pmid: "40790034"
title: "Descoberta de agentes anti-gota multi-alvo de Eurycoma longifolia Jack por meio de triagem fenotípica e otimização estrutural."
authors: "Zhang Z, Shi X, Wu T, He Z, Liang R, Ye W, Wu Z, Liao H, Zheng F, Yang Q, Zhao Z, Chen Y, Gao Z, Wang S, Wang M, Wang Z, Qi D, Yang M, Xu S, Wang Y, Zhao T, Egea J, Liu X, Pang J, Yi F, Zhan P"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2025 Aug 12"
doi: "10.1038/s41467-025-62645-6"
source: "PMC Full Text"

Descoberta de agentes anti-gota multi-alvo de Eurycoma longifolia Jack por meio de triagem fenotípica e otimização estrutural.

Autores

Zhang Z, Shi X, Wu T, He Z, Liang R, Ye W, Wu Z, Liao H, Zheng F, Yang Q, Zhao Z, Chen Y, Gao Z, Wang S, Wang M, Wang Z, Qi D, Yang M, Xu S, Wang Y, Zhao T, Egea J, Liu X, Pang J, Yi F, Zhan P

Periodico

Nature communications (2025 Aug 12)

Conteudo

Descoberta de agentes antigota multialvo de Eurycoma longifolia Jack por meio de triagem fenotípica e otimização estrutural
O desenvolvimento de medicamentos antigota que reduzem simultaneamente o ácido úrico e exercem efeitos anti-inflamatórios representa um avanço crítico para o manejo da progressão da gota. Produtos naturais com propriedades polifarmacológicas oferecem pontos de partida promissores para a descoberta de fármacos. Neste estudo, o ácido β-carbolino-1-propiônico, um constituinte bioativo de Eurycoma longifolia Jack, serviu como ponto de partida para o design de fármacos. Guiados por um modelo de farmacóforo de alvo duplo, projetamos e sintetizamos 64 derivados. Por meio de triagem sistemática, o composto 32 emerge como um candidato a fármaco, demonstrando potente atividade hipouricemiante em modelos de hiperuricemia em camundongos machos (eficácia comparável ao febuxostat e superior ao lesinurad e à benzbromarona) ao inibir transportadores de urato essenciais. Em um modelo de artrite gotosa aguda em ratos machos, o 32 atenua a inflamação mediada pelo inflamassoma da proteína 3 do receptor do tipo NOD. Notavelmente, o 32 exibe segurança aprimorada em comparação aos fármacos de controle. Este estudo exemplifica uma abordagem de descoberta de fármacos com mecanismo duplo inspirada em produtos naturais, demonstrando o potencial de uma polifarmacologia racional e, assim, oferecendo oportunidades terapêuticas para o manejo da gota.
O desenvolvimento de medicamentos antigota que reduzem simultaneamente o ácido úrico e exercem efeitos anti-inflamatórios é de interesse para o manejo da progressão da gota. Aqui, os autores empregam um modelo de farmacóforo de alvo duplo para projetar derivados do ácido β-carbolino-1-propiônico e identificar um candidato a fármaco que demonstra potente atividade hipouricemiante em modelos de hiperuricemia em camundongos machos e atenua a inflamação mediada por NLRP3.
Introdução
A gota é uma doença crônica caracterizada pela deposição de cristais de urato monossódico (UMS) nas articulações ou tecidos circundantes, o que desencadeia uma resposta imune mediada por IL-1β via inflamassoma da proteína 3 do receptor do tipo NOD (NLRP3). A hiperuricemia (HUA), base patológica fundamental da gota, surge principalmente de distúrbios do metabolismo das purinas ou excreção inadequada de ácido úrico sérico (AUS), tornando-se a quarta doença metabólica basal mais prevalente após hipertensão, hiperlipidemia e hiperglicemia. Numerosos estudos demonstraram uma associação entre gota, HUA e várias doenças cardiovasculares e cerebrovasculares, síndrome metabólica, fígado gorduroso, doença renal crônica e diabetes. Portanto, a patogênese e a seleção de fármacos terapêuticos emergiram como o foco central da pesquisa médica devido à crescente importância da HUA e da gota como ameaças à saúde humana.
O design dos compostos.
a Estruturas de fármacos representativos utilizados no tratamento da gota (a–f) e inibidor representativo do inflamassoma da proteína 3 do tipo receptor NOD (NLRP3) (g); b Modelos de farmacóforo do ácido β-carbolina-1-propiônico e do lesinurad (As figuras foram geradas pelo Schrödinger suite 2023-1); c O modelo de farmacóforo de inibidores do transportador de urato 1 (URAT1) (Este modelo foi gerado pelo Molecular Operating Environment (MOE, 2022.02; Chemical Computing Group ULC, 910-1010 Sherbrooke St. W., Montreal, QC H3A 2R7, 2022)); d O modelo de farmacóforo de inibidores do NLRP3 (Este modelo foi gerado pelo MOE); e O modelo de farmacóforo de duplo alvo de inibidores de URAT1 e NLRP3 (Este modelo foi gerado pelo MOE); f Design guiado por modelo de farmacóforo de compostos alvo.
A abordagem atual para o tratamento da gota envolve a utilização de intervenções farmacêuticas para reduzir eficazmente os níveis de ácido úrico sérico (SUA) e controlar a resposta inflamatória. Entre essas intervenções, a terapia de redução de urato a longo prazo leva à dissolução dos cristais de urato monossódico (MSU), resultando, em última análise, na prevenção de crises de gota ou tofos e na melhoria da qualidade de vida. Os medicamentos de moléculas pequenas que reduzem o SUA podem ser classificados em dois grupos principais: inibidores da xantina oxidase (XOIs), que inibem a formação de ácido úrico, e inibidores do transportador de urato 1 (URAT1), que promovem a excreção de ácido úrico. No entanto, os XOIs utilizados clinicamente, incluindo febuxostate (a) e alopurinol (b) (Fig. 1a), têm sido associados a efeitos adversos significativos, ao mesmo tempo que demonstram eficácia limitada no tratamento da artrite gotosa aguda. E os inibidores de URAT1 atualmente aprovados também apresentam limitações que dificultam seu uso generalizado: a benzbromarona (c) pode causar hepatite fulminante fatal, enquanto o lesinurad (d) possui uma advertência de tarja preta de nefrotoxicidade grave e não está mais disponível comercialmente (Fig. 1a). Por outro lado, os medicamentos anti-gota usados para controlar a resposta inflamatória na prática clínica são principalmente anti-inflamatórios tradicionais, como colchicina (e) e indometacina (f). Embora possam controlar rapidamente a inflamação articular e aliviar a dor; no entanto, a relevância de seus alvos é relativamente fraca e o uso prolongado pode levar à tolerância. Com a investigação contínua sobre a patogênese da gota, pesquisas demonstraram uma correlação significativa entre o início da gota primária e o polimorfismo no gene NLRP3 durante seu tratamento. O aumento da expressão de NLRP3 em células mononucleares do sangue periférico obtidas de indivíduos com artrite gotosa aguda indica o papel potencial do inflamassoma NLRP3 no desenvolvimento dessa condição. Além disso, é notável que pacientes com artrite gotosa aguda frequentemente apresentam hiperuricemia (HUA) concomitante. Portanto, o direcionamento direto do NLRP3 pode inibir eficazmente a montante da cascata inflamatória, levando a uma redução significativa na produção de mediadores inflamatórios e ao controle eficaz tanto do início agudo quanto da progressão crônica da gota.
Entretanto, atualmente não há nenhum inibidor de NLRP3 disponível comercialmente no mercado, e os ensaios clínicos do MCC950 (g), um inibidor de NLRP3 com mecanismo de ação bem definido e excelente atividade anti-inflamatória in vitro e in vivo, foram descontinuados devido à hepatotoxicidade. Em resumo, as limitações da terapia simples de redução de ácido úrico ou anti-inflamatória para o tratamento da gota são evidentes e facilmente perceptíveis. Além disso, o uso concomitante de medicamentos uricosúricos e anti-inflamatórios existentes frequentemente leva a interações farmacocinéticas e farmacodinâmicas complexas, podendo resultar em toxicidade cumulativa e efeitos adversos. Para enfrentar esse desafio, propomos duas estratégias potenciais: (1) desenvolver derivados aprimorados dos medicamentos atuais com melhores perfis de segurança por meio de otimização estrutural; (2) projetar agentes bifuncionais de molécula única‌ que reduzam simultaneamente o ácido úrico e suprimam a inflamação. Produtos naturais com atividades multi-alvo podem ser particularmente adequados para esse propósito, pois frequentemente exibem propriedades polifarmacológicas inerentes que poderiam ser otimizadas para efeitos terapêuticos duplos. Consequentemente, explorar o esqueleto de produtos naturais que exibem atividade de redução de ácido úrico e utilizá-los como compostos líderes para modificações estruturais racionais seria uma abordagem significativa para a descoberta de medicamentos anti-gota.
Eurycoma longifolia Jack (EL), uma planta tropical nativa de países do Sudeste Asiático como Vietnã, Malásia e Indonésia, é conhecida por suas diversas bioatividades, incluindo efeitos anti-inflamatórios, antigota, anticâncer, hipoglicêmicos e de melhora das funções sexuais. Os constituintes químicos primários da EL são triterpenoides com esqueleto quassinoide, alcaloides β-carbolínicos, cumarinas, esqualenos e anéis monofenil, etc. Recentemente, um estudo revelou que a administração de EL diminuiu significativamente os níveis de ácido úrico no sangue e preveniu alterações patológicas renais em um modelo animal de HUA induzida por oxonato de potássio, melhorando assim o transporte renal de urato. À medida que a pesquisa sobre os mecanismos de redução de ácido úrico da EL avançou, foi revelado que uma variedade de seus componentes pode inibir a atividade da xantina oxidase (XOD), reduzindo assim os níveis de ácido úrico. Além disso, foi relatado que o eurycomanol isolado da EL inibe a captação de ácido úrico em células HEK293T que expressam o transportador de urato humano 1 (hURAT1). No entanto, não se sabe se os alcaloides β-carbolínicos, que são os segundos mais abundantes depois dos triterpenoides na EL, possuem atividade de redução de ácido úrico.

Neste trabalho, utilizamos a triagem fenotípica para avaliar os efeitos de redução de ácido úrico dos alcaloides β-carbolínicos no modelo murino agudo de HUA. Os achados demonstram que o ácido β-carbolino-1-propiônico (h, Fig. 1a), presente no produto natural EL, exibe uma atividade específica de redução de ácido úrico (taxa de redução, DR = 41,70%), superando a eficácia do fármaco comercializado lesinurad (DR = 32,48%). A fim de melhorar ainda mais os efeitos de redução de ácido úrico, incorporar atividades anti-inflamatórias e mitigar a toxicidade, empregamos os modelos farmacofóricos do lesinurad, do ácido β-carbolino-1-propiônico, de inibidores de URAT1 e de inibidores de NLRP3 como guia para a otimização em múltiplas rodadas da estrutura do ácido β-carbolino-1-propiônico. Subsequentemente, projetamos e sintetizamos com sucesso um total de oito compostos carbolínicos e cinquenta e seis compostos indólicos. Todos os compostos recém-sintetizados foram submetidos à triagem fenotípica para avaliar sua atividade de redução de ácido úrico em camundongos. O Composto 32 representa um candidato promissor a fármaco antigota após a identificação abrangente de alvos e rigorosas avaliações de segurança e de adequação a fármaco. Este composto exibe tanto atividade de redução de ácido úrico quanto anti-inflamatória, demonstrando alta eficácia juntamente com baixa toxicidade.

Resultados
Otimização estrutural do ácido β-carbolino-1-propiônico
Reavaliação da atividade de redução de ácido úrico in vivo e avaliação da atividade em alvos in vitro para compostos representativos
Compostos SUA (μM) c DR % d URAT1 IC50 (μM) d,e XOD IR (%) 1 241.33 ± 109.70 78.82 3.02 ± 0.82 17.79 5 336.33 ± 107.55 72.89 13.80 ± 4.43 16.39 14 332.33 ± 140.97 73.28 16.09 ± 2.94 NA 17 270.00 ± 49.15 82.53 12.01 ± 2.39 20.31 25 246.00 ± 109.80 86.10 NA 17.21 27 188.20 ± 14.70 94.68 5.85 ± 2.86 5.31 32 196.67 ± 26.50 93.42 3.81 ± 0.99 23.56 34 317.75 ± 77.51 75.44 9.76 ± 2.33 1.21 41 180.00 ± 4.00 95.89 4.09 ± 0.79 2.49 45 334.67 ± 188.60 72.93 14.00 ± 2.08 NA 47 251.00 ± 77.43 85.35 NA NA 58 326.75 ± 64.88 74.11 NA NA 63 327.25 ± 101.13 74.03 5.80 ± 0.74 NA 64 287.33 ± 98.74 79.96 5.56 ± 0.90 NA h 484.25 ± 86.28 50.73 NA NA d 549.00 ± 130.93 41.12 6.88 ± 0.81 NA a f178.00 ± 0.00 96.16 - 100.24 c 283.00 ± 154.08 80.60 - - aModelo 826.00 ± 127.14 - - - bVeículo 152.33 ± 36.36 - - -
aModelo: grupo de camundongos machos HUA induzidos com hipoxantina (v.o.) e oxonato de potássio (s.c.), e não tratados com o composto teste (v.o., camundongos HUA não tratados); bVeículo: grupo de camundongos machos normais não tratados com hipoxantina (v.o.) e oxonato de potássio (s.c.), ou com o composto teste (v.o., camundongos normais não tratados); cDR = (SUA modelo – SUA composto) / (SUA modelo – SUA veículo); dNA: Sem atividade; eIR XOD: a taxa de inibição da XOD desses compostos em uma concentração única relativamente alta (10 μM); fAo utilizar um analisador de ácido úrico com limite inferior de quantificação (LIQ) de 178 μM, todos os sinalizadores “LO” emitidos pelo instrumento (indicando medições abaixo do LIQ) são registrados uniformemente como 178 μM, seguindo o princípio de atribuição conservadora.
O ácido β-carbolina-1-propiônico, composto por um anel β-carbolina e um ácido propiônico de cadeia lateral, é classificado como um alcaloide β-carbolínico com potencial atividade antigota em EL. Os resultados da triagem fenotípica indicam que o ácido β-carbolina-1-propiônico (DR = 41,70%) exibe uma certa atividade redutora de SUA em nosso modelo murino agudo de HUA bem estabelecido, superando a eficácia do agente comercializado lesinurad (DR = 32,48%). Lamentavelmente, o ácido β-carbolina-1-propiônico não apresentou efeito inibitório sobre XOD e URAT1 (Tabela 1), os dois alvos primários para a redução dos níveis de ácido úrico. Ao examinar a estrutura do ácido β-carbolina-1-propiônico, observamos uma semelhança com a estrutura do lesinurad, o que nos levou a construir modelos farmacofóricos respectivos para ambos, lesinurad e ácido β-carbolina-1-propiônico. O modelo farmacofórico do lesinurad, que engloba quatro características essenciais, incluindo um grupo aniônico, um aceptor de ligação de hidrogênio, um anel aromático e um grupo hidrofóbico, alinha-se consistentemente com os três componentes estruturais (o anel central A, o domínio hidrofóbico B e a cadeia lateral C contendo um grupo aniônico) elucidados em nosso trabalho anterior sobre o lesinurad e seus derivados. Curiosamente, a distância entre o grupo aniônico e o aceptor de ligação de hidrogênio do ácido β-carbolina-1-propiônico e do lesinurad é quase idêntica (lesinurad é 5,40 Å e ácido β-carbolina-1-propiônico é 5,74 Å). Subsequentemente, integramos os dois modelos farmacofóricos e observamos que, em comparação com o farmacóforo do lesinurad, o anel β-carbolina do ácido β-carbolina-1-propiônico pode ser identificado como o anel central A, enquanto sua cadeia lateral de ácido propiônico pode ser considerada como a cadeia lateral aniônica C, faltando apenas o domínio hidrofóbico B (Fig. 1b).

Primeiramente, para melhorar a atividade redutora de SUA do ácido β-carbolina-1-propiônico, utilizamo-lo como composto líder e empregamos uma estratégia de hibridização molecular guiada pelo modelo farmacofórico do lesinurad. Preservando a estrutura do anel central do ácido β-carbolina-1-propiônico, anéis benzênicos substituídos com bromo ou ciclopropil e anéis naftalênicos foram incorporados ao anel central via hibridização molecular no domínio hidrofóbico B, fornecendo um total de oito compostos carbolínicos (série I, compostos 1–8). Na rodada subsequente de modificação, preservando o domínio hidrofóbico B, empregamos uma estratégia de scaffold hopping para introduzir flexibilidade no rígido anel β-carbolina, abrindo-o, e para garantir a preservação das características de aceptor de ligação de hidrogênio, substituindo o N piridínico por oxigênio carbonílico. Enquanto isso, a introdução de grupos hidrofóbicos (como metil e dimetil) nas proximidades do ácido carboxílico, ou o alongamento apropriado da cadeia de átomos de carbono para investigar seu impacto na atividade redutora de ácido úrico, resultou em um total de oito compostos de indol amida (série II, compostos 9–16).
Posteriormente, para aumentar a atividade inibitória do inflamassoma NLRP3, mantendo a atividade redutora do ácido úrico sérico (SUA), analisamos o bolsão de ligação dos inibidores de NLRP3, que pode ser categorizado em três zonas distintas: o domínio hidrofóbico localizado no interior do bolsão, o canal de eletropositividade situado em seu domínio central e o domínio exposto ao solvente posicionado externamente, e construímos um modelo farmacofórico de alvo duplo dos inibidores de URAT1 e NLRP3, que compreende três grupos hidrofóbicos (S1, S2 e S3) e um centro aniônico, com espaçamentos respectivos de 3,94, 6,20 e 3,58 Å, bem como ângulos de 86,6° e 90,9° (Fig. 1c–e). Com base nesse modelo farmacofórico, o anel indol foi mantido como S1, enquanto o anel naftalênico hidrofóbico permaneceu como S2; adicionalmente, introduzimos um grupo sulfonamida como centro aniônico por meio de hibridização molecular. Finalmente, 48 compostos de indol acilsulfonamida foram projetados conectando diferentes grupos arila e alquila em S3 (série III, Fig. 1f).

Efeitos dos compostos recém-sintetizados na redução do SUA

Relação estrutura-atividade dos compostos da série III.

A cor preta indica nenhuma atividade; laranja indica DR > 30%; azul indica DR > 50% e vermelho indica DR > 70%.
A redução dos níveis de ácido úrico representa uma estratégia promissora para a prevenção de crises de gota e o alcance de níveis normais de ácido úrico. Esses compostos estruturais foram inicialmente avaliados quanto à sua atividade redutora de SUA em modelos agudos de HUA em camundongos, na dose oral de 2 mg/kg. Febuxostate (a), benzbromarona (c), lesinurada (d) e ácido β-carbolina-1-propiônico (h) foram utilizados como controles positivos. Os resultados resumidos podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1. A análise da relação estrutura-atividade (SAR) mostrou que a introdução dos anéis benzeno e naftaleno na série I aumentou significativamente a atividade redutora de SUA in vivo. Entre eles, o composto 1 (82,86%) e o 5 (74,54%) exibiram um aumento de mais de duas vezes na potência em comparação com o composto líder ácido β-carbolina-1-propiônico (42,11%). Análises adicionais revelaram que a incorporação de um anel naftaleno maior na zona B foi mais favorável para aumentar a atividade em comparação com um anel benzeno, enquanto os compostos bromo-substituídos demonstraram potência superior em comparação aos compostos ciclopropil-substituídos. Na série II, quando o esqueleto carbolina do anel central (zona A) foi substituído pelo anel indol, a maioria dos compostos ainda demonstrou atividade redutora de SUA em camundongos. Entre eles, o 14 (72,19%) exibiu a maior potência. Diferentemente da série I, a potência do anel naftaleno ciclopropil-substituído (zona B) foi significativamente maior do que a do anel naftaleno bromo-substituído, e a introdução de um grupo metila na cadeia lateral mostrou-se benéfica para aumentar a atividade. Na série III, a atividade in vivo geral de um total de 36 compostos superou a do ácido β-carbolina-1-propiônico (47,9%, 50,33%) (Tabela Suplementar 2). Entre eles, 25 (80,7%), 27 (84,1%), 32 (83,5%), 41 (85,97%) e 47 (84,18%) demonstraram efeitos redutores de SUA significativos, com DR > 80%. Semelhante à série II, o anel naftaleno ciclopropil-substituído na zona B apresentou atividade superior à do anel naftaleno bromo-substituído. A análise SAR subsequente revelou que a atividade foi significativamente afetada por vários grupos sulfonamida substituídos (Fig. 2).
Os compostos representativos das séries I a III (DR > 70%) foram submetidos a uma avaliação secundária para confirmar a atividade dos compostos, e os resultados correspondentes são apresentados na Tabela 1. Esses compostos demonstraram eficácia significativa na redução dos níveis de ácido úrico. Especificamente, seis compostos (17, 25, 27, 32, 41 e 47) exibiram atividade superior à da benzbromarona (80,60%), com aproximadamente o dobro da potência da lesinurada (41,12%) e um aumento de 1,6 vezes em comparação com o composto líder ácido β-carbolina-1-propiônico (50,73%). Os compostos mais potentes entre eles foram 27 (94,68%), 32 (93,42%) e 41 (95,89%), mostrando atividade comparável à do febuxostate (96,16%). Posteriormente, esses compostos foram submetidos a experimentos para investigar os mecanismos de redução dos níveis de SUA e anti-inflamação.
Avaliação de compostos representativos sobre URAT1 in vitro e simulação molecular
Com o objetivo de investigar preliminarmente os alvos dos compostos representativos (DR > 70%) com atividade hipouricemiante, as atividades inibitórias de URAT1 desses compostos foram avaliadas em células HEK293 com superexpressão de URAT1, utilizando ácido úrico marcado com 14C como substrato. Os resultados são apresentados na Tabela 1. Dentre eles, 1 e 32 exibiram a inibição mais potente sobre URAT1, com valores de CI50 de 3,02 ± 0,82 μM e 3,81 ± 0,99 μM, os quais foram cerca de 2,3 vezes e 1,8 vezes superiores ao do lesinurad (CI50 = 6,88 ± 0,81 μM), respectivamente. 27 (CI50 = 5,85 ± 2,86 μM), 41 (CI50 = 4,09 ± 0,79 μM), 63 (CI50 = 5,80 ± 0,74 μM) e 64 (CI50 = 5,56 ± 0,90 μM) apresentaram atividade sobre URAT1 ligeiramente superior à do lesinurad in vitro. Isso indica que os compostos 1, 27, 32, 41, 63 e 64 exibem potencial significativo na redução da reabsorção de ácido úrico nos túbulos renais e na promoção de sua excreção por meio da inibição de URAT1.
Resultados da conformação de ligação prevista do composto 32 ao URAT1.
a Uma visão geral do bolsão de ligação dos compostos no transportador de urato 1 (URAT1) (código PDB: 9JDZ); b–d Modos de ligação previstos do composto 1, composto 32 e lesinurad com URAT1 (As figuras foram geradas pelo PyMOL (Versão 2.5.2 Schrödinger). Linhas tracejadas amarelas são ligações de hidrogênio, linhas tracejadas azuis são empilhamentos π-π); e Análise de RMSD para os complexos previstos de URAT1 com os compostos 1,
32 e lesinurad.
Em seguida, investigamos o modo de ligação de 1 e 32 com URAT1 (Fig. 3a) por meio de docagem molecular, com o intuito de obter informações sobre o mecanismo subjacente às atividades aprimoradas. Como mostrado na Fig. 3b, os resíduos PHE395 e PHE241 exibiram potenciais interações de empilhamento π-π com o composto 1. O ácido carboxílico do composto 1 também apresentou ligações de hidrogênio com os resíduos ARG477 e GLN473. Em comparação com 1, o grupo aniônico de 32 reduz a interação com GLN473, enquanto o anel indólico de 32 forma uma interação de empilhamento π-π adicional com PHE364 (Fig. 3c). Os achados gerais sugerem que os compostos 1 e 32 exibem interações adicionais aprimoradas em comparação ao lesinurad (Fig. 3d), contribuindo assim para sua atividade inibitória superior contra URAT1.
Simulações de dinâmica molecular foram realizadas por 100 ns para estudar a estabilidade dos complexos de ancoragem URAT1-previsto por 1, URAT1-previsto por 32 e URAT1-previsto por lesinurade. Para esclarecer as características estruturais do URAT1, o desvio quadrático médio (RMSD) do complexo URAT1-previsto por 1, complexo URAT1-previsto por 32 e complexo URAT1-previsto por lesinurade foi analisado ao longo do tempo de simulação (Fig. 3e). O complexo URAT1-previsto por 1 e o complexo URAT1-previsto por 32 apresentaram uma tendência estável de 0 a 100 ns, com apenas pequenas flutuações observadas no marco de 80 ns. No entanto, o complexo URAT1-previsto por lesinurade demonstrou uma tendência ascendente persistente durante todo o processo de simulação. O complexo URAT1-previsto por 1 e o complexo URAT1-previsto por 32 exibiram um valor de RMSD mais estável (menos de 4,00 Å) em comparação com o complexo URAT1-previsto por lesinurade.
Estudo da atividade anti-inflamatória de compostos representativos in vitro e in vivo
Avaliação anti-inflamatória dos compostos representativos e os efeitos do 32 sobre NLRP3.
a Concentração inibitória média dos compostos sobre IL-1β secretada por BMDMs (n = 3, expressa como média ± EPM); b, c
32 não afeta a secreção de TNF-α e IL-6 (n = 3, expressa como média ± EPM, o teste de comparações múltiplas de Tukey foi utilizado para a análise de comparação múltipla); d Alterações na circunferência do tornozelo de ratos (n = 6, expressa como média ± EPM); e Imagens ilustrativas mostrando a progressão das articulações do tornozelo de ratos em vários intervalos de tempo; f A ressonância de plásmon de superfície (SPR) de 32 e da proteína 3 do receptor do tipo NOD (NLRP3); g O ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA) determina a ligação de NLRP3 ao 32. Este experimento foi realizado uma vez, com consistência técnica observada ao longo do gradiente de temperatura (48–78 °C) no ensaio; h A interação entre 32 e NLRP3. (As figuras foram geradas pelo PyMOL. As linhas tracejadas amarelas são ligações de hidrogênio.); i Análise da trajetória da simulação de dinâmica; j Representação cronológica das interações e contatos (ligações de hidrogênio, hidrofóbicas, pontes de água) no complexo NLRP3-previsto por 32 durante 100 ns de simulação de dinâmica molecular. (Comparado ao grupo controle, ns, P > 0,05.).
O inflamassoma NLRP3 é um componente-chave do sistema imune inato e desempenha um papel crucial na patogênese de várias doenças inflamatórias, incluindo a gota. A ativação do inflamassoma NLRP3 leva à clivagem da pró-IL-1β e da pró-IL-18 em suas formas ativas, que subsequentemente desencadeiam uma cascata de respostas inflamatórias. Neste estudo, investigamos o potencial de compostos representativos em inibir a ativação do inflamassoma NLRP3, avaliando seus efeitos sobre a liberação de IL-1β em macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) de camundongos estimulados por lipopolissacarídeo (LPS) e trifosfato de adenosina (ATP). Os resultados mostraram que todos os outros compostos puderam exibir inibição de IL-1β na concentração de 3 μM, com exceção dos compostos 27, 63 e 64 (Tabela Suplementar 3). Entre eles, os compostos mais potentes 25, 32 e 45 foram posteriormente avaliados quanto aos seus valores de IC50 na inibição da liberação de IL-1β em BMDMs estimulados por LPS e ATP (Fig. 4a). Os resultados mostraram que 32 (IC50 = 2,61 μM) e 45 (IC50 = 2,61 μM) exibiram maior atividade inibitória em comparação com 25 (IC50 = 7,28 μM).

Posteriormente, considerando a atividade de redução do ácido úrico, o composto 32 foi selecionado para investigação adicional de seus mecanismos anti-inflamatórios. Após o tratamento de BMDMs com 32, não foram observadas alterações significativas na produção de TNF-α e IL-6 (Fig. 4b, c), indicando que 32 não interfere na fase de iniciação da ativação do inflamassoma NLRP3. Em seguida, a eficácia in vivo de 32 foi avaliada em um modelo de artrite gotosa em ratos, com dose de injeção de 2 mg/kg. A inflamação aguda foi induzida pela injeção intra-articular de cristais de MSU na articulação do tornozelo, e a extensão do inchaço da articulação do tornozelo foi monitorada 2, 4, 6, 8 e 12 horas após a administração, enquanto se avaliava a liberação de IL-1β. A administração de 32 demonstrou eficácia significativa na redução do inchaço do tornozelo em ratos com artrite gotosa aguda (Fig. 4d, e), além de exercer potentes efeitos anti-inflamatórios (Fig. Suplementar 1), comparáveis aos do MCC950. Vale ressaltar que a concentração de 32 na articulação do tornozelo (83.733 ng/g) foi significativamente maior do que a do MCC950 (9.709 ng/g) em 2 horas, sugerindo que seus efeitos anti-inflamatórios podem ser potencializados pelo acúmulo no tecido local (Tabela Suplementar 4). Embora 32 tenha atividade inibitória do NLRP3 relativamente fraca, o alto nível de exposição pode compensar parcialmente a deficiência de atividade por meio de um efeito dependente da concentração, regulando assim efetivamente o NLRP3.
Para determinar se o composto 32 pode se ligar à proteína NLRP3, a afinidade do inibidor pela NLRP3 foi analisada por ressonância plasmônica de superfície (SPR). Os resultados na Fig. 4f mostraram que 32 pôde se ligar à proteína NLRP3 (KD = 27,8 μM). Simultaneamente, empregamos o ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA) para validação adicional (Fig. 4g). Os resultados foram consistentes com os obtidos no experimento de SPR, indicando que 32 aumenta a estabilidade térmica da NLRP3, o que sugere uma potencial interação de ligação entre 32 e NLRP3. Após determinar que 32 exerce um efeito direto sobre NLRP3, prosseguimos para investigar o modo de ligação de 32 com NLRP3. Os resultados de docking mostraram que 32 pode se ancorar no canal eletropositivo do bolsão central da NLRP3, formando interações hidrofóbicas com múltiplos resíduos de aminoácidos (ARG578, ALA228) e interações adicionais de empilhamento π-π com PHE575 e TYR632 (Fig. 4h). 32 foi posteriormente estudado por simulação de dinâmica molecular. Os resultados são mostrados na Fig. 4i; a análise de RMSD demonstrou manutenção estável do esqueleto proteico da NLRP3 dentro de 2-3 Å, enquanto o ligante exibiu flutuações em torno de 4 Å, indicando uma ligação sólida de 32 ao bolsão. Os contatos estabelecidos entre a proteína NLRP3 e 32 ao longo da trajetória são representados na Fig. 4j, com o painel superior ilustrando as interações em diferentes quadros. Notavelmente, múltiplos resíduos da proteína exibiram contatos específicos com 32, indicados por um tom mais escuro de laranja. Essa observação sugere a estabilidade do complexo NLRP3 previsto com 32.

Avaliação in vitro do efeito inibitório de compostos representativos sobre outros alvos associados à gota

A maioria dos produtos naturais foi relatada como fármacos eficazes na redução do urato por inibição da XOD, enquanto alguns estudos demonstraram que o extrato de EL possui atividade XOD. A potência inibitória da XOD desses compostos foi inicialmente avaliada em uma concentração única relativamente alta do inibidor (10 μM) para identificar inibidores potentes da XOD. Infelizmente, os resultados demonstram que o efeito inibitório desses compostos sobre a XOD foi inferior a 30% na concentração de 10 μM, indicando sua atividade inibitória insignificante (Tabela 1). No mesmo sistema experimental, o febuxostate alcançou inibição completa (100%), enquanto o lesinurad não exibiu efeito inibitório.

Resultados das simulações de dinâmica molecular da conformação de ligação prevista do composto 32 a URAT1, OAT4 e GLUT9.
a Efeitos dose-dependentes da benzbromarona e do composto 32 em células do transportador de ânions orgânicos 4 (OAT4) (n = 4, réplicas biológicas, expressos como média ± EPM); b Relação dose-resposta das correntes do transportador de glicose 9 (GLUT9) pelo composto 32 (n = 5, réplicas biológicas, expressos como média ± EPM); c A afinidade de ligação do composto 32 ao OAT4 foi avaliada por ressonância plasmônica de superfície (SPR); d A afinidade de ligação do composto 32 ao GLUT9 foi avaliada por SPR; e Modos de ligação previstos do composto 32 com OAT4 (código PDB: 8WJH) (As figuras foram geradas pelo PyMOL. Linhas tracejadas amarelas representam ligações de hidrogênio, linhas tracejadas verdes representam empilhamentos π-π); f Modos de ligação previstos do composto 32 com GLUT9 (código PDB: 8Y65) (As figuras foram geradas pelo PyMOL e Schrödinger. Linhas tracejadas amarelas representam ligações de hidrogênio, linhas tracejadas verdes representam empilhamentos π-π); g Análise do desvio quadrático médio (RMSD) para os complexos previstos de OAT4 com o composto 32; h Análise de RMSD para os complexos previstos de GLUT9 com o composto 32; i A afinidade de ligação do composto 32 ao transportador de urato 1 (URAT1) foi avaliada por SPR; j–l Análise de RMSD para os complexos previstos de OAT4 com o composto 32.

Adicionalmente, também investigamos sistematicamente os efeitos inibitórios do composto 32 sobre transportadores-chave de reabsorção de urato, como o transportador de ânions orgânicos 4 (OAT4) e o transportador de glicose 9 (GLUT9). O OAT4, localizado na membrana apical das células epiteliais do túbulo proximal renal humano, demonstrou promover efetivamente a excreção de urato mediante inibição funcional (como exemplificado pelo lesinurad). Utilizando modelos celulares HEK293 com superexpressão de OAT4 e 6-carboxifluoresceína (6-CFL) como substrato característico para ensaios de captação, o composto 32 (IC50 = 6,08 ± 2,58 μM) exibiu inibição comparável à do lesinurad contra OAT4 (IC50 = 4,35 ± 1,48 μM, Fig. 5a). Notavelmente, o GLUT9 atua como um transportador de urato de alta capacidade que medeia sinergicamente a reabsorção renal de urato juntamente com OAT4 e URAT1, porém atualmente carece de inibidores clinicamente disponíveis. A corrente relativa foi induzida em um modelo celular HEK293 com superexpressão de GLUT9 pela incubação com 1 mM de ácido úrico, e o composto 32 exibiu potente atividade inibitória contra GLUT9 (IC50 = 11,02 ± 1,33 μM, Fig. 5b). Os experimentos de SPR demonstraram ainda que o composto 32 apresenta fortes afinidades com OAT4 (KD = 0,71 μM) e GLUT9 (KD = 6,37 μM, Fig. 5c, d).
Dada a identificação inesperada de OAT4 e GLUT9 durante a triagem de atividade do alvo, os sítios de ligação específicos dessas proteínas permanecem obscuros. Portanto, empregamos o Chai-1 para prever a estrutura do complexo e utilizamos simulações de dinâmica molecular para verificar a estabilidade conformacional. Como mostrado na Fig. 5e, o grupo sulfonamida do composto 32 apresenta interações polares estáveis com ARG389 e TYR361 do OAT4, e seu sistema de anéis aromáticos realiza empilhamento π-π com PHE211. Além disso, seu domínio aromático está inserido no bolso hidrofóbico do GLUT9, formando múltiplas interações hidrofóbicas com PHE477, TYR369 e TRP378, enquanto seu grupo sulfonamida forma uma rede de ligações de hidrogênio com a cadeia lateral da ASN500 (Fig. 5f). Posteriormente, o RMSD do composto 32 com o domínio transmembranar do OAT4 e GLUT9 foi analisado, focando no RMSD da cadeia principal da proteína do domínio transmembranar e no átomo pesado da molécula pequena. Os resultados de RMSD mostraram que o 32 pode se ligar ao OAT4 e GLUT9 de forma relativamente estável (Fig. 5g, h). Além disso, realizamos uma validação sistemática da interação entre o composto 32 e URAT1 usando análise de SPR e RMSD. Os resultados de SPR revelaram ligação específica de afinidade moderada entre eles (KD = 2,84 μM, Fig. 5i). Durante a simulação de dinâmica molecular de 100 ns, os valores de RMSD dos átomos da cadeia principal no domínio transmembranar do URAT1 permaneceram estáveis em 3,0 ± 1,0 Å, indicando a manutenção da estabilidade conformacional da proteína. Enquanto isso, os átomos pesados do composto 32 mostraram flutuações mínimas de RMSD, sugerindo seu posicionamento estável dentro do bolso de ligação. Notavelmente, a distância entre o resíduo de ligação chave PHE241 e o centro do anel aromático do composto 32 permaneceu consistentemente em 5,0 ± 0,5 Å, formando interações de empilhamento π-π estáveis (Fig. 5j, l).
Avaliação preliminar da drug-likeness do composto 32
A fim de validar ainda mais a eficácia, apresentamos uma discussão sobre a dose mínima eficaz do composto 32 no modelo agudo de HUA em camundongos. Lesinurada, febuxostate e benzbromarona foram selecionados como controles positivos. Os resultados são apresentados na Tabela Suplementar 5. O composto 32 exibiu atividade notável de redução do ácido úrico sérico (SUA) na dose de 1 mg/kg, com um valor de DR de 90,6%, comparável ao do febuxostate (93,1%). No entanto, a atividade da lesinurada e da benzbromarona nessa dose foi limitada, com valores de DR de 10,8% e 17,3%, respectivamente. Em conjunto, esses achados confirmam ainda mais a atividade in vivo aprimorada e a dose eficaz do composto 32 em comparação com as da lesinurada e da benzbromarona. Além disso, conduzimos uma investigação abrangente sobre a relação entre a exposição e os efeitos farmacológicos do composto 32. No modelo agudo de HUA em camundongos, o aumento da dose oral de 1 mg/kg para 2 mg/kg resultou em alterações farmacocinéticas. A fase de absorção exibiu cinética de saturação, evidenciada por um aumento marginal de 10,8% na concentração plasmática aos 15 min (de 223 para 247 nM), apesar do incremento de 100% na dose. Isso foi seguido por aumentos desproporcionais na exposição: a Cmax aumentou 26,5% (de 223 para 282 nM), enquanto a concentração em 1 h disparou 115,8% (de 63,1 para 135,9 nM), indicativo de distribuição ou eliminação alteradas. Crucialmente, apesar de um aumento de 71,5% na AUC0-∞, a eficácia na redução do urato melhorou apenas 2,8%. Essa relação exposição-resposta não linear indica proximidade a um platô de eficácia, implicando ganho terapêutico limitado com o aumento adicional da dose. O valor de IC50 (3,81 μM) do composto 32 contra URAT1 é muito maior do que a concentração máxima (223 nM) na dose oral eficaz in vivo (2 mg/kg). Essa disparidade pode ser potencialmente atribuída à sinergia de múltiplos alvos, uma vez que o composto não apenas inibe URAT1, mas também demonstra efeitos inibitórios sobre OAT4 e GLUT9.
Avaliação da eficácia in vivo e dados de segurança do composto 32.
a Fluxograma do estabelecimento do modelo de hiperuricemia crônica (HUA) em camundongos; b Efeitos de 32 sobre o peso corporal de camundongos com HUA crônica durante o tratamento (n = 6, expressos como média ± EPM); c–g Efeitos de 32 sobre os níveis de ácido úrico sérico (AUS), creatinina sérica (CrS), nitrogênio ureico no sangue (BUN), alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) em camundongos com HUA crônica (n = 6, expressos como média ± EPM, análise de variância de uma via (ANOVA) com teste de comparação múltipla de Tukey (bilateral)); h CI50 de 32 e do controle positivo Cisaprida sobre a corrente de cauda do hERG (n = 3, réplicas biológicas, expressos como média ± EPM); i, j A variação de peso dos camundongos foi avaliada após administração oral dos compostos de teste na dose de 1000 mg/kg por uma semana (n = 5, expressos como média ± EPM); k O peso corporal dos camundongos antes e após a administração oral dos compostos de teste na dose de 50 mg/kg por um mês (n = 5, réplicas biológicas, expressos como média ± EPM, análise de variância de uma via (ANOVA) com teste de comparação múltipla de Tukey (bilateral)); l Aparência dos órgãos dos camundongos (n = 5); m Efeitos sobre a razão dos órgãos em camundongos (n = 5, expressos como média ± EPM, análise de variância de uma via (ANOVA) com teste de comparação múltipla de Tukey (bilateral)); n Estudo histopatológico da toxicidade subaguda em camundongos. Coração, fígado, baço, pulmão e rim foram seccionados e corados com H&E (barra de escala = 100 μm). Seis camundongos foram incluídos por grupo experimental, com três animais selecionados aleatoriamente por grupo submetidos a exame patológico detalhado. Este experimento foi realizado em uma única réplica independente, sem variabilidade interindividual na patologia tecidual observada entre os camundongos analisados; o Perfis de concentração plasmática-tempo de 32 em ratos após administração i.v. ou p.o. (n = 3, réplicas biológicas, expressos como média ± DP). (Comparado ao grupo controle, ***P < 0.001; **P < 0.01; *P < 0.05; ns, P > 0.05).
Tendo em vista que a gota é uma doença persistente que exige uma intervenção terapêutica prolongada, o potencial terapêutico e o perfil de segurança do composto 32 no tratamento da HUA crônica foram explorados adicionalmente utilizando um modelo de 30 dias (Fig. 6a). De acordo com os achados da Fig. 6b, pode-se observar que o modelo de HUA crônica neste experimento pode ter um impacto no crescimento dos camundongos, enquanto febuxostate, lesinurade e 32 demonstram potencial para promover o crescimento normal em camundongos com HUA. Como mostrado na Fig. 6c-g, os valores de ácido úrico sérico (SUA), creatinina sérica (SCr), nitrogênio ureico no sangue (BUN), alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) no grupo modelo estavam significativamente elevados em comparação com o grupo veículo, indicando o estabelecimento bem-sucedido de um modelo de HUA crônica induzido por oxonato de potássio e hipoxantina, mas este modelo resultou em comprometimento da função hepática e renal. Em comparação com o grupo modelo, o grupo do composto 32 apresentou redução em graus variados em todos os indicadores mencionados, enquanto os grupos lesinurade e febuxostate mostraram um leve aumento nos níveis de AST. Esses achados sugerem que a administração intragástrica do composto 32 exibe efeitos terapêuticos em camundongos com HUA crônica, potencialmente fornecendo proteção hepatorrenal e amenizando os danos hepáticos e renais induzidos pela HUA crônica. No entanto, deve-se notar que, embora o lesinurade também demonstre eficácia no tratamento da HUA crônica, ele pode exacerbar os danos hepáticos e renais. Os espécimes de fígado e rim foram seccionados, corados com hematoxilina e eosina (H&E) (Fig. Suplementar 2), e os resultados foram geralmente consistentes com as observações mencionadas anteriormente. Em comparação com o grupo modelo, o grupo do composto 32 exibiu danos renais e hepáticos menos graves, enquanto o grupo lesinurade demonstrou danos aumentados que poderiam potencialmente levar à expansão da cápsula renal.
Para a avaliação de segurança, inicialmente realizamos um ensaio de bloqueio do canal hERG in vitro utilizando o método de patch-clamp manual, empregando cisaprida monoidratada como composto de referência. Os resultados indicaram que o composto 32 é improvável de induzir cardiotoxicidade (IC50 > 10 µM) (Fig. 6h).
Em seguida, a toxicidade aguda e subaguda foi avaliada em camundongos Kunming (KM) saudáveis. A administração de 1000 mg/kg do composto 32 por gavagem oral (p.o.) durante o estudo de toxicidade aguda não resultou em mortalidade ou alterações significativas no peso corporal (Fig. 6i, j), enquanto o grupo febuxostate apresentou uma taxa de mortalidade de 50% (com taxas específicas por sexo de 40% em machos e 60% em fêmeas), enquanto o grupo lesinurade exibiu 100% de mortalidade nas mesmas condições de dosagem (Tabela Suplementar 6).
No experimento de toxicidade subaguda, todos os camundongos toleraram a administração oral de 32, febuxostat e lesinurad na dose de 50 mg/kg duas vezes ao dia por 30 dias sem mortes, comportamentos anormais ou diferenças estatisticamente significativas no peso corporal durante todo o período do estudo (Fig. 6k, variações semanais do peso corporal na Fig. Suplementar 3). O sangue e os órgãos, incluindo coração, fígado, baço, pulmão e rim, foram coletados para observação no último dia. O hemograma de rotina mostrou que a administração do composto 32 teve impacto mínimo na contagem total de leucócitos, contagem de eritrócitos, nível de hemoglobina, contagem de linfócitos e contagem de plaquetas nos camundongos em comparação com o grupo controle (Tabela Suplementar 7). Como mostrado na Fig. 6l, o impacto do composto 32 nas características morfológicas desses órgãos foi mínimo em comparação com febuxostat e lesinurad. Além disso, o composto 32 apresentou efeitos insignificantes nas proporções desses órgãos e não demonstrou alterações patológicas observáveis quando comparado ao grupo controle (Fig. 6m, n). No entanto, no grupo tratado com febuxostat, observações ocasionais de edema de cardiomiócitos, tumefação celular, afrouxamento do citoplasma e coloração pálida podem ser notadas. E nossas investigações anteriores revelaram que o lesinurad possui potencial para induzir hepatotoxicidade e nefrotoxicidade, como degeneração balonizante extensa e condensação de hepatócitos no fígado, degeneração hidrópica de hepatócitos e aumento dos glomérulos. De modo geral, o 32 apresentou perfis de segurança pré-clínica aprimorados em relação ao lesinurad e ao febuxostat.

Para avaliar a adequação do composto 32 como fármaco, realizamos uma avaliação de suas propriedades DMPK. Primeiramente, a atividade inibitória do 32 contra as enzimas do citocromo P450 (CYP) humano foi medida. Neste ensaio, o 32 não apresentou atividade inibitória óbvia contra CYP1A2, 2D6 e 3A4 (IC50 > 30 µM) (Tabela Suplementar 8). No entanto, exibiu atividade inibitória moderada contra CYP2C9 (IC50 = 2,77 μM) e CYP2C19 (IC50 = 2,03 μM); portanto, é necessária uma avaliação adicional para determinar o risco específico de interação medicamentosa (DDI) mediada pela inibição enzimática. Em seguida, os perfis farmacocinéticos do 32 foram avaliados em ratos Wistar, e os perfis de concentração sanguínea-tempo e os principais parâmetros farmacocinéticos estão representados na Fig. 6o e na Tabela Suplementar 9. A biodisponibilidade oral do 32 foi de 53,2%, o que atende aos requisitos para um potencial fármaco candidato.

Discussão
A prevalência global de gota e HUA está significativamente elevada. Os fármacos terapêuticos atualmente disponíveis consistem principalmente em agentes anti-inflamatórios de ação rápida e agentes redutores de ácido úrico de uso contínuo, mas seus resultados terapêuticos permanecem insatisfatórios. Além disso, esses fármacos exibem um mecanismo inibitório de alvo único, o que gera efeitos adversos significativos e potenciais preocupações de segurança a longo prazo associadas à medicação prolongada. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver medicamentos anti-gota que apresentem eficácia aprimorada, toxicidade reduzida e sejam adequados para administração prolongada. De acordo com estatísticas, a excreção renal de urato prejudicada é observada em ~90% dos pacientes com HUA primária. Durante o processo de excreção renal de ácido úrico, URAT1 e GLUT9 atuam como transportadores de reabsorção primários, servindo assim como determinantes principais para os níveis plasmáticos de ácido úrico e o desenvolvimento da gota. Isso sugere que o direcionamento de URAT1 e GLUT9 pode ser uma abordagem eficaz para o tratamento da HUA. Por outro lado, a ativação do inflamassoma NLRP3 por cristais de MSU tem relevância significativa tanto no início quanto na progressão da artrite gotosa, apresentando assim um promissor alvo terapêutico prospectivo. Consequentemente, a inibição farmacológica dos transportadores de reabsorção de urato e a modulação da montagem e ativação do inflamassoma NLRP3 representam uma via promissora para intervenção terapêutica na gota.

Produtos naturais e ingredientes ativos derivados da medicina tradicional chinesa possuem vantagens distintas no tratamento de doenças crônicas multifatoriais devido aos seus diversos efeitos terapêuticos e reações adversas mínimas, tornando-os uma fonte fundamental para fármacos inovadores direcionados a grandes doenças crônicas. Diante disso, empregamos um modelo murino de HUA aguda para triagem fenotípica e descobrimos que o ácido β-carbolina-1-propiônico, um composto natural encontrado em EL, demonstrou eficácia notável na redução dos níveis de ácido úrico em camundongos, superando a do fármaco comercializado lesinurada (DR = 41,70% vs. 32,48%). Em seguida, o modelo farmacofórico foi utilizado para conduzir três séries de otimização estrutural do ácido β-carbolina-1-propiônico. Posteriormente, compostos de indol acil sulfonamida com efeitos anti-gota de triplo-alvo e duplo mecanismo foram descobertos por meio de triagem de atividade in vitro e in vivo.
Notavelmente, o candidato a fármaco 32 exibiu atividade inibitória duas vezes maior em comparação ao lesinurad no teste de atividade do alvo URAT1 realizado in vitro (IC50 = 3,81 μM VS 6,88 μM). Além disso, sua eficácia aguda na redução do ácido úrico em camundongos (DR = 93,42%) foi significativamente superior à do lesinurad (DR = 41,12%) e comparável à do febuxostat (DR = 96,16%). O modelo murino de 30 dias para avaliação da HUA crônica demonstrou que o composto 32 exibiu uma redução sustentada nos níveis de SUA, enquanto indicadores como SCr, BUN, ALT e AST não mostraram sinais significativos de dano hepatorrenal. Concomitantemente, os resultados do ensaio de atividade da XOD hepática indicaram que o composto 32 não apresentou efeito inibitório sobre a atividade da XOD, sugerindo que seu mecanismo de ação na redução dos níveis de ácido úrico pode envolver a promoção da excreção de ácido úrico. A avaliação farmacológica abrangente, combinando perfil de atividade de alvos e análise de SPR, demonstrou que o composto 32 exerce seu efeito redutor de ácido úrico inibindo simultaneamente três transportadores de urato chave: OAT4, GLUT9 e URAT1. Adicionalmente, o composto 32 exibiu um impacto dependente da concentração na liberação de IL-1β induzida por ATP em BMDMs, demonstrando potentes efeitos anti-inflamatórios através da inibição do inflamassoma NLRP3. Os resultados da avaliação DMPK indicam que o composto 32 apresenta uma biodisponibilidade oral em ratos de 53,2%, atendendo aos requisitos para administração oral. A avaliação de segurança revelou a ausência de toxicidade hERG para o composto 32, com uma dose máxima tolerada superior a 1000 mg/kg em camundongos, e nenhum dano orgânico evidente após administração prolongada em alta dose (50 mg/kg). Assim, o composto 32 exibe segurança superior em comparação aos fármacos existentes.

No geral, este estudo estabelece o 32 como um agente antigota derivado de produtos naturais com um perfil polifarmacológico único, visando quatro proteínas-chave (URAT1/GLUT9/OAT4/NLRP3) para alcançar efeitos duplos de redução do ácido úrico e anti-inflamatórios. Ao evitar a inibição excessiva de um único alvo, seu design de múltiplos mecanismos atenua os efeitos adversos graves dos atuais fármacos redutores de ácido úrico de uso contínuo. Além da gota, este trabalho exemplifica um paradigma de descoberta de fármacos amplamente aplicável: aproveitar scaffolds de produtos naturais e polifarmacologia guiada por farmacóforos para abordar doenças complexas. Embora a validação clínica esteja pendente, o 32 representa um candidato promissor para avançar a terapia da gota em direção a desfechos mais seguros, eficazes e modificadores da doença.

Métodos

Compostos e células

Os compostos (1–64) mostrados na Tabela Suplementar 1-2 foram sintetizados em nossas instalações internas. E os métodos detalhados de síntese e os dados de caracterização desses compostos estão listados nos materiais suplementares (Figs. Suplementares 4-67). As células HEK293 (cat. nº CL-0003), HEK293T (cat. nº CL-0005) e THP-1 (cat. nº CL-0233) foram obtidas da Pricella Life Science & Technology Co., Ltd.

Declarações de ética
O cuidado e o manejo dos animais foram conduzidos em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication no. 93-23, revisado em 1985), bem como com o Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Shandong (ECSBMSSDU2021-2-156) e as Regras de Manejo Animal do Ministério da Saúde da República Popular da China.
Modelo de HUA in vivo em camundongos
Durante o processo de aclimatação e estudo, os animais foram alojados em grupos. Controlamos cuidadosamente o ambiente da sala de animais (condições alvo: temperatura de 20 °C a 25 °C, umidade relativa entre 40% e 70%, com exposição à luz por meio dia e escuridão por meio dia). Camundongos KM saudáveis com 3 semanas de idade foram divididos em quatro grupos: grupo veículo, grupo modelo, grupo controle ativo e grupo experimental. A HUA foi induzida no grupo modelo utilizando oxonato de potássio (s.c.) e hipoxantina (v.o.). Informações detalhadas sobre as dosagens e os protocolos de administração podem ser encontradas nos materiais suplementares. Amostras de sangue foram coletadas após 4 h de modelagem aguda e 30 dias de modelagem crônica.
Potência inibitória de alvos in vitro
Um sistema de expressão transiente baseado em células HEK293 para o URAT1 humano foi estabelecido para avaliar o transporte de ácido úrico-14C (protocolo detalhado nos Materiais Suplementares).
Os efeitos inibitórios in vitro dos compostos sobre a XOD bovina foram avaliados espectrofotometricamente. Resumidamente, o pó da enzima XOD foi reconstituído em PBS contendo pirofosfato de sódio 0,1 M (pH 7,5) até uma concentração final de 0,5 U/mL. A enzima (50 μL) foi pré-incubada com os compostos de teste (50 μL, 10 μM) por 15 min a 37 °C. A reação foi iniciada pela adição de 100 μL de xantina 0,3 mM, e as alterações de absorbância foram monitoradas imediatamente a 295 nm usando um leitor de microplacas. Febuxostate e lesinurada serviram como controles positivo e negativo, respectivamente.
Os efeitos inibitórios sobre o GLUT9 foram avaliados por meio de registros de patch-clamp de célula inteira. As correntes foram medidas usando um amplificador MultiClamp 700B/digitalizador Digidata 1550B e analisadas com o software pClamp 10 (Molecular Devices, CA, EUA). Os procedimentos detalhados são fornecidos nos Materiais Suplementares.
A atividade inibitória sobre o OAT4 foi determinada utilizando 6-CFL, um substrato clássico do OAT4. Células HEK293 (70% confluentes em placas de 96 poços) foram transfectadas com 100 ng/poço do plasmídeo pcDNA3.1(+)-OAT4. Após 24 h, as células foram pré-tratadas com os compostos de teste (ou veículo) em tampão HBSS por 30 min, seguido de incubação com 100 μM de 6-CFL por 15 min. As células foram lavadas três vezes com DPBS gelado, lisadas em NaOH 0,1 M e a intensidade de fluorescência foi medida (excitação/emissão: 485/535 nm).
Simulação de docking molecular e dinâmica
As preparações de proteína e ligante, bem como os estudos de docking, foram realizados utilizando a plataforma Schrödinger suite 2023-1. O Chai-1 foi utilizado para prever o possível modo de ligação entre a proteína e o ligante. Os arquivos 3D exportados foram visualizados no PyMOL (Versão 2.5.2 Schrödinger, LLC). Todas as simulações foram conduzidas utilizando o Schrödinger (Schrödinger, LLC. Desmond Molecular Dynamics System, versão 2023-1. Nova York, NY, EUA: Schrödinger, LLC, 2023) e empregaram o módulo Desmond. A trajetória resultante foi então analisada, e o RMSD do complexo foi calculado. Os dados da trajetória de dinâmica molecular (configurações inicial e final) são fornecidos nos Dados Suplementares 1.
Estimulação do inflamassoma
O efeito dos compostos sobre a liberação de IL-1β foi avaliado em BMDMs de camundongos. Os macrófagos foram obtidos das tíbias e fêmures de camundongos machos C57BL/6 J WT com 6 semanas de idade e foram cultivados durante a noite em placas de 12 poços. Posteriormente, foram estimulados com 1 μg/mL de LPS por 4 h, seguido pela adição de meio fresco contendo os diferentes compostos em concentrações especificadas por 15 min, com MCC950 servindo como controle positivo. Após isso, as células foram estimuladas com 5 mM de ATP por 30 min para ativar completamente o inflamassoma. Os sobrenadantes foram coletados e armazenados a −80 °C para detecção de IL-1β, TNF-α e IL-6. A determinação dos valores de IC50 foi realizada utilizando o GraphPad Prism 9.5.1.
Atividade antiartrite gotosa in vivo
Um total de 42 ratos machos Sprague-Dawley (SD) (7-8 semanas de idade, 180–220 g) foram aclimatados sob condições padrão por pelo menos 3 dias. Em seguida, foram divididos aleatoriamente nos seguintes grupos: grupo controle, grupo MSU, grupo MCC950 (2 mg/kg), grupo composto 32 (2 mg/kg). Os pesos dos ratos foram registrados, e cada grupo recebeu o fármaco correspondente ou solução placebo uma vez ao dia. Após administração contínua por 3 dias, as coxas dos ratos foram raspadas para expor a articulação do tornozelo e, subsequentemente, o método de Coderre foi empregado para estabelecer o modelo. A cavidade da articulação do tornozelo direito foi subsequentemente injetada com uma seringa estéril contendo uma suspensão de MSU a uma concentração de 50 mg/mL para completar o estabelecimento do modelo. Uma hora após o estabelecimento do modelo, a administração intragástrica foi retomada. O inchaço e as alterações na marcha dos dedos dos ratos foram observados de perto e documentados. O sangue foi coletado antes da modelagem, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas após a modelagem, e o sobrenadante foi obtido por centrifugação para a determinação do nível de IL-1β. A exposição do tecido da articulação do tornozelo e a exposição plasmática dos compostos em 2, 6 e 24 h foram detectadas.
Ressonância de plásmons de superfície
A proteína foi diluída para 100 ng/μL em tampão acetato de sódio no pH apropriado e imobilizada em um chip sensor CM5 via acoplamento de amina. Tampão PBS+ foi utilizado como tampão de corrida. Diluições seriadas do composto 32 (contendo 5% de DMSO) foram preparadas em PBS+. Diferentes concentrações de 32 foram injetadas sequencialmente sobre a superfície do chip. A interação entre 32 e a proteína-alvo produziu sensorgramas característicos de associação e dissociação. Nenhum sinal de resposta foi observado na ausência de ligação. A regeneração da superfície foi realizada lavando-se com tampão entre as injeções. Os dados dos sensorgramas foram ajustados globalmente a um modelo de ligação de Langmuir 1:1 utilizando o software BIAcore 1 K Evaluation (Cytiva, Marlborough, MA, EUA) para determinar a constante de taxa de associação e a constante de taxa de dissociação. Os dados processados foram exportados para o software Origin 7 (Versão 7.0552, OriginLab) para representação gráfica.
Ensaio de deslocamento térmico celular
Células THP-1 foram lisadas em gelo e centrifugadas. O sobrenadante foi coletado, aliquotado e incubado com DMSO ou composto 32 (10 μM) à temperatura ambiente por 10 min. Após a incubação, cada alíquota foi subdividida e desnaturada termicamente em diferentes temperaturas por 5 min. Após centrifugação, os sobrenadantes foram coletados e submetidos à análise por Western blot para detectar a proteína NLRP3 (Cell Signaling Technology, cat. nº 15101).
Ensaio de atividade do hERG
Células HEK293 transfectadas de forma estável com cDNA de hERG foram utilizadas para testar o efeito inibitório do composto 32 sobre o canal de potássio hERG. Registros de célula inteira foram realizados com um amplificador comercial de patch clamp. A porcentagem de inibição foi calculada de acordo com a seguinte equação: % de inibição = (1-(corrente de cauda de pico do composto)/(corrente de cauda de pico do veículo)) ×100. Os procedimentos detalhados podem ser encontrados nos materiais suplementares.
Estudo de toxicidade in vivo
Camundongos KM machos e fêmeas (3 semanas, 18–22 g) foram utilizados para avaliar a toxicidade aguda e subaguda in vivo do composto 32. O composto 32 foi dissolvido em 75:20:5 de CMC-Na 0,5%/água/DMSO. As informações específicas são apresentadas nos materiais suplementares.
Coloração H&E
As amostras de tecido animal foram fixadas em paraformaldeído tamponado neutro a 10%, desidratadas utilizando um processador de tecidos semiautomático (Leica, Alemanha) e incluídas em parafina. Os cortes foram corados com hematoxilina de Gill e eosina Y, e visualizados em microscópio óptico invertido.
Propriedades farmacocinéticas
As informações sobre os compostos, doses e esquema de administração para os estudos de farmacocinética são apresentadas nos materiais suplementares. Resumidamente, ratos SD machos (n = 3) foram tratados por via intravenosa (i.v.) ou gavagem (p.o.). O veículo consistiu em 5% de N-metil-2-pirrolidona (NMP), 10% de cremophor EL, 30% de PEG400 e 55% de água. Após a administração, as amostras de sangue foram coletadas nos tempos indicados e analisadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS).
Ensaio de atividade inibitória do CYP
O composto 32 foi preparado e incubado com microssomas hepáticos humanos e o cofator NADPH na presença dos substratos-sonda correspondentes. α-naftoflavona, sulfafenazol, (+)-N-3-benzilnirvanol, quinidina e cetoconazol selecionados foram utilizados como controles positivos. Uma solução fria de acetonitrila contendo tolbutamida e labetalol foi adicionada para interromper a reação. Foram retirados 200 μL do sobrenadante e diluídos com 100 μL de água para HPLC após centrifugação. Por fim, as misturas foram submetidas à análise por LC-MS/MS.
Estatística/bioinformática
A análise dos dados foi realizada utilizando o GraphPad Prism 9.5.1. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão/EPM de n = 3 experimentos independentes, salvo indicação em contrário.
Resumo do relatório
Informações adicionais sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Resumo do Relatório do Nature Portfolio vinculado a este artigo.
Informações suplementares
Dados de origem
Nota do editor: A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Estes autores contribuíram igualmente: Zhijiao Zhang, Xiaoyu Shi, Ting Wu.
Informações suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41467-025-62645-6.
Contribuições dos autores
P.Z., F.Y., J.P. e X.L. conceberam o projeto e delinearam os experimentos. Z.Z., X.S., R.L. e Q.Y. sintetizaram os compostos e realizaram os experimentos biológicos. Z.G., S.W. e M.W. realizaram os experimentos computacionais. Y.W., Z.W., M.Y., D.Q. e Z.W. concluíram a avaliação da atividade de redução do SUA in vivo. H.L., F.Z., Z.Z. e Y.C. concluíram o experimento de atividade in vitro de URAT1, GLUT9 e OAT4. J.E. concluiu o experimento de atividade in vitro do inflamassoma NLRP3. T.W., W.Y. concluíram o experimento de atividade in vivo anti-gota. T.Z. auxiliou na confirmação da estrutura dos compostos. Z.Z. e X.S. prepararam o manuscrito com a contribuição de todos os autores. P.Z. revisou o manuscrito do artigo integralmente. S.X. e Z.H. apresentaram opiniões valiosas sobre a redação do artigo. Todos os autores leram e aprovaram o artigo.
Revisão por pares
Informações sobre a revisão por pares
A Nature Communications agradece ao(s) revisor(es) anônimo(s) por sua contribuição para a revisão por pares deste trabalho. Um arquivo de revisão por pares está disponível.
Disponibilidade de dados
Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e em seus arquivos de informações suplementares (arquivo de Informações Suplementares e arquivo de Dados de Origem), e estão disponíveis com os autores correspondentes (P.Z., J.P., F.Y. ou X.L.). Os dados de origem são fornecidos com este artigo.
Conflitos de interesses
Os autores declaram não haver conflitos de interesses.
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