pmid: "39091264"
title: "L-Carnitina alivia a fibrose do músculo esquelético relacionada à caquexia ao induzir a deltex E3 ubiquitina ligase 3L a regular negativamente o eixo Runx2/COL1A1."
authors: "Lu Z, Wang L, Huo Z, Li N, Tong N, Chong F, Liu J, Zhang Y, Xu H"
journal: "Journal of cachexia, sarcopenia and muscle"
pubdate: "2024 Oct"
doi: "10.1002/jcsm.13544"
source: "PMC Full Text"

L-Carnitina alivia a fibrose do músculo esquelético relacionada à caquexia ao induzir a deltex E3 ubiquitina ligase 3L a regular negativamente o eixo Runx2/COL1A1.

Autores

Lu Z, Wang L, Huo Z, Li N, Tong N, Chong F, Liu J, Zhang Y, Xu H

Periodico

Journal of cachexia, sarcopenia and muscle (2024 Oct)

Conteudo

l-Carnitina alivia a fibrose muscular esquelética relacionada à caquexia ao induzir a deltex E3 ubiquitina ligase 3L a regular negativamente o eixo Runx2/COL1A1
Resumo
Introdução
A fibrose muscular esquelética (FME) induzida pela caquexia do câncer prejudica a regeneração muscular, altera a estrutura e a função muscular, reduz a eficácia dos fármacos anticâncer, diminui a qualidade de vida do paciente e encurta a sobrevida global. O fator de transcrição 2 da família RUNX (Runx2), um fator de transcrição, e a cadeia alfa 1 do colágeno tipo I (COL1A1), o principal constituinte da FME, foram previamente associados, tendo sido demonstrado que o Runx2 modula diretamente os níveis de mRNA de COL1A1. A l-Carnitina, um marcador da caquexia do câncer, pode aliviar a fibrose em modelos hepáticos e renais; no entanto, seu papel na fibrose associada à caquexia do câncer e o envolvimento do Runx2 nesse processo permanecem inexplorados.
Métodos
Camundongos C57 fêmeas (48 semanas de idade) foram inoculados subcutaneamente com células MC38 para estabelecer um modelo de caquexia do câncer. Uma dose de 5 mg/kg de l-carnitina ou um volume equivalente de água foi administrada por 14 dias via gavagem oral, seguida de avaliações da função muscular (força de preensão) e fibrose. Para elucidar a interação entre o eixo deltex E3 ubiquitina ligase 3L (DTX3L)/Runx2/COL1A1 e a fibrose em células NIH/3T3 estimuladas com fator de crescimento transformador beta 1, um conjunto de técnicas moleculares, incluindo PCR quantitativa em tempo real, análise de western blot, co-imunoprecipitação, docagem molecular, imunofluorescência e ensaios Duolink, foi utilizado. A relevância do eixo DTX3L/Runx2/COL1A1 no gastrocnêmio também foi explorada no modelo in vivo.
Resultados
A suplementação com l-carnitina reduziu os declínios induzidos pela caquexia do câncer na força de preensão (>88,2%, P < 0,05) e na área de fibras colágenas no gastrocnêmio (>57,9%, P < 0,05). Na dose de 5 mg/kg, a l-carnitina também suprimiu a expressão proteica de COL1A1 e actina de músculo liso alfa (α-SMA), que são marcadores de FME e miofibroblastos. Análises do banco de dados TRRUST indicaram que o Runx2 regula tanto COL1A1 quanto COL1A2. In vitro, a l-carnitina diminuiu os níveis proteicos de Runx2 e promoveu sua ubiquitinação. A superexpressão de Runx2 aboliu os efeitos da l-carnitina sobre COL1A1 e α-SMA. Ensaios de co-imunoprecipitação, docagem molecular, imunofluorescência e Duolink confirmaram uma interação entre DTX3L e Runx2, com a l-carnitina potencializando essa interação para promover a ubiquitinação de Runx2. A suplementação com l-carnitina restaurou os níveis de DTX3L para aqueles observados em condições não caquéticas, tanto in vitro quanto in vivo. O silenciamento de DTX3L aboliu os efeitos da l-carnitina sobre Runx2, COL1A1 e α-SMA in vitro. A expressão de DTX3L foi correlacionada negativamente com os níveis de Runx2 e COL1A1 em células NIH/3T3 não tratadas.
Conclusões
Este estudo revelou uma ligação anteriormente não reconhecida entre Runx2 e DTX3L na SMF e demonstrou que a l-carnitina exerceu um impacto terapêutico significativo na SMF associada à caquexia do câncer, potencialmente por meio da regulação positiva de DTX3L.

Introdução

A caquexia do câncer é uma síndrome multifatorial caracterizada por uma perda contínua de massa muscular esquelética. Notavelmente, a redução da massa muscular também está associada ao acúmulo de matriz extracelular (ECM), que é sintetizada por fibroblastos, resultando em aumento do tecido conjuntivo fibroso e diminuição das células parenquimatosas. O acúmulo excessivo de ECM resulta em fibrose muscular esquelética (SMF), que leva a danos estruturais e disfunção do músculo, podendo se tornar fatal. Reforçando a importância da SMF, a taxa de sobrevida pós-operatória de pacientes com câncer de pâncreas e caquexia que apresentavam alta SMF foi menor do que a de pacientes com baixa SMF. O aumento da SMF em pacientes com caquexia do câncer é acompanhado por um aumento do espaço endometrial, o que não é consistente em pacientes com câncer não caquéticos. S1 Assim, estudar a SMF é crucial para melhor identificar a caquexia e monitorar sua progressão.

Aconselhamento dietético, suporte nutricional adequado e exercício físico são atualmente os pilares do tratamento para a caquexia do câncer. Uma revisão sistemática dos efeitos de diferentes minerais, vitaminas e outros suplementos na caquexia do câncer, realizada pelo European Palliative Care Research Centre, mostrou que apenas a l-carnitina (LC) foi capaz de aumentar a sobrevida mediana de pacientes com câncer de pâncreas. Além disso, a diminuição do nível sérico de LC foi considerada um biomarcador de sarcopenia, definida como a perda de massa, qualidade e função muscular esquelética em pacientes com câncer. A sarcopenia causada por medicamentos anticâncer também pode ser reduzida pela LC, e foi sugerido que o sorafenibe pode inibir a absorção de carnitina para induzir sarcopenia. Shang et al. mostraram que a redução da SMF pode atenuar a sarcopenia em camundongos idosos. Muitos estudos demonstraram que a LC pode reduzir a ECM em pacientes com doenças hepáticas, renais e cardíacas. No entanto, os efeitos da LC na SMF associada à caquexia do câncer não são claros. A suplementação com LC pode representar uma estratégia potencial para prevenir ou tratar a fibrose relacionada à caquexia do câncer.
A cadeia alfa 1 do colágeno tipo I (COL1A1) é um componente estrutural fundamental da MEC e o principal constituinte da FME. Stilhano et al. demonstraram que a inibição da expressão de COL1A1 atenuou a degeneração do músculo esquelético. O nintedanibe, um fármaco inibidor da EndMT, mostrou melhorar a função do músculo esquelético ao diminuir a expressão de genes relacionados à FME, como COL1A1. Esses estudos sugerem que a redução da expressão de COL1A1 pode atenuar a FME e, assim, reduzir a perda muscular e a diminuição da força muscular causadas pela caquexia do câncer. O fator de transcrição 2 da família RUNX (Runx2) é um fator de transcrição considerado um marcador osteogênico e um alvo terapêutico promissor para tumores malignos. S2 Ducy et al. mostraram que o Runx2 regulou diretamente o nível de mRNA de COL1A1. Outro estudo indicou que a expressão de Runx2 está aumentada durante a atrofia muscular por desnervação. Pesquisas recentes demonstraram que o Runx2 promove fibrose aórtica e da valva aórtica em modelos de diabetes tipo 2 e envelhecimento. S3 , S4 O fator de crescimento transformador beta (TGF‐β1), um importante indutor de fibrose, é secretado por células cancerosas e promove a expressão e a função do Runx2. Assim, pode haver uma relação entre TGF‐β1, Runx2 e COL1A1 relacionada à FME associada à caquexia do câncer.
A Deltex E3 ubiquitina ligase 3-like (DTX3L) pertence à família Deltex de ubiquitinases E3. As pesquisas anteriores sobre DTX3L concentraram-se principalmente em tumores, nos quais foi demonstrado seu envolvimento na sobrevivência, proliferação, apoptose, metástase e reparo do DNA de células cancerosas. Recentemente, vários estudos mostraram que a expressão de DTX3L está associada a doenças inflamatórias. S5 Nossa pesquisa anterior mostrou que a LC atenua a diminuição da massa muscular esquelética e a inflamação induzidas pela caquexia em camundongos e ativa a via AKT (proteína quinase B). Em apoio a essa observação, Hu et al. mostraram que o silenciamento de DTX3L inibe a via AKT. No entanto, os efeitos da LC sobre DTX3L, o papel da DTX3L na fibrose e sua relação com a FME associada à caquexia do câncer são atualmente desconhecidos.
Neste estudo, exploramos se a LC poderia atenuar a FME e se os mecanismos envolviam DTX3L, Runx2 e COL1A1. Acreditamos que nossos achados possam fornecer novos conhecimentos sobre a caquexia do câncer e os potenciais benefícios da suplementação com LC.
Métodos
Modelo murino de caquexia
Experimentos com camundongos caquéticos foram conduzidos de acordo com um protocolo revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica do Exército. O estudo seguiu todas as regulamentações relevantes sobre pesquisa animal. Camundongos fêmeas BALB/c nude (6 semanas de idade) e camundongos C57 (44–48 semanas de idade) foram obtidos das instalações de criação de animais da Universidade Médica do Exército (Chongqing, China). O modelo de caquexia em camundongos nude foi descrito anteriormente. Resumidamente, seis camundongos fêmeas nude foram aleatoriamente designados para os grupos controle (três) e LC (três) com base no peso corporal, e o modelo de caquexia por câncer foi estabelecido pelo transplante subcutâneo de 5 × 10^6 células CT26 nos flancos esquerdos desses camundongos. Dezesseis camundongos C57 foram aclimatados às instalações de animais por 1 semana e, em seguida, aleatoriamente designados para um grupo normal (quatro), MC38 (seis) ou MC38 + LC (seis) com base no peso corporal. Um total de 5 × 10^6 células MC38 em 0,1 mL de meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) sem soro fetal bovino (FBS) foi injetado subcutaneamente na região inguinal direita de cada camundongo C57 para induzir caquexia por câncer nesses camundongos. O tratamento (água destilada ou 5 mg/kg de LC) foi administrado por gavagem oral diariamente durante 14 dias. O peso corporal e o tamanho do tumor foram registrados a cada 3 dias (Figura S1 A).

Linhagens celulares e modelos celulares
As células CT26, HEK 293 e NIH/3T3 foram adquiridas da Guangzhou Cellcook Biotech. As células MC38 foram obtidas do Professor Ye Lilin da Universidade Médica do Exército. As células MC38, CT26, HEK 293 e NIH/3T3 foram cultivadas em incubadora a 37°C em atmosfera de 5% de CO2. As células MC38, CT26 e HEK 293 foram mantidas em DMEM de alta glicose suplementado com 10% de FBS. As células NIH/3T3 foram mantidas em DMEM de alta glicose suplementado com 10% de soro bovino neonatal (NBS). A secreção de TGF-β pelas células cancerosas contribui para o início da fibrose em pacientes com caquexia por câncer. As células NIH/3T3 foram inoculadas em frascos de cultura T25 e tratadas com uma concentração final de 10 ng/mL de TGF-β1 (PeproTech, EUA) por 24 h (Figura S1 B).

Avaliação da força de preensão do camundongo
Um camundongo foi colocado na plataforma de um medidor de força de preensão (Ugo Basile, tipo 47200, Itália), segurado pela cauda e puxado suavemente para trás com força uniforme em linha reta. À medida que o camundongo era movido para trás, seus membros agarravam a placa de preensão até que a força de tração excedesse sua força de preensão. O visor mostrava a preensão máxima. A média das três tentativas repetidas foi registrada como a força muscular do camundongo.

Análise de sequenciamento de RNA
O RNA total foi extraído do músculo gastrocnêmio dos dois grupos de camundongos nude usando um kit comercial, e a análise de sequenciamento subsequente foi realizada pela Majorbio (Xangai). O limiar para genes diferencialmente expressos (DEGs) foi uma mudança de vezes (fold change) > 2 e um valor de P < 0,05 pelo DESeq2.

Histopatologia do músculo gastrocnêmio
Os músculos gastrocnêmios foram fixados em solução de paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,2 mol/L, seguida de lavagem em PBS e posterior coloração com solução de hematoxilina e eosina (HE). Em seguida, as secções musculares foram fotografadas utilizando o software ImageJ.
Coloração com Sirius red
Os músculos gastrocnêmios foram corados utilizando um Kit de Coloração Sirius Red (Double Jane; Xangai, China). O músculo gastrocnêmio da pata traseira proximal ao tumor foi removido, seccionado em parafina e, em seguida, tratado com hematoxilina férrica, Sirius red, ácido acético a 0,2%, álcool anidro, xileno e xileno de poliestireno e ftalato de dibutila. Um microscópio foi utilizado para examinar o tecido com ampliação de ×100. O software Image Pro Plus (Media Cybernetics, EUA) foi utilizado para medir a intensidade da coloração com Sirius red.
Transfecção de plasmídeos e RNAs de interferência curtos
Nos experimentos de superexpressão de GFP‐DTX3L ou Flag‐Runx2, o plasmídeo vazio foi utilizado para transfecção simulada. Para os ensaios de knockdown gênico, o RNA de interferência curto controle embaralhado (siRNA) e o DTX3L‐siRNA foram produzidos pela RiboBio Company (Xangai, China). A transfecção de plasmídeos e siRNA foi realizada de acordo com as instruções do fabricante para Lipofectamine 3000 (L3000015, Invitrogen). Resumidamente, 7,5 μL de Lipofectamine 3000 foram adicionados a 250 μL de meio Opti‐MEM (31985‐070, Gibco). Em seguida, 5 μg de cDNA ou 50 nmol de siRNA, 10 μL de P300 e 250 μL de meio Opti‐MEM foram adicionados a um novo tubo Eppendorf (EP) de 1,5 mL. A mistura de Lipofectamine 3000 e plasmídeo foi combinada na proporção de 1:1. Após 10–15 min à temperatura ambiente, 250 μL da mistura foram adicionados a cada placa de seis poços contendo células, que foram incubadas a 37°C por 24 h. As sequências de cDNA e siRNA para os genes alvo estão listadas na Tabela S1.
Ensaio de imunofluorescência
Os ensaios de imunofluorescência foram realizados de acordo com o protocolo padrão, conforme descrito anteriormente. S6 As células HEK 293 foram cultivadas em lamínulas e transfectadas com os plasmídeos GFP‐DTX3L e Flag‐Runx2 por 48 h. Após lavagem em PBS, as células foram fixadas por 15 min em paraformaldeído a 4%. As células foram permeabilizadas em Triton X-100 a 0,1%, lavadas e bloqueadas com soro de cabra por 30 min. Após o bloqueio, as células foram incubadas com um anticorpo anti‐Flag de coelho durante a noite a 4°C, seguidas de lavagem com PBS e incubação com um anticorpo secundário conjugado com Cy3 por 2 h a 37°C. As lamínulas foram então incubadas com 1 μg/mL de cloridrato de 4′,6‐diamidino‐2‐fenilindol (DAPI) por 5 min. Por fim, as lamínulas foram lavadas e montadas utilizando meio de montagem aquoso (Santa Cruz, SC‐24941). Controles negativos específicos para isotipo foram incluídos em cada experimento de coloração. As células coradas foram montadas e visualizadas em um Leica Stellaris STED (Leica TCS SP5, Alemanha). Os anticorpos utilizados estão listados na Tabela S2.
Ensaio Duolink
Os processos anteriores ao bloqueio foram os mesmos da imunofluorescência padrão, conforme descrito acima. No entanto, para os ensaios Duolink, a lamínula foi bloqueada com Duolink® Blocking Solution (Sigma Aldrich, DUO9210) por 60 min a 37°C e, em seguida, incubada com um anticorpo anti-Flag de coelho e um anticorpo anti-GFP de camundongo (Beyotime Biotechnology) durante a noite a 4°C. Em seguida, as células foram incubadas com as sondas PLA PLUS e MINUS por 1 h a 37°C, Duolink® Ligation Buffer por 30 min a 37°C e Amplification Buffer por 100 min a 37°C. As lamínulas foram lavadas duas vezes por 10 min cada vez à temperatura ambiente em Wash Buffer, e as lâminas foram montadas com lamínula usando um volume mínimo de Duolink® In Situ Mounting Medium com DAPI. As células coradas foram montadas e visualizadas em um Leica Stellaris STED (Leica TCS SP5). Os anticorpos utilizados estão listados na Tabela S2.

Análise por western blot
O western blotting foi realizado de acordo com o protocolo padrão, conforme descrito anteriormente. S7 A proteína foi extraída do gastrocnêmio da perna traseira distal ao tumor. Células NIH/3T3 expostas a diferentes condições foram lisadas em tampão (contendo 1000 μL de lisado celular, 20 μL de inibidor de fosfatase, 20 μL de inibidor de protease e 10 μL de fluoreto de fenilmetanossulfonila ou fluoreto de fenilmetilsulfonila [PMSF]) e, em seguida, centrifugadas a 12.000 rpm por 15 min a 4°C. O método do ácido bicinconínico (BCA) foi utilizado para detectar a concentração de proteína. A expressão proteica foi analisada por western blotting. As membranas foram incubadas primeiro com os anticorpos primários e, em seguida, essas membranas foram incubadas com os anticorpos secundários por 2 h à temperatura ambiente. Os resultados foram visualizados com o ChemiDocTouch™ Imaging System (BIO-RAD) e analisados usando o software Image Lab. Os anticorpos utilizados estão listados na Tabela S2.

Sequenciamento de RNA e análises estatísticas
Após a excisão, os músculos gastrocnêmios esquerdos de camundongos nude foram imediatamente congelados em nitrogênio líquido e enviados para a Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co. Ltd. Resumidamente, o RNA foi extraído usando o QIAzol Lysis Reagent (QIAGEN, Dusseldorf, Alemanha). As análises de RNA total foram feitas usando um Agilent 5300 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Califórnia, EUA). O preparo da biblioteca de 1 μg de RNA foi realizado usando o Illumina NovaSeq Reagent Kit (Illumina, Califórnia, EUA). O cDNA foi avaliado e o sequenciamento foi realizado usando um sequenciador Illumina NovaSeq 6000 (Illumina). As leituras brutas de extremidades pareadas foram cortadas e controladas quanto à qualidade pelo fastp com parâmetros padrão. A análise de expressão diferencial foi realizada usando o programa DESeq2.

Docking molecular e interações ligante-alvo
As estruturas preditas de DTX3L e Runx2 foram geradas pelo Alphafold (Google, Califórnia, EUA). Utilizamos o AutoDock Vina (The Scripps Research Institute, Califórnia, EUA) para realizar o docking molecular. O Docking Web Server (GRAMM) (Center for Computational Biology, University of Kansas, EUA) foi utilizado para o docking proteína–proteína. As interações ligante–alvo foram calculadas utilizando o AutoDock Tools 1.5.7 com parâmetros padrão. Por fim, a figura da interação proteína–proteína foi gerada pelo PyMOL (Schrödinger, Nova York, EUA).

Ensaios de coimunoprecipitação
Uma alíquota de 20 μL de esferas magnéticas (Thermo Fisher Scientific, EUA) foi lavada em PBS frio e, em seguida, colocada em albumina sérica bovina (BSA) a 3% por 1 h a 4°C. Em seguida, as esferas magnéticas foram lavadas novamente duas vezes com PBS frio. Um total de 500 μL de lisados celulares foi colocado nas esferas magnéticas e incubado durante a noite em um agitador a 4°C. As esferas magnéticas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS) após a remoção do líquido com o suporte magnético. Em seguida, utilizou-se dodecil sulfato de sódio (SDS) 2× para ressuspender as esferas magnéticas, que foram subsequentemente fervidas em banho-maria a 100°C por 10 min. Os sobrenadantes foram coletados após a remoção das esferas magnéticas do suporte magnético.

PCR quantitativa em tempo real
O RNA total foi extraído de células NIH/3T3 utilizando o reagente TRIzol e um Ultrapure RNA Kit (Cwbio, Taizhou, China). O cDNA foi obtido por transcrição reversa. A qPCR foi realizada utilizando SYBR Green (Bimake, Xangai, China). O estudo foi repetido de forma independente três vezes para cada amostra, e todas as reações de amplificação foram analisadas pelo método do ciclo limiar comparativo (Ct) e normalizadas em relação ao nível de mRNA de GAPDH. Todas as reações utilizaram as seguintes condições do termociclador: 95°C por 30 s, 39 ciclos de uma reação em duas etapas com desnaturação a 95°C por 5 s e anelamento a 59°C por 30 s. Os primers para os genes estão listados na Tabela S3.

Análise estatística
Todos os valores foram apresentados como média ± EPM. Múltiplos grupos foram comparados utilizando análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste da diferença mínima significativa (LSD), e as comparações entre dois grupos foram realizadas por meio de testes t utilizando o software SPSS (Versão 23.0; SPSS Software Inc., Chicago, EUA; IBM, EUA). Valores de P < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados
A L-carnitina alivia a fibrose muscular esquelética relacionada à caquexia do câncer
Nossa pesquisa anterior demonstrou que a LC alivia a perda muscular relacionada à caquexia do câncer. Para explorar ainda mais os efeitos da LC, realizamos sequenciamento de RNA (RNAseq) nos músculos gastrocnêmios de camundongos nude. Conforme mostrado na Figura 1 A , o tratamento com LC reduziu o nível de mRNA de membros da família do colágeno. Camundongos de meia-idade (44 a 48 semanas de idade) foram utilizados para os estudos iniciais porque os músculos esqueléticos de camundongos de meia-idade são mais suscetíveis à perda e têm maior dificuldade de recuperação do que os de camundongos jovens. Liu et al. descobriram anteriormente que a administração diária de 5 mg/kg de LC poderia manter uma concentração sérica normal em um modelo de caquexia em camundongos. Portanto, administramos 5 mg/kg de LC a cada camundongo após a formação de tumores estabelecidos. A força muscular (conforme indicada pela força de preensão) no grupo MC38 + LC foi semelhante à do grupo normal, e houve diferenças significativas entre esses camundongos e o grupo MC38 não tratado (Figura 1 B ). Os pesos total e livre de tumor dos camundongos não foram significativamente diferentes; no entanto, os resultados demonstraram que a suplementação com LC preveniu efetivamente a perda de peso nos camundongos caquéticos no experimento MC38 (Figura S1 C–E). O peso do gastrocnêmio e a área da fibra em corte transversal demonstraram que a administração de LC preveniu a atrofia muscular (Figura S1 F,G). Além disso, a proporção da área de fibras colágenas do gastrocnêmio no grupo MC38 foi aproximadamente duas vezes maior do que nos grupos normal e MC38 + LC (Figura 1 C ). Reforçando ainda mais o impacto da LC sobre o colágeno, a expressão proteica de COL1A1 no grupo MC38 + LC foi semelhante à do grupo normal (Figuras 1 D e S1 H), enquanto o nível no grupo MC38 não tratado foi significativamente maior.
A L-Carnitina (LC) alivia a fibrose muscular esquelética (FME) induzida por caquexia. (A) Alterações na expressão de mRNA de membros da família do colágeno nos músculos gastrocnêmios de camundongos com caquexia neoplásica identificadas por sequenciamento de RNA em camundongos nus portadores de tumor CT26 (n = 3, 3). (B) Avaliação da força de preensão em camundongos caquéticos com e sem tratamento com LC (5 mg/kg). O gráfico de barras mostra a força muscular (força de preensão) determinada por um medidor de força muscular (n = 4, 6, 6). (C) Área de fibras colágenas em camundongos caquéticos com e sem intervenção com LC. O gráfico de barras mostra o nível de FME em cada grupo (n = 4, 6, 6). (D) Análise por Western blot (WB) da expressão da cadeia alfa 1 do colágeno tipo I (COL1A1) no gastrocnêmio. O gráfico de barras mostra a expressão proteica relativa de COL1A1 (n = 4, 6, 6). (E, F) Análise por WB da expressão de COL1A1 em células NIH/3T3 após exposição a 10 ng/mL de fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-β1) por 24 h e após tratamento subsequente com 600 mg/L de LC por diferentes períodos de tempo ou com diferentes concentrações de LC por 60 min. O gráfico de pontos mostra a expressão proteica relativa de COL1A1. Imagens representativas são mostradas, e as imagens foram avaliadas usando o software Image Lab. Os dados são apresentados como médias ± EPM (n = 3). A análise de variância de uma via (B–F) seguida pelo teste da diferença mínima significativa foi usada para comparar os dados entre os grupos (*P < 0,05).
Com base na concentração fisiológica de LC no músculo esquelético de humanos saudáveis, as células foram tratadas com 600 mg/L de LC. O tratamento por 45 min reduziu a superexpressão de COL1A1 induzida por TGF-β1 (Figura 1 E). No entanto, uma concentração mais baixa de LC não levou a uma redução significativa, e uma concentração mais alta de LC não levou a qualquer redução adicional de COL1A1 (Figura 1 F). Foi demonstrado que a actina de músculo liso alfa (α-SMA), a fibronectina e a vimentina são marcadores da transdiferenciação de fibroblastos em miofibroblastos. O tratamento das células NIH/3T3 com LC por 60 min ou 6 h também reduziu a superexpressão de α-SMA, fibronectina e vimentina induzida por TGF-β1 (Figura S1 I). Notavelmente, o tratamento das células com LC resultou em uma diminuição dependente da concentração no nível proteico de α-SMA, mas sem alterações significativas na fibronectina ou vimentina (Figura S1 J). Esses resultados indicam que a LC reduz a fibrose induzida pela caquexia neoplásica e mantém a função muscular esquelética.
A L-Carnitina regula a cadeia alfa 1 do colágeno tipo I por meio do fator de transcrição 2 da família RUNX para aliviar a fibrose
Posteriormente, exploramos as vias a montante da família do colágeno para determinar como a LC estava exercendo seus efeitos. Usando o banco de dados TRRUST, descobrimos que Runx2 é um fator de transcrição chave que promove simultaneamente a expressão de COL1A1 e COL1A2 (Figura S2 A). O estudo conduzido por Raaz et al. demonstrou que Runx2 tem a capacidade de aumentar a transcrição de ambos COL1A1 e COL1A2. S3 Uma análise mais aprofundada dos dados "ômicos" revelou um índice de correlação de 0,9952 entre os mRNAs de COL1A1 e COL1A2 (Figura S2 B), e experimentos de superexpressão sugeriram que Runx2 desempenha um papel regulador para ambos COL1A1 e COL1A2 (Figura S2 C), apoiando que COL1A1 e COL1A2 podem ser regulados pelo mesmo fator de transcrição. Como mostrado nas Figuras 2 A,B e S2 D, a LC inibiu o aumento da proteína Runx2 induzido pelo câncer tanto no modelo de camundongo in vivo quanto em fibroblastos tratados com TGF-β1. O tratamento das células com uma concentração mais alta de LC (1200 mg/L) não teve nenhum efeito adicional in vitro, sugerindo que o nível fisiológico normal de LC é ideal para reduzir a fibrose (Figura 2 C ). Como Runx2 promove a expressão do mRNA de COL1A1, estudamos os efeitos da LC na expressão do mRNA de COL1A1 mediada por Runx2. Como esperado, a LC diminuiu o nível de mRNA de COL1A1 aos 30 min, e esse efeito foi abolido quando Runx2 foi superexpresso (Figura 2 D,E ). Notavelmente, os efeitos da LC sobre a proteína COL1A1 foram abolidos pela superexpressão de Runx2 (Figura 2 F ). Mais importante ainda, a redução da fibrose (conforme indicado pela expressão de α-SMA) foi associada aos efeitos sobre Runx2 (Figura S2 E).

A L-carnitina (LC) regula negativamente o fator de transcrição 2 da família RUNX (Runx2) para melhorar a fibrose. (A) Análise por Western blot (WB) da expressão de Runx2 no gastrocnêmio de camundongos experimentais. O gráfico de barras mostra a expressão relativa da proteína Runx2 (n = 4, 6, 6). (B–D) Análise por WB e qPCR da expressão de Runx2 e da cadeia alfa 1 do colágeno tipo I (COL1A1) em células NIH/3T3 após exposição a 10 ng/mL de fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-β1) por 24 h e após tratamento subsequente com 600 mg/L de LC por diferentes períodos de tempo ou com diferentes concentrações de LC por 60 min. O gráfico de barras mostra a expressão relativa da proteína Runx2 e do mRNA de COL1A1 (n = 3). (E, F) Análise por WB e qPCR da expressão de Runx2 e COL1A1 em células NIH/3T3 transfectadas com Flag-Runx2 por 24 h após exposição a 10 ng/mL de TGF-β1 por 24 h e após tratamento subsequente com LC por 30 min, 60 min ou 6 h. O gráfico de pontos mostra os níveis relativos da proteína e do mRNA de COL1A1 (n = 3). Imagens representativas são mostradas, e as imagens foram analisadas usando o software Image Lab (A–F). Os dados são apresentados como médias ± EPM. A análise de variância de uma via (A–E) seguida pelo teste da diferença mínima significativa ou teste t (F) foi usada para comparar os dados entre os grupos (*P < 0,05).
A L-carnitina promove a ubiquitinação do fator de transcrição relacionado a Runt 2
Em seguida, exploramos o mecanismo pelo qual a LC afeta a expressão de Runx2. Curiosamente, observamos que o tratamento com LC, na verdade, aumentou o nível de mRNA de Runx2 (Figura 3 A). Portanto, examinamos se a diminuição da expressão proteica de Runx2 era devida ao aumento da degradação. A ciclo-heximida (CHX) é um inibidor da síntese proteica, e o MG132 é um inibidor do proteassoma utilizado para prevenir a degradação de proteínas via sistema ubiquitina-proteassoma. Como mostrado na Figura 3 B,C, a LC promoveu uma diminuição da proteína Runx2 após o tratamento com CHX, e esse efeito foi abolido após o tratamento com MG132, sugerindo que a LC pode promover a degradação de Runx2 via sistema ubiquitina-proteassoma. Análises adicionais de ubiquitinação indicaram que a LC aumentou o nível de ubiquitinação de Runx2 (Figura 3 D), corroborando que a LC aumenta a degradação de Runx2 mediada por ubiquitina.

L-Carnitina (LC) promove a ubiquitinação do fator de transcrição 2 da família RUNX (Runx2). (A) Análise por qPCR da expressão de Runx2 em células NIH/3T3 após exposição a 10 ng/mL de fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-β1) por 24 h e após tratamento subsequente com 600 mg/L de LC por diferentes períodos de tempo. O gráfico de barras mostra a expressão de mRNA de Runx2 (n = 3). (B) Análise por western blot (WB) da expressão de Runx2 em células NIH/3T3 após exposição a 10 ng/mL de TGF-β1 por 24 h no meio de cultura (CM) ou 600 mg/L de LC por 5 min e tratamento com 15 mg/L de ciclo-heximida (CHX) por diferentes tempos. Imagens representativas são mostradas, e as imagens foram analisadas utilizando o software Image Lab. A análise de variância de uma via foi utilizada para comparar os dados entre os grupos (*P < 0,05) (n = 3). (C) Análise por WB da expressão de Runx2 em células NIH/3T3 após exposição a 10 ng/mL de TGF-β1 por 24 h e tratamento com 10 μM/mL de MG132 por 12 h, seguido de tratamento subsequente com 600 mg/L de LC por 1 h. (D) Análise por WB da expressão de ub-Runx2 em células NIH/3T3 transfectadas com Flag-Runx2 por 24 h após exposição a 10 ng/mL de TGF-β1 por 12 h e após tratamento com 10 μM/mL de MG132 por 12 h e 600 mg/L de LC por 15 min, com base no enriquecimento de Runx2 por imunoprecipitação.
A L-carnitina regula o fator de transcrição 2 da família RUNX via deltex E3 ubiquitina ligase 3L
A ubiquitinação de Runx2 requer uma E3 ubiquitinase. DTX3L, uma E3 ubiquitinase conhecida, foi identificada como regulada positivamente com base nos dados de RNAseq (Figura S3 A). Uma análise por PyMOL previu a presença de múltiplos sítios de ligação entre DTX3L e Runx2, e a pontuação para DTX3L–Runx2 foi de −651 com base em suas forças de interação, o que é maior do que −400, tipicamente considerado um ponto de corte para interação, indicando que há uma probabilidade muito alta de interação entre as duas proteínas (Figura S3 B). Portanto, co-transfectamos os plasmídeos GFP-DTX3L e Flag-Runx2 em células HEK 293 e observamos que havia de fato uma interação direta entre DTX3L e Runx2 com base em uma análise de co-imunoprecipitação (CO-IP) (Figura 4 A). Ensaios de imunofluorescência mostraram que DTX3L e Runx2 co-localizaram nas células (Figura 4 B), e experimentos de Duolink indicaram que o espaço entre DTX3L e Runx2 era <40 nm (Figura 4 C). Notavelmente, o tratamento com LC aumentou a interação direta entre DTX3L e Runx2 (Figura 4 D). Após o silenciamento da expressão de DTX3L com siRNA, a LC não apenas falhou em reduzir a expressão proteica de Runx2, como também promoveu seu aumento (Figura 4 E). Enquanto isso, o knockdown de siDTX3L também reduziu a ubiquitinação de Flag-Runx2, apoiando que DTX3L é uma E3 ligase para Runx2 (Figura 4 F).

L-carnitina (LC) alivia a fibrose via deltex E3 ubiquitina ligase 3L (DTX3L). (A) Análise por Western blot (WB) do fator de transcrição 2 da família RUNX (Runx2) e DTX3L em células HEK 293 após tratamento com plasmídeo Flag-Runx2 e GFP-DTX3L por 24 h, após enriquecimento para Flag ou GFP por imunoprecipitação. (B) Células HEK 293 foram transfectadas com Flag-Runx2 e GFP-DTX3L por 48 h e então coradas com anticorpos Flag e Cy3 e contracoradas com DAPI para determinar se Runx2 e DTX3L estavam co-localizados dentro da célula. Imagens representativas são mostradas. As setas indicam a co-localização de Runx2 e DTX3L. (C) Análise por Duolink da distância espacial entre Flag-Runx2 e GFP-DTX3L. (D) Análise por WB de Runx2 e DTX3L em células NIH/3T3 após tratamento com Flag-Runx2 por 24 h, seguido de exposição a 10 ng/mL de fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-β1) por 24 h e 600 mg/L de LC por 15 min, após enriquecimento para Flag por imunoprecipitação. (E) Análise por WB da expressão de Runx2 em células NIH/3T3 transfectadas com siRNA-DTX3L por 24 h, após exposição a 10 ng/mL de TGF-β1 por 24 h e subsequente tratamento com LC por 60 min. Imagens representativas são mostradas, e as imagens foram analisadas usando o software Image Lab. Os dados são apresentados como médias ± EPM (n = 3). Um teste t foi usado para comparar os dados entre os grupos (P < 0,05). (F) Análise por WB da expressão de ub-Runx2 em células NIH/3T3 após tratamento com Flag-Runx2 e siRNA-DTX3L por 24 h, seguido de exposição a 10 ng/mL de TGF-β1 por 12 h e tratamento com 10 μM/mL de MG132 por 12 h e 600 mg/L de LC por 15 min, após enriquecimento de Flag por imunoprecipitação (n = 3).
l‐Carnitina alivia a fibrose através do eixo deltex E3 ubiquitina ligase 3L/fator de transcrição 2 da família RUNX

Para determinar o papel de DTX3L neste modelo, verificamos a expressão de DTX3L em camundongos com caquexia. Como mostrado nas Figuras 5 A e S3 C, DTX3L foi expresso em um nível anormal no modelo de caquexia, enquanto a LC restaurou o nível proteico de DTX3L ao nível normal (controle). Semelhante ao Runx2, o nível de DTX3L foi diminuído pelo tratamento com 600 mg/L de LC por 60 min (Figura 5 B), e uma concentração mais alta de LC (1200 mg/L) não teve efeitos adicionais na expressão de DTX3L (Figura 5 C). Como mostrado na Figura S3 D, houve um pequeno aumento no nível de mRNA de DTX3L, semelhante ao observado para Runx2. Esses resultados sugerem que DTX3L desempenha um papel na resposta à LC e exibe alterações na expressão que correspondem às do Runx2. Além disso, os efeitos da LC nos níveis de expressão proteica e de mRNA de COL1A1 foram abolidos quando DTX3L foi silenciado com miRNA (Figura 5 D). Isso foi semelhante aos efeitos da LC sobre α‐SMA e fibronectina, mas não sobre a vimentina (Figura S3 E). Posteriormente, tanto DTX3L quanto Runx2 foram superexpressos em células NIH/3T3 para confirmar se a LC alivia a fibrose através do eixo DTX3L/Runx2. Como mostrado na Figura 5 E, os efeitos da LC na expressão de mRNA e proteína de COL1A1 foram mais extensos quando DTX3L foi superexpresso. Resultados semelhantes foram observados para α‐SMA (Figura S3 F). Esses achados sugerem que DTX3L está envolvido no mecanismo pelo qual a LC alivia a fibrose e implicam que DTX3L regula Runx2.
A L-Carnitina (LC) alivia a fibrose através do eixo deltex E3 ubiquitina ligase 3L (DTX3L)/fator de transcrição 2 da família RUNX (Runx2). (A) Análise por Western blot (WB) da expressão de DTX3L no gastrocnêmio. O gráfico de pontos mostra a expressão proteica relativa de DTX3L (n = 4, 6, 6). (B, C) Análise por WB da expressão de DTX3L em células NIH/3T3 após exposição a 10 ng/mL de fator de crescimento transformador beta 1 (TGF-β1) por 24 h e após tratamento subsequente com 600 mg/L de LC por diferentes períodos de tempo ou com diferentes concentrações de LC por 60 min. O gráfico de pontos mostra a expressão proteica relativa de DTX3L (n = 3). (D) Análise por WB e qPCR da expressão de DTX3L e da cadeia alfa 1 do colágeno tipo I (COL1A1) em células NIH/3T3 transfectadas com siRNA-DTX3L por 24 h, após exposição a 10 ng/mL de TGF-β1 por 24 h e 600 mg/L de LC por 30 min, 60 min ou 6 h. O gráfico de barras e o gráfico de pontos mostram a expressão proteica e de mRNA relativa de COL1A1 (n = 3). (E) Análise por WB e qPCR da expressão de DTX3L, Runx2 e COL1A1 em células NIH/3T3 transfectadas com Flag-Runx2 e vetor vazio ou plasmídeo GFP-DTX3L por 24 h, após exposição a 10 ng/mL de TGF-β1 por 24 h e 600 mg/L de LC por 30 min, 60 min ou 6 h. O gráfico de barras e o gráfico de pontos mostram a expressão proteica e de mRNA relativa de COL1A1 (n = 3). Imagens representativas são mostradas, e as imagens foram analisadas usando o software Image Lab. Os dados são apresentados como médias ± EPM (n = 3). Uma análise de variância de uma via (A–E) seguida pelo teste da diferença mínima significativa ou teste t (D, E) foi usada para comparar os dados entre os grupos (*P < 0,05).

O fator de crescimento transformador beta 1 perturba o eixo deltex E3 ubiquitina ligase 3L/fator de transcrição 2 da família RUNX

Curiosamente, observamos uma correlação positiva entre DTX3L e Runx2 (Figuras 4 E e 5 E). Portanto, levantamos a hipótese de que o TGF-β1 pode perturbar o eixo DTX3L/Runx2. Como mostrado na Figura 6 A, a expressão proteica de Runx2 diminuiu quando DTX3L foi superexpresso, e a expressão aumentou após o knockdown de DTX3L em culturas sem TGF-β1. Resultados semelhantes também foram observados para a expressão proteica de COL1A1 e α-SMA (Figura 6 B). No entanto, a correlação entre as proteínas Runx2 e DTX3L mudou de negativa para positiva quando as células foram tratadas com TGF-β1 (Figura 6 C). O tratamento das células com TGF-β1 levou a efeitos semelhantes sobre COL1A1 e α-SMA aos da superexpressão de DTX3L (Figura 6 D). Essas observações sugerem que a LC corrigiu parcialmente o eixo DTX3L/Runx2 no modelo de fibrose associada à caquexia do câncer (Figura 6 E).
Fator de crescimento transformador beta 1 (TGF‐β1) perturba o eixo deltex E3 ubiquitina ligase 3L (DTX3L)/fator de transcrição 2 da família RUNX (Runx2). (A, B) Análise por Western blot (WB) da expressão de Runx2, cadeia alfa 1 do colágeno tipo I (COL1A1) e actina de músculo liso alfa (α‐SMA) em células NIH/3T3 transfectadas com GFP‐DTX3L ou siRNA‐DTX3L por 48 h (n = 3). (C, D) Análise por WB da expressão de Runx2, COL1A1 e α‐SMA em células NIH/3T3 transfectadas com GFP‐DTX3L ou siRNA‐DTX3L por 24 h, seguido de tratamento com 10 ng/mL de TGF‐β1 por 24 h (n = 3). (E) Uma representação esquemática de como a l‐carnitina promove DTX3L para induzir a ubiquitinação de Runx2 para aliviar a fibrose muscular esquelética relacionada à caquexia.
Discussão
Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a fornecer evidências dos efeitos da LC na fibrose muscular e na força muscular relacionadas à caquexia do câncer. A força muscular é um indicador importante usado para avaliar o estado muscular, e nosso estudo clínico anterior demonstrou que a força de preensão está intimamente relacionada à mortalidade de pacientes com caquexia do câncer. , S8 , S9 Estudos clínicos apoiam que a suplementação de LC é benéfica para manter a força de preensão em pacientes em hemodiálise. No entanto, a suplementação de LC não melhorou a força de preensão em idosos saudáveis. Esses estudos mostram que a suplementação de LC para fornecer uma concentração fisiológica normal tem um impacto positivo na força de preensão em indivíduos que experimentam um estado de doença.
A SMF é considerada um marcador de distrofia muscular e dano muscular grave e se correlaciona negativamente com a força de preensão. , S10 Estudos anteriores mostraram que a LC diminui o grau de fibrose no fígado, rim e músculo cardíaco em uma variedade de modelos de doenças. No presente estudo, descobrimos que a LC aliviou a SMF causada pelo câncer. Além disso, nossos relatórios anteriores mostraram que a LC também pode melhorar a perda de massa muscular em camundongos portadores de tumor. Busquets et al. demonstraram que a LC exerce seus efeitos benéficos nas miofibras em indivíduos com perda muscular. , S11 Investigações adicionais são necessárias para explorar o papel da LC e seus metabólitos em diferentes doenças que causam aumento da expressão de SMF.
Estudos anteriores mostraram que a LC pode aliviar a fibrose por meio de vias envolvendo a ácido graxo dessaturase (FADS) 1/2, o receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (PPARγ) e a sirtuína 1 (Sirt1). Neste estudo, descobrimos que a LC alivia a fibrose através do eixo DTX3L/Runx2/COL1A1 em nossos modelos de caquexia do câncer. COL1A1 é um marcador clássico de fibrose muscular esquelética (FME). Na distrofia muscular de Duchenne, a expressão do gene COL1A1 pode ser reduzida por um inibidor da tirosina quinase, nintedanibe, e isso reduz o grau de FME. Um estudo anterior em um modelo de diferenciação de osteoblastos também demonstrou que o tratamento com LC afetou o nível de mRNA de Runx2. Relatamos aqui que DTX3L promoveu a degradação de Runx2 após o tratamento com LC. Vale ressaltar que já foi sugerido anteriormente que o mecanismo subjacente à degradação de Runx2 difere com base nas circunstâncias celulares. Por exemplo, a exposição ao fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) induz a degradação de Runx2 através de Smurf1 e Smurf2. Thacker et al. relataram que Skp2 regulou a função de Runx2 promovendo sua ubiquitinação durante a diferenciação de células HEK 293 e MC3T3-E1 em fenótipo osteoblástico. CHIP, como uma E3 ubiquitina ligase de Runx2, também desempenhou um papel negativo durante a diferenciação de células MC3T3-E1 em fenótipo osteoblástico. A proteína de interação com o terminal carboxila da HSC70 (CHIP) não apenas inibe a diferenciação de células MC3T3-E1 em fenótipo osteoblástico, mas também promove a diferenciação das células em fenótipo de adipócito. Curiosamente, a ligase de ubiquitina proteica E3 contendo domínio WW 1 (WWP1) induz a ubiquitinação e degradação de Runx2 para inibir a formação óssea, enquanto a ligase de ubiquitina proteica E3 contendo domínio WW 2 (WWP2) promove a ubiquitinação de Runx2 para induzir a diferenciação celular em direção ao fenótipo osteoblástico em células HEK 293 e C3H10T1/2. , S12
Os efeitos do TGF‐β1 sobre o Runx2 são complexos. Em células precursoras mesenquimais, foi demonstrado que o TGF‐β1 regula positivamente a expressão do Runx2, um fator de transcrição essencial na diferenciação dos osteoblastos. O TGF‐β1 facilita a fosforilação do Runx2. Essa modificação pós‐traducional desempenha um papel crítico na ativação subsequente da metaloproteinase‐13 da matriz (MMP‐13), uma enzima implicada na reabsorção e remodelação óssea. Além disso, o TGF‐β1 aumenta a acetilação do Runx2, o que também é essencial para a expressão da MMP‐13 nos osteoblastos. Estudos recentes revelaram mecanismos adicionais pelos quais o TGF‐β1 modula as funções do Runx2. Yu et al. demonstraram que o TGF‐β1 pode inibir a degradação do Runx2 no osso esponjoso. Kang et al. identificaram a histona desacetilase 4 (HDAC4) e a histona desacetilase 5 (HDAC5) como reguladores cruciais que suprimem a função do Runx2 durante a diferenciação osteoblástica na presença de TGF‐β. Além disso, outros fatores também podem influenciar o estado de acetilação do Runx2. A SIRT6, uma desacetilase dependente de NAD+, demonstrou reduzir os níveis de Runx2 acetilado, facilitando assim a degradação do Runx2.
Em contraste, nossos resultados mostram que, embora a DTX3L também esteja negativamente correlacionada com o Runx2, o TGF‐β1 altera a relação entre as duas proteínas. Isso pode ocorrer porque a DTX3L, como uma ligase de ubiquitina E3, é um transportador essencial para o transporte de ubiquitina e pode catalisar diferentes tipos de ubiquitinação, levando a efeitos distintos sobre o substrato. Lo et al. relataram que a DTX3L promoveu a ISGilação mediada por ISG15 da lipase (LIPG). A ISGilação é uma modificação semelhante à ubiquitinação, e seu papel clássico nas células é manter a estabilidade do substrato. Assim, é possível que a modificação do Runx2 induzida pela DTX3L possa afetar a estabilidade da proteína e que o impacto da DTX3L sobre o Runx2 seja regulado por outros fatores, como o TGF‐β1. A relação entre o proto‐oncogene MDM2 (MDM2) e o p53 corrobora essa possibilidade. A proteína MDM2 funciona como uma enzima de ubiquitinação para o p53; no entanto, seus efeitos sobre o p53 podem variar sob diferentes condições. , ^S13^ , ^S14^ Pan e Chen descobriram que o MDM2 e o regulador de p53 MDM4 (MDMX) colaboram para suprimir a função do p53 na ausência de estresse. Após dano ao DNA, o p53 é ativado e induz a expressão do MDM2, levando subsequentemente à degradação do MDMX e à ativação adicional do p53.^S13^ As descobertas de Yin et al. sugerem que o MDM2 aumenta a estabilidade e a atividade do p53 ao facilitar sua regulação positiva transcricional.^S14^ Pode haver uma regulação condicional semelhante do Runx2 pela DTX3L.
Em resumo, nossos estudos atuais demonstraram que a suplementação para atingir uma concentração fisiológica de LC pode melhorar a diminuição da força muscular e o aumento da fibrose causados pela caquexia do câncer em camundongos C57. Este é o primeiro estudo a descobrir que DTX3L é uma E3 ubiquitina ligase para Runx2 in vitro. Também mostramos que a LC regula a ubiquitinação de Runx2 por meio de DTX3L, levando a uma diminuição de COL1A1 e aliviando a fibrose muscular esquelética (SMF) causada pela caquexia do câncer. Nosso estudo fornece novos alvos para o tratamento de doenças relacionadas à fibrose e apoia o uso da suplementação de LC para o tratamento da caquexia do câncer.
Declaração de conflito de interesses
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Informações de suporte
Referências
Definição e classificação da caquexia do câncer: um consenso internacional
Fibrose muscular esquelética: uma visão geral
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Uma revisão sistemática sobre o papel das vitaminas, minerais, proteínas e outros suplementos para o tratamento da caquexia no câncer: um projeto de caquexia do Centro Europeu de Pesquisa em Cuidados Paliativos
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