pmid: "35980175"
title: "Genoma em nível cromossômico do feijão-veludo (Mucuna pruriens) fornece recursos para pesquisa e desenvolvimento da síntese de L-DOPA."
authors: "Hao S, Ge Q, Shao Y, Tang B, Fan G, Qiu C, Wu X, Li L, Liu X, Shi C, Lee SM"
journal: "DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes"
pubdate: "2022 Aug 23"
doi: "10.1093/dnares/dsac031"
source: "PMC Full Text"

Genoma em nível cromossômico do feijão-veludo (Mucuna pruriens) fornece recursos para pesquisa e desenvolvimento da síntese de L-DOPA.

Autores

Hao S, Ge Q, Shao Y, Tang B, Fan G, Qiu C, Wu X, Li L, Liu X, Shi C, Lee SM

Periodico

DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes (2022 Aug 23)

Conteudo

Genoma em nível cromossômico da mucuna (Mucuna pruriens) fornece recursos para pesquisa e desenvolvimento da síntese de L-DOPA

Resumo

Mucuna pruriens, comumente chamada de mucuna, é a principal fonte natural de levodopa (L-DOPA), comercializada como fármaco psicoativo para o manejo clínico da doença de Parkinson e da distonia responsiva à dopamina. Embora a mucuna seja uma espécie vegetal muito importante para a fabricação de alimentos e produtos farmacêuticos, a falta de informações genéticas e genômicas sobre essa espécie dificulta severamente a pesquisa molecular e o desenvolvimento biotecnológico. Aqui, relatamos o primeiro genoma da mucuna, com tamanho de 500,49 Mb e 11 cromossomos codificando 28.010 proteínas. A comparação genômica entre espécies de leguminosas indicou que a mucuna especiou há ~29 milhões de anos a partir do clado da soja, sem duplicação genômica específica. De forma importante, identificamos 21 genes codificadores de polifenol oxidase que catalisam a conversão de L-tirosina em L-DOPA na mucuna, e duas subfamílias apresentando expansão em tandem nos cromossomos 3 e 7 após a especiação. Curiosamente, as famílias gênicas de resistência a doenças e antipatógenos mostraram-se contraídas na mucuna, o que pode estar relacionado à expansão da polifenol oxidase. Nosso estudo gerou uma referência genômica de alta qualidade para a mucuna, uma planta agrícola e medicinal economicamente importante, e os genes biossintéticos de L-DOPA recém-reportados podem fornecer informações indispensáveis para o desenvolvimento biotecnológico e sustentável de um método de processamento de biossíntese de L-DOPA ecologicamente correto.

1. Introdução

A mucuna (Mucuna pruriens, 2n = 22) é uma planta tropical da família Fabaceae distribuída principalmente na Ásia, África e América. É uma fonte potencial versátil de nutrição e cultura de cobertura. As sementes de mucuna contêm 20,2–29,3% de proteína bruta, valor comparável ao das leguminosas Cajanus cajan e Cicer arietinum. Como cultura de cobertura leguminosa, a mucuna possui a característica de fixação de nitrogênio, e seu rápido crescimento pode melhorar a biomassa e a qualidade do solo para a agricultura. Apesar de suas vantagens óbvias como cultura, a mucuna é mais conhecida como uma importante medicina herbal; é uma fonte natural renomada e indispensável de levodopa (L-DOPA), amplamente utilizada no tratamento de transtornos mentais. Extratos de mucuna podem aliviar a doença de Parkinson (DP). Além disso, outros compostos desconhecidos na mucuna podem melhorar comprometimentos motores, olfatórios, mitocondriais e sinápticos em modelos de DP. A fonte natural de L-DOPA a partir do pó de sementes de mucuna exibe eficácia comparável, mas surpreendentemente um início mais rápido, do que a L-DOPA/carbidopa sintética padrão no tratamento da DP. Adicionalmente, a mucuna é eficaz no tratamento da infertilidade masculina, na neutralização do veneno de cobra e na melhora da qualidade do sono.
L-DOPA é o produto da oxidação da L-tirosina e é eventualmente descarboxilada em dopamina. A identificação das enzimas relevantes nesse processo e de suas sequências codificadoras poderia fornecer conhecimentos que auxiliem o desenvolvimento industrial e a produção de L-DOPA, bem como o melhoramento agrícola do feijão-veludo. No entanto, em contraste com a ampla aplicação e o uso diário do feijão-veludo, as informações genéticas e moleculares sobre essa espécie são escassas. Nenhuma informação genética clara ou pesquisa molecular em larga escala sobre o feijão-veludo estava disponível antes de 2017. O primeiro estudo transcriptômico de dois acessos de feijão-veludo identificou vários transcritos diferencialmente expressos, como MYB, MADS, WRKY e bHLH, relacionados à biossíntese de metabólitos secundários. Esse relatório, no entanto, não abordou claramente a via subjacente ao metabolismo da L-DOPA. Neste estudo, relatamos um genoma em nível cromossômico para o feijão-veludo, investigamos sua história evolutiva genômica e identificamos genes envolvidos na síntese de L-DOPA, com o objetivo de abrir caminho para pesquisas mais aprofundadas que auxiliem o melhoramento do feijão-veludo.
2. Materiais e métodos
2.1. Coleta de amostras e preparo de bibliotecas
As plantas de feijão-veludo (M. pruriens var. utilis) foram coletadas no Condado de Napo, Baise, Província de Guangxi, China, em novembro de 2017 e identificadas pelo Dr. Bao-jing Li, da Universidade de Medicina Chinesa de Yunnan, Kunming, China. Um espécime testemunho (No. 2017110601A) foi depositado no Laboratório-Chave Estadual de Pesquisa de Qualidade em Medicina Chinesa, Instituto de Ciências Médicas Chinesas, Universidade de Macau, Macau, China. O DNA genômico da folha de feijão-veludo foi extraído com o kit QIAGEN Genomic seguindo o protocolo do fabricante. Após a fragmentação, concentramos diferentes tamanhos de fragmentos de DNA (350, 2.000 e 5.000 pb) com o kit de purificação de DNA MGIEasy e verificamos a qualidade da biblioteca com o Bioanalyzer Agilent 2100. Após a ligação dos adaptadores de sequenciamento, as bibliotecas foram amplificadas e sequenciadas na plataforma BGISEQ500. Preparamos as bibliotecas Hi-C seguindo um protocolo Hi-C. Resumidamente, as folhas frescas de feijão-veludo foram picadas e reticuladas com formaldeído a 2%, seguidas pela digestão do DNA com uma enzima de restrição e marcação com biotina das extremidades dos fragmentos. Em seguida, o DNA fragmentado foi ligado e fragmentado mecanicamente, e os fragmentos marcados com biotina foram enriquecidos com esferas de estreptavidina e utilizados para construir a biblioteca de sequenciamento com o kit de sequenciamento MGI CoolMPS, também seguindo o protocolo do fabricante.
2.2. Montagem do genoma
Todas as leituras foram sequenciadas na plataforma BGISEQ-500. O SOAPdenovo v2.04 (parâmetros: -K 63 -R -k 41 -F) foi utilizado para montar os scaffolds, seguido por duas rodadas de fechamento de gaps, realizadas com o GapCloser v1.12 (configurações padrão). Para a montagem Hi-C, os dados foram primeiro processados pelo HiC-Pro v2.8.0 (configurações padrão), e o Juicer v1.5 (configurações padrão) foi então utilizado para mapear as leituras no genoma para validar as leituras pareadas disponíveis. O pipeline 3D-DNA v180922 (configurações padrão) foi utilizado para construir o genoma em nível cromossômico.
2.3. Anotação do genoma
As sequências repetitivas foram detectadas com abordagens baseadas em homologia e de novo, respectivamente. O programa RepeatMasker v4.0.7 (http://www.repeatmasker.org/, acessado em 10 de julho de 2020, parâmetros: -nolow -no_is -norna -engine ncbi -parallel 1) foi utilizado para buscar sequências repetitivas com base na biblioteca Repbase v21.01. Os elementos de repetição em tandem foram detectados utilizando o programa TRF v4.04 (parâmetros: 2 7 7 80 10 50 2000 -d -h). O RepeatModeler v1.03 (http://www.repeatmasker.org/RepeatModeler/, acessado em 10 de julho de 2020, parâmetros: -engine ncbi -database mydb -pa) e o LTR_finder v1.04 (configurações padrão) foram utilizados para construir uma biblioteca de repetições de novo abrangendo toda a sequência do genoma. Os pares de repetições terminais longas (LTR) (sequências terminais 5′ e 3′) foram extraídos e alinhados com o MUSCLE v3.8.31 (configurações padrão), e as distâncias das sequências (K) foram então calculadas pelo distmat do pacote EMBOSS v6.6.0 (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/help/distmat, acessado em 1 de fevereiro de 2021, parâmetro: -nucmethod 2). O tempo de inserção dos elementos LTR foi estimado de acordo com a fórmula T = K/2r, onde r se refere à taxa de evolução, com 7e−9 por sítio por ano.
Os modelos gênicos foram preditos com predições de novo, dados de homólogos (Glycine max, Phaseolus vulgaris, Medicago truncatula e Vigna unguiculata) e RNA-seq. As predições de novo foram realizadas utilizando o GlimmerHMM v3.0.4 (parâmetros: -d arabidopsis -f -g) e o software Augustus v3.2.1 (parâmetros: --species=arabidopsis --uniqueGeneId=true --noInFrameStop=true --gff3=on --strand=both). Os conjuntos gênicos de espécies homólogas foram primeiro mapeados nas sequências do genoma do feijão-veludo usando o BLAT v0.36 (parâmetros: -q=prot -t=dnax -noHead); em seguida, as fases de codificação foram determinadas usando o GeneWise v2.4.1 (configurações padrão). Os dados de RNA-seq foram mapeados no genoma com o HISAT2 v2.1.0 (configurações padrão), e os modelos gênicos foram então preditos pelo Braker v2.0 (configurações padrão). Finalmente, utilizamos o GLEAN v1.0.1 (configurações padrão) para integrar os três tipos de evidências. Por fim, o BUSCO v3.0.2 (parâmetros: -c 10 -e 0.001 -l embryophyta_odb9 -sp arabidopsis) foi utilizado para avaliar a montagem do genoma e os modelos gênicos.
2.4. Análise genômica comparativa
As sequências codificantes de sete espécies (M. pruriens, Arabidopsis thaliana, M. truncatula, G. max, P. vulgaris, V. unguiculata e Oryza sativa) foram alinhadas com o método BLASP todos-contra-todos incorporado no pacote blastall v2.2.26 (parâmetros: -p blastp -m 8 -e 1e-5 -F F). Em seguida, as famílias gênicas foram agrupadas pelo OrthoMCL v2.0.9 (parâmetro: --mode 3). Genes de cópia única foram extraídos e uma árvore taxonômica foi então construída usando PhyML v3.0 (configurações padrão) e TreeBeST v1.9.2 (configurações padrão) com base no resultado do alinhamento global usando MUSCLE v3.8.31 (configurações padrão), com O. sativa como grupo externo. O tempo de divergência foi estimado pelo MCMCTree v4.4 (parâmetros: clock=3, model=0, BDparas=1 1 0). A expansão e contração das famílias gênicas foram calculadas pela ferramenta CAFE v4.2.1 (-f Mucunapruriens -n Mucunapruriens=‘M.pruriens’). Blocos de sintenia do genoma completo foram detectados usando a versão Python do pacote MCScan v0.7.4 [https://github.com/tanghaibao/jcvi/wiki/MCscan (Python-version), 17 de março de 2021, data do último acesso, parâmetro: jcvi.formats.gff bed --type=mRNA, -m jcvi.graphics.dotplot --nostdpf --genomenames]. Os blocos pareados foram extraídos e, em seguida, os valores de sítios sinônimos degenerados de 4 vezes (4DTv) foram calculados e contados para estimar os eventos de duplicação do genoma completo (WGD).
2.5. Estudo dos genes da síntese de L-DOPA
Todos os modelos gênicos anotados foram primeiramente pesquisados no banco de dados da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), produzindo uma anotação gênica única para cada gene. Todos os genes anotados como polifenol oxidase foram reconhecidos como membros candidatos a genes da síntese de L-DOPA (via KEGG ko00350). Árvores gênicas foram construídas pelo FastTree v2.1.3 com base no alinhamento global do MUSCLE v3.8.31 (configurações padrão) e visualizadas pelo pacote ggtree v2.4.1. Os dados de RNA-seq de diferentes tecidos (folha, vagem, grão, caule e raiz) foram mapeados nos modelos gênicos usando bowtie v2 (configurações padrão), e os valores de fragmentos por quilobase de modelo de éxon por milhão de fragmentos mapeados foram então calculados para cada gene e cada amostra para representar o nível de expressão. O valor de distância entre todos os pares de genes foi calculado usando o programa distmat (parâmetro: -nucmethod 2) do pacote EMBOSS v3.0.2. Para as seis cultivares de feijão-veludo que crescem em diferentes zonas e com diferentes características de cor de semente, uma biblioteca de 350 pb foi construída para cada linhagem e sequenciada na plataforma BGISEQ500. Também utilizamos o SOAPdenovo v2.04 (parâmetros são os mesmos descritos na Seção 2.2) para montagem preliminar. A predição e anotação gênica foram realizadas com o mesmo pipeline descrito acima.
2.6. Identificação de genes R
Modelos de domínios contendo sítios ou domínios relacionados à resistência foram adquiridos do banco de dados Pfam (Repetições Ricas em Leucina: PF00560/PF07723/PF07725/PF12799; NB-ARC: PF00931; NB-LRR: PF12061; Pquinase: PF00069; TIR: PF01582; Dedo de zinco BED: PF02892). Em seguida, o hmmsearch v3.1b2 (configurações padrão) foi usado para pesquisar conjuntos de genes com modelos de genes R.
3. Resultados e discussão
3.1. Montagem e anotação do genoma
Um total de 50,11 Gb (∼100×) de dados genômicos completos foi produzido para a montagem (Tabela Suplementar S1). Montamos um genoma com comprimento total de 500,49 Mb. Usando 73 Gb de dados Hi-C, ancoramos ∼470 Mb de scaffolds (∼93,83%) em 11 cromossomos, com um scaffold N50 final de 48,43 Mb e contig N50 de 92,52 kb, respectivamente (Tabela 1, Fig. 1A e B). Dados públicos de RNA-seq foram mapeados ao genoma com uma alta taxa de alinhamento de 95,57%. Predissemos 28.010 genes codificadores no genoma da mucuna, dos quais 94,92% foram anotados funcionalmente com os bancos de dados Não Redundante (NR), KEGG, UniProt e Gene Ontology (GO). Os resultados da avaliação BUSCO revelaram que cerca de 93,5% e 96,4% dos genes BUSCO completos de embriófitas puderam ser cobertos, respectivamente, pelo nosso genoma e modelos gênicos, indicando alta completude do genoma da mucuna.
Visão geral genômica. (A) Visão geral genômica da mucuna (Mucuna pruriens). (a) Densidade de modelos gênicos. (b) Densidade de sequências repetitivas. (c–f) Densidade de elementos LINE, SINE, transposons de DNA e LTR. Os valores foram calculados em janelas de 1 Mb. Triângulos vermelhos indicam as posições dos genes de polifenol oxidase duplicados em tandem e os triângulos azuis são os genes restantes. (B) Mapa de calor da montagem Hi-C (uma versão colorida desta figura aparece na versão online deste artigo).
Resumo da montagem do genoma da mucuna

3.2. Elementos repetitivos no genoma da mucuna
Detectamos cerca de 39,75% (∼199 Mb) de sequências repetitivas no genoma da mucuna (Tabela Suplementar S2), valor maior que o de Lotus japonicus (∼31,85%) e menor que o de Arachis duranensis (∼44,62%), V. unguiculata (∼46,37), G. max (∼47,57%) e P. vulgaris (∼50,50%) e quase igual ao de M. truncatula (∼39,67%) (Tabela Suplementar S2). As porcentagens de repetições terminais longas (LTR) no total de sequências de elementos transponíveis (TE) também diferiram entre as espécies, sendo a porcentagem de LTR da mucuna de ∼74,82% (Tabela Suplementar S2). Nos genomas de mucuna, A. duranensis e C. arietinum, encontramos um pico comum distinto na distribuição do tempo de inserção dos LTR, sugerindo que um evento recente de explosão de LTR ocorreu por volta de 3 Ma. Enquanto isso, nenhum pico foi detectado em G. max, P. vulgaris, L. japonicus ou M. truncatula, sugerindo eventos sucessivos de explosão de LTR (Fig. Suplementar S1).

3.3. Análise genômica comparativa
Genes de sete espécies, incluindo O. sativa, A. thaliana e quatro leguminosas (G. max, P. vulgaris, M. truncatula e V. unguiculata), juntamente com o genoma da mucuna, foram alinhados e agrupados em 24.940 famílias, sendo que a mucuna ocupou 17.098 famílias. Utilizando 1.213 genes conservados de cópia única das sete espécies, foram estimadas a árvore filogenética e o tempo de especiação. Os resultados revelaram que a mucuna é um clado irmão da soja (G. max), do feijão-comum (P. vulgaris) e do feijão-caupi (V. unguiculata), tendo divergido dessas três espécies há aproximadamente 29 Ma (Fig. 2A).
Análise genômica comparativa e WGD entre genomas de leguminosas. (A) Tempo de divergência filogenética estimado e modelo de evolução cromossômica das espécies de leguminosas. (B) Sintenia genômica total dentro dos cromossomos da mucuna. (C) Distribuições de 4DTv da mucuna, feijão-comum, soja, mucuna vs. feijão-comum e mucuna vs. soja.
A expansão e contração de famílias gênicas podem ser eventos importantes durante a evolução das espécies. Descobrimos que o genoma da mucuna continha 838 famílias expandidas, mas mais famílias contraídas em comparação com as outras três leguminosas da tribo Phaseoleae (Fig. Suplementar S2). As famílias expandidas continham 3.073 genes, e a análise de enriquecimento KEGG sugeriu que elas estão significativamente relacionadas a 28 vias, incluindo transportadores ABC (ko02010, valor P: 7,42e−20), interconversões de pentose e glucuronato (ko00040, valor P: 6,00e−19), biossíntese de alcaloides isoquinolínicos (ko00950, valor P: 3,79e−16) e metabolismo da tirosina (ko00350, valor P: 8,08eE−14). Curiosamente, a L-DOPA está envolvida na via do metabolismo da tirosina. Além disso, as famílias contraídas continham 3.163 genes na mucuna, os quais foram significativamente enriquecidos em 26 vias, incluindo biogênese de ribossomos em eucariotos (ko03008, valor P: 1,03e−15), metabolismo do ácido linoleico (ko00591, valor P: 5,69e−15) e interação planta–patógeno (ko04626, valor P: 8,65e−15). Tanto os genes expandidos quanto os contraídos estavam distribuídos em várias vias comuns; no entanto, o número de genes na via de adaptação ambiental das famílias contraídas é muito maior do que o das famílias gênicas expandidas. Adicionalmente, existem 237 famílias exclusivas do genoma da mucuna. A análise de enriquecimento dessas famílias gênicas específicas mostrou que os genes estão associados a 13 vias, incluindo processamento de proteínas no retículo endoplasmático (ko04141, valor P 1,11e−6), metabolismo de selenocompostos (ko00450, valor P 2,74e−5) e biossíntese de diterpenoides (ko00904, valor P 3,08e−5) (Fig. Suplementar S3).
3.4. Eventos de WGD e sintenia cromossômica
A WGD desempenha um papel importante na evolução do genoma e na evolução cromossômica das plantas. A maioria das eudicotiledôneas compartilhou um antigo evento de triplicação do genoma completo (gamma WGT) que ocorreu há ∼125 Ma; para as plantas leguminosas, um evento de duplicação específico de Fabaceae ocorreu há ∼55 Ma, além da gamma WGT. No genoma da mucuna, pelo menos 12 segmentos auto-sintênicos óbvios foram encontrados (por exemplo, chr1, chr5, chr6 e chr8; Fig. 2B). A sintenia entre a mucuna e o feijão-comum, bem como entre a mucuna e o feijão-caupi, indicou correspondências colineares óbvias (Fig. Suplementar S4). Até o momento, nenhuma outra leguminosa sequenciada demonstrou ter passado por um evento recente de WGD específico da espécie, exceto a soja. Calculamos a distribuição de 4DTv para fazer inferências sobre os eventos de WGD. A distribuição de 4DTv da mucuna mostrou semelhanças com o feijão-caupi e o feijão-comum e passou por um evento ancestral de hexaploidização e pela WGD compartilhada por Fabaceae; não houve WGD específica da espécie (Fig. 2C). Isso é consistente com o número de cromossomos, que é quase o dobro na soja em comparação com a mucuna, o feijão-caupi e o feijão-comum, resultante do fato de G. max ter passado por um evento extra de WGD. O evento gamma WGT alterou o número de cromossomos das dicotiledôneas ancestrais de 7 para 21. Reconstruímos o processo evolutivo cromossômico da mucuna detectando colinearidade entre as leguminosas e a uva, que é considerada uma espécie representativa do cariótipo ancestral das eudicotiledôneas. Com base nos componentes do cariótipo na mucuna, assumimos que ocorreram pelo menos quatro fissões e fusões em cada cromossomo, em média. Por exemplo, o chr2 é derivado dos cromossomos ancestrais A1, A2, A4 e A5 (Fig. 2A).
3.5. Expansão e evolução dos genes de síntese de L-DOPA
Tirosinase (TYR, EC: 1.14.18.1), tirosina 3-monooxigenase (TH, EC: 1.14.16.2) e polifenol oxidase (EC: 1.10.3.1, também chamada de catecol oxidase) estão envolvidas no processo de transformação de l-tirosina em L-DOPA. Identificamos 21 genes de polifenol oxidase em mucuna, 7 em feijão-caupi, 21 em soja, 4 em Medicago truncatula e 3 em feijão-comum, respectivamente (Fig. 3A e Tabela Suplementar S3). Também investigamos o número de genes de polifenol oxidase nas montagens de seis cultivares de mucuna cultivadas em diferentes regiões com diferentes características de cor de semente (Tabela Suplementar S4). Ao montar os dados de sequenciamento do genoma completo (Seção 2.5), obtivemos seis montagens preliminares variando de 405 a 500 Mb em tamanho, e os valores de scaffold N50 variaram de 45,16 a 58,09 kb. Foram identificados de 12 a 14 genes de polifenol oxidase nas seis linhagens. A razão pela qual o número de genes é menor do que na versão cromossômica é que as sequências das montagens preliminares estavam relativamente fragmentadas e alguns genes não foram anotados (Fig. 3C e D). Esses resultados demonstram que o gene da polifenol oxidase está de fato expandido no genoma da mucuna. Além disso, com o suporte de dados de RNA-seq, identificamos todos os genes de polifenol oxidase anotados expressos em tecidos de mucuna (Fig. Suplementar S5), sugerindo que eles desempenham um papel no processo de síntese de L-DOPA na mucuna. Nossos achados estão alinhados com um estudo recente que relata que a síntese de L-DOPA na mucuna é catalisada pela polifenol oxidase (EC: 1.10.3.1), onde nenhum gene de tirosinase ou tirosina 3-monooxigenase (EC: 1.14.16.2) foi encontrado nos dados de transcriptoma.

Expansão dos genes de polifenol oxidase da L-DOPA no genoma da mucuna. (A) Árvore filogenética de genes de cinco genomas de leguminosas. (B) Localizações de duplicação em tandem de 18 genes de polifenol oxidase nos cromossomos 3 e 7. Os genes representados por triângulos estão agrupados em um clado na Fig. 1A (oito no cromossomo 3 com fundo rosa e quatro no cromossomo 7 com fundo lavanda em A). (C) Árvore filogenética de genes de sete mucunas; os genes comuns compartilhados pelas sete cultivares estão marcados com fundo verde. Os símbolos rosa e lavanda correspondem aos genes de polifenol oxidase em tandem em A. (D) Validação de cinco genes de polifenol oxidase marcados com ‘’ preto em C em outras cultivares de mucuna. Strain5 representa a montagem em nível cromossômico, e os genes indicados por ‘’ estão completos em Strain5 e presentes em linhagens de nível não cromossômico com sequências fragmentadas (Uma versão colorida desta figura aparece na versão online deste artigo).
A árvore gênica da polifenol oxidase de cinco leguminosas mostrou duas subfamílias notavelmente expandidas na mucuna (Fig. 3A). Esses genes estão distribuídos em tandem nos cromossomos chr3 e chr7 (Figs 1A e 3B), indicando a expansão em tandem dos genes da polifenol oxidase no genoma da mucuna. Para investigar o tempo de inserção dos genes da polifenol oxidase, comparamos a distância dos genes da polifenol oxidase (valores PP) e a distância ortóloga/paráloga do genoma completo (valores WP), que indicam eventos de especiação e WGD (Fig. 4). Descobrimos que os valores PP entre duas espécies foram muito maiores que o valor WP, indicando que os genes da polifenol oxidase já existiam no genoma ancestral. Ao mesmo tempo, o valor PP dentro da espécie é semelhante ou até ligeiramente maior que o valor de distância da WGD das Fabaceae (Fig. 4, por exemplo, M.pruries_M.pruries: PP 32,93 > WP 21,98), então especulamos que a L-DOPA sintase provavelmente se expandiu com o evento de WGD das Fabaceae, mas durante o processo de especiação, esses genes são retidos no genoma da mucuna, enquanto outras leguminosas, como o feijão-comum, podem tê-los perdido.
A distribuição de distância dos pares de genes do genoma completo e dos pares de genes da polifenol oxidase L-DOPA em leguminosas. São mostrados pares nos genomas de mucuna, feijão-comum e soja, bem como mucuna vs. feijão-comum e mucuna vs. soja. Duas áreas de fundo cinza abrangendo as duas figuras superiores e as três inferiores marcam a divergência entre mucuna e soja/feijão-comum, e os eventos de WGD compartilhados pelas Fabaceae, respectivamente. Linhas pontilhadas indicam os valores de pico de cada linha. WP: pares de genes do genoma completo, cor transparente. PP: pares de genes da polifenol oxidase, cor regular.
O acúmulo de L-DOPA na semente da mucuna provavelmente envolve a regulação de genes a montante e a jusante. Também investigamos os membros gênicos da tirosina descarboxilase (EC: 4.1.1.25), uma enzima que pode degradar a L-DOPA. Curiosamente, descobrimos que o genoma da mucuna não apenas continha mais genes da polifenol oxidase (EC: 1.10.3.1), mas também menos genes da tirosina descarboxilase do que outras leguminosas (13 na mucuna e 20–63 em soja/feijão-caupi/feijão-comum/trevo-barril, Tabela Suplementar S3). Acreditamos que nossos resultados fornecem uma base para futuros estudos genéticos da mucuna, por exemplo, sobre a atividade gênica da polifenol oxidase em diferentes estágios de vida e condições, e a regulação da síntese e o sistema de transporte da L-DOPA.
3.6. Contração dos genes R
Os genes de resistência (genes R) desempenham um papel vital na defesa das plantas contra estresses bióticos. Identificamos genes R no feijão-veludo e em outras seis espécies, incluindo soja, Arabidopsis, Medicago, feijão-comum, feijão-caupi e arroz (O. sativa), com base nos domínios conservados dos genes R. Em comparação com as outras seis espécies, encontramos uma notável contração dos genes R no feijão-veludo, com 433 genes R no feijão-veludo (o menor número entre as leguminosas), 486 em Arabidopsis (o menor número entre as espécies não leguminosas) e 649 no feijão-comum (Tabela Suplementar S5). Os genes de domínios de ligação a nucleotídeos e repetições ricas em leucina (NBS-LRR), que detectam a invasão de patógenos nas plantas, apresentaram um número menor de genes do que outras espécies, com aproximadamente um quarto do número encontrado na soja. Curiosamente, descobrimos que 45,56% (190/417) dos genes R do feijão-veludo estavam localizados em blocos cromossômicos antigos, o que foi muito superior às proporções de 30,28% (295/974), 24,46% (147/601), 21,17% (151/713) e 14,50% (176/1214) para soja, feijão-comum, feijão-caupi e Medicago, respectivamente. Isso sugere que os genes R em outras leguminosas provavelmente se expandiram muito mais do que aqueles no feijão-veludo após a especiação. Dado que o feijão-veludo apresenta forte adaptação a vários ambientes e o acúmulo de L-DOPA (uma substância aleloquímica que protege as plantas de competidores e invasores), especulamos que um mecanismo de compensação poderia explicar o número reduzido de genes R no genoma do feijão-veludo; ou seja, os altos níveis de L-DOPA que impedem a invasão por patógenos do feijão-veludo podem ser um fator para o seu pequeno número de genes NBS-LRR.
4. Conclusões
Mucuna pruriens não é apenas um excelente aditivo para a indústria alimentícia, mas também um importante material natural para a extração de L-DOPA para o tratamento da DP. Este estudo é o primeiro a relatar a montagem em nível cromossômico de M. pruriens, juntamente com a análise evolutiva genômica e uma descrição dos genes codificadores de enzimas essenciais para a biossíntese de L-DOPA. Esses resultados genômicos auxiliarão estudos genéticos adicionais e o desenvolvimento de M. pruriens e da biossíntese de L-DOPA.
Dados suplementares
Dados suplementares estão disponíveis online no DNARES.
Material Suplementar
Disponibilidade de dados
Todos os dados que apoiam este projeto, incluindo dados de sequenciamento do genoma completo e recursos genômicos, foram depositados no NCBI com o ID do projeto PRJNA862264 e no CNGB Sequence Archive (CNSA, https://db.cngb.org/cnsa/) com o ID do projeto CNP0002743.
Referências
Potencial nutricional de cinco acessos de uma leguminosa tribal do sul da Índia, Mucuna pruriens var utilis
Composição nutricional e antinutricional do feijão-veludo, uma leguminosa alimentícia subutilizada no sul da Índia
Nutrição de qualidade através do guandu — uma revisão
O valor nutricional e os benefícios para a saúde do grão-de-bico e do homus
Efeito de longo prazo de uma cultura de cobertura leguminosa (Mucuna pruriens var. utilis) sobre as comunidades da macrofauna e nematofauna do solo, sob cultivo de milho, no sul do Benin
O papel da L-DOPA nas plantas
O feijão-da-flórida mágico da Mucuna pruriens
Ingestão diária de Mucuna pruriens na doença de Parkinson avançada: um estudo piloto de 16 semanas, de não inferioridade, randomizado e cruzado
Mucuna pruriens para a doença de Parkinson: método de preparação de baixo custo, medidas laboratoriais e perfil farmacocinético
Ervas medicinais importantes na farmacoterapia da doença de Parkinson
Mucuna pruriens (feijão-da-flórida) resgata comprometimentos motores, olfatórios, mitocondriais e sinápticos no modelo genético PINK1B9 de Drosophila melanogaster da doença de Parkinson
Mucuna pruriens na doença de Parkinson: um estudo clínico e farmacológico duplo-cego
Mucuna pruriens melhora a fertilidade masculina por sua ação no eixo hipotálamo-hipófise-gonadal
Mucuna pruriens reduz o estresse e melhora a qualidade do sêmen em homens inférteis
MP-4 contribui para a neutralização do veneno de cobra pelas sementes de Mucuna pruriens por meio de um mecanismo indireto mediado por anticorpos
Um suplemento dietético contendo Chlorophytum borivilianum e feijão-da-flórida melhora a qualidade do sono em homens e mulheres
Caracterização bioquímica e análise espaço-temporal da via putativa da L-DOPA em Mucuna pruriens
Recursos transcriptômicos para a leguminosa medicinal Mucuna pruriens: montagem de novo do transcriptoma, anotação, identificação e validação de marcadores EST-SSR
Sequenciamento de captura de conformação cromossômica Hi-C de genomas de aves usando a plataforma BGISEQ-500
SOAPdenovo2: um montador de novo de leituras curtas com eficiência de memória empiricamente aprimorado
Integrando a montagem de comunidades e a biodiversidade para entender melhor a função do ecossistema: a abordagem Community Assembly and the Functioning of Ecosystems (CAFE)
HiC-Pro: um pipeline otimizado e flexível para processamento de dados de Hi-C
Juicer fornece um sistema de um clique para analisar experimentos de Hi-C com resolução de alças
Montagem de novo do genoma do Aedes aegypti usando Hi-C produz scaffolds em escala cromossômica
Tandem Repeats Finder: um programa para analisar sequências de DNA
LTR_FINDER: uma ferramenta eficiente para a predição de retrotransposons LTR de comprimento completo
MUSCLE: alinhamento múltiplo de sequências com alta precisão e alto rendimento
A sequência do genoma de Arabidopsis lyrata e a base da rápida mudança no tamanho do genoma
TigrScan e GlimmerHMM: dois localizadores de genes eucarióticos ab initio de código aberto
AUGUSTUS: um servidor web para predição de genes em eucariotos que permite restrições definidas pelo usuário
BLAT — a ferramenta de alinhamento semelhante ao BLAST
GeneWise e Genomewise
HISAT: um alinhador rápido de junções de splicing com baixos requisitos de memória
BRAKER1: anotação genômica não supervisionada baseada em RNA-Seq com GeneMark-ET e AUGUSTUS
Criação de um conjunto de genes consenso para abelhas melíferas
BUSCO: avaliação da completude da montagem e anotação genômica com ortólogos de cópia única
OrthoMCL: identificação de grupos de ortólogos para genomas eucarióticos
Novos algoritmos e métodos para estimar filogenias de máxima verossimilhança: avaliação do desempenho do PhyML 3.0
Cafeína como tratamento sintomático para a doença de Parkinson (Cafe-PD): um ensaio randomizado
PAML: um pacote de programas para análise filogenética por máxima verossimilhança
CAFE: uma ferramenta computacional para o estudo da evolução de famílias gênicas
A síntese de L-DOPA em Mucuna pruriens (L.) DC. é regulada pela polifenol oxidase e não pela CYP 450/tirosina hidroxilase: uma análise da via metabólica usando marcadores bioquímicos e moleculares
FastTree 2—árvores de máxima verossimilhança aproximada para grandes alinhamentos
Dois métodos para mapear e visualizar dados associados em filogenia usando Ggtree
Desempenho do Bowtie2 otimizado por programação genética em benchmarks de comparação genômica e testes analíticos (GCAT)
Alinhamento rápido de leituras com gaps usando Bowtie 2
Pfam: o banco de dados de famílias de proteínas
Heurística de velocidade de modelo oculto de Markov e procedimento iterativo de busca HMM
O significado evolutivo da poliploidia
Arqueogenômica in silico revela a organização, regulação e evolução do genoma de plantas modernas
A sequência do genoma da videira sugere hexaploidização ancestral nos principais filos de angiospermas
Propriedades físico-químicas e cinéticas da tirosinase de cogumelo
Transformação microbiológica de L-tirosina em L-dopa a partir de biomassa pré-tratada com metanol de um novo Coriolus versicolor em cultura submersa
Evolução dos genes de defesa contra doenças e seus reguladores em plantas
Proteínas NBS-LRR de plantas na detecção de patógenos e defesa do hospedeiro
Os efeitos da dopamina no crescimento radicular e na atividade enzimática em plântulas de soja
Crescimento radicular e enzimas relacionadas à lignificação de plântulas de milho expostas ao aleloquímico L-DOPA
L-DOPA em sementes de leguminosas: uma barreira química ao ataque de insetos