimento celular tanto em culturas monocamada quanto tridimensionais.
Interferência por RNA
A interferência de RNA é um modo comparativamente avançado de edição genômica, que utiliza moléculas de RNA de fita dupla (denominadas RNA interferente pequeno - siRNA ou RNA em grampo curto - shRNA) para silenciar os oncogenes-alvo E6 e E7. Diversas abordagens utilizaram essa técnica para silenciar E6/E7 parcial ou completamente, o que provocou senescência celular por meio do acúmulo celular de p53, hipofosforilação de pRb, inibição do crescimento celular em monocamadas e crescimento independente de ancoragem, levando a desfechos apoptóticos. Resultados semelhantes também foram observados em estudo in vivo, no qual o crescimento tumoral foi reduzido com o silenciamento de E6/E7. O shRNA de HPV16-E7, quando programado, induziu a degradação tanto dos transcritos quanto das proteínas E6 e E7, resultando no acúmulo celular de p53, p21 e hipofosforilação de pRb. Por fim, a perda de E6 e E7 resultou em apoptose. O knockdown de E6/E7 mediado por siRNA também se mostrou capaz de sensibilizar as células à morte celular induzida por cisplatina. Uma revisão analisou mais de 25 dados experimentais que avaliaram mais de 60 siRNAs sinteticamente preparados direcionados ao HPV16 E6, todos considerados eficazes na inibição do crescimento tumoral tanto in vitro quanto in vivo. A porcentagem de knockdown de E6 apresentou variação (~10% a cerca de 80%) dependendo da sequência dos oncogenes-alvo, da concentração molar de siRNA utilizada, do modo de entrega celular, do modelo celular usado no estudo, entre outros.
Assim, todas as formas de terapias baseadas em ácidos nucleicos, quando direcionadas aos oncogenes E6 e E7, promovem uma redução eficiente na progressão do câncer cervical por meio de vias semelhantes de inibição do crescimento celular e apoptose.

Edição Genômica com Nucleases Programáveis
Nucleases programáveis, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs) e sistemas CRISPR-Cas9, podem ser usadas para direcionar oncogenes causadores de doenças, como E6 e E7, a fim de anular completamente sua atividade para restringir e regredir o crescimento do tumor cervical. A edição genômica usando qualquer um dos procedimentos acima envolve o uso de domínios de ligação ao DNA específicos de sequência fundidos a unidades de clivagem de DNA não específicas, que levam a alterações precisas no gene de interesse. A eficiência da tecnologia utilizada depende da especificidade de sequência e da afinidade das nucleases, que podem ser programadas de acordo.
Nucleases de Dedo de Zinco
As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são endonucleases artificiais programadas pela fusão de proteínas de dedo de zinco de ligação ao DNA com o domínio de clivagem de DNA FokI. Quando duas ZFNs artificialmente programadas se dimerizam ao se ligarem ao DNA, elas formam uma nuclease FokI ativa, que pode clivar a sequência-alvo por meio da indução de quebras de fita dupla. As quebras de fita dupla introduzidas podem levar à morte celular pela via programada de apoptose ou à ativação do mecanismo de reparo do DNA. Geralmente, a junção de extremidades não homólogas é recrutada, o que introduz várias mutações nos genes-alvo. Isso resulta na regressão da doença causada pelos genes-alvo. As ZFNs foram usadas inicialmente contra o gene E2 do HPV, o que impediu a replicação do vírus dentro da célula hospedeira. Posteriormente, as ZFNs foram personalizadas para atingir o gene HPV-E7, o que interrompeu com sucesso o DNA do HPV, inibiu o crescimento das células de câncer cervical positivas para HPV 16/18 in vitro e verificou-se que sofreram apoptose. Elas foram ainda comprovadas como clinicamente mais eficientes, pois também puderam estabelecer seu efeito terapêutico em modelo de camundongo com xenoenxerto.

relataram que não conseguiram inibir com sucesso a expressão e a atividade de E6 usando ZFNs, pois nenhuma sequência-alvo correspondente pôde ser obtida usando software de computador disponível publicamente. Assim, eles usaram TALENs para o mesmo propósito.
Nuclease Efetora do Tipo Ativador de Transcrição
Nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs) são proteínas de fusão programáveis compostas por uma região de translocação N-terminal, segmentos repetidos centrais de 33 a 35 resíduos que podem se ligar ao DNA de maneira sequência-específica e uma unidade C-terminal que contém o sinal de localização nuclear (NLS) juntamente com a endonuclease FokI 8. Em 2015, uma equipe liderada por relatou pela primeira vez que a edição genômica mediada por TALEN dos oncogenes E6/E7 do HPV pode inibir com sucesso o crescimento tumoral, induzir apoptose e reduzir a capacidade tumorigênica de células infectadas pelo HPV tanto in vitro quanto in vivo. Eles encontraram resultados semelhantes em células infectadas por HPV16 (SiHa) e HPV18 (HeLa) in vitro. Em seguida, realizaram a triagem de pares de TALEN para direcionar o éxon E7 do genoma do HPV usando o software SAPTA. O par de TALEN que foi sequenciado e sintetizado tinha como alvo da posição 44 ao nucleotídeo 103, abrangendo a região de início do éxon I de E7, e possuía 19 sítios de ligação em cada lado de uma região espaçadora. Os pares de TALEN selecionados editaram efetivamente o genoma E7 do HPV em células SiHa infectadas por HPV16, conforme observado nos níveis de transcrito e proteína. Isso resultou em um aumento correspondente na quantidade de pRb e uma diminuição de p14ARF, os alvos downstream, seguindo uma via necrótica de morte celular, conforme demonstrado pela regulação positiva de RIP-1, Ciclofilina A e LDH-A. No devido tempo, outro estudo de relatou que a edição mediada por TALEN de E6 do HPV16 não produziu nenhuma atividade de edição, enquanto E7 pôde ser silenciado com sucesso em células CasKi infectadas por HPV16. O TALEN direcionado a E6 era composto por 18 módulos em ambos os braços, espaçados por uma região de 19 nucleotídeos, enquanto o TALEN direcionado a E7 continha 18 módulos em ambas as extremidades, separados por um intervalo de 21 nucleotídeos. Portanto, as nucleases programáveis devem ser projetadas para ter capacidade eficiente de nocaute, dependendo da especificidade da sequência, e para que os efeitos fora do alvo sejam minimizados, a fim de estabelecer seu imenso potencial terapêutico.
Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas-Cas9
Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR)-Cas9 é uma nova ferramenta de edição genômica originalmente observada como parte do sistema imune adaptativo em sistemas bacterianos para combater ácidos nucleicos estranhos. Diferentemente dos sistemas ZFN e TALEN, nos quais os domínios proteicos precisam ser manipulados, os sistemas CRISPR-Cas são comparativamente mais simples, pois envolvem o uso de um RNA guia único, que pode direcionar a endonuclease Cas9 para introduzir quebras de fita dupla no gene-alvo específico, levando ao silenciamento do gene por meio da utilização da maquinaria de reparo da célula hospedeira. Assim, terapeuticamente, evoluiu para ganhar a atenção científica no tratamento da progressão do câncer infectado por HPV. Vários estudos relataram o uso do silenciamento de E6/E7 mediado por CRISPR-Cas9 para regredir a progressão do câncer cervical. Os RNAs guia podem ser programados de acordo para atingir segmentos específicos de éxons dos oncogenes E6/E7. Dessa forma, o silenciamento mediado por CRISPR-Cas9 de ambos os oncogenes E6 e E7 em células SiHa/CasKi infectadas por HPV 16 e células HeLa infectadas por HPV 18 levou à inibição do crescimento, parada do ciclo celular e morte celular por meio da restauração de p53 e pRb. Posteriormente, tentou-se direcionar E6 usando o sistema CRISPR-Cas9 entregue por meio de vetor AAV tipo 2 e obteve-se sucesso na introdução de várias mutações no oncogene E6. Quando silenciado, E6 levou à redução do crescimento tumoral tanto in vitro quanto in vivo, juntamente com um aumento no status de p53, levando finalmente ao modo apoptótico de morte celular.
Embora essas tecnologias de edição genômica de ponta apresentem imenso potencial terapêutico, elas não são facilmente acessíveis. Além disso, os sistemas de entrega também permanecem um grande obstáculo devido à carga negativa, ao tamanho grande e à baixa penetração na membrana. Como o câncer cervical afeta principalmente mulheres de setores populacionais subdesenvolvidos, a aplicabilidade dessas técnicas de edição genômica em terapias clínicas continua sendo uma questão importante. A busca por terapêuticas eficientes e de baixo custo ainda é um foco importante de pesquisa para ajudar as pessoas com estratos financeiros desfavorecidos, ou seja, aquelas geralmente atingidas pelo câncer cervical.
Direcionamento Imunoterapêutico de E6/E7
Um ambiente ideal de progressão tumoral requer a inativação do sistema imunológico natural do corpo, o que inclui contagem reduzida de células T e sua atividade suprimida, alterações na expressão de citocinas e apresentação defeituosa de antígenos. As respostas imunes celulares e humorais específicas para E6 e E7 são clinicamente bem-sucedidas devido à atividade contínua desses oncogenes ao longo da progressão da doença. Sequências sintéticas de DNA de E6 e E7 do HPV 16/18 foram introduzidas para ativar o sistema imunológico usando um novo plasmídeo VGX-3100 (Inovio Pharmaceuticals). Em seguida, um estudo piloto introduziu células T CD8+ em pacientes, o que resultou em regressão histopatológica e também na eliminação do HPV 16/18. Uma combinação de plasmídeos sintéticos denominada MEDI0457 (anteriormente chamada de INO-3112) foi criada para direcionar os antígenos E6/E7 do HPV16 e HPV18, juntamente com IL-12 recombinante (interleucina-12) como adjuvante molecular (INO-9012). Sabe-se que a IL-12 promove a maturação e a atividade das células T, o que aumenta a atividade imunológica. Descobriu-se que o MEDI0457 induz respostas de anticorpos de longa duração, produção robusta de interferon-gama específico para HPV pelas células T e produção de células T citotóxicas específicas para o antígeno. Assim, essa resposta imune celular e humoral aprimorada, quando combinada com outros métodos de tratamento, reduziu a recorrência local e a taxa de metástase. Também foi relatado que as células T podem ser geneticamente modificadas para direcionar o E7 do HPV16, o que pode levar à regressão de cânceres cervicais infectados pelo HPV16 em modelo de camundongo com xenoenxerto. O E6 do HPV16 também pode ser alvo por meio de células T geneticamente modificadas, com resultado semelhante. A regressão completa do câncer cervical metastático também foi relatada em resposta a uma única infiltração de células T direcionadas para E6/E7 do HPV16. A terapia adotiva com células T é uma via promissora; o uso de programação genética para direcionar os oncoplayers do HPV usando as células T pode ampliar o escopo da imunoterapia, ajudando a direcionar os oncogenes especificamente, sem efeitos colaterais.
Fitoterapia Direcionada a E6 e E7
A abordagem fitoterápica baseia-se no uso de produtos naturais para o tratamento de diversas formas letais de câncer, sendo uma delas o câncer cervical. As muitas formas diferentes de fármacos anticâncer utilizadas nas quimioterapias modernas são obtidas diretamente de fontes naturais ou são versões modificadas destas, incluindo os bem conhecidos vincristina, podofilotoxina, camptotecina, vimblastina, paclitaxel, docetaxel, homoharringtonina, entre outros. Além disso, vários compostos vegetais ou extratos de plantas demonstraram efeitos anticâncer promissores em linhagens celulares de câncer cervical in vitro e in vivo. Dentre eles, muitos compostos naturais diferentes foram encontrados por suprimir diretamente a atividade de HPV-E6/E7, os quais foram listados na Tabela 1. Tais compostos são importantes candidatos a fármacos para pesquisa, uma vez que têm o potencial de silenciar diretamente os oncogenes e auxiliar na regressão do câncer cervical. Ademais, uma série de flavonoides foi identificada com capacidade de se ligar a E6 e inibir a degradação de p53, resultando na diminuição da viabilidade das células de câncer cervical infectadas por HPV. Além da luteolina, vários novos flavonoides também foram identificados no processo com um papel terapêutico promissor no câncer cervical. Vários extratos e produtos vegetais, como o látex de Ficus carica, o óleo de semente de linhaça ou os extratos do caule de Cudrania tricuspidata, também mostraram potencial anti-oncogênico, pois conseguiram reduzir a expressão dos transcritos e proteínas E6 e E7, com uma conclusão apoptótica concomitante. O uso de produtos naturais promete uma abordagem terapêutica comparativamente mais segura para o câncer cervical. O tratamento baseado em produtos naturais oferece um método mais fácil, abundantemente disponível e de baixo custo em comparação com as tecnologias de edição genômica ou o método imunoterápico. As vacinas profiláticas e terapêuticas, ou as terapias baseadas em células T, ou os vários modos de técnicas de edição genômica são demasiado caros para serem custeados pela parcela financeiramente desfavorecida da população, e o fato mais notável aponta para essas pessoas economicamente vulneráveis como o grupo mais comumente afetado pelo câncer cervical, conforme discutido anteriormente.
Fitocompostos com atividade anti-oncogênica para E6 e E7.
Nº Fitocomposto Fonte natural Tipo celular/modelo Observações do estudo Ref. 1 Curcumina Curcuma longa (rizoma) HeLa, SiHa e C33A Inibição dos transcritos e proteínas E6 e E7, prevenção da translocação de NF-κβ e AP1 e indução de apoptose 2 Berberina Berberis sp. (rizoma/casca) HeLa e SiHa Repressão de E6 e E7 com aumento concomitante de p53 e pRb, ativa AP1 e induz apoptose. Suprime a expressão de hTERT. 3 Jaceosidina Artemisia argyi (folhas) SiHa e CasKi Inibiu a ligação de E6 com p53 e de E7 com pRb 4 Wogonina Scutellaria baicalensis SiHa e CasKi Promove apoptose intrínseca através da supressão de E6 e E7 e aumento de p53 e pRb 5 Ácido nordihidroguaiarético Scutellaria baicalensis SiHa Inibição da expressão de E6 e regulação positiva de p53 e p21 6 Tanshinona IIA Salvia sp. HeLa, SiHa, CasKi e C33A Regula negativamente E6 e E7, induz apoptose e parada do ciclo celular, inibe o crescimento tumoral in vivo 7 Withaferina A Withania somnifera CasKi Apoptose através da repressão de E6 e E7; inibição do crescimento tumoral in vivo
Conclusão
E6 e E7, corretamente denominados “oncoplayers do HPV”, são a principal força motriz da carcinogênese cervical. Eles são responsáveis desde o ponto de iniciação do desenvolvimento tumoral, incluindo a manutenção da sinalização proliferativa contínua, o escape dos supressores tumorais e a ativação da telomerase, até a indução da angiogênese e invasão para estágios metastáticos. Estas são as seis marcas primárias de qualquer forma de câncer estabelecidas por. E6 e E7 assumem individualmente o controle de todas as seis marcas para estabelecer e auxiliar na progressão bem-sucedida do câncer cervical. Assim, esta revisão buscou incorporar a importância desses oncogenes do HPV em todas as esferas da atividade das células cancerígenas e também incluiu seu papel terapêutico. Uma vez que esses oncogenes são os principais fatores carcinogênicos, o direcionamento específico das células do câncer cervical poderia ser alcançado com a ajuda do direcionamento de E6 e E7. Isso os torna os candidatos a fármacos mais eficazes para cânceres infectados pelo HPV, incluindo o câncer cervical. Várias formas de terapias foram estudadas e testadas usando o direcionamento de E6 e E7, todas com seus próprios méritos e deméritos. A abordagem combinatória é a forma mais recente de prática clínica, que poderia resultar em melhores maneiras de combater o alto índice de mortalidade do câncer cervical em todo o mundo.
Contribuições dos Autores
AP e RK projetaram a estrutura do artigo, pesquisaram as publicações experimentais e discutiram a ideia conclusiva do artigo de revisão. AP escreveu e editou o manuscrito. RK revisou o manuscrito antes da submissão.
Conflito de Interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Referências
A restauração da expressão de p53 sensibiliza queratinócitos humanos imortalizados pelo papilomavírus humano tipo 16 à apoptose mediada por CD95
Imunoterapia contra HPV16/18 gera potentes respostas imunes celulares TH1 e citotóxicas
A região da oncoproteína E7 do HPV homóloga ao E1a do adenovírus e ao antígeno T grande do SV40 contém domínios separados para ligação a Rb e fosforilação pela caseína quinase II
O direcionamento antissenso de E6AP eleva p53 em células infectadas por HPV, mas não em células normais
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Vacinas terapêuticas para doenças associadas ao HPV de alto risco
Variantes do aminoácido 83 da E6 do papilomavírus humano tipo 16 aumentam a sinalização MAPK mediada por E6 e regulam diferencialmente a tumorigênese pela sinalização notch e Ras oncogênico
Identificação e caracterização baseadas em estrutura de flavonoides que interrompem a função da E6 do papilomavírus humano-16
Repressão transcricional da E-caderina pela E6 do papilomavírus humano tipo 16
Classificação dos papilomavírus
O óleo de semente de linhaça reduziu o crescimento tumoral, modulou as respostas imunes e diminuiu a expressão das oncoproteínas E6 e E7 do HPV em um modelo murino de câncer cervical ectópico
Nucleases de dedo de zinco direcionadas ao oncogene E7 do papilomavírus humano induzem a ruptura de E7 e um fenótipo transformado em células de câncer cervical HPV16/18-positivas
A ação antitumoral da curcumina em células associadas ao papilomavírus humano envolve a regulação negativa de oncogenes virais, prevenção da translocação de NFkB e AP-1 e modulação da apoptose
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Os papilomavírus de baixo risco
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A proteína E6 do papilomavírus humano 16 se liga ao receptor 1 do fator de necrose tumoral (TNF) e protege as células da apoptose induzida por TNF
Métodos baseados em ZFN, TALEN e CRISPR/Cas para engenharia genômica
O ácido nordihidroguaiarético inibe o crescimento de células de câncer cervical SiHa ao regular positivamente p21
Modulação da apoptose por oncoproteínas do papilomavírus humano (HPV)
Identificação de um novo repressor da telomerase que interage com o complexo E6/E6-AP do papilomavírus humano tipo 16
Atividades biológicas do látex de Ficus carica para potenciais terapêuticas em cânceres cervicais relacionados ao papilomavírus humano (HPV)
Marcas registradas do câncer
A expressão do oncogene E7 do HPV 16 em células epiteliais humanas normais causa alterações moleculares indicativas de uma transição epitélio-mesenquimal
Desenvolvimento e aplicações do CRISPR-Cas9 para engenharia genômica
O direcionamento mediado por TALEN de oncogenes do HPV melhora a malignidade cervical relacionada ao HPV
A persistência da displasia cervical de alto grau e do câncer cervical requer a expressão contínua do oncogene E7 do papilomavírus humano tipo 16
Células T modificadas direcionadas a E7 medeiam a regressão de cânceres por papilomavírus humano em um modelo murino
Os efeitos transcricionais globais da proteína E6 do papilomavírus humano em linhagens celulares de carcinoma cervical são mediados pela ubiquitina ligase E6AP
Inativação do gene E6 ou E7 do papilomavírus humano em células de carcinoma cervical usando uma endonuclease bacteriana guiada por RNA CRISPR/Cas
P53 e pRb previnem a re-replicação em resposta a inibidores de microtúbulos mediando uma parada reversível em G1
A wogonina induz apoptose suprimindo as expressões de E6 e E7 e ativando vias de sinalização intrínsecas em células de câncer cervical HPV16
Supressão e caracterização do gene E6AP com ribozimas hammerhead selecionadas in vitro
Enzimas de restrição híbridas: fusões de dedos de zinco ao domínio de clivagem Fok I
A proteína E5 do papilomavírus humano 16 regula positivamente a expressão do fator de crescimento endotelial vascular através da ativação do receptor do fator de crescimento epidérmico, MEK/ERK1,2 e PI3K/Akt
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Câncer cervical em países de baixa e média renda: abordando as barreiras à administração de radioterapia
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A proteína E6 do papilomavírus humano tipo 16 ativa a transcrição do gene TERT através da indução de c-Myc e liberação da repressão mediada por USF
Clivagem eficiente de DNA de fita dupla por nucleases artificiais de dedo de zinco compostas por uma proteína dedo de zinco e um dímero FokI de cadeia única
Gene and protein delivered zinc finger staphylococcal nuclease hybrid for inhibition of DNA replication of human papillomavirus
Tanshinone IIA inhibits viral oncogene expression leading to apoptosis and inhibition of cervical cancer
Withaferin A induces p53-dependent apoptosis by repression of HPV oncogenes and upregulation of tumor suppressor proteins in human cervical cancer cells
Comparative analysis of virus–host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase
A mutant of human papillomavirus type 16 E6 deficient in binding alpha-helix partners displays reduced oncogenic potential in vivo
Structural and functional analysis of E6 oncoprotein: insights in the molecular pathways of human papillomavirus-mediated pathogenesis
Solution structure of the partially folded high-risk human papilloma virus 45 oncoprotein E7
MYC activation associated with the integration of HPV DNA at the MYC locus in genital tumors
P53 family and cellular stress responses in cancer
The human papillomavirus type 16 E7 gene encodes transactivation and transformation functions similar to those of adenovirus E1A
Zinc-finger-nucleases mediate specific and efficient excision of HIV-1 proviral DNA from infected and latently infected human T cells
The association of mammalian DREAM complex and HPV 16 E7 proteins
Disruption of repressive p130-DREAM complexes by human papillomavirus 16 E6/E7 oncoproteins is required for cell-cycle progression in cervical cancer cells
Ruthenium oligonucleotides, targeting HPV 16 E6 oncogene, inhibit the growth of cervical cancer cells under illumination by a mechanism involving p53
The DREAM complex: master coordinator of cell cycle dependent gene expression
The HPV16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53
The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53
Epidemiology and burden of HPV related disease
TALEN based HPV-E7 editing triggers necrotic cell death in cervical cancer cells
Genome editing of oncogenes with ZFNs and TALENs: caveats in nuclease design
RNA interference against HPV16 E7 oncogene leads to viral E6 and E7 expression in cervical cancer cells and apoptosis via upregulation of Rb and p53
The human papillomavirus type 16 E6 oncoprotein activates mTORC1 signaling and increases protein synthesis
The HPV 16 E6 oncoprotein causes prolonged receptor protein tyrosine kinase signalling and enhances internalisation of phosphorylated receptor species
Complete regression of metastatic cervical cancer after treatment with human papillomavirus-targeted tumour-infiltrating T cells
Expression of suppressor of cytokine signalling 1 (SOCS 1) impairs viral clearance and exacerbates lung injury during influenza infection
HPV16 E6 RNA interference enhances cisplatin and death receptor –mediated apoptosis in human cervical carcinoma cells
As interações da proteína E6 do papilomavírus humano (HPV) com Bak são conservadas entre as proteínas E6 de tipos de HPV de alto e baixo risco
As oncoproteínas E6 e E7 do papilomavírus humano anulam independentemente o ponto de verificação do fuso mitótico
As proteínas E6 oncogênicas do papilomavírus humano direcionam as proteínas MAGI-2 e MAGI-3 para degradação
O gene humano do fator de crescimento endotelial vascular. Múltiplas formas proteicas são codificadas por splicing alternativo de éxons
siRNA sintético direcionado à proteína E6 do papilomavírus humano 16: uma perspectiva sobre abordagens nanoterapêuticas in vitro
Câncer global em mulheres: carga e tendências
A expressão das oncoproteínas E6 e E7 do papilomavírus humano tipo 16 em queratinócitos primários de prepúcio é suficiente para alterar a expressão de fatores angiogênicos.
Segurança, eficácia e imunogenicidade da VGX-3100, uma vacina terapêutica de DNA sintético direcionada às proteínas E6 e E7 dos papilomavírus humanos 16 e 18 para neoplasia intraepitelial cervical 2/3: um ensaio clínico randomizado, duplo-cego, controlado por placebo de fase 2b
Alterações imunológicas e perspectivas de imunoterapia no câncer de cabeça e pescoço
As proteínas E6 do papilomavírus humano e Myc associam-se in vivo e ligam-se e ativam cooperativamente o promotor da transcriptase reversa da telomerase
E5 do papilomavírus: a menor oncoproteína com muitas funções
O aumento da expressão de RRM2 pela oncoproteína E7 do papilomavírus humano promove angiogênese no câncer cervical
A análise abrangente das interações celulares do hospedeiro com as proteínas E6 do papilomavírus humano identifica novos parceiros de ligação de E6 e reflete a diversidade viral
Identificação sistemática de interações entre proteínas da célula hospedeira e oncoproteínas E7 de diversos papilomavírus humanos
Biologia e aplicações dos sistemas CRISPR: aproveitando a caixa de ferramentas da natureza para engenharia genômica
Reparo de quebras de fita dupla do DNA: bem está o que bem acaba
A alteração dos complexos de quinases do ciclo celular em fibroblastos que expressam E6 e E7 do papilomavírus humano precede a transformação neoplásica
Novos siRNAs altamente potentes e específicos para E6 e E7 para o tratamento do câncer cervical HPV 16 positivo
Estado atual no desenvolvimento de vacinas terapêuticas candidatas contra o HPV
Tratamento do câncer cervical mediado por CRISPR/Cas-9 direcionado à proteína E6 do papilomavírus humano
Modulação das vias apoptóticas pelos papilomavírus humanos (HPV): mecanismos e implicações para a terapia
A análise da estrutura em solução da oncoproteína E6 do HPV16 revela um mecanismo de autoassociação necessário para a degradação de p53 mediada por E6
As proteínas E7 dos papilomavírus humanos de baixo e alto risco compartilham a capacidade de direcionar o membro da família pRB, p130, para degradação
Interações diretas entre E6 do HPV e Myc induzem modificações de histonas, fosforilação da pol II e ativação do promotor da hTERT
Efeitos do ribozima anti-E6 do HPV16 na proliferação e apoptose da linhagem celular de câncer cervical humano CaSKi
Ribozima direcionado aos transcritos E6E7 do HPV16 em células de câncer cervical suprime o crescimento celular e sensibiliza as células à quimioterapia e radioterapia
Expressão da oncoproteína E7 do papilomavírus humano tipo 16 induz um processo relacionado à autofagia e sensibiliza queratinócitos humanos normais à morte celular em resposta à privação de fatores de crescimento
Expressão de uma oncoproteína viral em células epiteliais humanas normais desencadeia um processo relacionado à autofagia: seria a autofagia um “calcanhar de Aquiles” dos cânceres humanos?