pmid: "20141584"
title: "Efeitos eretogênicos e neurotróficos da icariina, um extrato purificado de erva-de-bode (Epimedium spp.) in vitro e in vivo."
authors: "Shindel AW, Xin ZC, Lin G, Fandel TM, Huang YC, Banie L, Breyer BN, Garcia MM, Lin CS, Lue TF"
journal: "The journal of sexual medicine"
pubdate: "2010 Apr"
doi: "10.1111/j.1743-6109.2009.01699.x"
source: "PMC Full Text"
Efeitos eretogênicos e neurotróficos da icariina, um extrato purificado de erva-de-bode (Epimedium spp.) in vitro e in vivo.
Autores
Shindel AW, Xin ZC, Lin G, Fandel TM, Huang YC, Banie L, Breyer BN, Garcia MM, Lin CS, Lue TF
Periodico
The journal of sexual medicine (2010 Apr)
Conteudo
Efeitos Eretogênicos e Neurotróficos da Icariina, um Extrato Purificado de Erva-de-bode (Epimedium spp.) In Vitro e In Vivo
Introdução
As espécies de Epimedium (conhecidas como erva-de-bode) têm sido utilizadas para o tratamento da disfunção erétil na Medicina Tradicional Chinesa por muitos anos. A icariina (ICA) é a fração ativa das espécies de Epimedium.
Objetivo
Avaliar os efeitos hemodinâmicos e teciduais penianos da ICA em ratos com lesão do nervo cavernoso. Também estudamos os efeitos in vitro da ICA em gânglios pélvicos cultivados.
Métodos
Ratos foram submetidos à lesão do nervo cavernoso e subsequentemente tratados por 4 semanas com alimentação diária por gavagem de uma solução placebo de solução salina normal e dimetilsulfóxido (DMSO) vs. ICA dissolvida em DMSO nas doses de 1, 5 e 10 mg/kg. Um grupo separado recebeu uma dose única de ICA 10 mg/kg 2 horas antes do teste funcional. O teste funcional com estimulação do nervo cavernoso e avaliação em tempo real da pressão intracavernosa (PIC) foi realizado em 4 semanas. Após o teste funcional, o tecido peniano foi obtido para imuno-histoquímica e estudos moleculares. Em experimentos separados, gânglios pélvicos foram excisados de ratos saudáveis e cultivados na presença de ICA, sildenafil ou meio de cultura placebo.
Medida de Desfecho Principal
Razão da PIC e área sob a curva (ASC) para a pressão arterial média (PAM) durante a estimulação do nervo cavernoso dos roedores. Também analisamos a expressão tecidual da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), eNOS: óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), calponina e apoptose por imuno-histoquímica e Western blot. A testosterona sérica e o hormônio luteinizante (LH) foram dosados por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). O comprimento diferencial do crescimento de neuritos foi avaliado nos gânglios pélvicos cultivados.
Resultados
Ratos tratados com dose baixa de ICA demonstraram razões PIC/PAM e ASC/PAM significativamente maiores em comparação com animais controle e que receberam dose única de ICA. A imuno-histoquímica e o Western blot revelaram positividade significativamente maior para nNOS e calponina nos tecidos penianos de todos os ratos tratados com ICA. A ICA levou a um comprimento de neuritos significativamente maior em espécimes cultivados de gânglios pélvicos.
Conclusão
A ICA pode ter efeitos neurotróficos além dos efeitos inibidores da fosfodiesterase tipo 5 já conhecidos.
Introdução
As várias espécies do gênero vegetal Epimedium têm sido utilizadas na Medicina Tradicional Chinesa (MTC) por séculos para tratar uma variedade de doenças humanas. Coloquialmente conhecidas como “erva-de-bode” ou “yin yang huo”, essas plantas têm, como o nome indica, despertado interesse particular por sua eficácia percebida no manejo de questões sexuais.
Investigações recentes sobre as propriedades dessas plantas sugeriram que o extrato metabolicamente mais ativo de Epimedium é a icariina (ICA), um glicosídeo flavonol obtido da parte aérea da planta. Foi demonstrado que a ICA exerce atividade inibitória contra a fosfodiesterase tipo 5 (PDE5) in vitro. A modificação da ICA nativa pela adição de duas porções de éteres hidroxietílicos aumenta a atividade inibitória da PDE5 em 80 vezes, próximo ao nível observado com a sildenafila. Além de um papel eretogênico, foi sugerido que a ICA possui propriedades miméticas da testosterona. Esses efeitos conferem credibilidade ao uso da ICA para o manejo de problemas sexuais.
Foi demonstrado que a ICA aumenta a expressão da eNOS e a produção de NO em células endoteliais humanas, bem como diminui a expressão da caspase-3 e a apoptose celular em resposta ao peróxido de hidrogênio. Também foi demonstrado que a ICA aumenta a resposta da pressão intracavernosa (PIC) desencadeada pela estimulação do nervo cavernoso em ratos; esses efeitos foram abolidos por inibidores da óxido nítrico sintase e da guanilato ciclase. Além disso, a ICA foi usada com sucesso para melhorar tanto o comprometimento da função erétil relacionado à castração quanto o arteriogênico, e o declínio no conteúdo de nNOS nos neurônios penianos em um modelo de roedor. Até onde sabemos, a utilidade da icariina para a potenciação da ereção em um modelo animal de cirurgia pélvica radical não foi explorada. Isso é de particular interesse, dadas as evidências recentes que sugerem que o regime comumente utilizado de terapia com doses rotineiras de inibidores da PDE5 disponíveis comercialmente pode não levar a melhores desfechos de função erétil após a prostatectomia.
Neste estudo, administramos ICA como suplemento diário ou dose única em ratos saudáveis de 12 semanas de idade que haviam sido submetidos a lesão por esmagamento do nervo cavernoso. Na conclusão do estudo, os indivíduos foram submetidos a testes funcionais de hemodinâmica erétil durante a estimulação do nervo cavernoso, bem como a avaliação histológica e molecular dos tecidos penianos. Também exploramos os efeitos neurotróficos da ICA em um sistema de cultura in vitro de gânglio pélvico maior de rato.
Métodos
A ICA foi obtida por extração tripla com etanol da parte aérea de Epimedii herba (especificamente, E. koreanum, E. sagittatum e/ou E. brevicornum). O produto foi seco a vácuo. O extrato seco foi suspenso em água e particionado sucessivamente com n-hexano, CHCl3 e álcool n-butílico. A fração de álcool n-butílico foi submetida a cromatografia em coluna de sílica gel para isolar a ICA, que foi posteriormente purificada por recristalizações repetidas com metanol. O produto final apresentou 98,8% de ICA, conforme determinado por análise de cromatografia líquida de alta eficiência.
Cinquenta e oito ratos Sprague Dawley machos saudáveis com 12 semanas de idade (Harlan Laboratories, Indianápolis, Indiana, EUA) foram obtidos e alojados dois por gaiola em gaiolas padrão para roedores. Todos os animais receberam ração padrão para ratos e água da torneira ad libitum e foram mantidos em sala com temperatura e umidade controladas, em ciclos de 12 horas de claro/escuro. Os animais vivos foram manuseados de acordo com a política institucional de criação de animais; a aprovação para todos os procedimentos em animais vivos foi obtida do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais.
A exposição do nervo cavernoso com ou sem lesão foi realizada conforme descrito anteriormente. Resumidamente, os animais foram anestesiados com isoflurano por inalação. Uma laparotomia foi realizada e os nervos cavernosos foram identificados no espaço periprostático em todos os ratos. Nos animais controle positivo (n = 12), nenhuma intervenção adicional foi realizada. Em todos os outros animais, o nervo cavernoso foi esmagado distalmente ao gânglio pélvico maior com um porta-agulha especialmente designado por um período de 2 minutos; este procedimento foi repetido no lado contralateral. Após o esmagamento do nervo cavernoso, a laparotomia foi fechada em dois planos com sutura absorvível. Todos os animais receberam um opioide e um anti-inflamatório não esteroidal (AINE) por injeção intraperitoneal (IP) no período perioperatório.
A partir do dia da lesão nervosa e continuando por 4 semanas, os ratos receberam alimentação diária por gavagem de uma mistura 50:50 de solução salina normal e DMSO, na qual foi dissolvido ICA em concentrações de 0 (grupos controle positivo e negativo, n = 12 cada), 1 mg/mL (n = 10), 5 mg/mL (n = 12) e 10 mg/mL (n = 12). Os animais foram tratados com as soluções apropriadas em doses de ICA de 0 (simulação e controle negativo), 1 mg/kg, 5 mg/kg ou 10 mg/kg. Os animais foram pesados semanalmente e a dosagem foi ajustada conforme apropriado. Para facilitar a alimentação por gavagem, os animais foram brevemente expostos a isoflurano a 2% em uma câmara de indução; após o animal estar levemente sedado, uma agulha de alimentação de ponta oliva calibre 16 foi avançada atraumáticamente no esôfago do animal e o tratamento prescrito foi administrado. Para avaliar o efeito de uma dose única de ICA 10 mg/kg na hemodinâmica peniana, um grupo separado de seis ratos foi submetido ao esmagamento do nervo cavernoso e não recebeu tratamento algum, exceto uma dose única de ICA 10 mg/kg 2 horas antes do sacrifício e da estimulação do nervo cavernoso.
No ponto de tempo de 4 semanas, todos os ratos foram anestesiados com cetamina e midazolam (100 e 5 mg/kg, respectivamente) por injeção intraperitoneal. Todos os ratos receberam uma dose de solução salina/DMSO ± ICA na concentração apropriada 2 horas antes da anestesia. Uma laparotomia de repetição foi realizada e os nervos cavernosos foram identificados. O pênis foi desnudado da pele sobrejacente e canulado com uma agulha heparinizada de calibre 23 conectada a um transdutor de pressão contínuo em tempo real. Os nervos cavernosos foram então estimulados com um eletrodo bipolar de aço; os parâmetros de estimulação foram trens contínuos de 50 segundos a 20 Hz, 1,5 mAmp. A resposta em tempo real do tecido erétil foi determinada pela alteração na pressão intracavernosa (ICP). A alteração máxima na ICP foi utilizada para análises posteriores; adicionalmente, a área sob a curva (AUC) para todas as avaliações de ICP foi quantificada determinando-se o número de pixels abaixo da curva de ICP durante a estimulação do nervo cavernoso usando o Image-Pro Plus v 5.1 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA).
Após o teste funcional, a pressão arterial sistêmica foi medida por canulação aórtica. A pressão arterial média (PAM) foi calculada pela fórmula PAM = (pressão arterial diastólica + [(pressão arterial sistólica – pressão arterial diastólica)/3]). Amostras de soro foram obtidas no momento da canulação aórtica. O sangue total foi aspirado para um tubo de coleta e deixado coagular por 30 minutos. O sangue coagulado foi então centrifugado a 1.000 rpm por 15 minutos. O soro foi decantado do tubo de coleta e armazenado a -80 graus centígrados até o uso. Os níveis séricos de testosterona em oito ratos selecionados aleatoriamente de cada grupo foram dosados usando o Parameter Testosterone Assay (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis séricos de LH dos mesmos ratos foram dosados usando um kit de ELISA para LH de rato (Cusabio, Newark, DE, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.
Após a canulação aórtica, os animais foram eutanasiados com pentobarbital intraperitoneal (200 mg/kg) e toracotomia bilateral. Os tecidos penianos foram coletados para imuno-histoquímica (armazenados em formaldeído a 3% com ácido pícrico a 0,05% por 4 horas, seguido de sacarose a 30% em solução salina tamponada com fosfato) a 4°C até o uso.
Um segmento do pênis de todos os ratos do estudo foi fixado em fixador de temperatura de corte ideal e, subsequentemente, seccionado a 5 micrômetros em um criostato. Os cortes teciduais foram corados com anti-nNOS de camundongo (1:800; BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, EUA), anti-eNOS de camundongo (1:11.000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), anticorpo anti-calponina de coelho (1:500; Abcam, Cambridge, MA, EUA) e marcação de terminações dUTP pela desoxinucleotidil transferase terminal (TUNEL; Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, EUA) utilizando técnica padrão. As lâminas foram examinadas por um observador cego quanto ao grupo de tratamento. A positividade para nNOS foi determinada pela contagem de fibras positivas em quatro campos aleatórios de alta magnificação (hpf; 400×) do feixe neurovascular dorsal da linha média do pênis. A positividade para eNOS foi quantificada pela seleção de quatro campos aleatórios de 200× dos corpos cavernosos. A positividade para calponina foi determinada pela seleção de quatro campos aleatórios de 200× dos corpos cavernosos. A positividade para TUNEL foi calculada pela contagem de núcleos positivos em quatro campos aleatórios de hpf dos corpos cavernosos. Toda a intensidade de coloração foi medida utilizando o Image-Pro Plus v 5.1 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, EUA).
Para análise por Western blot, amostras de proteína celular do pênis foram preparadas por homogeneização das células em um tampão de lise contendo IGEPAL CA-630 a 1%, desoxicolato de sódio a 0,5%, dodecil sulfato de sódio a 0,1%, aprotinina (10 μg/mL), leupeptina (10 μg/mL) e solução salina tamponada com fosfato. Lisados celulares contendo 20 mcg de proteína foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio e, em seguida, transferidos para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (Millipore Corp, Bedford, MA, EUA). A membrana foi corada com Ponceau S para verificar a integridade das proteínas transferidas e monitorar a transferência uniforme de todas as amostras proteicas. A detecção das proteínas-alvo nas membranas foi realizada com um kit de eletroquimioluminescência (Amersham Life Sciences Inc, Arlington Heights, IL, EUA) utilizando anticorpos primários para nNOS, eNOS, Calponina e Caspase3 (todos os anticorpos na concentração de 1:500, Abcam Inc, Cambridge, MA, EUA). Após a hibridização dos anticorpos secundários, as imagens resultantes foram analisadas com o ChemiImager 4.000 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, EUA) para determinar o valor de densidade integrada de cada banda proteica.
Um grupo separado de doze ratos Sprague-Dawley com 12 semanas de idade foi submetido à anestesia com isoflurano para coleta dos gânglios pélvicos principais (MPG) com a finalidade de cultura celular, conforme descrito anteriormente. Após a coleta, os ratos foram eutanasiados com pentobarbital intraperitoneal (200 mg/kg) e toracotomia bilateral. Cada região dorsocaudal do MPG (da qual se origina o nervo cavernoso) dos ratos experimentais foi seccionada em três fragmentos e plaqueada em um poço de cultura celular estéril em meio Matrigel, totalizando 72 espécimes. Todos os fragmentos de MPG foram incubados em meio Eagle modificado por Dulbecco (Sigma-Aldrich) em câmara umidificada com 5% de CO2. A cada poço de cultura foi adicionado ICA ou sildenafil nas concentrações de 10 nM, 100 nM e 10 µM. Os espécimes controle foram incubados com solução salina tamponada com fosfato. Após 48 horas, os fragmentos de MPG foram examinados sob microscópio de dissecção quanto ao crescimento de neuritos. O neurito mais longo de cada segmento foi medido; calculou-se o comprimento médio dos neuritos para cada grupo de tratamento.
Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Para análise estatística, realizou-se ANOVA de uma via, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni para diferenças entre os grupos. Todos os cálculos foram feitos utilizando o Prism versão 4.2 (Graphpad Software, La Jolla, CA, EUA). A significância estatística foi estabelecida em P < 0,05.
Resultados
Um acidente na alimentação por gavagem resultou em um único óbito no grupo de cirurgia simulada durante o período do estudo. Além disso, uma reação letal à anestesia com cetamina no momento do teste funcional ocorreu em quatro ratos (um de cada um dos grupos ICA e do grupo controle positivo). Nesses indivíduos, foi impossível realizar o teste funcional. Após contabilizar os óbitos anteriores ao teste funcional, o número total de ratos por grupo de estudo foi de 10, 11, 9, 11 e 11 para os grupos sham, controle negativo, ICA 1, 5 e 10 mg/kg, respectivamente. Ademais, os tecidos de quatro ratos do grupo de 5 mg/kg ressecaram durante o armazenamento e não puderam ser utilizados para imuno-histoquímica; por essa razão, a imuno-histoquímica não foi realizada nos tecidos obtidos de ratos do grupo de 5 mg.
Avaliação da PIC/PAM
A razão média PIC/PAM e AUC/PAM para todos os grupos é apresentada na Figura 1A, B. Ambas as medidas foram significativamente menores nos animais lesionados não tratados e nos animais que receberam dose única de ICA em comparação com os controles sham-positivos não lesionados (P < 0.01). Os animais dos grupos de tratamento com ICA 1 e 10 mg/kg apresentaram razões PIC/PAM significativamente maiores em relação aos animais controle; os animais que receberam ICA 5 mg/kg tenderam a ter uma razão PIC/PAM média mais alta, mas a diferença não foi estatisticamente significativa (intervalo de confiança de 95% [IC] —0.8187–0.03132). A diferença na razão PIC/PAM média entre os grupos de tratamento rotineiro com ICA e o grupo de dose única não atingiu significância estatística, embora esse valor tenha apresentado tendência à significância para todos os três grupos de tratamento. Os animais que receberam ICA 1 mg/kg apresentaram razões AUC/PAM significativamente maiores em relação tanto aos animais controle quanto aos animais que receberam dose única de ICA (P < 0.05); não houve outras diferenças significativas nas razões AUC/PAM entre os grupos.
nNOS Western Blot e Imuno-histoquímica
Imagens representativas da coloração para nNOS são apresentadas na Figura 2A. O número médio de fibras positivas para nNOS por campo de grande aumento (hpf) para cada grupo é apresentado na Figura 2B. Houve positividade significativamente maior para fibras de nNOS no grupo sham em comparação com todos os outros. O número de fibras positivas para nNOS foi significativamente menor no grupo controle em relação ao grupo de 1 mg/kg (P < 0.05, intervalo de confiança de 95% −22–−3) e quase significativamente menor em comparação com o grupo de 10 mg/kg (P = 0.08, IC 95% —19—1). O Western blot confirmou que o conteúdo peniano de nNOS foi significativamente maior em todos os grupos de tratamento com ICA em relação aos animais controle e aos que receberam dose única de ICA (Figura 3B).
eNOS Western Blot e Imuno-histoquímica
Imagens representativas da coloração para eNOS são apresentadas na Figura 4A. As intensidades médias de positividade para alfa-actina por campo de 200× para cada grupo são apresentadas na Figura 4A. O nível de positividade para eNOS no grupo controle foi significativamente menor em relação a todos os outros grupos. Não houve diferença significativa na positividade entre os ratos tratados com ICA e os sham. Embora a histoquímica tenha sugerido maior conteúdo de eNOS nos ratos tratados com ICA, esse achado não foi confirmado no Western blot, que não mostrou diferenças significativas entre os grupos (Figura 3C).
Calponina Western Blot e Imuno-histoquímica
A expressão proteica do marcador de músculo liso calponina foi significativamente maior nos animais sham e em todos os grupos de tratamento com ICA em relação aos animais controle (P < 0.05) (Figura 5A). A coloração para calponina foi mais intensa nos animais sham e no grupo ICA 1 mg/kg em relação aos controles não tratados (Figura 5B). Houve uma tendência a menor positividade para calponina nos animais controle vs. animais do grupo 10 mg/kg, mas a diferença não atingiu significância estatística (IC 95% —113,900–1,816). O Western blot confirmou que o conteúdo peniano de calponina foi significativamente maior em todos os grupos de tratamento com ICA em relação aos animais controle e aos que receberam dose única de ICA (Figura 3D).
Western blot para caspase-3 e imuno-histoquímica TUNEL
Não houve diferenças significativas na expressão de caspase-3 nem na positividade para TUNEL entre os grupos (dados não mostrados).
Níveis séricos de testosterona e LH
Os níveis séricos médios de testosterona são apresentados na Figura 6A. Em comparação com os níveis de testosterona relatados em “animais sham” de outros estudos, nossos animais sham demonstraram níveis séricos de testosterona semelhantes ou ligeiramente inferiores. Os níveis de testosterona nos animais controle e tratados com 1 mg/kg de ICA foram mais altos do que os observados nos animais sham, enquanto doses mais elevadas de ICA foram associadas a níveis séricos de testosterona mais baixos. A testosterona sérica no grupo de 10 mg foi significativamente menor do que a testosterona sérica no grupo controle (P < 0,01, IC 95% para a diferença 1,2–5,8) e no grupo de 1 mg/kg (P < 0,01, IC 95% para a diferença 1,8–4,8). Nenhuma outra diferença entre os grupos atingiu significância estatística. Os níveis séricos de LH são apresentados na Figura 6B. O desvio padrão da média foi grande entre os grupos; não houve diferença significativa na expressão de LH.
Avaliação in vitro do crescimento de neuritos
Imagens representativas do crescimento de neuritos a partir de fragmentos de MPG cultivados são apresentadas na Figura 7A. O comprimento médio dos neuritos nos diversos grupos é apresentado na Figura 7B. O comprimento dos neuritos foi significativamente aumentado nos fragmentos de MPG tratados com ICA em comparação com o MPG controle. Não houve diferença significativa no comprimento dos neuritos entre o MPG controle e o tratado com sildenafil.
Discussão
A ICA tem atraído atenção como um potencial agente terapêutico para uma variedade de estados patológicos humanos, incluindo osteoporose, insuficiência cardíaca congestiva e lesão cerebral isquêmica. Embora a ICA possa ter inúmeras aplicações em diferentes campos da medicina, ela é mais conhecida por seu suposto papel na potencialização da função sexual por meio da inibição da PDE5I.
No presente estudo, fornecemos evidências funcionais de que a ICA pode ter efeitos benéficos sobre a função erétil após lesão do nervo cavernoso. Esses efeitos podem ir além da inibição da PDE5; detectamos expressão significativamente maior de nNOS e conteúdo de músculo liso em ratos tratados com ICA em relação aos controles não tratados. Além disso, sugere-se que a eNOS também foi regulada positivamente nas células endoteliais do pênis após o tratamento com ICA, embora a evidência disso seja um pouco menos robusta devido à discrepância entre os resultados histoquímicos e de Western blot para eNOS. Curiosamente, foi a dose baixa de ICA que produziu os resultados benéficos mais consistentes.
Trabalhos anteriores apoiaram um papel da ICA na melhora da função erétil em vários modelos animais de disfunção erétil (DE). Makarova et al. relataram que a ICA aumenta a frequência de intromissão e ejaculação e diminui o período de latência entre as ejaculações em ratos machos idosos (20–22 meses) tratados com ICA nas doses de 300 ou 750 mg/kg por 10 dias. Liu et al. relataram que ratos castrados tratados diariamente com ICA por um período de 4 semanas, com um período de washout de 7 dias, apresentaram hemodinâmica peniana superior no momento do teste funcional eretogênico em comparação com ratos castrados não tratados. A expressão de nNOS nos animais tratados com ICA foi maior do que a observada nos controles, semelhante aos resultados do nosso estudo. Curiosamente, neste estudo, a dose de 5 mg/kg produziu uma resposta de PIC mais forte em relação à dose de 1 mg/kg.
Além de um papel na fisiologia erétil, um estudo anterior sugeriu que a ICA demonstrou corrigir o hipogonadismo induzido pela exposição à ciclofosfamida em ratos. Zhang et al. relataram que uma concentração mais alta (200 mg/kg/dia por gavagem oral) de ICA de menor pureza (40%) foi utilizada por 7 dias após o tratamento com ciclofosfamida. Os roedores do grupo ICA apresentaram níveis séricos de testosterona mais elevados em comparação com animais não tratados com ciclofosfamida e animais tratados apenas com ciclofosfamida. Esses resultados contrastam com os resultados de Liu et al. (que não detectaram diferença nos níveis séricos de testosterona entre os animais tratados com ICA e os controles) e com os resultados do presente estudo, no qual a ICA em doses acima de 1 mg/kg pareceu ter um efeito supressor dependente da dose sobre a concentração sérica de testosterona. Diferenças na pureza e no intervalo de dosagem da ICA, bem como diferenças no método de ensaio, podem ter contribuído para essas discrepâncias.
Curiosamente, no único estudo anterior que demonstrou alterações na testosterona sérica com a ICA, não houve perturbações significativas nos níveis de LH e hormônio folículo-estimulante (FSH) em ratos em nenhum dos braços de tratamento; este resultado é semelhante ao nosso. Isso sugere que, independentemente de seus efeitos sobre a T sérica, a ICA não afeta a expressão hipofisária de LH. É possível que a ICA possa influenciar a atividade da aromatase ou da 5-alfa redutase in vivo e, assim, modular os níveis séricos de T sem impactar diretamente a secreção de LH. É evidente que mais pesquisas serão necessárias para elucidar o impacto e os mecanismos da lesão do nervo cavernoso e/ou da terapia com ICA no metabolismo da T.
Embora diferenças funcionais e moleculares tenham sido evidentes entre nossos grupos de estudo, diferenças estatisticamente significativas não foram observadas em várias áreas-chave; a ausência de diferença significativa nos resultados funcionais entre os grupos que receberam doses mais altas de ICA e os animais controle provavelmente é secundária ao pequeno número de animais e à consequente falta de poder estatístico. No entanto, é evidente que, mesmo com o pequeno número de animais, a dose baixa de ICA foi eficaz em produzir respostas eréteis melhoradas. Na ausência de um período de washout, não podemos atribuir definitivamente as diferenças observadas nas razões ICP/MAP a um efeito “reabilitador peniano”. É possível que a melhora observada tenha sido secundária a um efeito inibitório agudo da PDE5 da droga nos ratos do estudo. A meia-vida do ICA foi relatada como sendo de aproximadamente 1 hora. Dadas as concentrações relativamente baixas de ICA utilizadas em nosso estudo, parece provável que a porção remanescente de ICA nos tecidos dos animais no momento do teste fosse baixa; no entanto, não podemos descartar a possibilidade de que um efeito inibidor direto da PDE5 da droga tenha desempenhado um papel nas razões ICP/MAP observadas. Para abordar essa possibilidade, conduzimos um estudo complementar com dose única de ICA em seis ratos; os valores de ICP/MAP, AUC/MAP e expressão de nNOS (por Western blot) foram semelhantes nesses animais aos controles, sugerindo que a dose única de ICA tem eficácia marginal neste sistema modelo e apoiando um papel reabilitador do ICA neste sistema modelo.
A lesão do nervo cavernoso em nossos ratos foi associada a um aumento (embora não significativo) na testosterona sérica em relação aos ratos não lesionados. Isso difere de um estudo recente que sugeriu que a lesão do nervo cavernoso está associada a hipogonadismo de mediação central em ratos. Variações no método de medição, na linhagem de ratos e no mecanismo de lesão (transecção no outro estudo em comparação com esmagamento no nosso) podem ter contribuído para as diferenças observadas, e mais pesquisas serão necessárias para resolver essa discrepância. Além disso, não detectamos diferenças significativas na apoptose entre animais sham e aqueles com lesão do nervo cavernoso; isso contrasta com relatos anteriores nos quais a lesão do nervo cavernoso aumenta a expressão de marcadores apoptóticos. No entanto, em um estudo do curso temporal da apoptose após lesão do nervo cavernoso, User et al. relataram um aumento acentuado na apoptose após a lesão do nervo cavernoso que diminuiu para o nível basal ao longo do tempo, com a diferença na apoptose entre animais lesionados e não lesionados sendo estatisticamente significativa, porém modesta, aos 28 dias pós-lesão, com normalização dos marcadores apoptóticos aos 60 dias pós-lesão. Teorizamos que a apoptose mediada pela lesão do nervo cavernoso havia retornado a níveis próximos ao basal em todos os grupos no momento do ensaio funcional neste estudo, embora não possamos descartar a possibilidade de que uma lesão menos grave tenha sido infligida em nosso estudo em relação a outros estudos semelhantes.
Apesar de várias limitações importantes, nosso estudo contribui para as evidências crescentes de que a ICA pode desempenhar um papel salutar importante na manutenção da função erétil peniana. Diferentemente de estudos anteriores, nossos resultados sugerem que doses muito baixas de ICA (1 mg/kg neste estudo) podem ter eficácia semelhante ou até maior do que doses mais elevadas. É particularmente intrigante que a ICA tenha apresentado propriedades neurotróficas quando cultivada com fragmentos de nervo. Os inibidores da PDE5 são os agentes mais comumente utilizados para reabilitação peniana em humanos e, até onde sabemos, nenhum inibidor sintético da PDE5 demonstrou efeitos neurotróficos significativos, achado confirmado no braço da sildenafila de nossos experimentos de cultura de GPP. Se a ICA seria uma alternativa superior aos iPDE5 ainda precisa ser determinado; estudos adicionais desse interessante composto da natureza podem aprimorar nossa compreensão e capacidade de tratar homens com DE.
Conclusões
O tratamento diário com ICA purificada em baixa dose melhora os parâmetros hemodinâmicos penianos 4 semanas após lesão do nervo cavernoso em um modelo de DE em ratos. A melhora dos desfechos funcionais nos animais tratados com ICA está associada ao aumento do conteúdo de nNOS peniano e de músculo liso. Nossos achados são de interesse não apenas como validação desse tratamento tradicional para problemas eréteis, mas também como um novo meio potencialmente importante para estudar e tratar lesões nervosas em pacientes humanos.
Conflito de Interesse: Nenhum.
Referências
Icariina sobre o efeito relaxante do músculo liso do corpo cavernoso
Efeitos da icariina sobre a atividade da fosfodiesterase-5 in vitro e o nível de monofosfato de guanosina cíclico em células musculares lisas cavernosas
Inibição potente da fosfodiesterase-5 humana por derivados da icariina
As propriedades miméticas da testosterona da icariina
Efeitos protetores da icariina sobre a lesão de células endoteliais da veia umbilical humana induzida por H2O2 in vitro
Icariina aumenta a expressão da óxido nítrico sintase endotelial em células endoteliais humanas in vitro
Efeitos da icariina sobre a pressão intracavernosa e a pressão arterial sistêmica de ratos
Efeitos da icariina sobre a função erétil e a expressão de isoformas da óxido nítrico sintase em ratos castrados
Efeitos da icariina sobre a função erétil e a expressão de isoformas da óxido nítrico sintase no corpo cavernoso de modelo de disfunção erétil arteriogênica em ratos
Efeito da vardenafila noturna versus sob demanda na recuperação da função erétil em homens após prostatectomia radical com preservação bilateral dos nervos
Efeitos da icariina sobre as atividades da PDE5 específica para GMPc e da PDE4 específica para AMPc
FK1706 melhora a recuperação da função erétil após lesão por esmagamento bilateral do nervo cavernoso em ratos
Efeitos neurotróficos do fator de crescimento endotelial vascular e das neurotrofinas em gânglios pélvicos principais cultivados
Neurotomia cavernosa em ratos está associada ao início de uma condição manifesta de hipogonadismo
Icariina estimula a proliferação e diferenciação de osteoblastos humanos aumentando a produção da proteína morfogenética óssea 2
Extrato etanólico de Epimedium brevicornum atenua a disfunção ventricular esquerda e o remodelamento cardíaco por meio da regulação negativa da atividade das metaloproteinases de matriz 2 e 9 e da apoptose miocárdica em ratos com insuficiência cardíaca congestiva
Atividade antiosteoporótica da icariína em ratas ovariectomizadas
Icariína aumenta a sobrevivência neuronal após privação de oxigênio e glicose por meio do aumento de SIRT1
Efeito da suspensão lipídica do extrato de Epimedium koreanum Nakai sobre o comportamento sexual em ratos
Determinação de icariína e metabólitos em soro de rato por eletroforese capilar de zona: estudos farmacocinéticos em ratos após administração de icariína
As consequências funcionais e estruturais da lesão do nervo cavernoso são atenuadas pelo citrato de sildenafila
FK506 e preservação da função erétil no modelo de lesão do nervo cavernoso: dose e momento ideais
A terapia intracavernosa com fator de diferenciação de crescimento-5 melhora a recuperação da função erétil em um modelo de lesão do nervo cavernoso em ratos
Peso peniano e alterações específicas de subtipos celulares em um modelo de disfunção erétil pós-prostatectomia radical
Reabilitação peniana farmacológica pós-prostatectomia radical: padrões de prática entre os membros da Sociedade Internacional de Medicina Sexual
Declaração de Autoria
Categoria 1
Concepção e Desenho
Alan W. Shindel; Guiting Lin; Tom F. Lue; Zhong-Chen Xin
Aquisição de Dados
Alan W. Shindel; Thomas M. Fandel; Yun-Ching Huang; Lia Banie
Análise e Interpretação dos Dados
Alan W. Shindel; Benjamin N. Breyer; Ching-Shwun Lin; Tom F. Lue; Maurice M. Garcia
Categoria 2
Redação do Artigo
Alan W. Shindel
Revisão Crítica do Conteúdo Intelectual
Alan W. Shindel; Yun-Ching Huang; Thomas M. Fandel; Zhong-Chen Xin; Guiting Lin; Tom F. Lue; Ching-Shwun Lin; Lia Banie; Benjamin N. Breyer; Maurice M. Garcia
Categoria 3
Aprovação Final do Artigo Concluído
Alan W. Shindel; Tom F. Lue; Guiting Lin; Zhong-Chen Xin; Thomas M. Fandel; Yun-Ching Huang; Lia Banie; Ching-Shwun Lin; Benjamin N. Breyer; Maurice M. Garcia
Avaliação da PIC/PAM em ratos com lesão do nervo cavernoso. (A) razão média PIC/PAM em todos os grupos; (B) razão média ASC/PAM em todos os grupos (*P < 0,01 vs. grupo controle e grupo dose única, †P < 0,05 vs. grupo controle e grupo dose única).
ASC = área sob a curva; PIC = pressão intracavernosa; PAM = pressão arterial média.
Imuno-histoquímica para nNOS. (A) imagens representativas de ratos dos grupos sham, controle, ICA 1 mg/kg e ICA 10 mg/kg (setas indicam pequenas fibras com coloração positiva); (B) positividade média para nNOS nos grupos sham, controle, ICA 1 mg/kg e ICA 10 mg/kg (**P < 0,05 vs. todos os outros grupos, *P < 0,05 e #P < 0,08 vs. grupo controle).
hpf = campos de grande aumento; ICA = icariína.
Western blot para nNOS, eNOS e calponina. (A) Western blot normalizado para alfa-actina; (B) positividade média para nNOS; (C) positividade média para eNOS; (D) positividade média para calponina (*P < 0,05 vs. animais controle e dose única).
Imuno-histoquímica para eNOS. (A) imagens representativas de ratos dos grupos sham, controle, ICA 1 mg/kg e ICA 10 mg/kg; (B) média da positividade para eNOS nos grupos sham, controle, ICA 1 mg/kg e ICA 10 mg/kg (*P < 0,05 em relação aos animais controle).
ICA = icariina.
Imuno-histoquímica para calponina. (A) Imagens representativas de ratos dos grupos sham, controle, ICA 1 mg/kg e ICA 10 mg/kg. (B) média da positividade para calponina nos grupos sham, controle, ICA 1 mg/kg e ICA 10 mg/kg (*P < 0,05 em relação aos animais controle).
ICA = icariina.
Níveis de gonadotrofina e testosterona. (A) Nível sérico de testosterona (*P < 0,05 em relação aos animais do grupo ICA 10 mg/kg); (B) nível sérico de LH.
ICA = icariina.
Crescimento de neuritos em cultura celular sob várias condições de tratamento. (A) Imagens representativas de gânglios pélvicos principais cultivados no grupo controle (painéis superiores), ICA (coluna da esquerda) e sildenafila (coluna da direita). Setas e números indicam o comprimento e a posição do neurito mais longo; (B) comprimento médio dos neuritos nos vários grupos de tratamento (*P < 0,05 vs. controle, **P < 0,05 vs. controle e todos os grupos de sildenafila).
ICA = icariina.