pmid: "34641483"
title: "Quassinoides das Raízes de"
authors: "Yang WQ, Tang W, Huang XJ, Song JG, Li YY, Xiong Y, Fan CL, Wu ZL, Wang Y, Ye WC"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2021 Sep 30"
doi: "10.3390/molecules26195939"
source: "PMC Full Text"

Quassinoides das Raízes de

Autores

Yang WQ, Tang W, Huang XJ, Song JG, Li YY, Xiong Y, Fan CL, Wu ZL, Wang Y, Ye WC

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2021 Sep 30)

Conteudo

Quassinoides das Raízes de Eurycoma longifolia e Suas Atividades Antiproliferativas
Uma investigação fitoquímica das raízes da planta medicinal Eurycoma longifolia resultou no isolamento de 10 novos quassinoides C20 altamente oxigenados, longifolactonas G‒P (1–10), juntamente com quatro conhecidos (11–14). Suas estruturas químicas e configurações absolutas foram inequivocamente elucidadas com base em análises espectroscópicas abrangentes e dados de cristalografia de raios X. Notavelmente, o composto 1 é um raro quassinoide C20 pentacíclico que apresenta um núcleo 2,5-dioxatriciclo[5.2.2.04,8]undecano densamente funcionalizado. O composto 4 representa o primeiro exemplo de quassinoides contendo uma funcionalidade 14,15-epóxi, e 7 apresenta um grupo hidroxila α-orientado incomum em C-14. Todos os compostos isolados foram avaliados quanto às suas atividades antiproliferativas em células de leucemia humana. Entre os isolados, os compostos 5, 12, 13 e 14 inibiram potentemente a proliferação in vitro das células K562 e HL-60, com valores de IC50 variando de 2,90 a 8,20 μM.

1. Introdução
   Quassinoides são uma classe de triterpenoides degradados altamente oxigenados, distribuídos principalmente na família de plantas Simaroubaceae. Com base no número de átomos de carbono envolvidos na construção de seus esqueletos básicos, os quassinoides são comumente categorizados em seis grupos distintos: tipos C26, C25, C22, C20, C19 e C18. Os quassinoides têm sido relatados por exibir uma ampla gama de atividades biológicas, incluindo atividades antitumorais, antimaláricas, anti-inflamatórias, antivirais, neuroprotetoras e antialimentares. Especialmente desde a descoberta da bruceantina, um quassinoide C20 isolado de Brucea antidysenteria (Simaroubaceae) no início da década de 1970, que mostrou notável atividade antileucêmica, as atividades antitumorais dos quassinoides têm atraído ampla atenção das comunidades química e biológica.
   Eurycoma longifolia Jack (Simaroubaceae), comumente conhecida como “Tongkat Ali”, é uma planta arbustiva florífera amplamente distribuída no Sudeste Asiático. As raízes de E. longifolia eram tradicionalmente usadas pela população local para o tratamento de malária, disenteria, inchaço glandular, febre persistente, dores e insuficiência sexual. Além disso, as atividades antitumorais do extrato bruto das raízes de E. longifolia foram relatadas em 2005. Investigações fitoquímicas anteriores das raízes de E. longifolia forneceram uma ampla variedade de componentes químicos, incluindo quassinoides, alcaloides cantin-6-ona, alcaloides β-carbolínicos, triterpenos do tipo tirucalano, derivados de esqualeno e neolignanas bifenílicas. Entre eles, os quassinoides são os constituintes químicos mais característicos desta planta.
   Anteriormente, nosso grupo relatou o isolamento e a caracterização de seis novos quassinoides (longifolactonas A‒F) com esqueletos inéditos C26 ou C20, obtidos da fração solúvel em éter de petróleo do extrato etanólico das raízes de E. longifolia. Dentre eles, a longifolactona F é o primeiro exemplo de quassinoide contendo um sistema de anel 2,5-dioxatriciclo[5.2.2.04,8]undecano densamente funcionalizado e sem precedentes. Em continuidade aos nossos estudos na busca por metabólitos estruturalmente únicos e biologicamente interessantes de plantas medicinais, a fração solúvel em acetato de etila da planta em questão foi investigada mais a fundo. Como resultado, foram isoladas as longifolactonas G‒P (1–10), 10 novos quassinoides C20, juntamente com quatro já conhecidos. Suas estruturas e configurações absolutas foram estabelecidas de forma inequívoca por meio de extensa análise de dados espectroscópicos e experimento de difração de raios X de monocristal. Notavelmente, o composto 1 é o segundo membro da rara classe de quassinoides que apresentam o núcleo 2,5-dioxatriciclo[5.2.2.04,8]undecano densamente funcionalizado. Além disso, o composto 4 representa o primeiro exemplo de quassinoide contendo uma funcionalidade 14,15-epóxi, e o composto 7 possui um substituinte 14α-OH incomum, o que torna 7 o segundo membro dessa classe rara de quassinoides até o momento. Neste trabalho, relatamos o isolamento e a elucidação estrutural desses novos quassinoides. Adicionalmente, as atividades antiproliferativas in vitro de todos os isolados sobre duas linhagens celulares de leucemia humana (células K562 e HL-60) também foram descritas.
2. Resultados e Discussão
   2.1. Quassinoides Isolados de E. longifolia
   As raízes secas ao ar e pulverizadas de E. longifolia (10 kg) foram extraídas com etanol 95% à temperatura ambiente por cinco vezes. O extrato etanólico (270 g) foi suspenso em água e particionado sucessivamente com éter de petróleo, acetato de etila e n-butanol. A fração solúvel em acetato de etila foi investigada no presente estudo. Por meio de uma série de procedimentos cromatográficos aplicados à referida fração, foram isolados 10 novos quassinoides C20 (longifolactonas G‒P, 1‒10), juntamente com quatro quassinoides C20 conhecidos: chaparrolida (11), 15β-hidroxiklaineanona (12), 14,15β-di-hidroxiklaineanona (13) e euricomanona (14) (Figura 1).
   2.2. Elucidação Estrutural dos Novos Quassinoides
   O composto 1 foi obtido na forma de agulhas incolores. Sua fórmula molecular foi determinada como C20H26O8 pelo pico do íon no HR-ESI-MS em m/z 395,1696 [M + H]+ (calculado para C20H27O8, 395,1700) e pelos dados de RMN de 13C. O espectro UV de 1 apresentou máximos de absorção em 241 nm. Seu espectro IV revelou as absorções características de grupos funcionais hidroxila (3455 cm−1) e carbonila (1730 e 1667 cm−1). Nos espectros de RMN de 1H e 13C de 1, foram observados sinais correspondentes a dois grupos hidroxila [δH 7,05 (1H, s) e 6,89 (1H, d, J = 5,7 Hz)], uma carbonila cetônica (δC 199,7), uma carbonila de éster (δC 171,5), uma ligação dupla trissubstituída [δH 6,07 (1H, s largo); δC 163,3 e 125,6], um carbono hemicetálico (δC 111,0), um carbono quaternário oxigenado (δC 82,9), quatro metinos oxigenados [δH 5,45 (1H, m), 5,13 (1H, s), 4,72 (1H, dd, J = 4,6, 1,8 Hz) e 4,00 (1H, s); δC 85,5, 83,5, 82,7 e 69,5], três metinos, um metileno, dois carbonos quaternários e quatro grupos metila [δH 1,96 (3H, s), 1,70 (3H, s), 1,39 (3H, s) e 1,34 (3H, d, J = 7,2 Hz); δC 21,6, 13,0, 12,9 e 12,8], indicativos de um esqueleto quassinoide C20 para 1. Com o auxílio dos dados de RMN 2D, todos os deslocamentos de prótons e carbonos de 1 foram atribuídos (Tabelas S1 e S2).
   Os dados espectroscópicos de RMN de 1 descritos acima foram muito semelhantes aos da longifolactona F, sugerindo a similaridade estrutural desses dois compostos. Diferentemente da longifolactona F, os sinais de RMN correspondentes a um grupo metileno (CH2-3) e a um grupo metino (CH-4) foram substituídos pelas ressonâncias de uma ligação dupla [δH 6,07 (1H, s largo); δC 163,3 e 125,6] em 1. No espectro HMBC, foram observadas correlações chave entre H3-29 e C-3, H-5 e C-3, H2-6 e C-4, sugerindo a presença de um motivo cetona α,β-insaturada no anel A de 1, o que também foi confirmado pelos valores característicos de deslocamento químico de C-2‒C-4 (δC 199,7, 125,6 e 163,3). Após uma interpretação abrangente de seus espectros de 1H–1H COSY e HMBC, a estrutura bruta de 1 foi estabelecida como um quassinoide C20 com um raro núcleo 2,5-dioxatriciclo[5.2.2.04,8]undecano (Figura 2).
   No espectro NOESY de 1, foram observadas correlações NOE chave entre H-1 e H-5/H-11, H-5 e H-9, indicando que esses prótons possuíam a mesma orientação. Enquanto isso, as correlações NOE entre OH-14 e H-15/H3-30, H-13 e H3-30, H3-19 e H3-30 foram observadas, sugerindo que esses prótons estavam localizados na mesma face da molécula (Figura 3). Finalmente, foram obtidos cristais adequados de 1. A análise subsequente por difração de raios X com radiação Cu Kα resultou em um excelente parâmetro de Flack de 0,06 (4), o que não apenas permitiu a verificação da estrutura plana de 1, mas também levou ao estabelecimento de sua configuração absoluta como 1S,5S,7R,8R,9R,10S,11R,12R,13S,14R,15R (Figura 4).
   A fórmula molecular de 2 foi deduzida como C21H30O8 com base em seus dados de HR-ESI-MS (m/z 433,1832 [M + Na]+; calculado para C21H30O8Na, 433,1833) e na análise dos dados de RMN de 13C. Os dados espectroscópicos de RMN de 1H e 13C de 2 (Tabelas S1 e S2) se assemelharam muito aos da 6-desidroxilongilactona, exceto pela presença de sinais adicionais devido a um carbono hemicetal (δC 102,5) e um grupo metila oxigenado [δH 3,83 (3H, s); δC 52,7] em 2. Posteriormente, a análise detalhada de seus espectros de COSY 1H–1H e HMBC permitiu o estabelecimento de um sistema de anéis 6/6/6/5 para 2, idêntico ao da 6-desidroxilongilactona. Além disso, a correlação HMBC entre 1′-OCH3 e C-16 indicou a presença de um grupo metoxicarbonila extra em 2. Com base nas informações da fórmula molecular, bem como no deslocamento evidente para campo baixo de C-15 (δC 102,5), os grupos metoxicarbonila e hidroxila restantes foram ambos atribuídos como ligados a C-15, o que também foi confirmado pela correlação HMBC entre H-14 e C-16 (Figura 2). Assim, a estrutura plana de 2 foi estabelecida. Finalmente, a estrutura de 2 foi completamente resolvida por um experimento de difração de raios X. Com um excelente parâmetro de Flack de 0,09 (8), a configuração absoluta de 2 foi atribuída como 1S,5S,7R,8R,9R,10S,11R,12R,13R,14S,15S (Figura 4).

A fórmula molecular de 3 foi determinada como C20H28O5 com base em seu pico de íon molecular sodiado em m/z 371,1831 [M + Na]+ (calculado para C20H28O5Na, 371,1829) e nos dados de RMN de 13C. Os dados espectrais de RMN de 1H e 13C de 3 foram semelhantes aos do composto conhecido co-isolado chaparrolide (11), o que indicou que 3 também era um quassinoide C20. Em comparação com os de 11, os espectros de RMN de 1H e 13C de 3 mostraram sinais adicionais para uma ligação dupla cis-dissubstituída [δH 6,31 (1H, d, J = 9,6 Hz) e 5,76 (1H, d, J = 9,6 Hz); δC 132,7 e 130,2] e um grupo exo-olefina [δH 5,00 (1H, s) e 4,84 (1H, s); δC 145,8 e 111,3], enquanto os sinais correspondentes a uma carbonila de cetona, um grupo metileno, um grupo metino e um grupo metila estavam ausentes. No espectro de COSY 1H–1H de 3, a correlação entre H-11 e H-12 indicou que o C-11 em 3 era um metino substituído por oxigênio em vez da carbonila de cetona em 11 (Figura 2). Além disso, os picos cruzados HMBC observados entre H2-29 e C-3/C-5, H-3 e C-5, H-3 e C-1 indicaram a presença de duas ligações duplas conjugadas no anel A de 3 (Figura 2). De forma semelhante, um experimento de difração de raios X utilizando radiação Cu Kα foi realizado, o que levou à atribuição completa da estrutura plana e da configuração absoluta de 3 (1R,5S,7R,8S,9R,10S,11S,12R,13R,14S, Figura 4).
A fórmula molecular de 4 foi atribuída como C20H26O7 com base em seus dados de HR-ESI-MS (m/z 401,1574 [M + Na]+; calculado para C20H26O7Na, 401,1571) e dados espectroscópicos de RMN de 13C, 18 unidades de massa a menos que o quassinoide C20 conhecido co-isolado, 14,15β-di-hidroxiclaineanona (13). Os espectros de RMN de 4 mostraram sinais característicos semelhantes aos de 13, exceto pela presença de um metino oxigenado [δH 3,36 (1H, s); δC 52,9] e um carbono quaternário oxigenado (δC 67,9). Considerando as informações da fórmula molecular, os dois grupos hidroxila em C-14 e C-15 em 13 foram substituídos por um anel epóxido em 4. Além disso, a correlação NOE entre H-15 e H3-18 no espectro NOESY sugeriu que o anel epóxido possuía orientação β (Figura 3). De forma semelhante a 1–3, a estrutura com configuração absoluta (1S,5S,7R,8S,9R,10S,11R,12R,13S,14R,15R) de 4 foi definitivamente atribuída por um experimento de difração de raios X (Figura 4).

A fórmula molecular de 5 foi determinada como C20H26O7 pelo pico de íon em HR-ESI-MS em m/z 401,1574 [M + Na]+ (calculado para C20H26O7Na, 401,1571) e dados de RMN de 13C. Os dados espectrais de RMN de 1H e 13C de 5 (Tabelas S1 e S2) foram muito semelhantes aos da 11-desidroclaineanona. As principais diferenças foram que os sinais correspondentes a um grupo metileno [δH 3,69 (1H, dd, J = 19,4, 12,7 Hz) e 2,70 (1H, dd, J = 19,4, 6,6 Hz); δC 29,1] no composto conhecido foram substituídos pelos sinais devidos a um metino oxigenado [δH 5,42 (1H, d, J = 10,1 Hz); δC 67,3] em 5, sugerindo a presença de um grupo hidroxila adicional em C-15 em 5. Essa suposição foi ainda confirmada pelo pico cruzado HMBC entre H-15 e C-16 (Figura 2). Subsequentemente, a estrutura planar e a configuração absoluta (1S,5S,7R,8S,9R,10S,12R,13R,14S,15R) de 5 foram completamente deduzidas por um experimento de difração de raios X de monocristal (Figura 4).

O HR-ESI-MS de 6 exibiu um pico de íon molecular sodiado em m/z 435,1626 [M + Na]+, correspondendo a uma fórmula molecular de C20H28O9. A comparação dos dados espectrais de RMN de 1H e 13C de 6 (Tabelas S1 e S3) com os da Δ4,5,14-hidroxiglaucarubol revelou que eles eram muito semelhantes, exceto pelos sinais da endo-olefina (δC 130,1 e 127,5) e de uma metila [δH 1,75 (3H, s); δC 20,2] na Δ4,5,14-hidroxiglaucarubol, que foram substituídos por sinais de uma exo-olefina [δH 4,98 (1H, s) e 4,74 (1H, s); δC 147,4 e 110,1] e de um metino [δH 2,74 (1H, sobreposto); δC 42,5] em 6. No espectro HMBC, as correlações entre H2-29 e C-3/C-5 indicaram que a exo-olefina estava localizada em C-4 (29) (Figura 2). Assim, a estrutura planar de 6 foi estabelecida. De forma semelhante, a estereoestrutura relativa e a configuração absoluta (1S,2S,5S,7R,8R,9R,10S,11R,12R,13S,14R,15R) de 6 foram estabelecidas por um experimento de difração de raios X de monocristal (Figura 4).
A fórmula molecular de 7 foi deduzida como C20H28O9 por seus dados de HR-ESI-MS (m/z 435,1621 [M + Na]+; calculado para C20H28O9Na, 435,1626) e dados de RMN de 13C. As características espectroscópicas de RMN de 7 foram semelhantes às da 14-epi-13,21-di-hidroeurycomanona, exceto pela presença de sinais atribuídos a um metino oxigenado [δH 4,63 (1H, s largo); δC 72,3] em 7, enquanto o sinal correspondente a um carbono de carbonila cetônica estava ausente. Os dados acima sugeriram que 7 era o derivado C-2 hidroxilado da 14-epi-13,21-di-hidroeurycomanona. Essa suposição foi confirmada pelo sistema de spin deduzido de H-1 a H-3 no espectro de COSY 1H–1H de 7 (Figura 2). Além disso, a correlação NOE entre H-2 e H3-19 no espectro NOESY sugeriu que H-2 e H3-19 tinham a mesma orientação (Figura 3). Finalmente, com um parâmetro de Flack de −0,12 (9), a estrutura absoluta de 7 (1S,2S,5S,7R,8R,9R,10S,11R,12R,13S,14S,15R) foi estabelecida de forma inequívoca (Figura 4).
O HR-ESI-MS do composto 8 exibiu um pico de íon molecular sodiado em m/z 431,1311 [M + Na]+ (calculado para C20H24O9Na, 431,1313), permitindo a determinação de uma fórmula molecular de C20H24O9 que era idêntica à do quassinoide C20 conhecido 13-epi-eurycomadilactona. Os dados espectrais de RMN de 1H e 13C de 8 (Tabelas S1 e S3) se assemelharam muito aos da 13-epi-eurycomadilactona, combinados com sua informação de fórmula molecular, sugerindo que 8 era um estereoisômero do composto conhecido. Uma análise mais aprofundada dos dados de RMN 2D de 8 confirmou que 8 tinha a mesma estrutura planar que a 13-epi-eurycomadilactona. Diferente da 13-epi-eurycomadilactona, o espectro NOESY de 8 mostrou a correlação entre H-13 e H2-30, indicando a orientação α para o H3-18 em 8 (Figura 3). A estrutura com configuração absoluta (1S,5S,7R,8R,9R,10S,11S,13R,14R,15R) de 8 foi finalmente determinada com base em um estudo de cristalografia de raios X usando a dispersão anômala da radiação Cu Kα (Figura 4).
O composto 9 foi atribuído a possuir uma fórmula molecular de C20H26O9 pelo pico de íon HR-ESI-MS em m/z 433,1472 [M + Na]+ (calculado para C20H26O9Na, 433,1469) e análise dos dados espectrais de RMN 1D, que era duas unidades de massa a mais que a de 8. Os espectros de RMN de 1H e 13C de 9 exibiram sinais semelhantes aos de 8 (Tabelas S1 e S3), exceto pelo sinal atribuído a uma carbonila cetônica (δC 197,0, C-2 em 8) que foi substituído pelos sinais de um metino oxigenado [δH 4,55 (1H, sobreposto); δC 72,5] em 9. Assim, o composto 9 foi assumido como sendo um derivado C-2 hidroxilado de 8. Essa dedução foi posteriormente verificada pelo sistema de spin de H-1 a H-3 no espectro de COSY 1H–1H de 9 (Figura 2). Além disso, a orientação α do 2-OH foi determinada com base na correlação NOE chave entre H-2 e H3-19 (Figura 3). Uma análise cristalográfica adicional levou ao estabelecimento inequívoco da estrutura e configuração absoluta (1S,2S,5S,7R,8R,9R,10S,11S,13R,14R,15R) de 9 (Figura 4).
A fórmula molecular de 10 foi deduzida como idêntica à de 9 com base em seus dados de HR-ESI-MS (m/z 433,1470 [M + Na]+; calculado para C20H26O9Na, 433,1469) e dados de RMN de 13C. A comparação dos dados de RMN de 10 com os de 9 (Tabelas S1 e S3) indicou que 10 possuía a mesma estrutura bruta que 9. As principais diferenças nos dados espectrais de RMN entre 10 e 9 foram os deslocamentos evidentes para campo baixo de C-5 (Δδ +5,1) e C-6 (Δδ +5,2) em 10, sugerindo que 10 poderia ser um epímero em C-5 de 9. A análise adicional de seus dados espectroscópicos de RMN 2D verificou que 10 possuía a mesma estrutura planar que 9. No espectro NOESY, foi observada correlação NOE entre H-5 e H3-19, sugerindo a orientação β para H-5 em 10 (Figura 3). Semelhante a 1–9, o estudo de difração de raios X de monocristal (Cu Kα) permitiu a atribuição da estereoquímica completa de 10. Como resultado, a configuração absoluta de 10 foi definitivamente atribuída como 1S,2S,5R,7R,8R,9R,10S,11S,13R,14R,15R (Figura 4).
2.3. Atividades Antiproliferativas dos Quassinoides Isolados
Os compostos isolados foram testados quanto às suas atividades antiproliferativas em duas linhagens celulares de leucemia humana, K562 e HL-60. Conforme mostrado na Tabela S5, os compostos 5, 12, 13 e 14 exibiram efeitos inibitórios potentes na proliferação das células K562 e HL-60, com valores de IC50 variando de 2,90 a 8,20 μM.
3. Materiais e Métodos
3.1. Métodos Gerais
Os pontos de fusão foram medidos em um instrumento de ponto de fusão X-5 (Fukai, Pequim, China) sem correção. As rotações ópticas foram determinadas em MeOH em um polarímetro P-1020 (JASCO, Tóquio, Japão) com uma célula de 1 cm à temperatura ambiente. Os espectros de UV foram adquiridos em um espectrômetro UV/vis JASCO V-500. Os espectros de IV foram obtidos com um espectrômetro de infravermelho JASCO FT/IR-480 plus utilizando pastilhas de KBr. Os dados de HR-ESI-MS foram coletados utilizando um espectrômetro Agilent 6210 TOF-MS (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Outros procedimentos experimentais foram realizados conforme descrito anteriormente. As linhagens celulares de leucemia humana, HL-60 e K562, foram adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 2 mM de L-glutamina.
3.2. Material Vegetal
As raízes de Eurycoma longifolia foram coletadas em Malaca, Malásia, em junho de 2014 e autenticadas pelo Prof. Guang-Xiong Zhou (Faculdade de Farmácia, Universidade de Jinan). Um espécime testemunho (No. 20140501) foi depositado no Centro de Pesquisa em Moléculas Naturais Bioativas e Fármacos Inovadores, Faculdade de Farmácia, Universidade de Jinan.
3.3. Extração e Isolamento
As raízes secas ao ar e pulverizadas de E. longifolia (10 kg) foram extraídas com EtOH 95% (v/v) cinco vezes à temperatura ambiente. O extrato etanólico combinado foi concentrado sob vácuo para fornecer um extrato bruto (270 g), que foi suspenso em água e então particionado sucessivamente com éter de petróleo, acetato de etila e n-butanol.
A fração solúvel em acetato de etila (95 g) foi submetida a cromatografia em coluna de sílica gel utilizando uma mistura gradiente de CHCl3-MeOH (100:0 → 0:100, v/v) como eluente, fornecendo 10 frações principais (Fr.1–Fr.10).
A Fr.2 (30,5 g) foi posteriormente separada em uma coluna de sílica gel (éter de petróleo-EtOAc, 100:0 → 0:100, v/v) para fornecer seis subfrações Fr.2A–Fr.2F. A Fr.2B (1,2 g) foi purificada por uma coluna de Sephadex LH-20 (CHCl3-MeOH, 1:1) seguida por CLAE semipreparativa (CH3CN-H2O, 35:65, v/v) para produzir os compostos 2 (5,0 mg) e 4 (8,0 mg). Em seguida, a Fr.2D (15,0 g) foi separada em uma coluna ODS (MeOH-H2O, 20:80 → 100:0) para fornecer seis subfrações (Fr.2D-1–Fr.2D-6). A Fr.2D-2 (3,0 g) foi subsequentemente purificada por CLAE semipreparativa (MeOH-H2O, 30:70, v/v) para fornecer os compostos 1 (14,5 mg) e 11 (8,4 mg), e a Fr.2D-4 (1,5 g) também foi purificada por CLAE preparativa (MeOH-H2O, 35:65, v/v) para fornecer o composto 3 (6,0 mg).
A Fr.3 (5,0 g) foi aplicada a uma coluna de Sephadex LH-20 (MeOH) e forneceu cinco subfrações Fr.3A–Fr.3E. Além disso, a Fr.3B foi posteriormente submetida a CLAE preparativa (MeOH-H2O, 32:68, v/v) para fornecer o composto 12 (45,0 mg).
A Fr. 6 (20,0 g) foi purificada em uma coluna ODS utilizando MeOH-H2O (20:80 → 100:0, v/v) como eluente para fornecer oito subfrações (Fr.6A–Fr.6H). A Fr.6B (8,0 g) foi submetida a uma coluna de Sephadex LH-20 (MeOH) para produzir cinco subfrações (Fr.6B-1–Fr.6B-5). A Fr.6B-2 (3,0 g) foi purificada por CLAE semipreparativa (CH3CN-H2O, 18:82, v/v) para fornecer os compostos 5 (7,4 mg), 6 (10,0 mg), 7 (40,5 mg) e 13 (1,5 g), respectivamente. A Fr.6B-4 (500 mg) foi purificada por CLAE preparativa (CH3CN-H2O, 18:82, v/v) para fornecer os compostos 8 (25,3 mg), 9 (5,2 mg) e 10 (5,1 mg).
A Fr.9 (3,5 g) foi aplicada a uma coluna de Sephadex LH-20 (MeOH) para obter quatro subfrações Fr.9A–Fr.9D. Em seguida, a Fr.9C (1,2 g) foi posteriormente submetida a separação por CLAE preparativa (CH3CN-H2O, 12:88, v/v) para fornecer o composto 14 (80 mg).
3.4. Caracterização dos Compostos
Longifolactona G (1): agulhas incolores (MeOH); p.f. 290–291 °C; [α +58,0 (c 0,55, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 241 (3,81) nm; IV (KBr) vmax 3455, 2957, 1730, 1667, 1432, 1379, 1348, 1229, 1198, 1115, 1017, 973, 878 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabelas S1 e S2; HR-ESI-MS m/z 395,1696 [M + H]+ (calculado para C20H27O8, 395,1700).
Longifolactona H (2): agulhas incolores (MeOH); p.f. 225–226 °C; [α −6,2 (c 0,34, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 241 (4,01) nm; IV (KBr) vmax 3432, 2941, 1725, 1662, 1380, 1262, 1122, 998, 819, 564 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabelas S1 e S2; HR-ESI-MS m/z 433,1832 [M + Na]+ (calculado para C21H30O8Na, 433,1833).
Longifolactona I (3): agulhas incolores (MeOH); p.f. 178–179 °C; [α +56,0 (c 0,46, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε); 230 (3,97) nm; IV (KBr) vmax: 3468, 3346, 2953, 2904, 2577, 1727, 1496, 1411, 1316, 1226, 1128, 1057, 1015, 963, 813, 712, 638 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabelas S1 e S2; HR-ESI-MS: m/z 371,1831 [M + Na]+ (calculado para C20H28O5Na, 371,1829).
Longifolactona J (4): agulhas incolores (MeOH); p.f. 255–256 °C; [α +18,2 (c 0,29, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 241 (3,75) nm; IV (KBr) vmax 3450, 2943, 1726, 1656, 1434, 1379, 1347, 1261, 1196, 1123, 1063, 998, 959, 589, 523 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabelas S1 e S2; HR-ESI-MS m/z 401,1574 [M + Na]+ (calc. para C20H26O7Na, 401,1571).

Longifolactona K (5): agulhas incolores (MeOH-C5H5N); p.f. 266–267 °C; [α −7,2 (c 0,31, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 240 (4,01) nm; IV (KBr) vmax 3429, 2944, 1726, 1660, 1435, 1381, 1261, 1122, 1064, 997, 964, 902, 819, 698, 449 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabelas S1 e S2; HR-ESI-MS m/z 401,1574 [M + Na]+ (calc. para C20H26O7Na, 401,1571).

Longifolactona L (6): agulhas incolores (MeOH); p.f. 265–266 °C, [α +22,2 (c 0,92, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 195 (3,80) nm; IV (KBr) vmax: 3468, 3354, 2951, 2904, 2719, 1729, 1499, 1389, 1314, 1226, 1125, 1055, 964, 814 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabelas S1 e S3; HR-ESI-MS m/z 435,1626 [M + Na]+ (calc. para C20H28O9Na, 435,1626).

Longifolactona M (7): agulhas incolores (MeOH); p.f. 300–301 °C; [α +10,1 (c 0,70, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 198 (3,60) nm; IV (KBr) vmax 3304, 2886, 1737, 1654, 1507, 1456, 1426, 1332, 1281, 1234, 1081, 993, 917 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabelas S1 e S3; HR-ESI-MS m/z 435,1621 [M + Na]+ (calc. para C20H28O9Na, 435,1626).

Longifolactona N (8): agulhas incolores (MeOH); p.f. 248–249 °C, [α +44,6 (c 0,67, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 240 (3,46) nm; IV (KBr) vmax: 3495, 3324, 1739, 1664, 1491, 1394, 1252, 1155, 1108, 1066, 973, 823 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabelas S1 e S3; HR-ESI-MS m/z 431,1311 [M + Na]+ (calc. para C20H24O9Na, 431,1313).

Longifolactona O (9): agulhas incolores (MeOH); p.f. 245–246 °C, [α +4,2 (c 3,07, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 198 (3,63) nm; IV (KBr) vmax: 3307, 2915, 1737, 1659, 1489, 1434, 1389, 1192, 1156, 1104, 974 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabelas S1 e S3; HR-ESI-MS: m/z 433,1472 [M + Na]+ (calc. para C20H26O9Na, 433,1469).

Longifolactona P (10): agulhas incolores (MeOH); p.f. 265–266 °C; [α −1,3 (c 0,15, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 196 (3,70) nm; IV (KBr) vmax: 3491, 3305, 1739, 1661, 1389, 1250, 1154, 1108, 1064, 975, 835 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabelas S1 e S3; HR-ESI-MS m/z 433,1470 [M + Na]+ (calc. para C20H26O9Na, 433,1469).

Chaparrolida (11): agulhas incolores (MeOH); p.f. 184–185 °C; [α +15,6 (c 0,11, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 196 (3,94) nm; IV (KBr) vmax 3484, 3369, 2961, 1720, 1381, 1242, 1098, 1054, 982, 810 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabela S4 no Material Suplementar; HR-ESI-MS m/z 389,1940 [M + Na]+ (calc. para C20H30O6Na, 389,1935).
15β-Hidroxiklaineanona (12): agulhas incolores (MeOH); p.f. 223–224 °C; [α +6,3 (c 1,73, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 242 (4,05) nm; IV (KBr) vmax 3460, 2950, 1733, 1671, 1436, 1378, 1259, 1124, 1068, 1000, 958, 902, 814, 697, 633 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabela S4 nos Materiais Suplementares; HR-ESI-MS m/z 403,1734 [M + Na]+ (calculado para C20H28O7Na, 403,1727).
14,15β-Di-hidroxiklaineanona (13): agulhas incolores (MeOH); p.f. 266–267 °C; [α +54,3 (c 0,51, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 241 (4,05) nm; IV (KBr) vmax 3425, 2945, 1726, 1660, 1435, 1381, 1344, 1262, 1122, 1064, 998, 964, 902, 818, 698 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabela S4 nos Materiais Suplementares; HR-ESI-MS m/z 419,1674 [M + Na]+ (calculado para C20H28O8Na, 419,1676).
Euricomona (14): agulhas incolores (MeOH); p.f. 285–286 °C; [α +39,5 (c 0,65, MeOH); UV (CH3CN) λmax (log ε): 241 (3,46) nm; IV (KBr) vmax 3402, 2981, 2880, 1736, 1676, 1622, 1504, 1435, 1312, 1231, 1121, 1056, 985, 826, 765 cm−1; dados espectrais de RMN de 1H e 13C, ver Tabela S4 nos Materiais Suplementares; HR-ESI-MS m/z 431,1314 [M + Na]+ (calculado para C20H24O9Na, 431,1313).
3.5. Análises Cristalográficas de Raios X
Os dados cristalográficos dos compostos 1–10 foram coletados usando um difratômetro Oxford-Diffraction SuperNova (Agilent Technologies, Yarnton, Reino Unido) com radiação Cu Kα. As estruturas cristalinas foram resolvidas por métodos diretos usando o programa SHELXS (Sheldrick, 2019) e refinadas pelo programa SHELXL-2018 (Sheldrick, 2019) e cálculo de mínimos quadrados de matriz completa. Os dados cristalográficos dos compostos 1–10 no formato CIF padrão foram depositados no Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC 2.105.724 para 1, CCDC 2.105.722 para 2, CCDC 2.105.723 para 3, CCDC 2.105.731 para 4, e CCDC 2.105.730 para 5, CCDC 2.105.729 para 6, CCDC 2.105.727 para 7, e CCDC 2.105.725 para 8, CCDC 2.105.726 para 9, e CCDC 2.105.728 para 10).
Dados cristalográficos para o composto 1 (M = 394,41 g/mol): ortorrômbico, grupo espacial P212121, a = 7,17350(10) Å, b = 10,18810(10) Å, c = 24,5189(2) Å, β = 90°, V = 1791,95(3) Å3, Z = 4, T = 99,99(10) K, μ (Cu Kα) = 0,948 mm−1, Dcalc = 1,462 g/cm3, 21.948 reflexões medidas (7,21° ≤ 2θ ≤ 147,054°), 3.593 únicas (Rint = 0,0301, Rsigma = 0,0140) que foram usadas em todos os cálculos. O R1 final foi 0,0306 (I > 2σ (I)), e wR2 foi 0,0807 (todos os dados). Parâmetro de Flack = 0,06(4).
Dados cristalográficos para o composto 2 (M = 410,45 g/mol): monoclínico, grupo espacial P21, a = 8,0642(2) Å, b = 10,6239(3) Å, c = 11,9568(3) Å, β = 107,411(2)°, V = 977,44(5) Å3, Z = 2, T = 100,00(10) K, μ (Cu Kα) = 0,888 mm−1, Dcalc = 1,395 g/cm3, 9.576 reflexões medidas (7,75° ≤ 2θ ≤ 146,844°), 3.595 únicas (Rint = 0,0302, Rsigma = 0,0220) que foram usadas em todos os cálculos. O R1 final foi 0,0353 (I > 2σ (I)), e wR2 foi 0,0946 (todos os dados). Parâmetro de Flack = 0,09(8).
Dados cristalográficos do composto 3 (M = 364,44 g/mol): monoclínico, grupo espacial P21, a = 7,0067(2) Å, b = 13,4001(4) Å, c = 9,7581(3) Å, β = 90,421(2)°, V = 916,17(5) Å3, Z = 2, T = 293(2) K, μ (Cu Kα) = 0,795 mm−1, Dcalc = 1,328 g/cm3, 8696 reflexões medidas (9,062° ≤ 2θ ≤ 147,176°), 3440 únicas (Rint = 0,0639, Rsigma = 0,0435) que foram usadas em todos os cálculos. O R1 final foi 0,0355 (I > 2σ (I)), e wR2 foi 0,0908 (todos os dados). Parâmetro de Flack = 0,09(9).
Dados cristalográficos do composto 4 (M = 378,41 g/mol): ortorrômbico, grupo espacial P212121, a = 9,63490(10) Å, b = 12,0407(2) Å, c = 15,6703(2) Å, β = 90°, V = 1817,93(4) Å3, Z = 4, T = 100,00(10) K, μ (Cu Kα) = 0,868 mm−1, Dcalc = 1,383 g/cm3, 14.343 reflexões medidas (9,262° ≤ 2θ ≤ 146,826°), 3607 únicas (Rint = 0,0285, Rsigma = 0,0201) que foram usadas em todos os cálculos. O R1 final foi 0,0284 (I > 2σ (I)), e wR2 foi 0,0746 (todos os dados). Parâmetro de Flack = −0,05(6).
Dados cristalográficos do composto 5 (M = 457,51 g/mol): monoclínico, grupo espacial I2, a = 7,84600(10) Å, b = 12,85380(10) Å, c = 22,0124(2) Å, β = 95,8390(10)°, V = 2208,45(4) Å3, Z = 4, T = 100,00(10) K, μ (Cu Kα) = 0,828 mm−1, Dcalc = 1,376 g/cm3, 20.973 reflexões medidas (7,976° ≤ 2θ ≤ 147,044°), 4407 únicas (Rint = 0,0497, Rsigma = 0,0283) que foram usadas em todos os cálculos. O R1 final foi 0,0334 (I > 2σ (I)), e wR2 foi 0,0884 (todos os dados). Parâmetro de Flack = 0,05(7).
Dados cristalográficos do composto 6 (M = 466,47 g/mol): ortorrômbico, grupo espacial P212121, a = 13,8037(6) Å, b = 12,1850(6) Å, c = 12,0498(5) Å, β = 90°, V = 2026,75(16) Å3, Z = 4, T = 113(20) K, μ (Cu Kα) = 1,079 mm−1, Dcalc = 1,529 g/cm3, 7421 reflexões medidas (7,336° ≤ 2θ ≤ 147,508°), 3904 únicas (Rint = 0,0401, Rsigma = 0,0517) que foram usadas em todos os cálculos. O R1 final foi 0,0503 (I > 2σ (I)), e wR2 foi 0,1464 (todos os dados). Parâmetro de Flack = −0,04(9).
Dados cristalográficos do composto 7 (M = 430,44 g/mol): ortorrômbico, grupo espacial P212121, a = 6,94750(10) Å, b = 9,86740(10) Å, c = 28,8229(4) Å, β = 90°, V = 1975,92(4) Å3, Z = 4, T = 100,00(10) K, μ (Cu Kα) = 0,983 mm−1, Dcalc = 1,447 g/cm3, 22.539 reflexões medidas (6,132° ≤ 2θ ≤ 147,044°), 3946 únicas (Rint = 0,0695, Rsigma = 0,0368) que foram usadas em todos os cálculos. O R1 final foi 0,0372 (I > 2σ (I)), e wR2 foi 0,1016 (todos os dados). Parâmetro de Flack = −0,12(9).
Dados cristalográficos do composto 8 (M = 480,45 g/mol): ortorrômbico, grupo espacial P212121, a = 7,02070(10) Å, b = 13,3311(2) Å, c = 22,4885(3) Å, β = 90°, V = 2104,78(5) Å3, Z = 4, T = 100,01(10) K, μ (Cu Kα) = 1,097 mm−1, Dcalc = 1,516 g/cm3, 20.217 reflexões medidas (7,71° ≤ 2θ ≤ 147,848°), 4187 únicas (Rint = 0,0429, Rsigma = 0,0296) que foram usadas em todos os cálculos. O R1 final foi 0,0282 (I > 2σ (I)), e wR2 foi 0,0734 (todos os dados). Parâmetro de Flack = −0,01(6).
Dados cristalográficos para o composto 9 (M = 410,41 g/mol): monoclínico, grupo espacial C2, a = 17,7027(6) Å, b = 8,4150(3) Å, c = 12,3274(3) Å, β = 99,070(3)°, V = 1813,43(10) Å3, Z = 4, T = 100,00(10) K, μ (Cu Kα) = 1,004 mm−1, Dcalc = 1,503 g/cm3, 16.975 reflexões medidas (7,262° ≤ 2θ ≤ 147,362°), 3.635 únicas (Rint = 0,0514, Rsigma = 0,0313) que foram usadas em todos os cálculos. O R1 final foi 0,0388 (I > 2σ (I)), e wR2 foi 0,1080 (todos os dados). Parâmetro de Flack = 0,10(9).
Dados cristalográficos para o composto 10 (M = 428,42 g/mol): ortorrômbico, grupo espacial P212121, a = 7,2511(2) Å, b = 10,6856(3) Å, c = 24,0611(9) Å, β = 90°, V = 1864,31(10) Å3, Z = 4, T = 100,00(10) K, μ (Cu Kα) = 1,042 mm−1, Dcalc = 1,526 g/cm3, 17.396 reflexões medidas (7,348° ≤ 2θ ≤ 147,984°), 3.693 únicas (Rint = 0,0511, Rsigma = 0,0405) que foram usadas em todos os cálculos. O R1 final foi 0,0375 (I > 2σ (I)), e wR2 foi 0,0896 (todos os dados). Parâmetro de Flack = 0,07(10).
3.6. Ensaio de Proliferação Celular
Células HL-60 e K562 foram cultivadas em placas de 96 poços e incubadas a 37 °C, em incubadora com 5% de CO2. Após incubação por 24 h, os sobrenadantes celulares foram descartados e suplementados com meio de cultura celular contendo compostos em diferentes concentrações. Após 48 h de incubação, os sobrenadantes celulares em cada poço foram removidos e substituídos por 100 μL de meio de cultura contendo 10 μL do kit de contagem celular-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), seguido de incubação a 37 °C, 5% de CO2 por 2 h. A absorbância a 450 nm das células foi medida usando um leitor de placas. A proliferação celular foi calculada de acordo com o valor de OD450 em células tratadas com ou sem compostos.
4. Conclusões
Em resumo, um estudo fitoquímico adicional das raízes da planta medicinal Eurycoma longifolia resultou no isolamento e caracterização de 14 quassinoides C20 altamente oxigenados, incluindo 10 novos (longifolactonas G‒P, 1–10). Estruturalmente, o composto 1 é o segundo membro de uma classe rara de quassinoides que apresenta um sistema de anel 2,5-dioxatriciclo[5.2.2.04,8]undecano incomum. O composto 4 possui uma funcionalidade 14,15-epóxi que é inédita em quassinoides, e o composto 7 apresenta um grupo hidroxila α-orientado incomum em C-14. Além disso, os compostos 5, 12, 13 e 14 mostraram potentes atividades antiproliferativas em duas linhagens celulares de leucemia humana, K562 e HL-60.
Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Materiais Suplementares
Estão disponíveis online os espectros detalhados de UV, IV, HR-ESI-MS e RMN dos compostos 1–14, bem como os dados cristalográficos dos compostos 1–10 como Materiais Suplementares.
Contribuições dos Autores
W.-Q.Y. e W.T. realizaram o isolamento, purificação, determinação estrutural e redigiram o manuscrito. X.-J.H. realizou a identificação estrutural dos compostos. J.-G.S. conduziu os experimentos de difração de raios X de monocristal. Y.-Y.L. trabalhou nos experimentos biológicos. Y.X. e C.-L.F. realizaram a extração, isolamento e identificação estrutural dos compostos. Y.W., Z.-L.W. e W.-C.Y. conceberam todos os experimentos e revisaram o artigo. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento
Este trabalho foi financiado pelo Programa Nacional de P&D da China (2018YFC1706200 e 2017YFC1703800), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81803379, 82003610 e 82104539), pelo Projeto de Equipes Locais de Inovação e Pesquisa do Programa de Talentos do Rio das Pérolas de Guangdong (2017BT01Y036) e pelo Programa de Pesquisa e Desenvolvimento de Áreas-Chave da Província de Guangdong (2020B1111110004).
Declaração do Comitê de Ética em Pesquisa
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Todos os dados que suportam este estudo estão disponíveis no manuscrito e nos Materiais Suplementares.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Disponibilidade de Amostras
Amostras dos compostos 1–14 estão disponíveis com os autores.
Referências
Quassinoides biologicamente ativos e sua química: Potenciais protótipos para o design de fármacos
Quassinoides: Fitoquímica e perspectiva antitumoral
Quassinoides de Picrasma quassioides e seus efeitos neuroprotetores
Princípios amargos quassinoides
Princípios amargos quassinoides II
Entrada de policiclização aniônica para triciclos relacionados a quassinoides e terpenoides: Uma síntese total estereocontrolada de (+)-cassaina
Um duplo acoplamento catalisado por cobre permite uma síntese em 3 etapas da arquitetura central dos quassinoides
Tongkat Ali (Eurycoma longifolia Jack): Uma revisão sobre sua etnobotânica e importância farmacológica
Efeitos citotóxicos dos extratos das raízes de Eurycoma longifolia
Revisão sobre uma medicina herbal tradicional, Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali): Seus usos tradicionais, química, farmacologia baseada em evidências e toxicologia
Eurycomanona suprime a expressão de marcadores tumorais de câncer de pulmão, prohibitina, anexina 1 e proteína 28 do retículo endoplasmático
Quassinoides das raízes de Eurycoma longifolia e sua atividade antiproliferativa em linhagens celulares de câncer humano
Eurycomanona e eurycomanol de Eurycoma longifolia Jack como reguladores de vias de sinalização envolvidas na proliferação, morte celular e inflamação
Quassinoides inéditos de Eurycoma longifolia: Evidência biogenética e efeitos antialimentares
Chaparrolida e castelanolida, novos princípios amargos de Castela nicholsoni
Análise espectral de ressonância magnética nuclear de carbono-13 de princípios amargos quassinoides
13β,18-di-hidroeurycomanol, um quassinoide de Eurycoma longifolia
Novos quassinoides das raízes de Eurycoma longifolia
Quassinoides altamente oxigenados de Eurycoma longifolia
Quassinoides citotóxicos e triterpenos do tipo tirucalano da madeira de Eurycoma longifolia
Quatro novos quassinoides das raízes de Eurycoma longifolia
Quassinoides de Eurycoma longifolia
Fatores de espalhamento asféricos para o modelo SHELXL, implementação e aplicação
Estruturas químicas dos quassinoides isolados das raízes de E. longifolia.
Principais correlações 1H–1H COSY e HMBC dos compostos 1–10.
Principais correlações NOESY dos compostos 1–10.
Desenhos ORTEP de raios X dos compostos 1–10.