pmid: "24467387"
title: "Inibidores de NF-κB de Eurycoma longifolia."
authors: "Tran TV, Malainer C, Schwaiger S, Atanasov AG, Heiss EH, Dirsch VM, Stuppner H"
journal: "Journal of natural products"
pubdate: "2014 Mar 28"
doi: "10.1021/np400701k"
source: "PMC Full Text"

Inibidores de NF-κB de Eurycoma longifolia.

Autores

Tran TV, Malainer C, Schwaiger S, Atanasov AG, Heiss EH, Dirsch VM, Stuppner H

Periodico

Journal of natural products (2014 Mar 28)

Conteudo

Inibidores de NF-κB de Eurycoma longifolia
As raízes de Eurycoma longifolia têm sido utilizadas em muitos países do Sudeste Asiático para aliviar várias doenças, incluindo malária, disenteria, insuficiência sexual e reumatismo. Embora numerosos estudos tenham relatado as propriedades farmacológicas de E. longifolia, o modo de ação da atividade anti-inflamatória não foi elucidado. O isolamento bioguiado de inibidores de NF-κB utilizando um ensaio de gene repórter da luciferase dirigido por NF-κB levou à identificação de um novo quassinoide, eurycomalida C (1), juntamente com 27 compostos conhecidos, incluindo 11 quassinoides (2–12), seis alcaloides (13–18), duas cumarinas (19, 20), um derivado de esqualeno (21), um triterpenoide (22) e seis compostos fenólicos (23–28) do extrato de E. longifolia. A avaliação da atividade biológica revelou que quassinoides do tipo C19 e C20, alcaloides β-carbolina e cantin-6-ona são potentes inibidores de NF-κB, com valores de IC50 na faixa micromolar baixa, enquanto quassinoides do tipo C18, compostos fenólicos, cumarinas, o derivado de esqualeno e o triterpenoide mostraram-se inativos quando testados a uma concentração de 30 μM. Eurycomalactona (2), 14,15β-di-hidroclaieanona (7) e 13,21-desidroeurycomanona (10) foram identificados como potentes inibidores de NF-κB com valores de IC50 inferiores a 1 μM.
Eurycoma longifolia Jack. (Simaroubaceae) é um arbusto ou árvore distribuída em países do Sudeste Asiático. É conhecida localmente como “cay ba binh” no Vietnã, “pasak bumi” na Indonésia e “tongkat ali” na Malásia. As raízes desta planta são usadas na medicina tradicional para aliviar várias doenças, como malária, disenteria, inchaço glandular e insuficiência sexual. No Vietnã, além dos usos comuns, uma decocção e um extrato alcoólico das raízes de E. longifolia são utilizados para o tratamento do reumatismo. Vários compostos como quassinoides, alcaloides cantin-6-ona, alcaloides β-carbolina, derivados de esqualeno, triterpenos do tipo tirucalano e bifenilneolignanas foram relatados como componentes principais, que possuem propriedades antimaláricas, antiúlcera e antiplasmódicas e atividades afrodisíacas.
A ação anti-inflamatória de E. longifolia não foi investigada, exceto por um estudo recente, que relata que esta planta possui propriedades estabilizadoras das membranas dos glóbulos vermelhos humanos. O fator de transcrição NF-κB é um regulador chave de muitas vias pró-inflamatórias e, portanto, sua inibição resulta em efeitos anti-inflamatórios. Para investigar uma potencial inibição do NF-κB, foram utilizadas células HEK-293/NF-κB-luc, que é uma linhagem celular estável contendo um gene repórter da luciferase dirigido por NF-κB, que foi aplicada com sucesso anteriormente para o perfil de atividade de uma variedade de extratos de plantas medicinais.− O extrato metanólico das raízes de E. longifolia revelou efeitos inibidores promissores do NF-κB (66,9 ± 3,2%) a uma concentração de 10 μg/mL. Portanto, um procedimento de isolamento bioguiado foi conduzido para identificar o(s) princípio(s) ativo(s), o que levou ao isolamento de 28 compostos, incluindo um novo quassinoide (1). As atividades inibidoras do NF-κB dos isolados foram determinadas em um modelo baseado em células, e as determinações de seus valores de IC50 foram realizadas para os mais ativos destes.

Resultados e Discussão

O extrato metanólico das raízes de E. longifolia foi separado por extração líquido-líquido com água e solventes de polaridade crescente (n-hexano, éter dietílico, acetato de etila e n-butanol). As frações obtidas foram secas, redissolvidas em DMSO e testadas quanto à sua capacidade de inibir a ativação do NF-κB induzida por TNF-α. As células HEK-293/NF-κB-luc foram tratadas com os materiais de teste a uma concentração de 10 μg/mL (controle positivo: partenolídeo 5 μM) e estimuladas com TNF-α. A viabilidade celular foi determinada simultaneamente por coloração com CellTracker Green CMFDA. As frações de éter dietílico e acetato de etila mostraram uma atividade inibidora significativa do NF-κB e nenhuma citotoxicidade significativa (ver Figura S1, Informações de Suporte). Assim, essas frações foram separadas por cromatografia em coluna de Sephadex LH-20 e sílica gel, bem como por cromatografia de partição centrífuga rápida, para fornecer um novo quassinoide, eurycomalide C (1), e 27 compostos conhecidos (2–28).
O composto 1 foi obtido na forma de placas incolores. O espectro de HRESIMS exibiu um íon quase molecular em m/z 347,1478 ([M – H]−), consistente com a fórmula química C19H24O6. Os espectros de IV (1759 cm–1, 1686 cm–1) e UV (234 nm, log ε 3,91) sugeriram a presença de uma cetona α,β-insaturada de um quassinoide do tipo C19. O espectro de RMN de 1H de 1 mostrou sinais devidos a um próton olefínico (δH 5,90), três oximetinos (δH 4,79, 4,36, 4,08), quatro metinos (δH 2,98, 2,92, 2,82, 2,23), um metileno (δH 2,72, 2,37), dois grupos metila terciários (δH 1,44, 1,38) e dois grupos metila secundários (δH 1,26, 1,18). O espectro de RMN de 13C de 1 revelou 19 sinais, incluindo aqueles para dois grupos carbonila (δC 206,9, 198,6), um par de carbonos olefínicos (δC 165,5, 122,7), um carbono de carbonila de γ-lactona (δC 176,4) e três carbonos oxigenados (δC 81,4, 83,4, 69,3). Esses dados se assemelharam muito aos da euricomalação (2), exceto pelo deslocamento para campo mais alto do sinal dos prótons olefínicos (1: δH 5,90; 2: δH: 6,10), dos prótons metilênicos (1: δH 2,72, 2,37; 2: δH 2,81, 2,76) e pela presença adicional de grupos metila secundários. Consequentemente, 1 deve possuir uma porção Δ5,6 em vez da unidade Δ3,4 da euricomalação (2). Isto é consistente com as correlações de HMBC observadas entre o próton olefínico em δH 5,90 com C-10 (δC 49,4) e C-4 (δC 34,2), bem como entre o próton metilênico em δH 2,72 e C-2 (δC 206,9), C-4 (δC 34,2) e C-5 (δC 165,5). Portanto, a dupla ligação foi localizada inequivocamente em Δ5,6, conjugada com a cetona em C-7. A orientação axial (β) de H-4 foi deduzida a partir das constantes de acoplamento entre H-3 e H-4 (J3a,4 = 13,5 e J3e,4 = 3,9) e pôde ser verificada por um experimento de ROESY, que revelou picos de correlação cruzada entre os prótons do grupo metila C-19 e H-4, bem como entre os prótons do grupo metila C-18 e H-3e (2,37), o qual mostrou uma correlação adicional com H-1. Assim, a estrutura do euricomalídeo C foi proposta como 1, representando, até onde sabemos, um novo quassinoide.
Os constituintes conhecidos foram identificados como euricomalação (2), 7α-hidroxieuricomalação (3), 5,6-desidroeuricomalação (4), euricolação E (5), longilação (6), 14,15β-di-hidroclaieanona (7), 11-desidroclaieanona (8), euricomanona (9), 13,21-desidroeuricomanona (10), lauricolação A (11), lauricolação B (12), 1-metoxicarbonil-β-carbolina (13), 9-hidroxi-cantin-6-ona (14), 9-metoxi-cantin-6-ona (15), 9,10-dimetoxi-cantin-6-ona (16), 5-metoxi-4-hidroxi-cantin-6-ona (17), cantin-6-ona 9-O-β-D-glicosídeo (18), escopoletina (19), fraxidina (20), eurileno (21), pedunculosídeo (22), ácido vanílico (23), aldeído vanílico (24), ácido siríngico (25), ácido 1,1′-bifenil-3,3′-dicarboxílico (26), isoaloeresina D (27) e 3,5,6,7,8,3′,4′-heptametoxiflavona (28). A identificação dos compostos foi realizada por meio de espectrometria de massas e espectroscopia de RMN, bem como pela comparação dos dados físicos e espectroscópicos com os de compostos de referência relatados na literatura.
Entre esses compostos, quassinoides e alcaloides foram encontrados como os principais componentes nas frações ativas. É interessante que um derivado de cromona (isoaleoresina D, 27), que até agora foi relatado apenas no gênero Aloe, foi identificado também como constituinte de E. longifolia. Além disso, um triterpenoide (pedunculosídeo, 22) e um flavonoide (3,5,6,7,8,3′,4′-heptametoxiflavona, 28) foram isolados pela primeira vez desta planta.
Todos os compostos isolados (1–28) foram testados quanto à sua capacidade de inibir a via NF-κB em células HEK-293/NF-κB-luc estimuladas por TNF-α em uma concentração inicial de 30 μM. Quassinoides do tipo C19 (1–6) e C20 (7–10), alcaloides (13–16) e o flavonoide 28 exibiram mais de 50% de inibição (Tabela S1, Informações de Suporte). Esses compostos foram posteriormente analisados para determinar seus respectivos valores de IC50 (Tabela 1). Os compostos 2, 7 e 10 mostraram-se potentes inibidores de NF-κB com valores de IC50 inferiores a 1 μM (0,5, 1,0 e 0,7 μM, respectivamente). Os compostos 3–6, 8, 9, 14 e 15 exibiram valores de IC50 variando de 1,5 a 7,4 μM. Menos ativos foram os compostos 1 e 16, apresentando valores de IC50 de 18,4 e 19,5 μM, respectivamente, e os compostos 13 e 28, com valores de IC50 superiores a 20 μM. A ordem de suas atividades foi 2 > 10 > 7 > 3 > 8 > 9 > 5 > 14 > 6 > 4 > 15 > 1 > 16 > 28 > 13. Quassinoides do tipo C18 (11 e 12), cumarinas (19 e 20), compostos fenólicos (23–27), o derivado de esqualeno (21) e o triterpenoide (22) não apresentaram efeitos inibitórios discerníveis contra NF-κB. Assim, quassinoides dos tipos C19 e C20 e alcaloides podem ser considerados os principais princípios anti-inflamatórios de E. longifolia. Entre os quassinoides, a euricomolactona (2) apresentou a atividade inibitória de NF-κB mais potente, enquanto a 9-hidrochantin-6-ona (14) foi o inibidor mais potente entre os alcaloides isolados.
Os quassinoides são conhecidos por sua citotoxicidade contra algumas linhagens celulares (CaOv-3, HeLa, HepG2, HM3KO, MCF-7), enquanto outras (MDBK, Vero) parecem não ser afetadas. Consequentemente, os quassinoides isolados foram investigados quanto aos seus efeitos na viabilidade celular. Na concentração de 30 μM, nenhum dos compostos testados (Tabela S1, Informações de Suporte) apresentou atividade inibitória do crescimento contra células HEK-293/NF-κB-luc. Isso está de acordo com estudos recentes que investigaram a toxicidade aguda de uma fração de éter dietílico de E. longifolia e alguns de seus constituintes em um modelo de camundongo. Após aplicação oral, o valor de DL50 da fração de éter dietílico foi de 2,31 g/kg de peso corporal, enquanto um dos quassinoides isolados, eurycomanona (9), apresentou um valor de DL50 de 122,5 μM/kg (0,05 g/kg) de peso corporal. O mesmo estudo também avaliou os efeitos em um ensaio de toxicidade com Artemia salina, fornecendo valores de DL50 de 144,8, 323,5, 3,5 e 10,3 μg/mL para os compostos 6, 7, 9 e 10, respectivamente. Curiosamente, o fracionamento guiado pela toxicidade aguda forneceu apenas quassinoides do tipo C20 (7–10), enquanto outros tipos [o tipo C18 (11 e 12), o tipo C19 (1–6)] não foram detectados. Um estudo clínico recente utilizando um extrato padronizado solúvel em água de E. longifolia (Physta) contendo 0,8–1,5% de eurycomanona (9) (200 mg duas vezes ao dia) não revelou efeitos adversos. A partir disso, pode-se concluir que as discrepâncias nos dados de citotoxicidade dos quassinoides provavelmente se devem aos diferentes modelos celulares utilizados e às condições variáveis dos ensaios. No entanto, sob as condições experimentais particulares utilizadas no presente estudo, os compostos isolados não apresentaram efeitos citotóxicos.
Valores de IC50 e os Correspondentes
Valores de CI95 da Inibição de NF-κB em TNF-α-Estimuladas
Células HEK-293/NF-κB-luc dos Compostos Testados
composto IC50 (μM) CI95 (μM) eurycomalide C (1) 18.4 16.9–20.1 eurycomalactona (2) 0.5 0.3–0.7 7α-hidroxieurycomalactona (3) 1.5 1.3–1.6 5,6-desidroeurycomalactona (4) 6.2 5.3–7.4 eurycolactona E (5) 3.8 3.2–4.5 longilactona (6) 4.7 3.7–5.9 14,15β-diidroxiclaieanona (7) 1.0 0.8–1.2 11-desidroclaieanona (8) 1.9 1.8–2.1 eurycomanona (9) 2.4 2.0–2.9 13,21-desidroeurycomanona (10) 0.7 0.6–0.9 1-metoxicarbonil-β-carbolina (13) 29.3 20.3–42.4 9-hidroxicantin-6-ona (14) 3.8 3.3–4.4 9-metoxicantin-6-ona (15) 7.4 6.6–8.2 9,10-dimetoxicantin-6-ona (16)a 19.5 13.0–29.4 3,5,6,7,8,3′,4′-heptametoxiflavona (28) 23.3 18.4–29.4 partenolida (controle positivo) 1.5 1.3–1.8
Testado como o correspondente
HCl
sal, dissolvido em água.
Entre os alcaloides isolados, a 1-metoxicarbonil-β-carbolina (13) exibiu efeitos fracos sobre o NF-κB, com um valor de IC50 de 29,3 μM. Em um estudo anterior, outro alcaloide β-carbolínico (4,8-dimetoxi-1-vinil-β-carbolina) isolado de Melia azedarach L. var. japonica foi relatado como supressor da síntese de NO em células RAW 264.7 ativadas por LPS/interferon γ, por meio da inibição da expressão da proteína iNOS devido à diminuição da transcrição do mRNA. Além disso, o mecanismo desse efeito foi explicado pela capacidade dos alcaloides β-carbolínicos de suprimir a via de sinalização do NF-κB através da inibição da atividade de IKK em macrófagos RAW 264.7 estimulados por LPS. Embora o conteúdo do composto 13 nas raízes de E. longifolia seja baixo (com base na quantidade isolada), ele pode contribuir para o efeito inibitório dos extratos sobre o NF-κB.

Entre os cinco alcaloides cantin-6-ona isolados, a 5-metoxi-4-hidroxicantin-6-ona (17) e a cantin-6-ona-9-O-β-d-glicosídeo (18) foram inativas na concentração de 30 μM, enquanto a 9-hidroxicantin-6-ona (14), a 9-metoxicantin-6-ona (15) e a 9,10-dimetoxicantin-6-ona (16) exibiram bons efeitos inibitórios sobre o NF-κB. Em termos de observações preliminares de relação estrutura-atividade, o grupo hidroxi na posição C-9 parece ser mais importante do que um grupo metoxi (14, IC50 3,8 μM; 15, IC50 7,4 μM). Além disso, a metilação do segundo grupo OH fenólico na posição C-10 resulta em uma redução adicional do efeito inibitório sobre o NF-κB (16, IC50 19,5 μM). Os alcaloides cantin-6-ona foram relatados como constituintes citotóxicos e antimaláricos de E. longifolia; no entanto, até onde sabemos, esta é a primeira vez que se descobre que os alcaloides cantin-6-ona são inibidores do NF-κB.

Os principais constituintes dos extratos ativos de E. longifolia foram identificados como quassinoides pertencentes aos tipos C18 (11 e 12), C19 (1–6) e C20 (7–10). É interessante que os quassinoides do tipo C18 não mostraram atividade inibitória, enquanto os dos tipos C19 e C20 foram responsáveis pelo efeito dos extratos que exibiram inibição do NF-κB na faixa de baixo μM (valores de IC50 de 0,5 a 18,4 μM). Dados preliminares de relação estrutura-atividade puderam ser estabelecidos para essa classe de compostos. Primeiro, como a ciclopentenona no anel A dos quassinoides do tipo C18 aboliu esse efeito, o anel A de seis membros é claramente necessário para tal atividade. Segundo, a dupla ligação entre os carbonos 3 e 4 parece ser mais relevante do que a dupla ligação entre os carbonos 5 e 6 (o composto 1 apresentou um valor de IC50 mais alto (>30 vezes) do que o composto 2). Terceiro, a troca de um dos grupos hidroxi em C-2 ou C-7 por uma funcionalidade carbonila resultou em uma diminuição significativa da inibição do NF-κB (composto 2, IC50 0,5 μM; composto 3, IC50 = 1,5 μM; composto 5, IC50 = 3,8 μM).
Em conclusão, os presentes resultados demonstraram que o extrato metanólico das raízes de E. longifolia possui potentes efeitos inibitórios sobre NF-κB. A investigação das frações ativas levou à identificação de basicamente duas classes principais de compostos responsáveis pela atividade: (i) quassinoides do tipo C19 e C20 e (ii) alcaloides β-carbolínicos e cantin-6-ona. A bioatividade observada dos compostos isolados pode ser uma primeira indicação do seu modo de ação molecular e ajudará a elucidar o uso tradicional da raiz de E. longifolia contra a inflamação. O estudo resultou na descoberta dos alcaloides cantin-6-ona como uma nova classe de compostos que atuam como inibidores de NF-κB.
Seção Experimental
Procedimentos Experimentais Gerais
O ponto de fusão foi registrado em um aparelho DSC 7 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, EUA). As rotações ópticas foram determinadas com um polarímetro Perkin-Elmer 341 (Wellesley, MA, EUA) a 20 °C. Os espectros de ultravioleta (UV) foram registrados em um espectrofotômetro Shimadzu UV-1800. Os espectros de FTIR foram registrados em um espectrômetro FTIR Bruker IFS 25 acoplado a um microscópio de IR (Bruker Optics, Ettlingen, Alemanha) no modo de transmissão “4000–6000 cm–1”, utilizando discos de ZnSe de 2 mm de espessura. Experimentos de RMN 1D e 2D foram registrados em um espectrômetro de RMN Bruker DRX 300 (Bruker Biospin Rheinstetten, Alemanha) ou Bruker Advance II 600; os solventes de RMN foram MeOH-d4/CDCl3/DMSO-d6/piridina-d6 com 0,03% de TMS (Eurisotop Gif-Sur-Yvette, França) utilizado como padrão interno. HRESIMS foram medidos em um espectrômetro de massas Bruker mikrOTOF-QII. As análises por LC foram realizadas utilizando um sistema HP 1100 (Agilent, Waldbronn, Alemanha) equipado com amostrador automático, DAD e termostato de coluna. As separações foram realizadas em uma coluna Agilent Zorbax SB-C18 80A (150 × 4,6 mm d.i., 3,5 μm) e uma pré-coluna Merck (VWR, Darmstadt, Alemanha) LiChroCART 4-4 com recheio LiChrospher 100 RP18 (5 μm). Foi empregada uma fase móvel composta por 0,02% de TFA em H2O (v/v) (solvente A) e MeOH (solvente B) com eluição por gradiente (0 min, 90:10 (A:B); 50 min, 20:80; 51 min, 2:98; 60 min, 2:98). O comprimento de onda de detecção foi de 254 nm e o termostato foi ajustado a 35 °C. O volume de injeção foi de 10 μL; a vazão foi de 0,3 mL/min. Para os experimentos de LC-ESIMS, o sistema HPLC foi acoplado a um ion trap Bruker (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) Esquire 3000plus, substituindo o solvente A por uma solução de 0,9% de ácido fórmico e 0,1% de ácido acético em H2O (v/v). Os parâmetros de MS foram os seguintes: modo ESI positivo; voltagem do spray −4,5 kV; gás nebulizador 35 psi; vazão do gás de secagem 8,00 L/min; faixa de m/z 100–1500. Neste trabalho, foi utilizado um aparelho de cromatografia de partição centrífuga rápida (FCPC) (Kromaton, França), equipado com sistema de bombas Gilson 302/803C modelo 302 (Villiers-la-Bel, França). A cromatografia em coluna foi realizada utilizando Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech AB, Estocolmo, Suécia) e sílica gel 60 (0,040–0,063 mm; Merck, VWR, Darmstadt, Alemanha) como fases estacionárias. A CCD foi realizada em placas de sílica gel 60 F254 (VWR, Darmstadt, Alemanha). Todos os solventes utilizados para isolamento foram adquiridos da VWR International (Darmstadt, Alemanha). Os solventes para HPLC foram obtidos da Merck (Darmstadt, Alemanha). Água ultrapura foi produzida por um sistema de purificação de água Sartorius Arium 611 UV (Göttingen, Alemanha). Parthenolida e TNF-α humano recombinante foram adquiridos da Sigma-Aldrich, Viena, Áustria.
Raízes de E. longifolia foram coletadas na Montanha Chua Chan (Dong Nai/Vietnã) em setembro de 2010 e identificadas pelo Prof. Tran Hung (Departamento de Farmacognosia/Faculdade de Farmácia, Universidade de Medicina e Farmácia da Cidade de Ho Chi Minh). Uma exsicata (DN107) está armazenada no Departamento de Farmacognosia/Faculdade de Farmácia, Universidade de Medicina e Farmácia da Cidade de Ho Chi Minh, Vietnã.

Extração e Isolamento

A extração foi realizada com 4 kg das raízes moídas e secas ao ar, que foram percoladas com 60 L de MeOH à temperatura ambiente. A solução obtida foi evaporada até a secura utilizando um rotavapor a 35 °C, fornecendo 320,6 g de extrato bruto. A separação inicial foi realizada por meio de extração líquido-líquido; 310,4 g do extrato bruto foram suspensos em 1,0 L de água e extraídos com n-hexano (500 mL × 6), éter dietílico (500 mL × 6) e acetato de etila (500 mL × 10), seguido por n-butanol (500 mL × 6). Cada uma das camadas orgânicas combinadas, bem como a camada aquosa, foi evaporada até a secura, fornecendo as frações n-hexano (Eury-Hx, 13,0 g), éter dietílico (Eury-DE, 6,2 g), acetato de etila (Eury-Et, 21,8 g), n-butanol (Eury-Bu; 38,5 g) e água (Eury-Wa; 160,2 g). As frações de éter dietílico e acetato de etila obtidas, que apresentaram os efeitos anti-inflamatórios mais promissores, foram separadas por meios cromatográficos para isolar os compostos puros.
A fração Eury-DE (5,5 g) foi submetida a CC de Sephadex LH-20, eluída com MeOH para obter 11 frações (EuryA1 a EuryA11). A fração EuryA9 foi aplicada em CC de sílica gel (DCM/MeOH, 99,5:0,5 a 98,0:2,0, v/v) fornecendo o composto 15 (4,6 mg). A fração EuryA9-12 (29,8 mg) foi recromatografada por CC de sílica gel (AcOEt/MeOH/H2O, 8:1,8:0,2, v/v/v) fornecendo o composto 14 (12,0 mg). A fração EuryA8 foi separada por CC de Sephadex LH-20, eluída com CH2Cl2/acetona (85:15, v/v) para fornecer 19 frações. O composto 15 (8,0 mg) foi isolado da fração EuryA8-6 por CC de sílica gel. A subfração EuryA8-18 foi purificada por CC de Sephadex LH-20 com MeOH como eluente, rendendo o composto 26 (16,9 mg). Um precipitado cristalino de uma solução metanólica de EuryA7 foi separado por filtração e purificado por CC de sílica gel para fornecer os compostos 19 (21,5 mg) e 17 (24,0 mg). O resíduo não cristalino da fração EuryA7 foi aplicado em FCPC (n-hexano/CHCl3/MeOH/H2O, 1:3:3:2, fase inferior: fase móvel) para fornecer 10 frações (EuryA7-R1 a EuryA7-R10). A fração EuryA7-R1 foi separada por CC de Sephadex LH-20 (CH2Cl2/acetona, 85:15, v/v) e posteriormente purificada por CC de sílica gel (CH2Cl2/MeCN, 9:1, v/v) para obter o composto 13 (7,0 mg). A fração EuryA7-R4 foi aplicada em CC de Sephadex LH-20 (CH2Cl2/acetona, 85:15, v/v) fornecendo os compostos 20 (12,5 mg) e 24 (15,0 mg). A fração EuryA7-R7 foi separada por CC de Sephadex LH-20 (MeOH), rendendo o composto 23 (13,5 mg). O composto 25 (6,9 mg) foi isolado da fração EuryA7-R6 por CC de Sephadex LH-20 (MeOH, seguido por MeOH/H2O, 1:1, v/v). A fração EuryA7-R10 foi posteriormente cromatografada em CC de Sephadex LH-20 (MeOH, seguido por MeOH/H2O; 1:1, v/v) para render o composto 7 (35,8 mg). A fração EuryA6 formou cristais em MeOH, os quais foram purificados por CC de Sephadex LH-20 (CH2Cl2/acetona, 85:15, v/v) para obter o composto 2 (75,2 mg). O resíduo de EuryA6 foi aplicado em CC de Sephadex LH-20 (CH2Cl2/acetona, 85:15, v/v) para fornecer 20 frações. A fração EuryA6-R6 foi submetida a FCPC (n-heptano/AcOEt/MeOH/H2O, 1:1:3:1, fase superior: fase móvel), depois purificada por CC de Sephadex LH-20 (CH2Cl2/acetona; 85:15, v/v) e CC de sílica gel (CH2Cl2/MeCN, 95:5, v/v) para fornecer os compostos 3 (13,9 mg), 4 (11,7 mg) e 1 (12,0 mg). A fração EuryA6-R7 foi separada por CC de sílica gel (CH2Cl2/MeCN, 95:5, v/v) para obter o composto 12 (20,49 mg) e o composto 11 (13,34 mg). A fração EuryA2 foi purificada por CC de Sephadex LH-20 (MeOH); a recristalização da subfração EuryA2-2 em CHCl3 forneceu o composto 21 (80 mg).
Eury-Et (10,5 g) foi submetido a CC em Sephadex LH-20, eluída com MeOH, fornecendo 10 frações (EuryB1 a EuryB10). A fração EuryB8 foi submetida a CC em sílica gel (CH2Cl2/MeOH; gradiente 100:0 a 98:2, v/v) para obter o composto 16 (27,4 mg). A fração EuryB7 foi separada por FCPC (n-hexano/CH2Cl2/MeOH/H2O, 0,5:3:3:2, fase inferior: fase móvel) e então purificada por CC em Sephadex LH-20 (MeOH) fornecendo o composto 7 (153,1 mg) e o composto 18 (6,8 mg). A fração EuryB6 foi aplicada a uma CC em sílica gel (CH2Cl2/MeOH, gradiente 10:0 a 8,8:1,2, v/v) fornecendo 20 frações. A fração EuryB6-2 foi submetida a CC em Sephadex LH-20 (CH2Cl2/acetona, 85:15, v/v) e CC em sílica gel (CH2Cl2/MeOH, 9:1, v/v) para obter o composto 28 (5,2 mg) e o composto 8 (9,3 mg). A fração EuryB6-6 foi recristalizada de CH2Cl2/MeOH (8:2) fornecendo o composto 5 (9,7 mg). Os compostos 6 (39,52 mg) e 10 (25,15 mg) foram obtidos das frações EuryB6-8 e EuryB6-11 por CC em Sephadex LH-20 (MeOH/H2O, 1:1, v/v), respectivamente. A fração EuryB5 foi submetida a CC em sílica gel (CH2Cl2/MeOH/H2O; gradiente 10:1:0,5 a 10:4:3, v/v/v), fornecendo 16 subfrações. As frações EuryB5-9 e EuryB5-13 foram purificadas por CC em Sephadex LH-20 (MeOH/H2O; 1:1, v/v) fornecendo os compostos 9 (15,0 mg) e 27 (27,3 mg), respectivamente. A fração EuryB5-15 também foi submetida a CC em Sephadex LH-20 (MeOH/H2O; 1:1, v/v) e posteriormente purificada por CC em sílica gel para obter o composto 22 (4,5 mg).

Eurycomalide C (1):
placas incolores (CHCl3); p.f. 243–245 °C; [α]D20 0 (c 0,12, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 234 (3,91) nm; IR (filme) νmax 3494, 3356, 2918, 2850, 1759, 1686 cm–1; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 5,90 (1H, s, H-6), 4,79 (1H, td, J = 4,9, 10,0 Hz, H-11), 4,36 (1H, brd, J = 4,7 Hz, H-12), δ 4,08 (1H, brs, H-1), 2,98 (1H, s, H-14), 2,92 (1H, m, H-13), 2,82 (1H, m, H-4), 2,72 (1H, dd, J = 3,9, 13,1 Hz, H-3a), 2,37 (1H, t, J = 13,5 Hz, H-3b), 2,23 (1H, d, J = 3,8 Hz, H-9), 1,44 (3H, s, H-20), 1,38 (3H, s, H-19), 1,26 (3H, d, J = 6,1 Hz, H-18), 1,18 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-21); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 206,9 (C, C-2), 198,6 (C, C-7), 176,4 (C, C-15), 165,5 (C, C-5), 122,7 (CH, C-6), 83,4 (CH, C-12), 81,4 (CH, C-1), 69,3 (CH, C-11), 52,2 (CH, C-14), 49,4 (C, C-10), 48,1 (C, C-8) 47,6 (CH, C-9), 34,2 (CH, C-4), 31,7 (CH, C-13), 22,7 (CH3, C-20), 18,2 (CH3, C-19), 18,2 (CH3, C-18), 16,5 (CH3, C-21); ESIMS (positivo) m/z 349,0 [M + H]+, 719,1 [2M + Na]+; HRESIMS m/z 347,1478 [M – H]− (calculado para C19H23O6, 347,1500).

Transformação do Composto 16 no Sal de HCl Correspondente
Para investigações farmacológicas, todos os compostos isolados foram dissolvidos em DMSO em uma concentração adequada. Como o composto 16 apresentou baixa solubilidade em DMSO, o composto foi convertido no cloridrato correspondente para obter melhor solubilidade; portanto, 2 mg do composto 16 foram dissolvidos em 1 mL de diclorometano e extraídos duas vezes com 1,0 mL de HCl 0,1 N. A camada aquosa foi evaporada até a secura para obter o sal correspondente do composto 16.
Atividade de NF-κB e Viabilidade Celular
Células HEK293/NF-κB-luc (Panomics, RC0014) foram utilizadas para a determinação da atividade de NF-κB e viabilidade celular, conforme descrito anteriormente. As células foram cultivadas a 37 °C e atmosfera de 5% de CO2 em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Lonza, Basileia, Suíça) suplementado com 100 μg/mL de higromicina B, 100 U/mL de benzilpenicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 2 mM de glutamina e 10% de soro fetal bovino (SFB). As células foram coradas por 1 h em meio livre de soro suplementado com 2 μM de CellTracker Green CMFDA (C2925; Invitrogen). Como essa sonda fluorescente é retida no interior das células vivas, ela pode ser usada para monitorar a integridade da membrana celular e tem sido amplamente utilizada para quantificar células viáveis. Posteriormente, as células foram replaqueadas em placas de 96 poços (4 × 104 células/poço) em DMEM sem vermelho de fenol e sem SFB durante a noite. As células foram então pré-tratadas com as amostras investigadas ou com o veículo solvente (0,1% de DMSO no meio de cultura) por 30 min e estimuladas com TNF-α (2 ng/mL) por 4 h. Em seguida, as células foram lisadas em tampão de lise para luciferase (Promega; E1531), e a luminescência da luciferase de vagalume e a fluorescência do CellTracker Green CMFDA foram quantificadas com um leitor de placas Genios Pro (Tecan, Grödig, Áustria). Para a quantificação da atividade de NF-κB, o sinal derivado da luciferase do repórter de NF-κB foi normalizado pela fluorescência derivada do CellTracker Green CMFDA para compensar diferenças no número de células. Diferenças potenciais na viabilidade celular foram detectadas pela comparação da fluorescência do CellTracker Green CMFDA das células tratadas com o veículo solvente e das células tratadas com as amostras indicadas.

Análises Estatísticas
Regressão não linear (com resposta sigmoidal à dose) foi utilizada para calcular os valores de IC50 usando o GraphPad Prism 4.03 (GraphPad Software, Inc.). As diferenças estatísticas foram comparadas por análise de ANOVA seguida pelo teste de Tukey. Um valor de p < 0,01 foi considerado significativo.

Informações de Suporte Disponíveis
O efeito do extrato de E. longifolia, frações cromatográficas e compostos isolados na concentração de 30 μM, incluindo os dados de viabilidade celular, estruturas de compostos conhecidos adicionais e espectros de RMN 1D e 2D da eurycomalida C (1) estão disponíveis gratuitamente via Internet em .

Material Suplementar

Contribuições dos Autores
⊥ T. V. A. Tran e C. Malainer contribuíram igualmente para este trabalho.

Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.

Dedicatória
Dedicado ao Prof. Dr. Otto Sticher, da ETH-Zurique, Zurique, Suíça, por seu trabalho pioneiro em farmacognosia e fitoquímica.

Referências