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pmid: "33391503"
title: "Perfil metabolômico revela alterações de aminoácidos e carnitina como assinaturas metabólicas na psoríase."
authors: "Chen C, Hou G, Zeng C, Ren Y, Chen X, Peng C"
journal: "Theranostics"
pubdate: "2021"
doi: "10.7150/thno.51154"
source: "PMC Full Text"

Perfil metabolômico revela alterações de aminoácidos e carnitina como assinaturas metabólicas na psoríase.

Autores

Chen C, Hou G, Zeng C, Ren Y, Chen X, Peng C

Periodico

Theranostics (2021)

Conteudo

Perfil metabolômico revela alterações de aminoácidos e carnitinas como assinaturas metabólicas na psoríase
O perfil de metabólitos de alto rendimento oferece a oportunidade de revelar mecanismos metabólicos e identificar biomarcadores. A psoríase é uma doença inflamatória crônica imunomediada. No entanto, o papel do metabolismo na patogênese da psoríase permanece incerto.
Métodos: Amostras de plasma de indivíduos (45 com psoríase e 45 controles saudáveis pareados por sexo, idade e IMC) foram coletadas. Foram realizadas metabolômica não direcionada e metabolômica direcionada para aminoácidos ou carnitinas; em seguida, amostras de plasma de camundongos induzidos por imiquimode (IMQ) foram submetidas ao perfil metabolômico direcionado para aminoácidos e carnitinas. Citometria de fluxo foi utilizada para estudar o efeito da L-carnitina (LC(C0)) na inflamação psoriásica induzida por IMQ.
Resultados: Por meio da abordagem de metabolômica não direcionada, detectamos aminoácidos e carnitinas significativamente alterados em pacientes com psoríase. O perfil metabolômico direcionado para aminoácidos identificou 37 aminoácidos alterados na psoríase, dos quais 23 estavam marcadamente regulados positivamente, incluindo aminoácidos essenciais (EAAs) e aminoácidos de cadeia ramificada (BCAAs), enquanto glutamina, cisteína e asparagina estavam significativamente reguladas negativamente. O perfil metabolômico direcionado para carnitinas identificou 40 carnitinas significativamente alteradas, 14 das quais, incluindo palmitoilcarnitina (C16), estavam marcadamente reguladas negativamente na psoríase, enquanto hexanoilcarnitina (C6) e 3-OH-octadecenoilcarnitina (C18:1-OH) estavam significativamente reguladas positivamente. Curiosamente, os níveis de glutamina, asparagina e C16 correlacionaram-se negativamente com o escore PASI. Além disso, uma maior abundância de LC(C0) foi associada a uma redução marcante do espessamento epidérmico induzido por IMQ e da infiltração de células Th17 nas lesões cutâneas, indicando a suplementação de LC(C0) como uma terapia potencial para o tratamento da psoríase.
Conclusão: Nossos resultados sugerem que o metabolismo de aminoácidos e carnitinas está significativamente alterado na psoríase, especialmente o metabolismo de EAAs, BCAAs e LC(C0), que podem desempenhar papéis fundamentais na patogênese da psoríase.
Introdução
A psoríase é uma doença inflamatória mediada por células imunes, e acredita-se que um desequilíbrio de células T desempenhe um papel fundamental em sua patogênese. O eixo IL-23/IL-17A-Th17 é uma das vias mais críticas na patogênese da psoríase, coordenado por abundantes citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-17, TNF-α, IL-1β e IL-6. Evidências indicam que TNF-α e IL-1β facilitam o desenvolvimento de resistência à insulina ao elevar os níveis de insulina e colesterol HDL no sangue, e a resistência à insulina suprime a diferenciação de queratinócitos, resultando em proliferação persistente. Além disso, o eixo IL-23/Th17 tem potencial diabetogênico, e a psoríase foi identificada como um fator de risco para doenças metabólicas devido a vias patogênicas compartilhadas, incluindo o eixo IL-23/Th17.
A psoríase está frequentemente associada a outras doenças sistêmicas, como obesidade, diabetes ou resistência à insulina e dislipidemia sérica. Esses distúrbios metabólicos aumentam significativamente o risco de psoríase devido ao estado inflamatório crônico de baixo grau e estão associados a um pior prognóstico. Por exemplo, eles podem afetar negativamente a resposta clínica quando pacientes com psoríase recebem medicamentos biológicos. Curiosamente, foi relatado que pacientes com psoríase são mais propensos a desenvolver resistência à insulina do que indivíduos saudáveis, indicando que a psoríase pode ser, em certa medida, uma doença metabólica.

A metabolômica é uma técnica emergente que analisa os produtos finais do metabolismo. No entanto, a investigação da psoríase por metabolômica tem sido limitada. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) foi realizada para analisar os perfis metabólicos em lesões cutâneas psoriásicas, pele não lesionada e pele psoriásica após tratamento com corticosteroides. A análise mostrou que metabólitos, como glicose e mio-inositol, estavam significativamente alterados em pacientes com psoríase em comparação com a pele não lesionada e, após o tratamento, esses níveis de metabólitos retornaram ao normal. A metabolômica não direcionada (LC-MS) também foi realizada para medir as alterações de metabólitos na psoríase grave após tratamento anti-TNF-α. Vários aminoácidos, como prolina, arginina, glicina, treonina e aspartato, estavam intimamente associados ao tratamento anti-TNF-α em pacientes com psoríase.

A L-carnitina (LC), também conhecida como carnitina livre (C0), é considerada um nutriente condicionalmente essencial que desempenha um papel funcional no metabolismo energético e na oxidação de ácidos graxos. Recentemente, a deficiência de carnitina tem sido amplamente relatada em distúrbios como diabetes, câncer, desnutrição, sepse, envelhecimento e psoríase. Por exemplo, a LC(C0) pode servir como tratamento para a onico-paquidermo-periostite psoriásica infantil (POPP), e foi detectada melhora clínica nos sintomas da artrite psoriásica durante o tratamento para infertilidade com LC(C0). Essas duas observações indicaram uma potencial propriedade terapêutica da LC(C0) para a psoríase. Além disso, foi demonstrado que a carnitina possui importantes propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes, hipolipemiantes e de suporte a órgãos. No entanto, o papel específico do metabolismo da carnitina na patogênese da psoríase permanece incerto.

Neste estudo, realizamos o perfil metabolômico plasmático não direcionado e direcionado em pacientes com psoríase e em modelo murino de psoríase induzida por IMQ para explorar o papel do metabolismo na psoríase. Os achados mostram que o metabolismo de aminoácidos e carnitinas está significativamente alterado na psoríase, especialmente dos AAEs e AACRs, sugerindo que esse metabolismo alterado pode desempenhar um papel fundamental na patogênese da psoríase. Mais importante ainda, identificamos os papéis protetores da LC(C0) na patogênese da psoríase, fornecendo uma nova estratégia para o tratamento da psoríase.

Procedimentos Experimentais

Este estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa institucional local (IRB) (Hospital Xiangya, Universidade Central do Sul, IRB-201512526). Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque. Coletamos plasma de 90 indivíduos (45 pacientes com psoríase vulgar e 45 controles saudáveis pareados por sexo, idade e IMC). As características demográficas dos participantes estão resumidas na Tabela 1. Os critérios de inclusão abrangeram pacientes com psoríase recém-diagnosticada e não tratada, sem outras comorbidades metabólicas. Tanto os pacientes com psoríase quanto os controles saudáveis tinham mais de 18 anos de idade, forneceram consentimento informado por escrito e cederam amostras de sangue. Os critérios de exclusão incluíram o uso de medicamentos imunossupressores sistêmicos subcutâneos e intravenosos. Os pacientes foram avaliados clinicamente quanto ao subtipo de psoríase e ao escore PASI.

Perfil metabolômico não direcionado e análise de dados

A extração de metabólitos foi realizada principalmente de acordo com métodos previamente relatados. Resumidamente, amostras de 100 µL foram extraídas pela adição direta de 300 µL de metanol pré-resfriado. Após agitação em vórtex por 1 min e incubação a -20 °C por 2 h, as amostras foram centrifugadas por 20 min a 4.000 rpm, e o sobrenadante foi transferido para frascos de amostrador automático para análise por LC-MS. Uma amostra de controle de qualidade (CQ) foi preparada reunindo o mesmo volume de cada amostra para avaliar a reprodutibilidade da análise por LC-MS.
A análise foi realizada em um instrumento ACQUITY UPLC acoplado a um espectrômetro de massas Xevo G2-XS QTOF (Waters, EUA). A separação cromatográfica de todas as amostras foi realizada em uma coluna BEH C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 µm, Waters, EUA), e a temperatura da coluna foi mantida a 50 °C. O sistema UPLC foi operado com um programa de eluição por gradiente composto por água com 0,1% de ácido fórmico (fase móvel A) e metanol (fase móvel B). O gradiente linear foi otimizado da seguinte forma: 0-2 min, 0% B; 2-12 min, 0-100% B, com uma vazão de 0,4 mL/min. A análise por espectrometria de massas foi conduzida nos modos de íons positivos e negativos. Para garantir a exatidão das razões m/z, os valores de m/z de todos os íons adquiridos via QTOF/MS foram ajustados em tempo real pelo LockSpray. A leucina-encefalina foi selecionada como composto de massa de referência para o modo de íons positivos ([M + H] + = 556,2771) e para o modo de íons negativos ([M - H] - = 554,2615). Uma amostra de CQ foi injetada a cada dez amostras para monitorar a reprodutibilidade da plataforma analítica.
Os dados brutos foram importados para o software Progenesis QI (Waters, EUA) para processamento automático de dados. O fluxo de trabalho para processamento e análise de dados incluiu correção do tempo de retenção, configuração do desenho experimental, seleção de picos, normalização, deconvolução e identificação de compostos. Para as features (m/z extraídas com o tempo de retenção correspondente) extraídas pelo Progenesis QI, o metaX foi utilizado para análise estatística, incluindo análise de componentes principais (PCA), análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) e controle de qualidade. R2 e Q2, parâmetros da PLS-DA, foram 0,792 e 0,291, respectivamente, no modo positivo, com valor de p (R2) = 0 e valor de p (Q2) = 0, e no modo negativo, R2 = 0,839 e Q2 = 0,458, com valor de p (R2) = 0 e valor de p (Q2) = 0, respectivamente.
Para identificar as features detectadas nas amostras, a m/z exata foi primeiramente derivada para corresponder ao metabólito das bases de dados Metlin, biblioteca BGI (biblioteca interna de padrões MS/MS) e HMDB. Além disso, o Mummichog foi utilizado para aproveitar a organização das redes metabólicas para prever a atividade funcional diretamente das tabelas de features, contornando a identificação de metabólitos.

Camundongos e tratamentos

Camundongos BALB/c foram adquiridos da Hunan SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Hunan, China). Os camundongos foram criados e mantidos em condições livres de patógenos específicos (SPF) e receberam ração e água ad libitum. Camundongos pareados por idade e sexo foram utilizados em todos os experimentos, de acordo com o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O protocolo do estudo animal foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Xiangya (Central South University, China, #2015110134).
Camundongos BALB/c com 6 a 8 semanas de idade foram tratados com doses tópicas diárias de 62,5 mg de creme de IMQ a 5% (MedShine, cat. 120503, China), aplicado nas costas depiladas por 6 dias consecutivos. Um sistema de pontuação baseado no Índice de Área e Gravidade da Psoríase (PASI) clínico foi utilizado para avaliar a inflamação cutânea nas lesões de pele dos camundongos. Resumidamente, eritema, descamação e infiltração foram cada um classificados em uma escala de 0 a 4, como segue: 0, ausente; 1, leve; 2, moderado; 3, acentuado; e 4, grave. O nível de eritema foi pontuado usando uma tabela com tons de vermelho. A pontuação cumulativa serviu como medida da gravidade da inflamação (escala: 0-12). A inflamação semelhante à psoríase em camundongos foi induzida pelo tratamento com imiquimode (IMQ) por 3 (n = 6) ou 6 (n = 8) dias consecutivos, e os camundongos psoriásicos foram comparados com controles normais não tratados (n = 6). As amostras de pele dos camundongos foram coletadas e imediatamente fixadas em solução de paraformaldeído a 4% (Servicebio, cat. G1101, China) para coloração com hematoxilina e eosina (H&E), e a espessura epidérmica foi medida sob o microscópio. Os fenótipos dos modelos de camundongos psoriásicos são mostrados na Figura S1.

Quantificação de aminoácidos e acilcarnitinas

Os aminoácidos e acil-carnitinas no plasma humano e de camundongos foram medidos por cromatografia líquida de ultra performance acoplada à espectrometria de massas em tandem (UPLC-MS-MS). As amostras foram analisadas em um sistema QTRAP 5500 LC-MS/MS (SCIEX, Framingham, MA) equipado com um UPLC Waters (Waters, EUA).

Para a quantificação de aminoácidos, 40 μL de plasma foram misturados com 20 μL de padrão interno (IS) marcado com isótopo estável em ácido sulfossalicílico para precipitar proteínas, seguido de agitação em vórtice e centrifugação (4000 rpm, 4 °C, 20 min). A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna HSS T3 (100 × 2,1 mm, 1,8 µm, Waters, EUA), e a temperatura da coluna foi mantida a 40 °C. O sistema UPLC utilizou um programa de eluição por gradiente composto por água com 0,1% de ácido fórmico (fase móvel A) e acetonitrila (fase móvel B). O gradiente linear foi otimizado e foi o seguinte: 0,3-6 min, 2% a 40% B; 6-9 min, 40% B; 9-9,5 min, 40% a 90% B, com uma vazão de 0,5 mL/min. A calibração foi realizada adicionando-se quantidades diferentes de padrões de aminoácidos ao plasma. Os dados foram analisados usando o software MultiQuant (SCIEX, EUA).

Para a quantificação de acil-carnitinas, 40 μL de plasma foram misturados com 10 μL de padrão interno (IS) marcado com isótopo estável em acetonitrila/2-propanol/metanol 3:1:1 (v/v) para precipitar proteínas, seguido de agitação em vórtice e centrifugação (4000 rpm, 4 °C, 20 min). A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna HILIC (100 × 2,1 mm, 1,7 µm, Waters, EUA), e a temperatura da coluna foi mantida a 40 °C. O sistema UPLC utilizou um programa de eluição por gradiente composto por acetonitrila a 95% com 10 mM de formato de amônio (fase móvel A) e acetonitrila a 50% com 10 mM de formato de amônio (fase móvel B). O gradiente linear foi otimizado e foi o seguinte: 1-7 min, 95% a 35% B; 7-8 min, 35% B, com uma vazão de 0,5 mL/min. A calibração foi realizada adicionando-se quantidades diferentes de padrões de aminoácidos ao plasma. Os dados foram analisados usando o software MultiQuant (Sciex, EUA).

Tratamento de suplementação com L-carnitina (LC(C0))

Camundongos BALB/c com 6 a 8 semanas de idade foram tratados com L-carnitina (Sigma-Aldrich, cat. C0158, EUA) na dose de 1 g/kg/dia do dia 1 ao dia 18 por perfusão gástrica. IMQ foi aplicado topicamente no dorso raspado dos camundongos a partir do dia 13 por 6 dias consecutivos. Os camundongos foram fotografados e eutanasiados para análise das lesões cutâneas e do baço no dia 19. (Os camundongos foram divididos em 3 grupos: veículo (IMQ + veículo ig), LC (IMQ + LC ig) e não tratado (Controle)).

Processamento de tecidos

Lesões cutâneas de camundongos induzidos por IMQ foram cortadas em pequenos pedaços e digeridas em 5 mL de PBS contendo 2 mg/mL de colagenase tipo IV (Sigma-Aldrich, cat. V900893, EUA) e 1 mg/mL de dispase II (Sigma-Aldrich, cat. D4693, EUA) sob agitação a 37 °C por 90 min. A atividade enzimática foi interrompida utilizando meio com 10% de SFB. O tecido foi adicionalmente homogeneizado com uma seringa e filtrado através de um filtro celular de 40 μm. O filtro celular foi lavado com 20 mL de PBS, seguido de centrifugação (500 x g a 4 °C por 10 min). Suspensões de células únicas dos baços foram obtidas macerando os baços através de filtros celulares de 40 μm. O filtro celular foi lavado com 20 mL de PBS, seguido de centrifugação (500 x g a 4 °C por 5 min) e, em seguida, as hemácias foram lisadas utilizando uma solução de lise (BD Pharm Lyse™, cat. 555899, EUA). As células únicas foram então coradas com anticorpos fluorescentes para citometria de fluxo.

Citometria de Fluxo

Os anticorpos estão resumidos na Tabela S1. Primeiramente, o corante de viabilidade fixável Zombie Aqua™ foi utilizado para selecionar células vivas. Posteriormente, Trustain fcX anti-CD16/32 de camundongo foi utilizado para bloquear os receptores Fc das células de camundongo. Para a marcação de superfície, células únicas isoladas da pele ou do baço foram incubadas com anticorpos a 4 °C por 30 min, seguidas de lavagem e centrifugação (500 x g a 4 °C por 5 min). Para a marcação intracelular de citocinas (Th1 e Th17), as células foram reestimuladas em 100 μL de RPMI suplementado com Golgi-Plug (1:1000, BD, cat. 550529, EUA), PMA (50 ng/mL, Applichem, cat. MKCD3841, Alemanha) e ionomicina (750 ng/mL, Tocris, cat. 56092-81-0, Grã-Bretanha) por 4 a 6 h a 37 °C. Após a marcação de superfície, as células foram permeabilizadas e fixadas em 250 μL de BD Cytofix/Cytoperm™ de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, as células foram lavadas com tampão de permeabilização e coradas intracelularmente a 4 °C por 30 min em tampão de permeabilização. Após a marcação de superfície, as células foram fixadas e permeabilizadas para a marcação intranuclear (Tregs), utilizando o concentrado e diluente de fixação/permeabilização para Foxp3/fator de transcrição eBioscience da ThermoFisher. As células foram então incubadas com anticorpos anti-Foxp3 de camundongo/rato à temperatura ambiente por 40 min de acordo com as instruções do fabricante. A aquisição foi realizada com FACS Canto II (BD Biosciences). A análise por citometria de fluxo de células vivas e únicas foi realizada utilizando o software FlowJo (Tree Star).

Análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA) ou o R (http://www.R-project.org.) com vários pacotes, incluindo ggplot2 e dplyr. A significância das diferenças entre os grupos foi determinada pelo teste t de Student bicaudal não pareado ou ANOVA de uma via com teste post hoc de Dunnett quando as amostras não apresentavam distribuição normal. Todos os dados representam a média ± DP.

Resultados

Perfis de metabólitos no plasma de psoríase identificados por metabolômica não direcionada
No perfil metabolômico não direcionado, detectamos 5529 e 4289 características nos modos positivo e negativo, respectivamente. A análise de componentes principais (PCA) não mostrou diferença significativa entre os dois grupos, no entanto, as amostras de CQ agrupadas se agruparam em ambos os modos de íons positivo e negativo (Figura S2A), indicando que a autenticidade do LC-MS é adequada. Além disso, a análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA), um método supervisionado de análise multivariada de dados, foi conduzida para examinar as diferenças entre amostras de psoríase e controles saudáveis, e os resultados do modelo PLS-DA distinguiram claramente os grupos de psoríase e controle saudável nos modos positivo e negativo, conforme mostrado na Figura 1A-B. Os metabólitos diferencialmente expressos (Tabela S2) foram identificados por análise estatística (VIP ≥ 1 & p.adj < 0,05).

Para explorar as identidades e o enriquecimento funcional das características diferenciais, pesquisamos bancos de dados e redes metabólicas. Conforme mostrado nas Figuras 1C-D e Figuras S1B-C, as características diferenciais foram identificadas como alfa-aminoácidos e derivados, carnitinas e acilcarnitinas, ácido glutâmico e derivados, bem como outros compostos. A análise de vias foi realizada através do MetaboAnalyst, que mostrou que os metabólitos diferencialmente expressos em pacientes com psoríase estavam enriquecidos em vias incluindo a biossíntese de aminoacil-tRNA e o metabolismo de vários aminoácidos, como alanina, aspartato, glutamato, D-glutamina e D-glutamato, glutationa, arginina, prolina, cisteína e metionina (Figura S3). Esses resultados foram consistentes com estudo anterior. Além disso, a predição da rede metabólica validou os resultados da análise de enriquecimento funcional, revelando que o metabolismo no grupo de psoríase estava centrado no metabolismo da histidina e do triptofano (Tabela S2).

Perfis de aminoácidos em pacientes com psoríase e no modelo de camundongo com psoríase induzida por IMQ identificados por metabolômica direcionada a aminoácidos

Nosso perfil não direcionado revelou alterações significativas de aminoácidos no plasma de pacientes com psoríase, indicando que o metabolismo de aminoácidos pode desempenhar um papel importante na patogênese da psoríase. Portanto, conduzimos metabolômica direcionada a aminoácidos e identificamos 37 aminoácidos diferencialmente expressos (Figura S4A). Entre estes, 26 apresentaram alterações superiores a 1,5 vezes em pacientes com psoríase em comparação com indivíduos controle, incluindo 23 aminoácidos regulados positivamente e 3 regulados negativamente (Figura 2A-B).
O IMQ, um ligante de TLR-7/8, induz dermatite semelhante à psoríase em camundongos, mimetizando a patogênese da psoríase humana e a inflamação sistêmica, incluindo níveis elevados de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias do eixo IL-23/IL-17A-Th17. Analisamos os perfis de aminoácidos no modelo de dermatite semelhante à psoríase induzida por IMQ em camundongos por metabolômica direcionada a aminoácidos. Como mostrado na Figura 2C-D, encontramos 15 aminoácidos com níveis aumentados após o tratamento com IMQ, em grande parte consistentes com os resultados observados em pacientes humanos com psoríase. Entre esses 15 aminoácidos, 1-metilhistidina, homocitrulina, prolina, sarcosina, isoleucina e fosfoetanolamina continuaram a aumentar após 3 e 6 dias consecutivos de tratamento, enquanto ácido alfa-amino-n-butírico, arginina, ácido aspártico, cistina, histidina, lisina, fenilalanina, treonina e valina estavam aumentados após o tratamento por 3 dias, mas diminuíram no dia 6. No entanto, suas concentrações aos 6 dias foram maiores do que os níveis correspondentes no grupo controle (Figura 2D). Além disso, 37 aminoácidos com diferenças significativas no plasma de camundongos com dermatite semelhante à psoríase tratados com IMQ por 3 ou 6 dias consecutivos foram quantificados (Figura S4B).

Os aminoácidos com diferença significativa tanto em pacientes com psoríase quanto no modelo de dermatite semelhante à psoríase induzida por IMQ em camundongos incluíram glutamato, ácido aspártico, AEs (Figura 3A-B), ACRs (isoleucina, leucina e valina) (Figura 3A-B), fosfoserina (Pser), ornitina, outros aminoácidos hidrofóbicos, incluindo alanina e prolina, e os aminoácidos aromáticos (AAAs, fenilalanina e tirosina). Curiosamente, esses aminoácidos estão envolvidos em doenças metabólicas, incluindo obesidade e resistência à insulina, que estão associadas à psoríase.

Metabolômica direcionada à carnitina em pacientes com psoríase e no modelo de dermatite semelhante à psoríase induzida por IMQ em camundongos

O perfil não direcionado mostrou que os níveis de carnitina livre (C0) e butirilcarnitina (C4) estavam marcadamente diminuídos em pacientes com psoríase, e a via de beta-oxidação de ácidos graxos foi importante na patogênese da psoríase. Como a carnitina é uma substância energética essencial que participa da beta-oxidação de ácidos graxos, realizamos metabolômica direcionada à carnitina para investigar o papel das acilcarnitinas na psoríase e identificamos 40 acilcarnitinas com diferenças significativas (Figura S5A). Entre essas acilcarnitinas, 16 apresentaram alterações superiores a 1,5 vezes em pacientes com psoríase em relação aos indivíduos controle saudáveis, compreendendo 14 acilcarnitinas diminuídas e 2 aumentadas (Figura 4A-B).
No modelo de camundongo com psoríase induzida por IMQ, identificamos 34 acilcarnitinas (Figura S5B), das quais 11 foram expressas diferencialmente após o tratamento com IMQ (teste t, p<0,05), incluindo as espécies C10, C12 e C14. Os camundongos psoriásicos tratados com IMQ por 3 dias consecutivos apresentaram níveis mais elevados dessas acilcarnitinas do que os controles, enquanto aqueles tratados por 6 dias tiveram níveis mais baixos de acilcarnitinas do que os controles normais (Figura 4C-D). Esses achados sugeriram que perturbações metabólicas de análogos da carnitina semelhantes às observadas em pacientes com psoríase existem em camundongos com psoríase induzida por IMQ.
Correlação dos metabólitos plasmáticos identificados com a gravidade da psoríase
A gravidade da psoríase foi avaliada pelo escore PASI; portanto, exploramos a associação entre os metabólitos identificados e a gravidade da psoríase dividindo a coorte de psoríase em grupos leve (PASI ≤ 10, n = 25) e moderado-grave (PASI > 10, n = 20). A análise de correlação de Pearson dos escores PASI e os níveis de aminoácidos ou acilcarnitinas são apresentados na Figura 5A-B e na Tabela S3. Descobrimos que os níveis de glutamina, asparagina e C16 foram negativamente correlacionados com o escore PASI, enquanto houve uma correlação positiva com os níveis de alanina, carnosina, ornitina e fosfoserina (Pser) (Figura 5A-B). Esses dados ressaltaram os efeitos potencialmente benéficos da glutamina, asparagina e C16 na psoríase vulgar, fornecendo uma nova visão sobre a avaliação da gravidade da doença, diagnóstico e identificação de potenciais alvos terapêuticos na psoríase.
Em seguida, utilizamos a análise multivariada da curva característica de operação do receptor (ROC) para discriminar entre várias classes de aminoácidos, carnitina e acilcarnitinas. Como mostrado na Figura 5C e na Figura S6, a combinação de asparagina, carnosina e Pser foi correlacionada com o PASI, o que poderia identificar a psoríase com uma AUC acima de 0,98.
Atenuação significativa da dermatite semelhante à psoríase induzida por IMQ pela suplementação com L-Carnitina
Nossos resultados revelaram que as concentrações de LC(C0) e da maioria das espécies de acilcarnitinas estavam significativamente diminuídas no plasma de pacientes com psoríase em relação aos indivíduos controle (Figura 4A-B). Esses metabólitos também estavam diminuídos em camundongos nos quais a psoríase foi induzida pela aplicação tópica de IMQ por 6 dias consecutivos, em comparação com camundongos controle (Figura 4C-D). Essas observações foram consistentes com a possibilidade de que a LC(C0) possa ter potencial uso terapêutico na psoríase.
Para testar a hipótese de que a suplementação com LC(C0) modula a psoríase, realizamos um estudo de intervenção em camundongos. Tratamos camundongos psoriásicos induzidos por IMQ com LC(C0) para estudar seu metabolismo. O esquema de uso do medicamento e os registros diários de peso são exibidos na Figura 6A. Como esperado, em comparação com o veículo, a suplementação com LC(C0) diminuiu acentuadamente o espessamento epidérmico induzido por IMQ no dia 19 após a aplicação tópica de IMQ por 6 dias consecutivos (Figura 6B). A análise por citometria de fluxo mostrou que a suplementação com LC(C0) diminuiu acentuadamente a infiltração de células Th17 mediada por IMQ nas lesões cutâneas, mas não afetou as células Th1 (Figura 6C). A infiltração de células Treg nas lesões cutâneas também aumentou após a suplementação com LC(C0) (Figura 6D). Além disso, a suplementação com LC(C0) reduziu significativamente o acúmulo induzido por IMQ de células inflamatórias Gr-1+ infiltradas nas lesões cutâneas e no baço, especialmente do tipo monocítico de células inflamatórias Gr-1+, sem afetar o tipo granulocítico (Figura 6E). Nossos resultados identificaram um papel anti-inflamatório do LC(C0), que poderia aliviar a inflamação psoriásica induzida por IMQ.

Discussão

Estudos recentes revelaram que distúrbios metabólicos, incluindo obesidade abdominal e dislipidemia sérica, estavam positivamente correlacionados com o risco de psoríase devido ao seu “estado inflamatório crônico de baixo grau” envolvendo o eixo IL-23/Th17. A psoríase foi identificada como fator de risco para doenças metabólicas, e evidências crescentes fornecem suporte para essa observação epidemiológica. Por exemplo, níveis aumentados de IL-23 e IL-17 foram encontrados no diabetes, sugerindo seu papel sinérgico no dano às células β. Além disso, na obesidade, foram observadas concentrações elevadas de IL-23 e uma expansão da subpopulação Th17 no tecido adiposo. Assim, pode haver vias metabólicas compartilhadas de patogênese entre a psoríase e os distúrbios metabólicos. Nosso estudo concentrou-se nos aminoácidos significativamente alterados e no metabolismo da carnitina na psoríase em humanos e camundongos.
Perturbações do metabolismo de aminoácidos são comuns em distúrbios metabólicos e na psoríase. Os BCAAs são um grupo de EAAs que compreendem leucina, isoleucina e valina. Os EAAs, que raramente foram investigados na psoríase, só podem ser obtidos por meio da dieta e não podem ser sintetizados no corpo a partir de outros metabólitos. Níveis elevados de BCAA têm sido amplamente observados em humanos com condições associadas à obesidade. Consistente com as observações em doenças metabólicas, nossos resultados revelaram aumento de BCAAs circulantes no plasma de pacientes com psoríase e de camundongos psoriásicos tratados com IMQ (Figura 3). Também descobrimos que os níveis de EEA estavam acentuadamente elevados em humanos e camundongos (Figura 3). Assim, os distúrbios metabólicos podem ser fatores de risco para o desenvolvimento da psoríase.
Não está claro se os BCAAs circulantes podem servir como biomarcadores de distúrbios metabólicos e/ou são agentes causais desses distúrbios. Evidências crescentes indicam os papéis pró-inflamatórios dos BCAAs; por exemplo, os BCAAs promovem a disfunção endotelial por meio da inflamação mediada por NF-κB. Os BCAAs, especialmente a leucina, são ativadores do mTOR e podem promover estresse oxidativo e inflamação via ativação do mTORC1. Além disso, a suplementação com BCAAs suprime a ativação da Akt2 por vias dependentes de mTORC1 e mTORC2, e NF-κB e mTOR são alvos terapêuticos da psoríase. Os níveis significativamente elevados de BCAAs na psoríase observados no presente estudo sugerem que esses aminoácidos podem desempenhar papéis importantes na patogênese da psoríase, uma possibilidade que requer investigação adicional. Curiosamente, há evidências de que o direcionamento do catabolismo dos BCAAs pode ser usado como estratégia para tratar a resistência à insulina associada à obesidade, utilizando inibidores para restaurar o fluxo catabólico dos BCAAs ou reduzir a ingestão de proteínas (BCAAs).
Os alimentos mais ricos em BCAAs são carne, peixe, ovos e laticínios; portanto, pode ser benéfico para pacientes com psoríase limitar a ingestão dessas dietas ricas em proteínas. Foi relatado que pacientes com psoríase frequentemente apresentam hábitos alimentares desequilibrados, como maior ingestão de carne vermelha e gordura, mas menor ingestão de fibras alimentares, exacerbando a psoríase por meio da ativação da família de domínio de ligação a nucleotídeos e repetições ricas em leucina, da via TNF-α/IL-23/IL-17 e de espécies reativas de oxigênio. Portanto, estratégias nutricionais podem ser benéficas para aliviar os sintomas e a gravidade da psoríase.
Glutamina, um nutriente imunomodulador, é o aminoácido livre mais abundante no plasma e desempenha importantes funções metabólicas ao fornecer intermediários para o ciclo do ácido tricarboxílico (ciclo TCA). Células altamente proliferativas, como as células cancerígenas, são particularmente dependentes da glutamina para a biossíntese. Além disso, observou-se deficiência total de glutamina corporal em estados catabólicos, como trauma, infecção e sepse. Em consonância com um estudo anterior, encontramos níveis significativamente reduzidos de glutamina e níveis acentuadamente elevados de glutamato no plasma de pacientes com psoríase (Figura 2). Esses achados corroboram a hipótese de que as vias de ciclagem da glutamina estão proeminentemente envolvidas no desenvolvimento da psoríase vulgar. Ademais, uma forte correlação inversa foi relatada entre os níveis de glutamina e AACR em camundongos alimentados com glutamina e glutamato, revelando papéis distintos da glutamina em comparação aos AACR, que também foram destacados na coorte do Estudo do Coração de Framingham. Essas observações ressaltaram os efeitos potencialmente benéficos da glutamina sobre o risco cardiometabólico e mostraram que o glutamato pode conferir um risco metabólico adverso. Foi relatado que a suplementação parenteral de glutamina em ambiente de terapia intensiva reduziu a taxa de morbidade e mortalidade. Mais importante ainda, na psoríase, descobrimos que o nível de glutamina se correlacionou negativamente com o escore PASI (Figura 5A), apoiando fortemente nossa hipótese de que a suplementação de glutamina ou a inibição do acúmulo de glutamato é benéfica para pacientes com psoríase, pelo menos para aqueles com comorbidades metabólicas.

Além de realizar o perfil metabólico em pacientes com psoríase, investigamos, pela primeira vez, as alterações metabólicas de aminoácidos e carnitinas na inflamação psoriásica induzida por IMQ. Uma comparação da metabolômica de pacientes com psoríase com a de camundongos com inflamação psoriásica induzida por IMQ sugeriu que aminoácidos e carnitinas modulam o processo da psoríase e/ou servem como biomarcadores na psoríase, uma possibilidade que necessita de investigação adicional. De forma interessante, descobrimos que a suplementação com LC(C0) atenuou significativamente a inflamação semelhante à psoríase induzida por IMQ em camundongos (Figura 6), revelando seu papel anti-inflamatório na psoríase.
As deficiências em várias carnitinas e acilcarnitinas circulantes em pacientes com psoríase, conforme observado no presente estudo (Figura 4A-B), também podem ser explicadas pelo aumento da oxidação de ácidos graxos nas lesões cutâneas e pela atividade aumentada da carnitina palmitoiltransferase-1 (CPT-1) devido ao consumo energético rapidamente elevado das células em proliferação. A CPT-1 é a enzima-chave responsável pela taxa de oxidação de ácidos graxos de cadeia longa nas mitocôndrias, e foi relatado que a inibição da atividade da CPT-1 com etomoxir alivia a inflamação psoriásica. Consistente com essas observações, verificamos que os níveis das espécies C16, incluindo C16, C16-OH, C16:1, C16:1-OH, C16:2 e C16:2-OH, estavam reduzidos em pacientes com psoríase (Figura 4A-B). Mais importante ainda, encontramos uma correlação negativa entre C16 e o Escore PASI (Figura 5B), identificando C16 como um potencial marcador protetor na avaliação da gravidade da psoríase. Além disso, a carnitina-acilcarnitina translocase (CACT) e a carnitina palmitoiltransferase-2 (CPT-2), localizadas na membrana mitocondrial interna, também podem ser alvos terapêuticos promissores para prevenir a translocação e a transformação das acilcarnitinas, respectivamente.

Conclusão

Nosso estudo demonstra o valor potencial da integração de dados clínicos, experimentais e metabolômicos de pacientes com psoríase vulgar e camundongos com psoríase induzida por IMQ, e da realização de fenotipagem detalhada. Nossos resultados sugerem que o metabolismo de aminoácidos, especialmente dos EAAs e BCAAs, e da carnitina está significativamente alterado na psoríase e pode desempenhar papéis-chave na patogênese da doença. Mais estudos são necessários para elucidar se níveis elevados de EAAs, BCAAs e glutamato, glutamina reduzida e níveis significativamente diminuídos de carnitina e acilcarnitinas podem prever o risco de psoríase e para explorar os mecanismos subjacentes.

Material Suplementar

Abreviaturas
IMQ
imiquimod
EAAs
aminoácidos essenciais
BCAAs
aminoácidos de cadeia ramificada
C16
palmitoilcarnitina
LC(C0)
L-carnitina (carnitina livre)
Escore PASI
índice de Área e Gravidade da Psoríase (PASI)
Imunologia da psoríase
Papéis diferenciais da sinalização mTOR-STAT3 na função efetora das células T gama-delta dérmicas na inflamação cutânea
Distúrbios lipídicos na psoríase: uma atualização
A interleucina-1beta interfere na homeostase epidérmica por meio da indução de resistência à insulina: implicações para a patogênese da psoríase
Papel preventivo das células T reguladoras produtoras de interleucina-17 do tipo 17 (Treg 17) no diabetes tipo 1 em camundongos diabéticos não obesos
O papel da via interleucina-23/Th17 na comorbidade cardiometabólica associada à psoríase
Intercomunicação de células imunes no diabetes tipo 1
Aumento da atividade do eixo pró-inflamatório interleucina-23/interleucina-17 em mulheres obesas
Síndrome metabólica e risco de psoríase incidente: dados prospectivos do Estudo HUNT, Noruega
A síndrome metabólica está associada a um risco aumentado de psoríase: um estudo de base populacional nacional
O índice de massa corporal prediz a descontinuação por ineficácia e o sexo feminino prediz a descontinuação por efeitos colaterais em pacientes com psoríase tratados com adalimumabe, etanercepte ou ustequinumabe na prática diária: um estudo prospectivo, comparativo e de longa duração de sobrevida do medicamento do registro BioCAPTURE
A quemerina sérica está aumentada em pacientes com psoríase em placas crônica e se normaliza após o tratamento com infliximabe
Pacientes com psoríase são resistentes à insulina
Nrf2 e HIF1alfa convergem para a reprogramação metabólica induzida por arsênio e a formação de células-tronco cancerosas
O sinal intrínseco do tumor CD47 regula a glicólise e promove o crescimento e a metástase de células de câncer colorretal
O partenolídeo melhora a inflamação do cólon através da regulação do equilíbrio Treg/Th17 de maneira dependente da microbiota intestinal
A reína modula o metabolismo das purinas do hospedeiro no intestino através da microbiota intestinal e melhora a colite experimental
Alterações metabólicas na pele psoriásica sob tratamento com corticosteroide tópico
A metabolômica por LC-MS de pacientes com psoríase revela aumentos dependentes da gravidade da doença nos aminoácidos circulantes que são melhorados pelo tratamento anti-TNFalfa
Papel da carnitina na doença
A análise metabólica da psoríase identifica os metabólitos associados, fornecendo modelos computacionais para o monitoramento da doença
L-carnitina e caquexia do câncer: aspectos clínicos e experimentais
Carnitina: uma opção terapêutica para onico-paquidermo-periostite psoriásica infantil (POPP)
Melhora clínica dos sintomas da artrite psoriásica durante o tratamento da infertilidade com carnitina
A L-carnitina, um componente da dieta e ligante do transportador de cátions orgânicos OCTN, exibe propriedades imunossupressoras e suprime a inflamação intestinal
Procedimentos para perfil metabólico em larga escala de soro e plasma usando cromatografia gasosa e cromatografia líquida acopladas à espectrometria de massas
metaX: um software flexível e abrangente para processamento de dados de metabolômica
METLIN: um banco de dados de espectros de massa de metabólitos
HMDB 4.0: o banco de dados do metaboloma humano para 2018
Prevendo a atividade de rede a partir de metabolômica de alto rendimento
A inflamação cutânea semelhante à psoríase induzida por imiquimode em camundongos é mediada pelo eixo IL-23/IL-17
Usando o MetaboAnalyst 3.0 para análise abrangente de dados de metabolômica
Exploração de biomarcadores candidatos para psoríase humana com base na metabolômica sérica por cromatografia gasosa-espectrometria de massas
Dieta rica em gordura exacerba a inflamação cutânea psoriásica precoce independentemente da obesidade: ácidos graxos saturados como atores-chave
A psoríase induzida por imiquimode em camundongos depende da sinalização de IL-17 dos queratinócitos
A di-hidroartemisinina melhora a inflamação cutânea psoriásica e sua recidiva ao diminuir a memória de células T CD8(+) em camundongos selvagens e humanizados
Metabolômica e doenças metabólicas: onde estamos?
Níveis plasmáticos de aminoácidos e secreção de insulina na obesidade
O perfil de metabólitos identifica vias associadas ao risco metabólico em humanos
Aminoácidos de cadeia ramificada na doença
Aminoácidos de cadeia ramificada promovem disfunção endotelial por meio do aumento da geração de espécies reativas de oxigênio e inflamação
Papel imunomodulador dos aminoácidos de cadeia ramificada
Alta concentração de aminoácidos de cadeia ramificada promove estresse oxidativo, inflamação e migração de células mononucleares do sangue periférico humano via ativação de mTORC1
Aminoácidos de cadeia ramificada exacerbam distúrbios metabólicos hepáticos de glicose e lipídios relacionados à obesidade atenuando a sinalização de Akt2
Direcionamento do catabolismo de BCAAs para tratar a resistência à insulina associada à obesidade
Nutrição: um fator dietético ambiental chave na gravidade clínica e no risco cardiometabólico em pacientes do sexo masculino com psoríase avaliados por questionário de frequência alimentar de 7 dias
Uma dieta ocidental, mas não uma dieta rica em gordura e pobre em açúcar, predispõe camundongos a uma maior suscetibilidade à dermatite psoriasiforme induzida por imiquimode
Nutrição e psoríase: existe alguma associação entre a gravidade da doença e a adesão à dieta mediterrânea?
Nutrição e psoríase
Efeitos não nutritivos da glutamina
As respostas das células T inflamatórias dependem da facilitação da captação de glutamina pelo transportador de aminoácidos ASCT2 e da ativação da quinase mTORC1
Fome versus fartura: compreendendo o metabolismo dos tumores in vivo
Glutamina exógena: as evidências clínicas
Metabolômica na doença psoriásica: estudo piloto revela diferenças de metabólitos na psoríase e na artrite psoriásica
Uma nova abordagem terapêutica para tratar a psoríase pela inibição da oxidação de ácidos graxos pelo Etomoxir
Análise de perfil metabolômico não direcionado para plasma humano. Gráficos de escores PLS-DA dos grupos saudável e psoríase em (A) modo positivo e (B) modo negativo. Gráficos de validação obtidos a partir de 200 testes de permutação em (A) modo positivo (R2 = 0.791, Q2 = 0.291) e (B) modo negativo (R2 = 0.839, Q2 = 0.458). (C e D) Anotação do perfil metabolômico usando busca em banco de dados e análise de rede metabólica para explorar a identificação correspondente e o enriquecimento funcional.
O perfil metabolômico direcionado a aminoácidos foi examinado em plasma humano e de camundongos. (A) Distribuição da mudança de vezes (fold change) de 37 aminoácidos no grupo psoríase versus saudável. (B) Mapa de calor dos aminoácidos diferenciais quantificados no plasma humano. (C) Mapa de calor dos aminoácidos diferenciais no modelo de camundongo induzido por IMQ nos pontos de tempo inicial, 3 dias, 6 dias. (D) Distribuição da concentração dos aminoácidos diferenciais no modelo de camundongo induzido por IMQ ao longo dos três pontos de tempo.
Sete aminoácidos estão significativamente alterados tanto no plasma humano quanto no de camundongos. Boxplot dos 7 aminoácidos diferenciais, incluindo lisina, triptofano, fenilalanina, treonina e BCAAs (isoleucina, leucina e valina), no plasma humano (A) e de camundongos (B).
As acilcarnitinas são quantificadas no plasma de humanos e camundongos. (A) Distribuição da mudança de vezes (fold change) das acilcarnitinas no grupo psoríase versus saudável. (B) Mapa de calor das acilcarnitinas diferenciais quantificadas no plasma humano. (C) Mapa de calor das acilcarnitinas diferenciais no modelo de camundongo induzido por IMQ nos pontos de tempo inicial, 3 dias, 6 dias. (D) Distribuição da concentração das acilcarnitinas diferenciais no modelo de camundongo induzido por IMQ ao longo dos três pontos de tempo.

Análise de biomarcadores dos aminoácidos e acilcarnitinas com a gravidade da psoríase. (A e B) Distribuição dos coeficientes de correlação de Pearson entre o escore PASI e aminoácidos ou acilcarnitina. (C) Curva característica de operação do receptor (ROC) baseada nos aminoácidos selecionados usando análise única e combinada.

A suplementação com L-carnitina atenua significativamente o espessamento epidérmico induzido por IMQ através da regulação negativa das células Th17 e da infiltração de células inflamatórias Gr-1+. (A) Registro diário de peso e esquema específico de uso do fármaco. (B) Coloração H&E da pele do dorso de camundongos que receberam veículo por via intragástrica (IMQ + veículo) ou L-carnitina (IMQ + LC) ou não tratados (Controle). (É apresentado um camundongo representativo de cada grupo, n = 5-7 camundongos por grupo). Barras de escala: 100 μm. Os dados da análise estatística são mostrados no painel inferior esquerdo. Painéis representativos de citometria de fluxo para quantificação de células Th1 e Th17 (C), células Treg (D) em lesões cutâneas de camundongos BALB/c (n = 5-7 camundongos por grupo). Os dados da análise estatística são mostrados no painel direito. (E) Painéis representativos de citometria de fluxo para quantificação de células inflamatórias Gr-1+ no baço e lesões cutâneas de camundongos BALB/c (n = 5-7 camundongos por grupo). As células Gr-1+ foram selecionadas a partir de células CD45+. Os dados da análise estatística são mostrados no painel direito. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001, ns, não significativo. Foi utilizada ANOVA de uma via com teste post hoc de Dunnett.

Dados demográficos dos pacientes com psoríase e indivíduos controle saudáveis

Características	Pacientes com Psoríase	Indivíduos Controle Saudáveis	Valor de P
Número	45	45	1
Idade em anos	40,64±12,00	39,42±8,95	0,37
Gênero	25 homens, 20 mulheres	24 homens, 21 mulheres	1
IMC	22,03±3,20	22,38±4,01	0,97
Raça/etnia	100% chineses	100% chineses	1
Escore PASI	10,11±7,46	N/A	<0,001

Abreviaturas: N/A, não se aplica; PASI, Índice de Área e Gravidade da Psoríase; IMC, Índice de Massa Corporal. Os valores são apresentados como médias ± desvio padrão. O valor de P foi calculado pelo teste de Wilcoxon não pareado.