pmid: "34214447"
title: "Mudanças nas paisagens dos efeitos da variante missense da MTHFR humana."
authors: "Weile J, Kishore N, Sun S, Maaieh R, Verby M, Li R, Fotiadou I, Kitaygorodsky J, Wu Y, Holenstein A, Bürer C, Blomgren L, Yang S, Nussbaum R, Rozen R, Watkins D, Gebbia M, Kozich V, Garton M, Froese DS, Roth FP"
journal: "American journal of human genetics"
pubdate: "2021 Jul 01"
doi: "10.1016/j.ajhg.2021.05.009"
source: "PMC Full Text"
Mudanças nas paisagens dos efeitos da variante missense da MTHFR humana.
Autores
Weile J, Kishore N, Sun S, Maaieh R, Verby M, Li R, Fotiadou I, Kitaygorodsky J, Wu Y, Holenstein A, Bürer C, Blomgren L, Yang S, Nussbaum R, Rozen R, Watkins D, Gebbia M, Kozich V, Garton M, Froese DS, Roth FP
Periodico
American journal of human genetics (2021 Jul 01)
Conteudo
Mudanças nas paisagens dos efeitos da variante missense da MTHFR humana
Resumo
As variantes clínicas missense mais raras não podem atualmente ser classificadas como patogênicas ou benignas. A deficiência da 5,10-metilenotetrahidrofolato redutase humana (MTHFR), o distúrbio hereditário mais comum do metabolismo do folato, é causada principalmente por variantes missense raras. Para complicar ainda mais a interpretação das variantes, os impactos das variantes dependem frequentemente do ambiente. Um exemplo importante desse fenômeno é a variante MTHFR p.Ala222Val (c.665C>T), que é transportada por metade de todos os humanos e tem um impacto fenotípico que depende do folato dietético. Aqui descrevemos os resultados de 98.336 ensaios de impacto funcional variantes, cobrindo quase todas as possíveis substituições de aminoácidos MTHFR em quatro ambientes de folinato, cada um na presença e ausência de p.Ala222Val. O atlas resultante dos efeitos da variante MTHFR revela muitas dependências complexas tanto do folinato quanto do p.Ala222Val. As pontuações do atlas MTHFR podem distinguir variantes patogênicas de benignas e, entre indivíduos com deficiência grave de MTHFR, correlacionar-se com a idade de início da doença. Fornecendo uma ferramenta poderosa para a compreensão das relações estrutura-função, o atlas sugere um papel para um loop desordenado na retenção do cofator no sítio ativo e identifica variantes que permitem escapar da inibição pela S-adenosilmetionina. Assim, um modelo baseado em oito mapas de efeitos de variantes de MTHFR ilustra como as mudanças nas paisagens da variação missense dependente do ambiente e do contexto genético podem informar nossa compreensão clínica, estrutural e funcional da deficiência de MTHFR.
Introdução
Um grande desafio na relação entre genomas e características é o fenómeno da penetrância incompleta, ou “resiliência genética”. Nos humanos, sabe-se há muito tempo que o impacto das variantes causadoras de doenças difere entre os indivíduos. Por exemplo, 30% a 40% dos indivíduos com variantes patogênicas do BRCA1 permanecem livres de câncer de mama e de ovário ao longo da vida. As explicações para a penetrância incompleta podem incluir efeitos ambientais que desencadeiam, medeiam ou suprimem os efeitos de um alelo, por exemplo, exposição à radiação ionizante ou interações genéticas (quando um alelo tem um efeito surpreendente no impacto de outro). Embora a dependência dos efeitos variantes no ambiente e no contexto genético possa ser complexa, estes podem muitas vezes ser modelados através de ensaios baseados em células.
A interpretação das variantes clínicas, que pondera as evidências disponíveis para classificar a patogenicidade, dá grande importância aos resultados dos ensaios funcionais. No entanto, os ensaios funcionais baseados em células consomem muitos recursos e geralmente faltam para variantes recém-descobertas, e a maioria de todas as variantes missense são classificadas como variantes de significado incerto (VUS). Está cada vez mais claro que o teste de funções variantes “reactivamente” (apenas depois de observar primeiro a variante num ser humano) não consegue acompanhar o ritmo. Está a surgir uma abordagem mais “pró-activa”, na qual ensaios multiplexados de efeito variante (MAVEs) são aplicados para testar sistematicamente variantes em genes associados a doenças; tais variantes incluem variantes missense ainda não observadas em nenhum ser humano, por exemplo, para cistationina beta-sintase (CBS) e calmodulina.
Aqui, examinamos o gene humano MTHFR, que codifica a 5,10-metilenotetrahidrofolato redutase, uma enzima chave na via do metabolismo de um carbono que inclui os ciclos essenciais de folato e metionina. A deficiência grave de MTHFR (MIM: 236250), o distúrbio hereditário mais comum do metabolismo do folato, foi descrita em mais de 200 indivíduos, a maioria dos quais foi diagnosticada na infância. Principalmente uma doença do sistema nervoso central, também pode resultar em tromboembolismo ou doença ocular. Em indivíduos mais velhos, foram relatados marcha atáxica, distúrbios psiquiátricos e sintomas relacionados a eventos cerebrovasculares. Bioquimicamente, a deficiência grave de MTHFR está associada ao acúmulo maciço de homocisteína no sangue (hiper-homocisteinemia), ou seja, homocisteína plasmática elevada até 60–320 μM; intervalo de referência normalmente 5–15 μM) junto com metionina plasmática baixa ou normal baixa. Em contraste com a deficiência grave, algumas variantes da MTHFR produzem hiperhomocisteinemia leve (15–30 μM), o que aumenta o risco de defeitos congênitos no tubo neural e tem sido relatado que aumenta o risco de doença cardiovascular, embora a última associação seja controversa, e de defeitos congênitos no tubo neural. A suplementação dietética com folinato pode remediar os sintomas de casos leves de hiperhomocisteinemia.
O MTHFR é mais amplamente conhecido por causa da variante comum p.Ala222Val, que é transportada por cerca de metade de todos os humanos (frequência alélica global de 31%, gnomAD). Esta variante, que corresponde a c.665C> T (às vezes anotada como “c.677C> T” com base na anotação de sequência de codificação desatualizada), diminui a termoestabilidade e afinidade do MTHFR ao dinucleotídeo de flavina adenina (FAD) e produz atividade enzimática reduzida com baixa disponibilidade de substrato. Os níveis modestamente aumentados de homocisteína plasmática associados ao p.Ala222Val são prontamente melhorados pelo aumento do folato na dieta. Embora as mulheres grávidas homozigotas para c.665C> T (p.Ala222Val) sejam aconselhadas a seguir uma dieta rica em folato para evitar defeitos congênitos no tubo neural, esse conselho é comumente dado a todas as mulheres grávidas, independentemente do status de p.Ala222Val, e se há efeitos mais amplos sobre a saúde da variante p.Ala222Val permanece controverso. No entanto, aproximadamente um terço das variantes raras ou privadas em MTHFR ocorrem em cis com p.Ala222Val, e a extensão em que p.Ala222Val modula os efeitos de outras variantes de MTHFR ou sua capacidade de resposta à suplementação de folinato não é clara, complicando ainda mais a interpretação da variante MTHFR.
Aqui aplicamos ensaios multiplexados para gerar um atlas dos impactos das variantes do MTHFR em contextos ambientais e genéticos.
Materiais e Métodos
Visão geral das medições multiplexadas dos efeitos da variante MTHFR
Aqui fornecemos uma visão geral dos métodos usados para mapeamento de efeitos de variantes MTHFR e seguimos com detalhes adicionais.
Testar funcionalmente todas as possíveis substituições de aminoácidos em uma proteína alvo exige um ensaio escalável. Aqui aproveitamos o fato de que cepas de levedura S. cerevisiae sem o ortólogo MET13 da MTHFR normalmente não podem crescer sem metionina suplementada, mas são resgatadas pela expressão da MTHFR humana. Como a levedura (ao contrário dos humanos) pode sintetizar folato, utilizamos uma extensão deste ensaio em que o FOL3 da levedura também é deletado, permitindo o controle externo do folato intracelular através da titulação do folinato (5-formil-tetrahidrofolato) em meio de crescimento.
Utilizando a sequência de codificação da isoforma de splice canônica de MTHFR (Ensembl: ENST00000376590.9; GenBank: NM_005957.5), produzimos bibliotecas de cDNA mutagenizadas a partir de modelos de referência ("tipo selvagem" ou WT) e variante p.Ala222Val. Cada variante deveria estar suficientemente bem representada em sua biblioteca para permitir uma medição precisa da frequência da variante, mas também queríamos limitar o número de variantes por clone. Portanto, geramos múltiplas bibliotecas de cDNA completas, cada uma direcionada por mutagênese dirigida por oligo em uma região diferente. Bibliotecas mutantes de MTHFR para cada uma das quatro regiões em cada uma das duas origens genéticas foram clonadas separadamente em massa em vetores de expressão de levedura e transformadas na cepa de ensaio descrita abaixo.
Cada um dos conjuntos de cepas de levedura que expressam a variante MTHFR foi cultivado com suplementação de metionina (a condição não seletiva) e sem (condição seletiva), em cada uma das quatro concentrações diferentes de folinato (12,5, 25, 100 e 200 μg/mL).
Avaliamos os efeitos variantes usando a abordagem TileSeq, que envolve a extração de DNA correspondente ao locus do gene alvo de células agrupadas e sequenciamento de segmentos do gene alvo (“blocos”) a uma profundidade (normalmente> 2M de leituras) suficiente para que a “frequência alélica” de cada variante seja estimada e comparada entre as populações de células selecionadas e não selecionadas. Uma vantagem do uso de blocos curtos (~ 130 nt) é que ambas as fitas podem ser sequenciadas em uma plataforma econômica de sequenciamento de leitura curta, o que por sua vez permite erros de chamada de base bastante reduzidos e estimativas precisas de frequências alélicas baixas (partes por milhão). Uma desvantagem é que qualquer clone pode conter variações adicionais invisíveis fora do bloco sequenciado. No entanto, pode-se estimar de forma robusta as frequências subjacentes dos alelos, mantendo a complexidade do conjunto que é suficientemente alta para que o impacto médio da variação adicional não observada seja relativamente constante para todas as variantes. Foi demonstrado anteriormente que o TileSeq pode medir efeitos variantes com uma precisão comparável à das abordagens baseadas no sequenciamento completo de clones.
O uso de mutagênese regional em combinação com TileSeq supera os desafios apresentados por proteínas mais longas, nas quais é difícil ter um número modesto de mutações por clone e representar cada variante em frequências distinguíveis de erros aleatórios decorrentes de amplificação e sequenciamento.
Uma pontuação de funcionalidade e erro de medição associado foram derivados para cada variante (ver métodos suplementares A) em cada concentração de folinato e antecedentes genéticos. Como a mutagênese e a seleção foram realizadas separadamente para cada região, as pontuações de cada região foram redimensionadas antes de serem combinadas em um único mapa de efeito variante global (ver métodos suplementares A).
Cepa e validação do ensaio MTHFR
A cepa de levedura (MATα fol3Δ::KanMX met13Δ::KanMX his3Δ1 lys2Δ0 leu2Δ0 ura3Δ0), clone MTHFR ORF (Ensembl: ENST00000376590.9; GenBank: NM_005957.5, correspondente a UniProt: P42898-1) e variante p.Ala222Val O clone que utilizamos para o ensaio de complementação, conforme descrito anteriormente, foi gentilmente cedido pelo Dr. Jasper Rine. Subclonamos ORFs WT e MTHFR mutantes em um vetor de expressão de levedura compatível com Gateway pHYC-Dest2 (baseado em CEN / ARS, promotor ADH1 e marcador LEU2) para permitir complementação em larga escala.
Validamos nossa implementação deste sistema em ensaios de crescimento líquido de baixo rendimento (usando um leitor de microplacas Tecan) e avaliamos MTHFR WT, p.Ala222Val e controles nulos em seis níveis diferentes de suplementação de folinato (0, 6,25, 12,5, 25, 50 e 100 μg/mL). O ensaio de crescimento confirmou que a MTHFR humana complementa a perda de MET13 de levedura e que a variante p.Ala222Val apresenta um modesto defeito de aptidão, que aumentou em gravidade com concentrações diminuídas de folinato (Figura S1A).
Construção de biblioteca mutagenizada
Usamos o método POPCode (Precision Oligo-Pool Based Code Alteration) para gerar bibliotecas de variantes MTHFR randomizadas por códon. Como o MTHFR (1971 pb) é mais longo do que qualquer gene previamente mutagenizado com POPCode, a mutagênese foi realizada regionalmente: a sequência de codificação foi subdividida em quatro regiões para fins de mutagênese, de modo que foram geradas quatro bibliotecas completas de MTHFR nas quais cada região foi alvo, por sua vez, para mutagênese de códon aleatório. Em resumo, oligonucleotídeos de 28 a 38 pb, transportando códons degenerados de NNK localizados centralmente, foram projetados ao longo de todo o comprimento da ORF do MTHFR. Os oligos de cada região foram combinados para produzir quatro pools regionais de oligos. O WT MTHFR completo uracilado (ou p.Ala222Val MTHFR) foi usado como modelo, e quatro reações de recozimento separadas (envolvendo Kapa HiFi Uracil + DNA polimerase [KapaBiosystems] e uma mistura de dNTP / dUTP) foram configuradas com os oligos regionais. Uma vez recozidos os oligos, as lacunas foram preenchidas através da polimerase KAPA HiFi Uracil + DNA (Kapa Biosystems) e os cortes foram selados com Taq DNA ligase (NEB). O modelo uracilado original foi então degradado com Uracil-DNA-Glicosilase (UDG) (NEB), e a cadeia mutagenizada recentemente sintetizada foi amplificada através do uso de primers contendo sítios attB. Em seguida, transferimos o produto de PCR assim gerado em massa para pDONR223 através de reações Gateway BP para gerar clones de entrada (reunimos 100.000 clones por biblioteca para manter a complexidade).
Posteriormente, transferimos as bibliotecas de entrada para um vetor de expressão pHYC-Dest2 usando reações Gateway LR em massa (agrupamos 300.000 clones para manter a complexidade) para permitir a expressão de levedura. Essas bibliotecas de expressão mutagenizadas regionalmente foram então transformadas na cepa met13fol3 de S. cerevisiae. Então, para manter a alta complexidade, reunimos pelo menos 300.000 clones para gerar bibliotecas hospedeiras regionais.
Ensaio multiplexado para função variante MTHFR
O ensaio de complementação funcional baseado em levedura do MTHFR foi previamente estabelecido por Marini e colegas para a avaliação de variantes individuais. Detalhes são fornecidos aqui para triagem de complementação de alto rendimento: em resumo, para cada região, plasmídeos foram extraídos de dois pellets de ∼2,7 × 108 células dos pools de transformantes regionais met13 fol3 de S. cerevisiae, produzindo ∼300.000 transformantes totais. Estas preparações de plasmídeo foram utilizadas para PCR de ladrilho a jusante. Estes dois conjuntos de plasmídeos serviram como duas réplicas biológicas para a condição não seletiva.
Lavamos aproximadamente 3 x 108 células dos pools de transformantes regionais três vezes para eliminar qualquer metionina residual e subsequentemente inoculamos as células em meio seletivo. Utilizamos meio sintético completo (SC) sem leucina (USBiológico) (para garantir a retenção do plasmídeo) como meio de crescimento não seletivo. Para meios seletivos, utilizamos meios sintéticos definidos (SD) sem metionina; isso foi feito com uma base de nitrogênio de levedura sem vitaminas ou aminoácidos (US Biological). Para aliviar as auxotrofias na cepa mutante, complementamos o meio seletivo com concentrações padrão de histidina, lisina, uracila e todas as outras vitaminas, exceto ácido folínico. Em seguida, adicionamos folinato ao meio seletivo em quatro concentrações diferentes: 12,5, 25, 100 e 200 μg/mL.
Para cada um dos oito ensaios de complementação agrupados (quatro concentrações de folinato para cada uma das duas origens genéticas), duas réplicas de células em meio seletivo foram deixadas crescer até a densidade total (5-6 duplicações) com agitação a 30°C. 2,7 x 108 células foram colhidas de cada réplica e o DNA plasmídico foi extraído dessas células. Este DNA foi posteriormente usado como modelo para PCR lado a lado. Paralelamente, a cepa met13 fol3 foi transformada de forma semelhante com a ORF WT, e esta cepa de controle foi cultivada em 10 mL de meio seletivo e não seletivo ao lado dos pools regionais para servir como controles WT.
Estratégia de sequenciamento e pontuação
Usamos a estratégia TileSeq descrita anteriormente para ler os efeitos da seleção. O MTHFR foi dividido em quatro regiões para mutagênese e seleção separadas; cada região foi subdividida em blocos para medição baseada em sequenciamento de frequências variantes (para um total de 19 blocos). Cada bloco era curto o suficiente para permitir o sequenciamento completo de ambas as cadeias para atingir um erro de chamada de base baixo e, assim, permitir a medição precisa de frequências variantes extremamente baixas (partes por milhão). Cada região consistia de quatro a seis peças (R1: quatro peças, R2: quatro peças, R3: cinco peças e R4: seis peças). Para cada uma das bibliotecas de plasmídeos de conjuntos não seletivos e seletivos, a PCR lado a lado foi realizada conforme descrito anteriormente. Em resumo, cada bloco foi amplificado com primers contendo um sítio de ligação para adaptadores de sequenciamento Illumina. Esses amplicons da primeira etapa foram então indexados com adaptadores de sequenciamento Illumina na PCR da segunda etapa. O sequenciamento emparelhado foi realizado com um Illumina NextSeq 500 por meio de um NextSeq 500/550 High Output Kit v2 em cada bloco de todas as condições e do controle WT. A abundância relativa de cada biblioteca foi ajustada para que houvesse uma profundidade de sequenciamento de aproximadamente 2 milhões de leituras para cada bloco.
Os dados de leitura do TileSeq foram processados conforme descrito anteriormente. Resumidamente, as condições foram demultiplexadas com Illumina bcl2fastq. As frequências alélicas variantes em cada condição foram calculadas por meio do tileseq_package, que usa bowtie2 para alinhar cada par de leitura ao modelo e chamar mutações quando ambas as leituras de cada bloco concordam com sua presença. Em todos os blocos, 99,1% das leituras puderam ser mapeadas para o modelo e 87,5% dos pares de leitura concordaram com todas as variantes chamadas. Variantes com discordância dentro de um par lido foram tratadas como tipo selvagem. A contagem e a normalização da profundidade de sequenciamento foram realizadas com software customizado (tileseq_package v1.5, consulte a seção de disponibilidade de código). Isso produziu dados de frequência variante para cada condição e replicação. Extrapolando a partir das mutações observadas em cada bloco, estimamos uma média de 0,93, 0,86, 0,8 e 0,71 alterações de códons por clone para as regiões 1–4, respectivamente, e também modelamos a distribuição do número de alterações de códons por clone esperado sob uma distribuição de Poisson (Figura S2). Os valores brutos de aptidão foram calculados a partir das leituras de sequenciamento conforme descrito anteriormente com o pipeline tileseqMave (consulte “disponibilidade de dados e código”). Aqui, atualizamos o tileseqMave para permitir que as pontuações de cada região sejam reescalonadas separadamente, de modo que as pontuações de zero e um sejam definidas pelos respectivos modos de absurdo e variantes sinônimas. Veja os métodos suplementares A para detalhes de análise.
Modelagem de estrutura e determinação de resíduos de sítios de ligação
Para obter um modelo estrutural de MTHFR, incluindo todos os locais de ligação relevantes, usamos OpenPyMol para gerar um alinhamento estrutural entre a estrutura MTHFR humana obtida de Froese e colegas (PDB:6FCX) e seu ortólogo de E. coli ligado ao proxy de substrato LY309887 por Pejchal e colegas (PDB:2FMN). Em seguida, extraímos listas de todos os resíduos dentro de 5Å do LY309887, do FAD e do SAH, bem como da interface de dimerização.
Modelagem da dependência da funcionalidade variante do folinato e p.Ala222Val
Uma descrição completa da abordagem de modelagem pode ser encontrada nos métodos suplementares B. Em resumo, a resposta de cada variante à suplementação de folinato foi modelada através de uma função linear parcimoniosa que expressa a pontuação de funcionalidade em uma determinada concentração em termos de uma funcionalidade básica e um parâmetro de resposta ao folinato. O modelo de máxima verossimilhança para cada variante foi determinado e comparado com o modelo nulo correspondente, que não assume resposta de suplementação. Essa probabilidade do modelo nulo permite a determinação de uma razão de verossimilhança logarítmica (LLR) que expressa o quão mais provável o modelo de resposta à suplementação é comparado ao modelo nulo. Usamos uma abordagem semelhante para modelar a interação genética entre uma variante e p.Ala222Val. Para obter valores de razão de verossimilhança logarítmica de interação genética (LLRg), primeiro expressamos o escore de funcionalidade de duplo mutante esperado por meio de regressão polinomial entre os escores de funcionalidade nos antecedentes WT e p.Ala222Val. Em seguida, derivamos modelos independentes de folinato e dependentes de folinato do escore esperado para a combinação de cada variante com p.Ala222Val e subsequentemente estimamos a máxima verossimilhança e LLRg como fizemos para LLR.
Identificação de variantes supressoras p.Ala222Val
Para identificar supressores genéticos de p.Ala222Val, primeiro estabelecemos a distribuição de variantes sinônimas no background p.Ala222Val e calculamos seus percentis 95 em cada concentração de folinato testada. Estes correspondem ao limite de pontuação de funcionalidade acima do qual uma variante provavelmente exibirá funcionalidade semelhante a p.Ala222Val em menos de 5% do tempo (ou seja, o limite que atinge um p empírico <0,05 em um teste unilateral). Em seguida, procuramos variantes que obtivessem um bom ajuste no modelo de interação genética (log probabilidade > −8) e tivessem uma probabilidade posterior superior a 95% de uma interação genética positiva (dependente ou independente de folinato). Em seguida, verificamos quais dessas variantes alcançaram pontuações de funcionalidade de dupla mutação que ficaram acima do limiar sinônimo acima mencionado em folinato baixo (12,5 μg/mL), folinato alto (200 μg/mL) ou todas as concentrações de folinato.
Simulação de dinâmica molecular do sítio de ligação do FAD
Usamos o Amber Modeler 9.24 para realizar simulações de dinâmica molecular no modelo estrutural descrito acima. As distâncias entre FAD, Trp165 e o sítio ativo para cada quadro de simulação foram calculadas e analisadas com código R personalizado (consulte a seção “disponibilidade de dados e código”). Um modelo de Markov da interação molecular detalhada também foi criado com código R personalizado. Uma descrição detalhada desta análise pode ser encontrada nos métodos suplementares C.
Identificação de variantes hipercomplementadoras
Para determinar o conjunto de variantes hipercomplementadoras, primeiro determinamos a distribuição dos escores de funcionalidade base de todas as variantes sinônimas medidas no contexto do WT. Então, para todas as variantes missense com funcionalidade base maior que 1 (= semelhante a WT), usamos o teste t de Welch (incorporando a média, desvio padrão e número de repetições de cada variante) para determinar se sua funcionalidade era significativamente maior que a distribuição da variante sinônima. Usamos o método de correção FDR de Benjamini & Hochberg para corrigir valores de p para testes de múltiplas hipóteses e variantes selecionadas que alcançaram FDR <5%.
Ensaio in vitro para atividade de MTHFR
Para testar se as variantes tiveram efeito na atividade da MTHFR e se esses efeitos foram alterados pela suplementação de FAD ou S-adenosilmetionina (SAM), usamos um ensaio in vitro conforme descrito anteriormente; usamos células 293T (ATCC: CRL-3216) modificadas por edição genética para abrigar knock-out de MTHFR (KO) ou variantes específicas. Em células MTHFR-KO 293T, a atividade específica foi medida após transfecção com vetor vazio (pcDNA-C-Flag-LIC), vetor contendo WT MTHFR (correspondente ao GenBank: NM_005957.5) ou construções variantes de MTHFR geradas por mutagênese dirigida ao local. O ensaio foi realizado em tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 6,6) sob concentrações saturantes de substrato (100 μM de metilenoTHF; 200 μM de NADPH) na ausência ou presença de 75 μM de FAD (para estudos de responsividade de FAD) ou na presença de 75 μM de FAD após pré-incubação por 5 min a 37°C com SAM purificado (para inibição de SAM estudos). O Ki para SAM foi estimado a partir de um gráfico de inibidor versus resposta e um ajuste de curva de quatro parâmetros (GraphPad Prism v8.00). Para estudos de tratamento térmico, as amostras foram incubadas a 46°C por 5 min antes do ensaio, sem suplementação de FAD ou com 75 μM de FAD suplementado antes ou depois do tratamento térmico, conforme descrito.
Conjuntos de variantes de referência de referência
Para avaliar a capacidade dos escores do mapa de prever a patogenicidade das variantes (e, em última análise, os fenótipos individuais), precisávamos estabelecer conjuntos de referência de variantes positivas e negativas. Uma descrição completa do processo pode ser encontrada nos métodos suplementares D. Em resumo, para o conjunto de referências positivas, os genótipos e fenótipos dos casos de hiperhomocisteinemia foram reunidos em grande parte a partir de publicações anteriores. As variantes que foram observadas com mais frequência em casos de início precoce do que em casos de início tardio foram incluídas no “conjunto de referência positiva de início precoce” (compreendendo 30 variantes), enquanto as variantes que foram observadas com mais frequência em casos de início tardio do que em casos de início precoce foram incluídas no “conjunto de referência de início tardio” (compreendendo 40 variantes). Os empates foram excluídos.
Para obter um conjunto de variantes de referência aleatórias, acessamos o gnomAD (uma coleção de genótipos destinados a ser composto principalmente de indivíduos não afetados) e filtramos por variantes MTHFR missense que preenchiam um dos dois critérios a seguir para enriquecer variantes provavelmente benignas: (i) a frequência global do alelo menor está acima de 1 em 10.000; ou (ii) pelo menos um caso homozigoto foi observado. Detalhes completos das etapas de filtragem podem ser encontrados nos métodos suplementares E.
Determinação de uma razão logarítmica de patogenicidade para cada variante
Visão geral da geração e validação do mapa de efeito de variante
(A) O processo de mapeamento de efeito variante.
(B) Distribuição de pontuações para variantes sinônimas, sem sentido e sem sentido no contexto do WT com suplementação de folinato de 12,5 μg/mL.
(C) O comportamento de p.Ala222Val através das concentrações de folinato. As barras de erro correspondem a SEM.
(D) A dependência de folinato é mostrada para a variante p.Ala461Ser em ambos os fundos WT (mutante único, preto) e p.Ala222Val (mutante duplo, azul). Os pontos de dados são coloridos de acordo com o histórico genético e as barras de erro representam SEM. As linhas mostram os modelos de melhor ajuste (parâmetros à direita). A linha laranja indica o comportamento duplo mutante esperado com base no modelo de regressão polinomial. As linhas pontilhadas vermelhas e verdes representam pontuações típicas do tipo nulo e do tipo WT, respectivamente. Equações de modelagem de mutantes simples e duplos são mostradas na parte inferior.
Mapas de efeitos variantes de MTHFR para funcionalidade de base, resposta de folinato e interações genéticas independentes e dependentes de folinato com p.Ala222Val
(A) Visualização de mapas em tamanho real.
(B) Visão expandida das posições 120–200. Em ordem decrescente, os mapas representam a funcionalidade básica (impacto funcional no fundo WT em baixos níveis de folinato); resposta funcional à suplementação de folinato; e independente de folinato; e interações genéticas dependentes com p.Ala222Val. Para cada mapa, o eixo x mostra a posição dos aminoácidos MTHFR e o eixo y corresponde a possíveis alterações de aminoácidos. Os tamanhos das barras diagonais indicam o erro estimado na pontuação correspondente. Quadrados cinza indicam dados faltantes e quadrados amarelos indicam o aminoácido WT em cada posição.
Modelagem da resposta à suplementação de folinato e interação genética
(A) Pontuações medianas de funcionalidade de variantes nas posições de aminoácidos com as seguintes propriedades: (1) abaixo de 20% de área de superfície acessível (ASA) no domínio catalítico; (2) acima de 50% de ASA no domínio catalítico; (3) dentro de 5Å do MTHF ligado; (4) dentro de 5Å do FAD ligado; (5) abaixo de 20% ASA no domínio regulatório; (6) acima de 50% ASA no domínio regulatório; (7) dentro de 5Å da SAH ligada; (8) redução de mais de 20% de AAS quando na forma de dímero. Os valores de p foram calculados pelo teste U de Mann-Whitney. As barras grossas e finas correspondem à mediana, aos quartis superior e inferior, respectivamente.
(B) Visualização da estrutura do MTHFR com resíduos coloridos de acordo com a intensidade média de variantes significativas responsivas ao folinato em cada posição. As posições vermelhas indicam uma resposta positiva ao folinato, as posições azuis indicam uma resposta negativa ao folinato e as posições brancas indicam nenhuma resposta. FAD e folinato são mostrados em representações de wireframe amarelo e verde.
(C) Gráficos de dispersão comparando a funcionalidade base do modelo de máxima verossimilhança (bi) e os parâmetros de resposta à suplementação de folinato para cada variante. A linha vermelha mostra uma mediana contínua ao longo do eixo x (tamanho do intervalo 0,1); as linhas pontilhadas em vermelho escuro, verde escuro e cinza indicam funcionalidade semelhante a nula, funcionalidade semelhante a WT e resposta zero, respectivamente.
Contexto estrutural e simulações de dinâmica molecular
(A) Modelo estrutural do domínio catalítico do MTHFR; a coloração está de acordo com a funcionalidade base mediana das substituições em cada posição. Modelos wireframe do análogo do folato (amarelo) e FAD (verde) são mostrados, juntamente com a alça desordenada (vermelho).
(B) Mapas térmicos de funcionalidade básica e resposta de suplementação de folinato para resíduos de alça desordenada; as cores são como na Figura 3.
(C) Fração do tempo de simulação MD gasto onde o carbono alfa do resíduo 165 era ≤9Å do grupo flavina FAD. Os valores de p são mostrados para testes U de Mann-Whitney.
(D) Fração do tempo de simulação gasto em estados onde o grupo FAD flavin estava ≤7Å do centro do sítio ativo. Os valores de p são mostrados para testes U de Mann-Whitney.
(E) Atividade enzimática específica das variantes WT e Trp165 na presença e ausência de FAD. As barras de erro mostram o desvio padrão.
(F) Atividade enzimática das variantes WT e Trp165 em relação à atividade enzimática da mesma variante na presença de FAD. As barras de erro mostram o desvio padrão.
(G) Um espaço de estado e modelo de transição de modos de ligação entre Trp165 e o grupo flavina FAD. O tamanho do círculo representa o tempo gasto em cada estado e a largura da seta representa a probabilidade de transição.
Hipercomplementação e perda de supressão de SAM
(A) Pontuações de efeito variante para resíduos dentro de 5Å do sítio de ligação SAM/SAH, indicando variantes hipomórficas (azul) e hipercomplementadoras (vermelhas).
(B) Esquerda: posições dos mesmos resíduos na estrutura 3D do MTHFR em relação ao SAH ligado.
(C e D) Atividade enzimática de p.Ala368Gly e p.Glu463Asn quando expressa em células HEK293. (C) Atividade absoluta em diferentes concentrações de SAM e (D) atividade relativa em resposta a concentrações crescentes de SAM são mostradas. As barras de erro mostram o desvio padrão.
Avaliação de mapas contra conjuntos de variantes de referência patogênicas e aleatórias
(A) A área sob a curva de recuperação de precisão balanceada (AUBPRC) para todos os mapas medidos experimentalmente e modelos derivados é mostrada em relação às concentrações de folinato (reais ou virtuais).
(B) Comparação das pontuações de funcionalidade no fundo p.Ala222Val e 25 μg/mL de folinato. As linhas tracejadas verde claro, verde escuro e vermelho correspondem a pontuações semelhantes a WT, semelhantes a fundo p.Ala222Val e semelhantes a nulo, respectivamente. As linhas em negrito e cinza claro mostram medianas e quartis, respectivamente. Os valores de p correspondem aos testes U de Mann-Whitney.
(C e D) Curvas individuais de recuperação de precisão de mapas e modelos selecionados, bem como preditores computacionais PolyPhen-2, PROVEAN, CADD, Deogen2 e SNAP2.
(E) Distribuição das razões log-verossimilhança de patogenicidade entre as concentrações de folinato em ambos os antecedentes.
A avaliação em relação aos conjuntos de referência mostrou que as pontuações de funcionalidade nos domínios catalítico e regulador não estavam numa escala comparável em termos de previsão da patogenicidade das variantes. Talvez não seja surpreendente que a extensão em que as células dependem de cada uma das funções da MTHFR seja diferente entre humanos e leveduras. Separadamente para cada um desses domínios, implementamos uma função de transformação para representar efeitos variantes em termos da força da evidência a favor e contra a patogenicidade, ou seja, uma razão log-verossimilhança de patogenicidade (LLRp). Para esse fim, usamos as distribuições de pontuações de funcionalidade para os conjuntos de referência positivos e aleatórios tanto para o mapa experimental de melhor desempenho (fundo p.Ala222Val a 25 μg/mL de folinato) quanto para o modelo linear com parâmetros de melhor desempenho (fundo de WT a 120 μg/mL de folinato; ver Figura 6A) para construir razões de verossimilhança, enquanto consideramos os domínios catalíticos e regulatórios separadamente. Os detalhes dos cálculos subjacentes podem ser encontrados nos métodos suplementares F.
Atribuição de pontuações personalizadas de funcionalidade MTHFR a genótipos diplóides
Como um conjunto de referência positivo de genótipos diplóides, extraímos de nossa tabela com curadoria de literatura casos que apresentavam pelo menos uma variante missense e forneciam informações sobre a idade de início e o status de p.Ala222Val. Como um conjunto de referência aleatório, obtivemos indivíduos de 1000 Genomas Fase III para os quais genótipos em fases no locus p.Ala222Val estavam disponíveis e selecionamos indivíduos com pelo menos uma variante missense.
Para fornecer modelos da relação entre genótipo diplóide e fenótipo, definimos quatro modelos diferentes de complexidade crescente. Todos os modelos envolveram a conversão de pontuações de funcionalidade para cada alelo em razões de log-verossimilhança de patogenicidade (como acima), usando a transformação apropriada, dependendo se a variante se enquadrava na região catalítica ou regulatória, conforme definido acima. Para refletir a natureza recessiva da deficiência de MTHFR, atribuímos um genótipo diplóide ao LLRp mais baixo (menos provável de ser patogênico) dos dois alelos. O primeiro modelo (M1) interpreta as variantes como se estivessem no contexto do WT, enquanto o segundo modelo (M2) leva em conta a interação genética. O terceiro modelo (M3) é responsável por uma variante comum cis adicional, p.Glu429Ala (E429A) e sua interação genética com p.Ala222Val. Uma descrição formal dos modelos pode ser encontrada em Métodos Suplementares G.
Resultados
Aplicando um ensaio funcional escalável a variantes missense de MTHFR
Testar funcionalmente todas as possíveis substituições de aminoácidos exige um ensaio escalável, que foi oferecido pelo fato de que a expressão de MTHFR humana permite que S. cerevisiae sem o ortólogo MET13 de MTHFR cresça sem metionina suplementada. Como a levedura (ao contrário dos humanos) pode sintetizar folato, utilizámos uma variante deste ensaio que permite o controlo externo do folato intracelular através da titulação do folinato em meio de crescimento. Depois de validar o sistema (Figura S1A), produzimos bibliotecas de cDNA mutagenizadas a partir de modelos de referência ("tipo selvagem"; WT) e variante p.Ala222Val. Geramos múltiplas bibliotecas de cDNA completas, cada uma direcionada por mutagênese dirigida por oligo em uma das quatro regiões. (Veja material e métodos para detalhes).
Bibliotecas mutagenizadas para cada região nos antecedentes WT e p.Ala222Val foram clonadas em massa em vetores de expressão de levedura e transformadas na cepa de ensaio (Figura 1A). Cada um dos conjuntos de cepas resultantes foi cultivado em condições seletivas e não seletivas em cada uma das quatro concentrações diferentes de folinato (12,5, 25, 100 e 200 μg/mL). A abundância relativa de variantes em cada conjunto pós-crescimento foi avaliada através de 2 milhões de leituras de sequenciamento da região mutagenizada de cada biblioteca. (Veja material e métodos para detalhes).
Uma pontuação de funcionalidade e erro de medição associado foram derivados para cada variante em cada concentração de folinato e antecedentes genéticos. Depois de filtrar as pontuações para substituições de aminoácidos que foram mal medidas (por exemplo, porque não estavam bem representadas na biblioteca não seletiva), obtivemos pontuações para 91% (± 0,3%) e 88% (± 0,8%) dos 13.776 possíveis resultados mutacionais (alterações de aminoácidos, absurdos ou sinônimos) em WT e p.Ala222Val-background MTHFR, respectivamente (as pontuações foram calculadas em média entre condições de folinato; ver Tabela S1 para detalhes). As pontuações de funcionalidade foram reescalonadas de modo que uma pontuação de 0 corresponda a uma perda completa de função e uma pontuação de 1 corresponda ao crescimento semelhante ao WT, produzindo assim um atlas de 98.336 pontuações de efeito variante MTHFR-missense, coletadas em oito diferentes contextos ambientais/genéticos.
Os escores de funcionalidade de variantes sinônimas e sem sentido foram geralmente bem separados uns dos outros, e a distribuição dos escores de funcionalidade da variante missense pareceu ser bimodal (Figura 1B), indicando que muitas variantes missense do MTHFR têm toda ou nenhuma função e que uma minoria tem efeitos intermediários (ver material e métodos para obter detalhes).
A conhecida variante hipomórfica p.Ala222Val foi pontuada em 41,8% da funcionalidade WT na condição de folinato mais baixa; essa pontuação aumentou com a concentração de folinato (Figura 1C), consistente com relatos anteriores de que p.Ala222Val reduziu a atividade enzimática de WT e é remediável pela suplementação de folinato. Uma grande fração de outras variantes foi menos funcional no contexto p.Ala222Val do que no contexto WT. Entre 11.902 variantes missense medidas nos mapas, 5.836 foram significativamente menos funcionais no fundo p.Ala222Val (teste de Welch com FDR q <0,05) em pelo menos uma concentração de folinato testada, e 1.203 variantes foram significativamente menos funcionais em todas as concentrações testadas. Por outro lado, apenas 20 variantes foram significativamente mais funcionais em p.Ala222Val em todas as concentrações, e 372 variantes foram mais funcionais em pelo menos uma concentração (uma lista completa das variantes afetadas está na Tabela S2). Comparamos nosso atlas com medições de atividade enzimática de baixo rendimento publicadas anteriormente para sete variantes em origens WT e p.Ala222Val. Encontramos uma alta correlação com nossos mapas, especialmente em níveis elevados de folinato (200 μg/mL) (rho de Spearman = 0,93; Figura S1B).
Modelagem de “funcionalidade básica”, resposta ao folinato e interação genética
Para cada variante, usamos um modelo linear para inferir uma pontuação de “funcionalidade básica” (independente de folinato) (b) e uma pontuação de responsividade ao folinato (r) para obter modelos bem ajustados para 78% das variantes (Figura S3A). Um exemplo de ajuste é mostrado na Figura 1D (linha preta). Também estimamos a probabilidade do modelo de cada variante em relação a um modelo de controle mais simples que não capturou a capacidade de resposta ao folinato. Por exemplo, as quatro medições do próprio p.Ala222Val dos quatro mapas WT foram 6 × 1014 vezes mais prováveis no modelo linear (no qual a pontuação de funcionalidade aumentou 0,0016 para cada μg/mL de suplementação de folinato) do que no modelo de controle de melhor ajuste. Como outro exemplo, nossos dados para p.Trp165Cys (discutidos mais abaixo) são 5 × 1039 vezes mais prováveis no modelo linear do que no modelo de controle, e a pontuação de funcionalidade aumenta 0,0027 por μg/mL de folinato. Das 12.620 variantes de MTHFR modeladas com sucesso, pudemos identificar com segurança 895 (7%) como sendo responsivas ao folinato (Tabela S2). (Veja Métodos Suplementares para detalhes.)
Para capturar interações genéticas entre cada variante e o polimorfismo p.Ala222Val comum (ou seja, casos em que os efeitos fenotípicos de uma combinação de duas variantes se desviam da expectativa), inicialmente modelamos o comportamento esperado de mutantes duplos por meio de regressão polinomial, tomando pontuações de funcionalidade para as duas pontuações de mutantes individuais correspondentes como entradas (Figura S3B, Figura 1D, linha laranja). Em seguida, modelamos a força de interação genética (ε) para cada variante como a soma dos termos de interação genética independente de folinato (εb) e dependente de folinato (εr). Identificamos todas as variantes que partiram com segurança de modelos mais simples, faltando toda a interação genética ou apenas termos de interação genética dependentes de folinato. Das 10.136 variantes modeladas, descobrimos que 3.359 (33,2%) interagem geneticamente com p.Ala222Val; 2.839 (28%) têm interação genética independente de folinato e 521 (5,1%) têm interação genética dependente de folinato (Tabela S2). (Veja métodos suplementares para detalhes.)
Os parâmetros de melhor ajuste deste modelo nos permitem descrever variantes de MTHFR em termos de quatro características: (1) funcionalidade geral da variante, (2) impacto da suplementação de folinato na função variante e (3) independente de folinato de cada variante e (4) interações genéticas dependentes de folinato com o fundo comum de p.Ala222Val. A Figura 2 mostra um mapa de efeito variante para cada uma dessas características para um segmento de MTHFR (o conjunto completo de mapas ao longo de todo o comprimento da proteína é mostrado na Figura S4).
O contexto estrutural dos efeitos variantes
O MTHFR eucariótico possui dois domínios conectados por uma curta sequência ligante. Um domínio catalítico N-terminal em uma dobra do barril TIM mantém o FAD como um cofator no sítio ativo, que está localizado no topo do barril. O domínio regulador C-terminal inclui uma interface de homodimerização e um único sítio de ligação que pode conter S-adenosilmetionina (SAM) ou S-adenosil-homocisteína (SAH). SAM induz uma mudança conformacional que se propaga através do domínio ligante MTHFR para inativar o domínio catalítico. A SAH liga-se competitivamente e bloqueia a inibição do SAM. Uma região curta, desordenada e rica em serina no terminal N abriga muitos locais de fosforilação que podem produzir maior sensibilidade à inibição de SAM.
A funcionalidade substancialmente reduzida das variantes no domínio catalítico em relação ao domínio regulatório foi visualmente evidente em todos os mapas (p < 2,2 × 10-16; Mann-Whitney U = 1 × 107). Esse fenômeno também foi observado (p = 0,015; Mann-Whitney U = 22) para o subconjunto de variantes presentes em uma coorte de referência aleatória (ver material e métodos). Um impacto geral maior para resíduos catalíticos é consistente com uma frequência alélica mediana significativamente menor de variantes de coorte de referência aleatória no domínio catalítico (p = 0,026; Mann-Whitney U = 45) e com a observação de que 12 das 13 variantes missense observadas como homozigotas na coorte de referência aleatória estavam localizadas no domínio regulatório.
Esperava-se que os resíduos no núcleo da proteína e nas interfaces de ligação fossem mais sensíveis à mutação do que os resíduos não interfaciais na superfície. De fato, para aminoácidos com <20% de área de superfície acessível ao solvente (ASA), a pontuação mediana de substituições foi inferior à de aminoácidos com> 50% de AAS, tanto no domínio regulatório quanto no domínio catalítico (Δmediana = 0,151 e Δmediana = 0,545 e p = 1,6 × 10−8 e p = 5,3 × 10−12, respectivamente, por Mann-Whitney U teste; Figura 3A). Da mesma forma, para aminoácidos dentro de 5Å dos locais de ligação do substrato (5,10-metilenotetrahidrofolato) ou cofator (FAD) no domínio catalítico, as substituições mostraram defeitos de funcionalidade mais graves do que aqueles nos resíduos de superfície (Δmediana = 0,518 e Δmediana = 0,59 e p = 3,3 × 10−4 e p = 1,4 × 10−4, respectivamente, por Mann-Whitney teste U). Curiosamente, no entanto, os resíduos dentro de 5Å da SAH ligada (ligação ao domínio regulador) não exibiram pontuações mais baixas do que os resíduos superficiais. Isto pode indicar que a supressão de SAM não é estritamente necessária para o crescimento celular nas condições do nosso ensaio. Da mesma forma, as pontuações para resíduos localizados na interface de dimerização não foram inferiores às pontuações para resíduos localizados na superfície restante do domínio regulador, o que corresponde a observações anteriores de que a dimerização não é estritamente necessária para a função MTHFR.
O contexto estrutural das interações ambientais e genéticas
Nossa hipótese é que a responsividade ao folinato dos efeitos variantes seria enriquecida dentro do domínio catalítico da MTHFR, e este foi de fato o caso (OR = 3,32 e p < 2,2 × 10−16, teste exato de Fisher). A capacidade de resposta ao folinato foi mais evidente na metade do domínio catalítico que é espacialmente proximal ao domínio regulatório (Figura 3B), incluindo um hotspot proeminente em torno da posição 325 na proximidade estrutural da cauda poliglutamil do folato e na posição 165 dentro de uma alça desordenada (explorado mais abaixo). Pontos de acesso adicionais de responsividade ao folinato também foram observados em outras estruturas de loop (ordenadas) próximas às posições de aminoácidos 200, 230 e 270, que juntas formam um agrupamento estrutural próximo ao local de ligação do FAD.
Uma comparação direta das pontuações básicas de funcionalidade e capacidade de resposta (Figura 3C) para os modelos de mais alta qualidade (probabilidade logarítmica> -6) revelou que as variantes hipomórficas são as mais propensas a responder à suplementação de folinato, enquanto as variantes semelhantes a nulas e semelhantes a WT tiveram menor probabilidade de responder.
Avaliando a tendência de diferentes regiões estruturais de exibir interação genética, descobrimos que a região rica em serina, juntamente com as metades N-terminais de ambos os domínios catalítico e regulador, é enriquecida para interações genéticas dependentes e independentes de folinato. Um hotspot adicional de interações independentes de folinato foi observado nas posições 560-610, e o enriquecimento para interações dependentes de folinato foi observado nas posições 320-330 (Figura S3C).
Para determinar se existem variantes que podem suprimir os efeitos hipomórficos do alelo p.Ala222Val, procuramos variantes bem modeladas com interações genéticas positivas confiáveis, onde a funcionalidade duplo mutante foi significativamente maior que a do p.Ala222Val sozinho (ver material e métodos para detalhes). Das 10.136 variantes bem modeladas, 636 (6,3%) suprimiram p.Ala222Val. Estes poderiam ser subdivididos em 232 supressores independentes de folinato, 385 variantes que suprimiam apenas p.Ala222Val em níveis baixos de folinato e 19 variantes que suprimiam apenas em níveis elevados de folinato. A Figura S3D mostra o supressor mais forte em cada categoria. Considerando apenas as substituições que podem resultar de uma substituição de nucleotídeo único (e, portanto, são mais prováveis de serem observadas em populações humanas), encontramos 70 supressores independentes de folinato, 152 com baixo teor de folinato e 10 com alto teor de folinato. (Veja a Tabela S2 para a lista completa).
Um loop desordenado pode servir para amarrar o cofator FAD
Uma estrutura cristalina para o MTHFR humano revelou uma alça desordenada e não conservada, que se estende dos resíduos 159 a 174 dentro do domínio catalítico, para “salvar” o sítio ativo (Figura 4A). Os resíduos de loop, em forte contraste com o domínio catalítico circundante, eram geralmente tolerantes à mutação em nosso atlas (Figura 4B). Embora cercado por posições de alça tolerantes, o triptofano na posição 165 mostrou defeitos de funcionalidade fortes e dependentes de folinato para a maioria das substituições de aminoácidos (Figura 4B). Dada uma relação previamente observada entre os níveis de folinato e a retenção do cofator FAD na variante p.Ala222Val, bem como nossa observação derivada do atlas de impactos na funcionalidade dependente de folinato em uma alça proximal ao sítio de ligação do FAD, nos perguntamos se Trp165 poderia ser importante para a retenção de FAD na ausência do substrato derivado do ácido folínico do MTHFR.
Para explorar mais de perto o papel deste loop, realizamos simulações de dinâmica molecular para a proteína WT, para a substituição polar p.Trp165Gln e para a substituição aromática p.Trp165Tyr. Sob todas as condições iniciais examinadas, o Trp165 tendeu a associar-se ao grupo flavina do cofator FAD, frequentemente com orientações sugerindo uma pilha π entre anéis aromáticos. Consistente com as pontuações do mapa funcionalmente anormais para p.Trp165Gln, o carbono alfa do resíduo desviou-se significativamente mais frequentemente da flavina FAD do que na estrutura WT (p = 0,0001, teste U de Mann-Whitney) (Figura 4C) ou com substituição aromática p.Trp165Tyr (p = 0,019, teste U de Mann-Whitney). (Veja material e métodos para detalhes).
Para testar a hipótese de que o loop, via ligação ao Trp165, serve para reter o FAD no sítio ativo, também avaliamos os movimentos do FAD no mesmo conjunto de simulações. Embora um deslocamento> 7Å do FAD para longe do sítio ativo tenha sido numericamente mais comum para a substituição aromática p.Trp165Tyr, a diferença não foi significativa (p = 0,15, teste U de Mann-Whitney). No entanto, o deslocamento FAD foi significativamente mais comum para p.Trp165Gln do que para WT (p = 0,003, teste U de Mann-Whitney) (Figura 4D; consulte material e métodos para obter detalhes).
Como o p.Trp165Gln e outras substituições não aromáticas do Trp165 exibiram um forte impacto apenas sob condições de baixo teor de folato, nos perguntamos se o deslocamento do FAD é resgatado pela presença de folato. Repetindo nossas simulações na presença do análogo de THF LY309887, observamos numericamente menos deslocamento de FAD para p.Trp165Gln e p.Trp165Tyr; houve redução significativa para este último (p = 0,029, teste U de Mann-Whitney).
Em seguida, desejamos confirmar o efeito desses mutantes na atividade enzimática in vitro (ver material e métodos). Consistente com nossas simulações, o ensaio de atividade mostrou que tanto o p.Trp165Gln quanto o p.Trp165Tyr reduziram a atividade enzimática em comparação com a do WT; p.Trp165Tyr foi menos severamente impactado (Figura 4E). Nas comparações da atividade in vitro na presença e ausência de FAD, ambas as variantes pareceram ser mais responsivas à suplementação de FAD do que o WT, consistente com a retenção diminuída de FAD endógeno (Figura 4F).
Também queríamos examinar se essas variantes afetavam a estabilidade das proteínas. Avaliamos a atividade para variantes específicas de MTHFR após tratamento térmico antes, depois e sem suplementação de FAD. Para o controle p.Ala222Val, a atividade enzimática foi completamente perdida e não se recuperou a menos que o FAD fosse suplementado antes da desnaturação térmica, como esperado. Por outro lado, as variantes Trp165, como WT: (1) retiveram alguma atividade após o tratamento térmico mesmo sem a suplementação de FAD, (2) retiveram mais atividade quando o FAD foi suplementado após o tratamento térmico e (3) foram completamente protegidas pela adição de FAD antes do tratamento térmico (Figura S5). Isto sugere que as variantes do Trp165, consistentes com a sua posição numa alça flexível, não reduzem a estabilidade global da proteína. No entanto, de acordo com o resultado da nossa simulação, estes resultados também sugerem que as variantes do Trp165 afetam a ligação do FAD e que há um impacto maior para a substituição não aromática do p.Trp165Gln.
Para explorar ainda mais a interação entre Trp165 e FAD, examinamos as simulações MD com mais detalhes. Agrupamos espacialmente estruturas de todos os pontos no tempo das simulações WT com base na posição relativa e orientação dos anéis aromáticos de FAD e Trp165. Isto identificou oito modos de ligação distintos (ver material e métodos). Também extraímos taxas de transição para criar um modelo de transição de estado (Figura 4G), mostrando que todos os estados observados “alimentaram” dois modos dominantes, cobrindo juntos 96% dos pontos no tempo. Em ambos os modos dominantes, é aparente uma interação de empilhamento π entre Trp165 e o grupo flavina.
Juntos, nossos resultados indicam que esta alça desordenada, na ausência de folato e via interação direta de empilhamento π entre Trp165 e o grupo flavina do FAD, auxilia na retenção de FAD. Este papel parece ser parcialmente resgatável por outros resíduos aromáticos na posição 165. Na presença de folato, o Trp165 não parece ser necessário para a retenção de FAD. Isto é mais provável porque o próprio folato, através de interações de empilhamento π entre a flavina do FAD e o grupo pteroil do folato, mantém o FAD no lugar.
Hipercomplementação aponta para perda de supressão de SAM
Identificamos 896 variantes que proporcionaram resgate de crescimento além do WT MTHFR (FDR <5%; ver material e métodos), um fenômeno previamente descrito como “hipercomplementação”. Tanto a inspeção visual do mapa de funcionalidade geral quanto a análise estatística mostraram que o domínio regulatório foi enriquecido para hipercomplementação (OR = 3,07; p = 2,2 × 10−16, teste exato de Fisher; ver Figuras S4 e S6A).
A hipercomplementação poderia surgir da interrupção da capacidade do domínio regulatório de suprimir o MTHFR na ligação do SAM, tornando-o assim constitutivamente ativo. Supondo que as alterações de aminoácidos próximas ao sítio de ligação do SAM têm maior probabilidade de perturbar essa interface, descobrimos que os resíduos cujas áreas de superfície são mais de 60% enterradas pelo SAM têm maior probabilidade de hipercomplementar do que outros resíduos do domínio regulatório (teste exato de Fisher: OR = 1,69, p = 6,3 × 10−4, Figura S6A). Da mesma forma, hipotetizando que as variantes que reduzem a capacidade do MTHFR de distinguir SAM de SAH estariam próximas do grupo metil SAM, descobrimos que 16 dos 20 aminoácidos dentro de 5Å do grupo metil possuem múltiplas variantes de hipercomplementação (Figuras 5A e 5B). Estes incluíram Ala368, previamente modelado para colidir estericamente com o grupo metil SAM, e Glu463, previamente previsto como necessário para a ligação de SAM. Nessas duas posições, as variantes p.Ala368Gly e p.Glu463Asn mostraram fenótipos de hipercomplementação particularmente fortes (Figura 5A).
Para testar se p.Ala368Gly e p.Glu463Asn diminuem a supressão de SAM, usamos um ensaio baseado em células humanas estabelecido para examinar a atividade de reação direta de MTHFR para estas e outras variantes nessas posições de aminoácidos (Figuras 5C e 5D e Figura S6). Ensaios de atividade de proteínas superexpressas em células MTHFR-KO HEK293 (Figura S6) e de proteínas endógenas após edição genética (Figuras 5C e 5D) mostraram que cada variante tem atividade máxima semelhante a WT (Figura 5C e Figura S6B). Embora as variantes em Ala368 fossem suprimíveis aumentando os níveis de SAM da mesma maneira que os controles (Figura 5D e Figura S6C), as variantes em Glu463 mostraram uma perda de supressibilidade de SAM (Figura 5D e Figura S6D).
Mapas de efeitos variantes do MTHFR correlacionam-se com patogenicidade variante
Para avaliar inicialmente o valor potencial do nosso atlas para interpretação de variantes clínicas, examinamos variantes de MTHFR previamente observadas em sequenciamento clínico por Invitae. Embora os fenótipos não estejam disponíveis para indivíduos sequenciados, sabe-se qual painel de genes o médico solicitou para sequenciamento. Painéis específicos de doenças (homocistinúria, defeitos de oxidação de ácidos graxos e doença neurometabólica) produziram variantes com pontuações de mapa significativamente mais baixas (Figura S7A; teste U de Mann-Whitney, p = 0,031) do que painéis não específicos (por exemplo, telas de portador e exoma; consulte métodos suplementares para obter detalhes de métodos estatísticos).
Para permitir a avaliação do atlas, estabelecemos uma referência composta por um conjunto de variantes de referência positivas, com curadoria de literatura, que apareceram com mais frequência em indivíduos com homocistinúria de início precoce (ver material e métodos) e o conjunto de referência aleatório de variantes descrito acima, encontrado na população em geral. Avaliamos a área sob a curva de recuperação de precisão balanceada (AUBPRC; consulte métodos suplementares H) para o seguinte: cada mapa individual, mapas derivados da média de WT e da média das pontuações p.Ala222Val e um único mapa combinado derivado de uma média de todos os mapas, bem como “mapas virtuais” com pontuações interpoladas de 0 a 200 μg/mL de folinato (Figura 6A).
As pontuações tenderam, como esperado, a ser mais baixas para variantes positivas do que para variantes de conjunto aleatório, mas foram visivelmente mais baixas no domínio catalítico do que no domínio regulatório (Figura 6B). Embora isto se deva em grande parte ao facto de as variantes de referência positivas terem pontuações mais baixas no domínio catalítico do que no domínio regulador, isto também se aplicava às pontuações das variantes de referência aleatórias (teste U de Mann-Whitney, p = 0,015). Descobrimos que todos os mapas e modelos tiveram um desempenho muito melhor para o domínio catalítico (AUBPRC máximo = 0,97) do que para o domínio regulatório (AUBPRC máximo = 0,78). Embora a diferença entre pontuações de variantes positivas e aleatórias tenha sido significativa no domínio catalítico (teste U de Mann-Whitney, p = 1,65 × 10−4), foi apenas sugestiva no domínio regulatório (p = 0,08). Para ambos os domínios, o mapa de fundo p.Ala222Val a 25 μg/mL de folinato (“AV25”) teve o melhor desempenho (p < 0,001, consulte material e métodos para obter detalhes do teste). Curiosamente, entre os 78 indivíduos para os quais o status p.Ala222Val estava disponível, a presença de p.Ala222Val foi acentuadamente elevada entre os casos de homocistinúria (OR = 15,7; p < 2,2 × 10-16; teste exato de Fisher), explicando por que um mapa no background p.Ala222Val foi o mais preditivo.
Avaliamos a capacidade do mapa AV25 de distinguir variantes de referência positivas de aleatórias e comparamos os resultados com múltiplos preditores computacionais. Examinando o domínio regulatório separadamente, o mapa AV25 mostrou um AUBPRC de 0,78, que foi estatisticamente indistinguível daquele de PROVEAN (0,77), PolyPhen-2 (0,66), SNAP2 (0,67), CADD (0,81) e Deogen2 (0,8). A fração de variantes de referência positivas que puderam ser recuperadas em um limite de precisão rigoroso (recuperação com precisão de 90%, ou R90P) foi de 29% para AV25, o que foi numericamente melhor que o método computacional (R90P foi de 17%, 0%, 0%, 0% e 8% para PolyPhen-2, PROVEAN, SNAP2, CADD e Deogen2, respectivamente). (veja material e métodos para detalhes).
Para o domínio catalítico, a comparação foi mais clara (ver Figura 6C). Aqui, AV25 alcançou um AUBPRC de 0,97, que superou todos os preditores computacionais testados: os valores de AUBPRC foram 0,74, 0,85, 0,76, 0,73 e 0,76 para PolyPhen-2, PROVEAN, SNAP2, CADD e Deogen2, respectivamente. Nosso mapa AV25 mostrou um R90P de 75%, que foi novamente superior ao obtido por cada um dos métodos computacionais: os valores de R90P foram 0%, 44%, 11%, 0% e 33% para PolyPhen-2, PROVEAN, SNAP2, CADD e Deogen2, respectivamente. Assim, embora o mapa AV25 tenha um desempenho apenas igual aos métodos computacionais para o domínio regulatório, ele superou claramente os métodos computacionais na identificação da variação patogênica no domínio catalítico.
Para fornecer evidências para a interpretação de variantes clínicas dentro de uma estrutura Bayesiana, derivamos uma razão log-verossimilhança (LLRp) de patogenicidade para cada variante, tratando os domínios catalíticos e regulatórios separadamente (ver material e métodos e Tabela S2). As respectivas formas das funções LLRp (Figura S7C) mostram que, embora as pontuações do domínio regulatório tendam a ser úteis apenas para prever a patogenicidade, as pontuações no domínio catalítico podem fornecer fortes evidências de patogenicidade ou benignidade. Os valores de LLRp calculados com nossos modelos lineares para todas as concentrações possíveis de folinato até 200 μg/mL em ambos os antecedentes mostraram um impacto claro para p.Ala222Val na probabilidade de patogenicidade e na dependência da patogenicidade nos níveis de folinato (Figura 6E).
Por fim, comparamos as pontuações do mapa AV25 com medições de atividades enzimáticas in vivo selecionadas pela literatura. Embora as atividades medidas para as mesmas variantes muitas vezes variassem consideravelmente na literatura, ainda assim observamos uma correlação significativa (r = 0,48; p = 9,9 × 10−5; Figura S7B). De acordo com as nossas observações no nosso mapa, as variantes do domínio regulador tenderam a apresentar maior atividade enzimática.
Atribuição de pontuações personalizadas de funcionalidade MTHFR a genótipos diplóides
Dos casos de deficiência de MTHFR para os quais tínhamos dados (Tabela S3A), 27 tinham pelo menos uma variante missense. Estes produziram uma coorte de referência positiva de 15 indivíduos com deficiência de MTHFR de início precoce e 12 com deficiência de MTHFR de início tardio. Como uma coorte de referência aleatória (Tabela S3B), utilizamos genótipos diplóides em fases para 77 indivíduos do Projeto 1000 Genomas.
Predição diplóide de genótipo para fenótipo
(A) Representações formais dos três modelos testados com uma variante de exemplo.
(B) As previsões do modelo para todas as coortes de referência de início precoce, de início tardio e aleatórias à medida que mudam com o aumento da complexidade do modelo.
(C e D) Curva de recordação de precisão de todos os modelos, avaliada em casos de início precoce versus indivíduos de referência aleatórios (C) e indivíduos de início precoce versus indivíduos de início tardio (D).
Para atribuir pontuações individualizadas a genótipos diplóides, desenvolvemos uma série de três modelos (Figura 7A; material e métodos), diferindo apenas em como a presença de múltiplas variantes in cis deve ser tratada para o cálculo de uma pontuação alélica. O primeiro modelo (M1) foi o mais ingênuo, pois pontuou apenas a variante rara em cada alelo (não vimos casos de múltiplos em variantes missense raras cis) e ignorou a presença de variantes comuns (p.Ala222Val e p.Glu429Ala). O segundo modelo (M2) explorou nosso mapa de interações genéticas com p.Ala222Val para cada variante. Finalmente, o terceiro modelo (M3) considerou p.Glu429Ala e utilizou o modelo de interação genética para combinar a variante rara com p.Ala222Val e uma regra de produto simples para contabilizar impactos adicionais de p.Glu429Ala. Cada modelo então derivou uma pontuação LLR para cada indivíduo, tomando o mínimo dos dois LLRs de cada indivíduo de seus dois alelos em trans.
Avaliamos a capacidade de cada modelo de distinguir casos de início precoce de indivíduos de referência aleatórios (Figuras 7B e 7C). As mudanças entre M2 e M3 foram sutis e não resultaram em diferenças na ordem de classificação entre os dois modelos. Assim, suas curvas PRC foram idênticas e ambas superaram significativamente o modelo ingênuo M1 (p = 0,009; AUBPRCs 0,96 e 0,96 versus AUBPRC 0,95).
Finalmente, queríamos avaliar os modelos em termos da tarefa muito mais desafiadora de distinguir entre casos de início precoce e de início tardio. Os modelos M1, M2 e M3 produziram desempenhos AUBPRC estatisticamente indistinguíveis (p > 0,17 para todas as comparações pareadas) de 0,76, 0,67 e 0,67, respectivamente. O modelo M1 foi significativamente melhor que a adivinhação aleatória (p = 0,005), enquanto os modelos M2 e M3 ainda foram fortemente sugestivos (p = 0,071 e 0,071), apesar de suas funções LLR não terem sido calibradas para esta distinção.
Discussão
A consideração dos fatores que influenciam a penetrância da variação genética no MTHFR nos levou a avaliar a função das variantes em diferentes ambientes (níveis de folinato) e origens genéticas (WT e p.Ala222Val). Fomos assim capazes de enumerar de forma abrangente estes efeitos e mostrar que tanto o folinato como o p.Ala222Val modulam substancialmente os efeitos de muitas variantes.
Usando nosso atlas, obtivemos novos insights sobre múltiplos mecanismos bioquímicos dentro da MTHFR e especificamente sobre o papel de uma alça desordenada na retenção de cofatores e o mecanismo de inibição da MTHFR mediada por SAM. Este último também levou à descoberta de variantes específicas que suprimem a inibição mediada por SAM e, assim, levam à hiperatividade da enzima.
Várias observações gerais podem ser feitas a partir do atlas (Figura 3 e Figura S4). Por exemplo, as variantes no domínio catalítico pareciam substancialmente menos adequadas do que aquelas no domínio regulador. Embora visualmente evidente em todos os mapas, isto pode ser um artefato de um ensaio de levedura que não reflete as condições fisiológicas humanas. A ideia de que variantes na região catalítica tendem a ter impactos mais fortes em humanos é apoiada por (1) a observação de que variantes da região catalítica da coorte de referência aleatória derivada de gnomAD tendem a ter frequências alélicas mais baixas e a serem menos frequentemente homozigóticas do que aquelas na região regulatória e (2) por medições de atividade enzimática com curadoria de literatura para casos de homocistinemia que mostraram maior atividade para variantes regulatórias do que para variantes de domínio catalítico.
Observou-se que a maioria das variantes no núcleo hidrofóbico, no sítio ativo e em outras interfaces de interação molecular eram funcionalmente anormais (Figura 1D). Curiosamente, os resíduos localizados na interface de dimerização não foram significativamente mais sensíveis à mutação do que a superfície restante do domínio regulador, correspondendo às observações de que a dimerização não é estritamente necessária para a função do MTHFR.
Nosso atlas ofereceu informações sobre dois novos aspectos da bioquímica do MTHFR. Uma alça desordenada que se estende pelas posições 159-174 foi implicada como uma “ligação” potencial para um resíduo aromático na posição 165. Este resíduo é, na ausência de folato, modelado como formando uma interação de empilhamento ⊓ com o grupo flavina do FAD e auxiliando assim na retenção do cofator FAD. Curiosamente, em E. coli e S. cerevisiae, esse loop é mais curto (PDB: 6PEY e PDB: 6FNU) e não contém resíduos aromáticos. O fato de que tanto E. coli quanto S. cerevisiae, diferentemente dos mamíferos, são capazes de biossíntese de folato e, portanto, não dependem de folato na dieta, sugere que a origem dessa característica é a seleção natural para a capacidade de manter a função enzimática em baixas concentrações de substrato.
Ao examinar as tendências gerais relacionadas à responsividade ao folinato, descobrimos que os hipomorfos têm maior probabilidade de responder ao folinato do que as variantes neutras e as variantes semelhantes a nulas (Figura 2D). Isto reflete observações semelhantes que foram feitas em relação às variantes responsivas à vitamina B6 na proteína cistationina beta-sintase (CBS) e é consistente com a ideia de que os hipomorfos são mais propensos a se beneficiar do acompanhamento de moléculas pequenas.
Outro insight bioquímico foi a perda (confirmada experimentalmente) da supressão de SAM na variante Glu463Asn, conforme previsto pela hipercomplementação no atlas. Muitas variantes no domínio regulatório mostraram hipercomplementação, possivelmente devido à interrupção da supressão do SAM. A supressão reduzida de SAM pode resultar de múltiplos mecanismos, por exemplo, interrupção da interface de ligação SAM/SAH, a capacidade de distinguir entre SAM e SAH, a mudança conformacional necessária para propagar a detecção de SAM ou estabilidade do domínio regulatório. No entanto, as pontuações do nosso atlas não conseguem distinguir entre esses mecanismos.
Isto levanta a questão de quais efeitos (se houver) as variantes de hipercomplementação do MTHFR podem ter na saúde humana. Embora p.Glu463Asn ainda não tenha sido observado em seres humanos, duas outras variantes que aparecem como hipercomplementadores em nosso ensaio foram observadas em casos de deficiência de MTHFR de início tardio: p.Arg325Cys e p.Val575Gly. O primeiro afeta uma arginina estruturalmente próxima da cauda de poliglutamilação carregada negativamente dos folatos ligados. Isto poderia alterar a cinética enzimática. No entanto, também é possível que a poliglutamilação do folato funcione de maneira ligeiramente diferente em leveduras e em humanos. A última variante, p.Val575Gly, substitui uma valina envolvida em múltiplas interações hidrofóbicas no núcleo do domínio regulador por uma glicina. Isto pode afectar a dobra do domínio regulador, por exemplo, a sua estabilidade, para tornar o MTHFR constitutivamente activo.
O atlas revelou padrões interessantes de interações genéticas com a variante comum p.Ala222Val. Descobriu-se que a região rica em serina, o ligante entre domínios e as metades N-terminais de ambos os domínios catalítico e regulador são enriquecidos para interações genéticas. Estruturalmente, estas regiões estão todas em contato direto umas com as outras (agrupadas em torno do ligante) e provavelmente desempenham um papel na mudança conformacional alostérica induzida pelo SAM. Pontos de acesso adicionais de interação genética foram observados. Por exemplo, as posições 324-329 formam um ponto de acesso de interação positiva no topo de uma hélice alfa de barril TIM e perto da cauda poliglutamil do folato. A maioria das substituições neste hotspot pareciam hipomórficas; muitas substituições hidrofóbicas foram fortemente remediáveis com folinato, e as substituições polares mostraram interação genética positiva com p.Ala222Val, sugerindo que esses resíduos controlam a afinidade do substrato (a diminuição da afinidade seria remediável por maior concentração de substrato, enquanto a ocupação aumentada de folato tenderia a reter FAD e resgatar p.Ala222Val). Um ponto de acesso de interação negativa pode ser encontrado nos resíduos 200-207, que formam uma pequena alça que cobre o grupo adenosina do FAD, e as mutações aqui podem diminuir a retenção do FAD e, assim, exacerbar os efeitos do p.Ala222Val. Embora seja necessária modelagem mecanística adicional, nosso mapa de interações genéticas positivas e negativas com p.Ala222Val, exibindo componentes dependentes e independentes de folinato, pode ajudar a distinguir entre possíveis modelos da interação complexa entre p.Ala222Val e funções catalíticas e regulatórias.
Para a variante comum p.Glu429Ala, nosso mapa indicou neutralidade, mas também interação genética negativa com p.Ala222Val. Estruturalmente, o Glu429 está localizado na superfície do domínio regulador, onde o seu resíduo hidrofílico é exposto ao solvente circundante para estabilizar o domínio regulador do MTHFR. Se o p.Glu429Ala alterar ligeiramente a estabilidade do domínio regulador, isso poderia explicar a sua interação negativa com o p.Ala222Val. No entanto, a co-ocorrência in cis destes polimorfismos é bastante rara (encontrada em nenhum dos casos de homocistinemia que consideramos e em apenas um indivíduo no conjunto de dados de controle de 1000 Genomas).
Embora apenas o diagnóstico precoce e a terapia oportuna possam prevenir complicações a longo prazo em indivíduos com homocistinúrias, apenas alguns programas de triagem neonatal em todo o mundo visam a deficiência de MTHFR. Isso ocorre porque a triagem para níveis reduzidos de metionina em manchas de sangue seco tem baixa sensibilidade e porque a triagem de tHcy como marcador primário é cara. Portanto, vale a pena considerar se futuros programas de triagem neonatal baseados no sequenciamento do genoma (com testes subsequentes de tHcy, se indicado) poderiam melhorar a detecção precoce e os resultados da deficiência de MTHFR.
Na previsão da patogenicidade das variantes, as pontuações do nosso mapa superaram em muito uma série de preditores computacionais, especialmente no domínio catalítico. No domínio regulatório, alguns preditores baseados na conservação, como o PROVEAN e o CADD, conseguiram atingir AUBPRCs mais elevados, mas não conseguiram obter uma recordação superior com 90% de precisão do que os mapas. Resumimos quantitativamente as evidências de patogenicidade tanto para determinados alelos quanto para genótipos diplóides, levando em consideração o histórico genético. Descobrimos que o mapa experimental no fundo p.Ala222Val a 25 μg/mL de ácido folínico teve um desempenho significativamente melhor do que todos os outros mapas. Isso é consistente com a observação de que, entre os genótipos dos casos de homocistinemia coletados como parte de nossos conjuntos de referência, a frequência alélica de p.Ala222Val foi visivelmente elevada (MAF = 41%) em relação à população geral (OR = 1,57; p < 7,5 × 10−3; teste exato de Fisher). Finalmente, descobrimos que, ao considerar todo o contexto genético diplóide, os modelos que levam em conta as interações genéticas envolvendo p.Ala222Val melhoraram significativamente nosso desempenho na classificação de indivíduos pela presença de deficiência grave de MTHFR.
A estrutura experimental que usamos para gerar nosso atlas MTHFR teve algumas limitações. Embora o sistema experimental baseado em levedura tenha um desempenho muito bom em nossos testes de referência no que diz respeito à previsão da patogenicidade de variantes, algumas pontuações de mapas de variantes foram discordantes com sua presença nos conjuntos de referência positivos ou aleatórios (presumivelmente neutros), e é possível que um ensaio de complementação baseado em células humanas com potencial para capturar mais mecanismos específicos do organismo possa ter feito a diferença. No entanto, é difícil dizer quais (se houver) destes casos são falhas do sistema experimental, em oposição a classificações erradas anteriores de variantes de referência. Exemplos de variantes discordantes incluíram a variante patogênica anotada p.Ala175Thr (observada como c.523G>A em humanos), que exibiu 36% de funcionalidade (no mapa p.Ala222Val de folinato de 25 μg/mL que teve melhor desempenho na previsão de patogenicidade). Embora isso indicasse função reduzida, esse escore não foi baixo o suficiente para prevermos a patogenicidade usando nossa abordagem LLRp. Ala175 está localizado no topo de uma hélice alfa dentro do barril TIM do domínio catalítico, próximo ao difosfato do FAD. Nosso atlas forneceu evidências sugestivas (probabilidade posterior = 77%) para uma interação genética negativa com p.Ala222Val. Dos dois casos relatados como portadores desta mutação, o status p.Ala222Val é conhecido apenas por um deles (heterozigoto), mas infelizmente sem informações de faseamento. Assim, esta variante pode ser patogénica de uma forma dependente de p.Ala222Val, mas o nosso ensaio não conseguiu prevê-la como tal. Em outro exemplo, a variante do conjunto de referência aleatória p.His263Pro (observada como c.788A>C em humanos) parecia hipomórfica (funcionalidade de 21%, novamente no mapa p.Ala222Val de folinato de 25 μg/mL), apesar de um MAF relativamente alto de 3 × 10−4 e 36 indivíduos heterozigotos no gnomAD. Embora não haja evidência clínica da patogenicidade das variantes His263, o fato de His263 estar localizado dentro de uma hélice alfa e fazer parte do sítio de ligação de NADPH e folato e de que as substituições de prolina tendem a quebrar as hélices apoia a sugestão derivada do mapa de que p.His263Pro é funcionalmente anormal.
Existem muitas limitações na nossa capacidade de fornecer interpretações para pontuações de mapas em escala absoluta. Esperamos que as pontuações de funcionalidade estejam monotonicamente relacionadas à aptidão das células de levedura; no entanto, a relação precisa permanece desconhecida. Embora nossas pontuações tenham sido dimensionadas de forma que pontuações de 0 correspondam à mediana de variantes sem sentido e pontuações de 1 à mediana de variantes sinônimas, as pontuações intermediárias provavelmente têm uma relação não linear com a aptidão celular e uma relação não linear (provavelmente diferente) com a atividade enzimática. Uma pontuação reduzida pode resultar do impacto de uma variante na atividade enzimática total através de impactos na atividade específica, no nível de expressão proteica, ou ambos. Além disso, as variantes de perda de função no domínio regulatório afetam a atividade e/ou a aptidão celular de maneira diferente da perda de função no domínio catalítico, de modo que a relação entre a pontuação do mapa, a atividade enzimática e a aptidão celular pode diferir entre as regiões. Portanto, nossos mapas podem se beneficiar de uma calibração adicional de escala não linear (por exemplo, possibilitada por ensaios de crescimento competitivo que permitem a comparação direta e quantitativa do impacto do crescimento de variantes em diferentes regiões), de modo que pontuações intermediárias de diferentes regiões possam ser mais comparáveis. No entanto, uma escala tal que as pontuações em cada região correspondam a uma extensão semelhante de perda funcional pode não produzir a escala ideal para prever impactos na saúde humana. Isto destaca a importância de transformar as pontuações em razões log-verossimilhança de patogenicidade (LLRp), para prever os impactos humanos das variantes da MTHFR.
Nosso conjunto de variantes subjacente é composto por clones que, em muitos casos, carregam mais de uma variante. Além disso, não são observadas variantes fora de cada bloco sequenciado. Assim, o sucesso da abordagem TileSeq exige que cada variante pontuada esteja presente em muitos clones independentes, de modo que o efeito de segundas variantes invisíveis seja “estimado”. Isto é análogo à capacidade das abordagens de associação genômica ampla de associar características a variantes individuais, apesar de milhões de diferenças interindividuais em outros locais genômicos. Os efeitos da variação de fundo tendem a ser médios, como evidenciado pela forte separação entre pontuações de variantes sinônimas e sem sentido (Figura 1B). Embora não possamos ter certeza de que as medidas de interação genética e dependência de folato que derivamos sejam robustas a variações invisíveis, nossa capacidade de usar esses dados para encontrar e confirmar insights mecanísticos individuais, como os de Trp165 e Glu463, sugere que sim.
Para modelar a dependência de cada variante do folinato e do status de p.Ala222Val, utilizamos um modelo linear parcimonioso que permite a extrapolação para outras concentrações de folinato. No entanto, o modelo linear simplifica, sem dúvida, o verdadeiro comportamento e só deve ser aplicado dentro da faixa de níveis de folinato testados.
Nosso ensaio de complementação avalia apenas variantes de MTHFR ao nível da atividade global. A actividade global reduzida pode resultar da estabilidade proteica reduzida que reduz a actividade total enquanto mantém a actividade específica ou da actividade específica reduzida sem abundância de proteína reduzida. Assim, a observação da diminuição da funcionalidade não fornece, por si só, uma explicação mecanicista. Embora a resolução da capacidade de resposta ao folato e das interações genéticas fornecesse pistas adicionais sobre esses mecanismos, explicações mais concretas poderiam ser encontradas através do uso de ensaios subfuncionais adicionais, por exemplo, de interação proteína-proteína, estabilidade proteica ou respostas a estímulos regulatórios.
Poucos mapas de efeitos variantes foram relatados anteriormente, e aqui exploramos um atlas de paisagens de funcionalidade dinâmica através de combinações de ambientes e origens genéticas. Vale a pena notar que o mapa mais útil para prever a patogenicidade foi medido em 25 μg/mL de folinato no fundo p.Ala222Val. Teria sido impossível prever a priori qual dos contextos que examinamos seria ideal, destacando o valor para futuros estudos de mapeamento de efeitos variantes considerarem uma série de fatores ambientais e genéticos relevantes para a penetrância variante.
Declaração de interesses
F.P.R. detém ações da Ranomics e é investidor e consultor da SeqWell (cada uma das quais oferece serviços que são potencialmente úteis para mapeamento de efeitos de variantes) e aceitou suporte para viagens em conferências da Illumina. S.Y. e R. N. são funcionários da Invitae e R.N. é consultor da Pfizer, Maze Therapeutics e Genome Medical e acionista da Maze Therapeutics e Genome Medical. Os demais autores declaram não ter interesses conflitantes.
Referências
Mecanismos de supressão: a fiação da resiliência genética
Meta-análise da penetrância BRCA1 e BRCA2
Onde o genótipo não é preditivo do fenótipo: para uma compreensão da base molecular da penetrância reduzida nas doenças hereditárias humanas
Integrando abordagens genéticas na descoberta de medicamentos anticâncer
BRCA1, PARP e 53BP1: letalidade sintética condicional e viabilidade sintética
Resistência ao inibidor de PARP: um cabo de guerra em células com mutação BRCA
Padrões e diretrizes para a interpretação de variantes de sequência: uma recomendação de consenso conjunto do Colégio Americano de Genética Médica e Genômica e da Associação de Patologia Molecular
Sherloc: um refinamento abrangente dos critérios de classificação da variante ACMG-AMP
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MaveDB: uma plataforma de código aberto para distribuir e interpretar dados de ensaios multiplexados de efeito variante
Disponibilidade de dados e código
O software de análise de sequência TileSeq pode ser encontrado no Github em https://github.com/rothlab/tileseq_package (versão 1.5). O pipeline de pontuação MAVE pode ser encontrado no Github em https://github.com/jweile/tileseqMave (a versão com número de commit fa8b190 foi usada). Scripts personalizados para todas as análises downstream podem ser encontrados no Github em https://github.com/jweile/mthfrModel. Os valores de funcionalidade para todos os oito mapas de efeitos variantes experimentais foram depositados no MaveDB sob o número de acesso urn:mavedb:00000049. Mapas derivados de funcionalidade básica, resposta ao folinato, interações genéticas independentes do folinato e interações genéticas dependentes do folinato, bem como listas de variantes que respondem significativamente à suplementação de folinato ou interagem significativamente com p.Ala222Val, podem ser encontrados na Tabela S2. Os genótipos e fenótipos de casos de homocistinemia selecionados pela literatura para avaliação e os genótipos de referência aleatórios de 1000 Genomas podem ser encontrados na Tabela S3.
Recursos da web
Scripts personalizados no Github, https://github.com/jweile/mthfrModel
MAVE, https://github.com/jweile/tileseqMave
TileSeq, https://github.com/rothlab/tileseq_package
Informações suplementares
Informações complementares podem ser encontradas online em https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2021.05.009.