pmid: "34201554"
title: "Preparação Enzimática de Peptídeos Bioativos com Atividade Inibidora da ECA a partir de Soja e Mucuna: Uma Revisão Sistemática."
authors: "Sitanggang AB, Putri JE, Palupi NS, Hatzakis E, Syamsir E, Budijanto S"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2021 Jun 23"
doi: "10.3390/molecules26133822"
source: "PMC Full Text"
Preparação Enzimática de Peptídeos Bioativos com Atividade Inibidora da ECA a partir de Soja e Mucuna: Uma Revisão Sistemática.
Autores
Sitanggang AB, Putri JE, Palupi NS, Hatzakis E, Syamsir E, Budijanto S
Periodico
Molecules (Basel, Switzerland) (2021 Jun 23)
Conteudo
Preparação Enzimática de Peptídeos Bioativos com Atividade Inibidora da ECA a partir de Soja e Mucuna: Uma Revisão Sistemática
A enzima conversora de angiotensina I (ECA) é uma peptidase com papel significativo na regulação da pressão arterial. Neste trabalho, apresenta-se uma revisão sistemática sobre a preparação enzimática de peptídeos inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina I (iECA). A revisão sistemática é conduzida seguindo as diretrizes PRISMA. A soja e a mucuna são conhecidas por apresentarem alto teor proteico, o que as torna adequadas como fontes de proteínas precursoras para a produção de peptídeos iECA. A endopeptidase é comumente utilizada na preparação de peptídeos iECA à base de soja, enquanto para a mucuna, uma combinação de endo e exopeptidase é frequentemente empregada. A glicinina da soja é o substrato preferido para a preparação de peptídeos iECA. Ela contém prolina como um de seus principais aminoácidos, o qual exibe importância significativa na inibição da ECA. Os melhores tratamentos enzimáticos para produzir peptídeos iECA a partir da soja são: atividade proteolítica pela Protease P (Amano-P de Aspergillus sp.), temperatura de 37 °C, tempo de reação de 18 h, pH 8,2 e relação E/S de 2%. Por outro lado, as melhores condições enzimáticas para produzir hidrolisados peptídicos com alta atividade iECA são por meio da atividade hidrolítica sequencial pela combinação de pepsina-pancreatina, com relação E/S para cada enzima de 10%, temperatura e tempo de reação para cada proteólise de 37 °C e 0,74 h, respectivamente, pH para pepsina de 2,0 e para pancreatina de 7,0. Como leguminosa subutilizada, os estudos sobre a hidrólise enzimática das proteínas da mucuna na produção de peptídeos iECA são limitados. Conclusivamente, a atividade dos peptídeos iECA à base de soja depende de seus tamanhos moleculares, dos resíduos de aminoácidos e de suas posições. Aminoácidos hidrofóbicos com cadeias laterais apolares, resíduos carregados positivamente, ramificados e cíclicos ou aromáticos são geralmente preferidos para peptídeos iECA.
A hipertensão é uma doença de alta prevalência e é considerada um dos principais problemas de saúde globalmente. Lim et al. relataram que as doenças cardiovasculares decorrentes das complicações da hipertensão são responsáveis por 9,4 milhões de mortes a cada ano. Portanto, é importante adotar as medidas de mitigação apropriadas para reduzir a taxa de mortalidade por hipertensão. Também conhecida como pressão alta, a hipertensão é uma condição médica em que a pressão arterial (PA) está anormalmente elevada. De acordo com a Diretriz ACC/AHA de 2019 sobre Prevenção Primária de Doenças Cardiovasculares, uma PA normal é descrita como tendo pressão sistólica e diastólica inferior a 120 e 80 mmHg, respectivamente (PA < 120/80 mmHg). Existem dois estágios de hipertensão. O estágio 1 é definido com PA de 130–139/80–89 mmHg, enquanto a hipertensão estágio 2 é para PA ≥ 140/90 mmHg. Como mencionado acima, a hipertensão pode levar a doenças cardiovasculares e acidente vascular cerebral. A hipertensão geralmente é tratada com medicamentos reguladores da pressão arterial, como inibidores da enzima conversora de angiotensina I (ECA) (por exemplo, lisinopril, captopril), vasodilatadores, etc. Dados os efeitos colaterais dos inibidores sintéticos da ECA (por exemplo, distúrbios do paladar, tosse e inchaço da camada inferior da pele humana ou edema angioneurótico), várias investigações têm sido realizadas para encontrar inibidores potentes da ECA a partir de produtos naturais, especialmente de proteínas alimentares. Como resultado do crescente interesse em alimentos funcionais nos últimos anos, foi relatado que peptídeos bioativos derivados de proteínas alimentares têm vários efeitos benéficos na saúde humana, incluindo atividade inibitória contra a ECA. Portanto, os peptídeos bioativos podem ser considerados uma alternativa para o manejo da hipertensão.
Um peptídeo bioativo é definido como um composto orgânico com impacto positivo na saúde humana (por exemplo, atividade inibitória contra a ECA, capacidade antioxidante, atividade antimicrobiana, antitrombótica, imunomoduladora, etc.) que consiste em 2 a 20 aminoácidos unidos por ligações covalentes chamadas ligações peptídicas. No sistema digestivo do corpo humano, os peptídeos bioativos são liberados por proteases digestivas, como a pepsina ou enzimas microbianas. Além disso, o processamento de alimentos e a maturação podem liberar peptídeos bioativos.
A natureza é uma fonte abundante de peptídeos bioativos produzidos por organismos como plantas e animais. Embora os produtos de origem animal continuem sendo a maior fonte de peptídeos bioativos, este trabalho discutirá principalmente os peptídeos bioativos de origem vegetal derivados especificamente da soja e do feijão-veludo. O conteúdo nutricional da soja consiste em 35–40% de proteína, 20% de lipídios e 9% de fibra alimentar com base no peso seco. Devido ao seu alto teor proteico, a soja é amplamente utilizada como fonte de peptídeos bioativos entre outras plantas. Enquanto isso, um tipo menos conhecido de leguminosa chamado feijão-veludo possui um conteúdo nutricional de aproximadamente 25% de proteína e 14% de gordura bruta com base em seu peso seco. Como ambos os feijões são considerados fontes proteicas potentes na dieta humana, sua utilização como fontes de proteínas precursoras para a produção de peptídeos bioativos é promissora. No entanto, no caso do feijão-veludo, estudos relacionados à sua utilização como fonte de proteína precursora são escassos. Assim, é importante elucidar a abordagem tecnológica de produção de peptídeos derivados do feijão-veludo, especialmente para a inibição da atividade da ECA.
Destacando o crescente interesse nos peptídeos bioativos como parte da dieta e a maior prevalência da doença não transmissível da hipertensão, esta revisão sistemática discute os avanços na preparação enzimática de peptídeos bioativos de soja e feijão-veludo que exibem atividade inibidora da Enzima Conversora de Angiotensina I (ACEi). Este estudo concentra sua discussão nas condições hidrolíticas ideais necessárias para produzir peptídeos ACEi e na influência das propriedades intrínsecas dos peptídeos (ou seja, resíduos de aminoácidos e seu arranjo na sequência, peso molecular, hidrofobicidade) sobre a atividade ACEi.
2. Resultados
2.1. Preparação do Substrato como Fonte de Peptídeos ACEi de Soja e Feijão-Veludo
A preparação de substratos a partir da soja é raramente discutida na literatura. Substratos de soja como fontes de proteínas parentais podem ser concentrado ou isolado proteico de soja, farinha de soja rica em proteína e as principais proteínas de armazenamento da soja (isto é, glicinina ou β-conglicinina). Gouda et al. prepararam o substrato proteico de soja, a glicinina. Este método segue um método previamente descrito, desenvolvido em um estudo de Rao e Rao, com o uso de precipitação com (NH4)2SO4 e centrifugação. Água contendo β-mercaptoetanol (0,1% v/v) é usada para extrair farinha de soja desengordurada por 4–6 h sob agitação constante. A solução é então centrifugada a 6000–8000 rpm por 45 min a 25 °C, seguida pela adição de MgCl2 seco até que a concentração final de MgCl2 na solução atinja 5 mM. A glicinina é coletada por centrifugação, e o precipitado é seco com um liofilizador. A liofilização é usada como método preferido de remoção de água porque tem a vantagem de causar menos danos à estrutura do substrato proteico. No entanto, o fracionamento da glicinina na maioria dos estudos envolve a precipitação do extrato proteico alcalino de soja em pH 6,3–7,0.
Para a preparação do substrato de mucuna, o fracionamento úmido é o método comumente utilizado. Inicialmente, a farinha de mucuna é preparada moendo os grãos com um moinho de discos, seguido de peneiramento. A farinha de feijão preparada é então suspensa em bissulfito de sódio a 3% na proporção de 1:6 (p:v) e deixada de molho por uma hora com agitação constante em pH alcalino (pH = 8). O papel do bissulfito de sódio é aumentar a solubilidade da proteína da mucuna. Abtahi e Aminlari afirmaram que a modificação da proteína com um tratamento químico, como o bissulfito de sódio, aumenta o índice de dispersibilidade proteica (PDI). Após a separação dos sólidos fibrosos e lavagem com bissulfito de sódio a 3%, a suspensão de proteína-amido é deixada para sedimentar por 30 min. O objetivo da sedimentação é recuperar o amido. O pH da solução proteica é ajustado para o ponto isoelétrico (ou seja, pH 4,2) usando solução de HCl 1,0 M. O precipitado é obtido centrifugando a solução a 1317× g por 20 min e posteriormente seco usando um liofilizador a −47 °C e pressão de 13 × 10−3 mbar. Em outro estudo de Mugendi et al., que caracterizaram as propriedades nutricionais do isolado proteico de mucuna, a extração foi conduzida com água destilada em pH 9, seguida de centrifugação. O pH do extrato foi então ajustado para 4,5 para precipitar a proteína.
2.2. Condições Hidrolíticas para a Produção de Peptídeos Inibidores da ECA a partir de Substratos Proteicos de Soja e Mucuna
As enzimas para proteólise são classificadas como endopeptidases e exopeptidases, com base no local de ação sobre o substrato. As exopeptidases hidrolisam nas extremidades N- ou C-terminais do peptídeo, enquanto as endopeptidases clivam ligações peptídicas no interior e distantes das extremidades de uma cadeia polipeptídica ou nos pontos não terminais da sequência. As enzimas mais comuns utilizadas para produzir peptídeos bioativos à base de soja são pepsina, papaína, alcalase, proteinase de M. purpureus, tripsina, quimotripsina, protease de gengibre, Amano Protease de Aspergillus sp. e protease D3 da cepa JM109 de E. coli. Todas essas enzimas são endopeptidases. Endopeptidases, como alcalase e proteinase K, produzem aminoácidos hidrofóbicos de cadeia curta, que são preferidos para aumentar a atividade inibidora da ECA. Além disso, endopeptidases prolil-específicas, como a Protease P de Aspergillus niger, são frequentemente utilizadas, pois podem gerar peptídeos bioativos contendo prolina, favorecidos por sua forte afinidade à ECA. As condições hidrolíticas das proteínas de soja para a produção de peptídeos inibidores da ECA são mostradas na Tabela 1.
Para o feijão-veludo, as enzimas proteolíticas relatadas de forma limitada na literatura são uma combinação de pepsina-pancreatina e alcalase–flavourzyme. Em contraste com os peptídeos derivados da soja, para os peptídeos obtidos do feijão-veludo, a hidrólise é conduzida com uma combinação de endopeptidase e exopeptidase. A aplicação de ambas, endo e exopeptidase, permite uma ampla ação de clivagem e produz cadeias mais curtas de peptídeos. A Tabela 2 mostra as condições de hidrólise enzimática das proteínas derivadas do feijão-veludo.
- Discussão
3.1. Condições Hidrolíticas da Preparação de Peptídeos Bioativos à Base de Soja
Além da fermentação, os peptídeos bioativos também podem ser produzidos pela atividade hidrolítica de proteases sobre as proteínas precursoras da soja. Fatores importantes a considerar na produção de peptídeos bioativos derivados da soja por proteólise são o tipo de enzima, a temperatura de reação, o tempo de hidrólise, o pH e a razão enzima-substrato (E/S). Em uma baixa razão enzima-substrato (E/S), a enzima cortará continuamente as ligações peptídicas mais suscetíveis durante o período de hidrólise. Enquanto isso, com o aumento da razão E/S, a ação de clivagem é mais rápida durante o estágio inicial da hidrólise e se torna mais lenta em um estágio posterior. Isso ocorre porque, no estágio inicial, a reação é consumida pela clivagem rápida das ligações peptídicas suscetíveis e, em um estágio posterior, as enzimas degradam as ligações peptídicas menos suscetíveis. As razões E/S relatadas para a produção de peptídeos inibidores da ECA a partir de proteínas de soja são, em sua maioria, inferiores a 10%, com a maioria em 4 e 6%.
Entre outras, as enzimas proteolíticas comuns utilizadas para a produção de peptídeos bioativos a partir da soja incluem a pepsina, a alcalase e a protease D3. A pepsina é uma protease que hidrolisa ligações peptídicas entre aminoácidos aromáticos, como fenilalanina, triptofano e tirosina. É classificada como uma endopeptidase. Wang et al. afirmaram que a pepsina degrada proteínas de forma eficaz entre pH 1,2–2,5, e o pH ideal para a atividade proteolítica da pepsina é 1,6, com temperatura de 37 °C e uma relação E/S de 10 U:1 μg. De acordo com Chen et al., o pH ótimo utilizado para a hidrólise com pepsina foi 2, enquanto para Lo e Li-Chan, o pH ótimo utilizado foi 5. Essa discrepância provavelmente é influenciada pelas propriedades físico-químicas únicas de cada uma das proteínas substrato em diferentes ambientes de pH. Chen et al. selecionaram uma temperatura de hidrólise de 37 °C por 24 h, enquanto em outro estudo dos mesmos autores, utilizou-se 39 °C com metade do tempo do estudo anterior.
A alcalase é conhecida por produzir peptídeos com domínios hidrofóbicos na extremidade C-terminal, com condições ótimas de hidrólise: temperatura de 56 °C, pH 7, relação E/S de 2% (v/p) por 6 h. Wu e Ding, Rayaprolu et al., Li et al. utilizaram alcalase na produção de peptídeos bioativos a partir da soja, com diferentes condições. Tanto Wu & Ding quanto Rayaprolu et al. utilizaram temperaturas de hidrólise de 50–55 °C, o que está de acordo com a temperatura ótima de hidrólise da alcalase para a produção de outros tipos de peptídeos bioativos. Enquanto isso, Li et al. utilizaram temperatura de reação de 37 °C. Quanto ao tempo de hidrólise, ele varia nos três estudos, com Wu & Ding relatando 12 h, Rayaprolu et al. 1 h e Li et al. 0,25 h. Todos os três utilizaram condições hidrolíticas alcalinas, uma vez que a alcalase pode ter pH ótimo de até 10.
As condições para hidrolisar proteínas de soja para a produção de peptídeos ACEi podem ser diferentes das condições em que a atividade catalítica ótima da enzima aparece utilizando substrato padrão (caseína, albumina, etc.). Um estudo conduzido por Yasuda et al. sugeriu que a protease derivada de Monascus purpureus tem temperatura ótima de 50 °C e pH de 3,2 para atingir atividade ótima. No entanto, utilizando a mesma fonte enzimática, Kuba et al. conduziram a hidrólise a 37 °C com pH de 3,3 para a produção de peptídeos ACEi.
Gouda et al. compararam quatro enzimas diferentes para a produção de peptídeos bioativos derivados da soja, a saber, tripsina, quimotripsina, protease P e protease de gengibre. A tripsina e a quimotripsina utilizadas nesse estudo eram de origem bovina e, em ambos os casos, as condições de hidrólise foram 37 °C, pH 8,2, por 18 h. Essas enzimas são enzimas digestivas encontradas no intestino delgado, que possui pH de 8 a 9. A hidrólise da β-lactoglobulina com tripsina, relatada em outro estudo, foi realizada em pH 7,8, 37 °C e tempo de hidrólise de 2,42 h. Enquanto isso, Kimball et al. hidrolisaram proteínas de soja usando quimotripsina, com condições ótimas: relação E/S de 2/100 (p/p) a 37 °C, com tempo de reação de 20 a 30 min. A reação com protease P também foi utilizada com as mesmas condições de hidrólise da tripsina e quimotripsina. Siala et al. relataram que, para a protease derivada de Aspergillus niger, o pH ótimo foi 4,0, enquanto a enzima apresentou alta atividade em uma faixa de temperatura de 30 a 60 °C, com atividade ótima a 50 °C. Enquanto isso, a protease de gengibre, uma cisteíno protease indicada pela presença de resíduo de cisteína no sítio ativo da enzima, é melhor utilizada em uma faixa de pH de 6 a 8, com temperatura de 60 °C. A protease D3 é outra cisteíno peptidase inovadora, purificada do cotilédone de soja em germinação. De acordo com Miwa, a protease D3 atuou em temperatura ótima de 40 °C, com pH acima de 4. Kodera e Nio confirmaram a afirmação anterior ao utilizar a protease D3 a 37–40 °C, em pH 4,5.
O pH, o tempo de hidrólise, a relação E/S e a temperatura de reação ideais para a produção de peptídeos inibidores da ECA (ACEi) a partir de proteínas derivadas da soja variam conforme a enzima utilizada. No entanto, o pH e a temperatura ótimos são relativamente consistentes, pelo menos para a pepsina e a alcalase. A pepsina é ótima em pHs de 1,2 a 2,5 e temperaturas de 37 a 39 °C, enquanto para a alcalase, pHs de 7 a 9 e temperaturas de 50 a 60 °C são as condições utilizadas para a produção de peptídeos inibidores da ECA a partir de proteínas de soja.
3.2. Condições Hidrolíticas da Preparação de Peptídeos Bioativos à Base de Mucuna
A hidrólise das proteínas originais da mucuna adota a combinação de enzimas endopeptidases e exopeptidases. Chalé et al. e Segura-Campos et al. conduziram a hidrólise do concentrado de mucuna usando uma combinação de pepsina-pancreatina e uma combinação de alcalase-flavourzyme, enquanto Tuz e Campos usaram uma combinação de pepsina–pancreatina. As condições hidrolíticas para a hidrólise com pepsina e pancreatina foram 37 °C por 15 min em pH 2 para a pepsina e em pH 7 para a pancreatina. Isso está de acordo com o estudo anterior de Wang et al., que utiliza pepsina para degradar tanto proteínas suscetíveis quanto resistentes à pepsina. Enquanto isso, a flavourzyme, uma mistura de endo e exopeptidases encontrada em Aspergillus oryzae, atua ativamente na temperatura de 50–55 °C e pH 5–7. Chalé et al. e Segura-Campos et al. usaram flavourzyme em combinação com alcalase para hidrolisar proteínas derivadas da mucuna com a mesma condição de hidrólise. As condições ótimas utilizadas foram 50 °C, pH 7 por 15 min. Essas condições correspondem às condições ótimas de Nguyen et al., porém, na hidrólise da proteína de soja. A faixa das atividades de inibição da ECA (concentração inibitória média máxima/IC50) da fração peptídica da mucuna é de 0,0009–10,2 μg/mL. Os melhores tratamentos enzimáticos com IC50 de ECA de 0,0009 μg/mL são os seguintes: a atividade hidrolítica sequencial pela combinação de pepsina–pancreatina, razão E/S para cada uma é de 10%, a temperatura e o tempo de reação para cada uma são 37 °C e 0,74 h, respectivamente, e o pH para pepsina e pancreatina é 2 e 7, respectivamente. Infelizmente, não há estudo relatado que identifique as estruturas dos peptídeos inibidores da ECA das proteínas da mucuna no momento em que este trabalho é realizado. Portanto, a discussão a seguir concentra-se nos peptídeos inibidores da ECA derivados das proteínas da soja.
3.3. Peptídeos Bioativos com Atividade Inibidora da ECA de Proteínas da Soja
O isolado proteico de soja consiste em várias proteínas que são agrupadas em quatro classes principais de proteínas, a saber, 2S (albumina), 7S (β-conglicinina), 11S (glicinina) e 15S. Essas proteínas de armazenamento são agrupadas com base nos coeficientes de sedimentação quando a solução proteica é submetida a um campo centrífugo. Embora existam outras proteínas minoritárias na soja, como hemaglutininas, inibidor de tripsina e enzimas intrínsecas, as proteínas 7S e 11S são as mais abundantes e representam 75% do conteúdo total de proteínas de armazenamento.
Para a 11S, existem cinco subunidades proteicas identificadas, divididas em dois grupos com base na homologia. O Grupo 1 compreende G1 (53,6 kDa), G2 (52,4 kDa), G3 (52,2 kDa), e o Grupo 2 com G4 (61,2 kDa) e G5 (55,4 kDa). A β-conglicinina é a principal glicoproteína da proteína de armazenamento 7S. Ela consiste em três subunidades principais, denominadas α (cerca de 67 kDa), α′ (cerca de 71 kDa) e β (cerca de 50 kDa), sendo que todas as três possuem propriedades físico-químicas diferentes. A fração 7S das globulinas também compreende mais duas proteínas, além da β-conglicinina, a γ-conglicinina e a Bo-conglicinina. No total, essas proteínas de armazenamento da soja são consideradas proteínas precursoras potentes para a produção de peptídeos inibidores da ECA. Na Tabela 3, são apresentados os peptídeos inibidores da ECA identificados na literatura publicada. Adicionalmente, esses peptídeos inibidores da ECA identificados são alinhados com as sequências de aminoácidos das proteínas precursoras típicas da soja, como glicinina, β-conglicinina e albumina 2S, para elucidar a origem desses peptídeos inibidores da ECA identificados.
Chen et al. identificaram cinco peptídeos (ou seja, IA, TLAGAG, PPL, ITLL e VMALPG) com atividade inibidora da ECA produzidos a partir de proteínas de soja. Outros quatro peptídeos inibidores da ECA foram isolados da β-conglicinina e da glicinina, a saber, LAIPVNKP, LPHF, SPYP e WL, por Kuba et al.. Além disso, Gouda et al. isolaram VLIVP da glicinina. Outros peptídeos inibidores da ECA isolados da soja foram YVVFK, PNNKPFQ, NWGPLV e IPPGVPYWT. Uma comparação desses peptídeos inibidores da ECA identificados com o banco de dados SWISS-PROT de proteínas precursoras derivadas da soja mostra que a maioria dos peptídeos inibidores da ECA identificados é encontrada nas proteínas da soja, G1-G2, G4, α, α′, β e albumina 2S. Os peptídeos inibidores da ECA identificados que são consistentes com o banco de dados são IA, NWGPLV, SPYP, WL, LPHF, LAIPVNKP, VLIVP e PNNKPFQ (consulte a Tabela 3).
O peso molecular (PM) de um peptídeo inibidor da ECA pode determinar sua afinidade com a ECA, pois o sítio de ligação pode ser muito estreito para peptídeos de alto PM. As atividades inibidoras da ECA dos peptídeos correspondentes identificados na Tabela 3 são avaliadas e o VLIVP, um peptídeo com PM de 540 Da, apresenta a maior atividade inibidora da ECA, com um IC50 de 1,69 µM (Tabela 4). Ao contrário, a menor atividade inibidora da ECA pertence ao SPYP, com um valor de IC50 de 850 µM. Apesar de ter um PM consideravelmente baixo (ou seja, 462 Da), o SPYP possui a menor atividade inibidora da ECA. Uma correlação entre os PMs dos peptídeos inibidores da ECA e seus valores de inibição é mostrada na Figura 1. O coeficiente de determinação é 0,036, o que indica uma correlação muito fraca. Isso sugere que a atividade inibidora da ECA não depende inteiramente do PM do peptídeo. Especialmente quando o PM do peptídeo é inferior a 1 kDa, a estrutura molecular do peptídeo inibidor da ECA determina notavelmente a interação entre o peptídeo inibidor da ECA e o sítio ativo da ECA. Esses fatores estruturais, como a hidrofobicidade do peptídeo e os tipos de resíduos de aminoácidos codificados na cadeia peptídica, são relatados como influenciadores da atividade de inibição sobre a ECA.
Peptídeos com forte atividade inibidora da ECA são, em sua maioria, compostos por aminoácidos hidrofóbicos com cadeia lateral apolar, resíduos carregados positivamente, ramificados, cíclicos ou aromáticos, e prolina na extremidade C-terminal. A ECA contém o sítio ativo HEXXH (isto é, histidina, ácido glutâmico, desconhecido, desconhecido e histidina), no qual duas histidinas (His383 e His387), juntamente com o glutamato (Glu411), formam os ligantes de ligação ao zinco (Zn2+). De acordo com Jimsheena e Gowda, a presença de prolina na extremidade C-terminal do QRP e sua curta distância de coordenação, especialmente o oxigênio carbonílico da ligação peptídica entre Q e R (3,2 Å), levaram a um aumento da inibição da ECA. Bechaux et al. e Aluko também afirmaram que o peptídeo inibidor da ECA preferido possui um aminoácido de cadeia ramificada na extremidade N-terminal (cadeia lateral alifática com ramificação) e, na extremidade C-terminal, prolina, aminoácidos aromáticos, ramificados ou básicos. Assim, peptídeos com N-terminal de V ou I e C-terminal de W, Y, P e F são mais preferidos. A presença de prolina em sequências peptídicas com atividade inibidora da ECA também é relatada por Sitanggang et al. em peptídeos derivados de soja fermentada (tempeh) (isto é, NEGDVLVIPPGVP, APIDVVVPPGNT, VAPTPNVPPYAG, FLVPPQ, FLVPPQE). Sabe-se que a existência de prolina e hidroxiprolina nos peptídeos não é afetada pela ação das proteases digestivas, especialmente nos tripeptídeos com prolina-prolina na extremidade C-terminal. A resistência dos peptídeos bioativos às proteases gastrointestinais pode ser benéfica para manter a atividade dos peptídeos inibidores da ECA.
O fato de o VLIVP apresentar a maior atividade inibidora da ECA (ver Tabela 4) é consistente com os argumentos anteriores. O VLIVP possui um aminoácido ramificado, a valina, no sítio N-terminal e prolina na extremidade C-terminal. Outro fator que também contribui para o menor valor de IC50 é o uso da glicinina como substrato para a proteólise. De acordo com Riblett et al., a glicinina continha prolina como um de seus principais aminoácidos, o qual era um aminoácido preferido na produção de peptídeos inibidores da ECA, em comparação com a β-conglicinina. Considerando que o VLIVP apresenta a maior atividade inibidora da ECA, os melhores tratamentos enzimáticos para a produção de peptídeos inibidores da ECA a partir das proteínas precursoras da soja são: atividade proteolítica pela protease P (Amano-P de Aspergillus sp.), temperatura de 37 °C, tempo de reação de 18 h, pH 8,2 e relação E/S de 2%.
- Materiais e Métodos
A abordagem para a construção desta revisão seguiu Carey et al., que consiste em um guia passo a passo para a realização de uma revisão sistemática. As visões gerais dos procedimentos incluem planejamento inicial, condução das buscas, extração de dados e análise de qualidade.
4.1. Definição da Pergunta de Pesquisa, Critérios de Inclusão e Exclusão dos Artigos
Este trabalho realizou uma revisão da literatura para buscar referências relevantes. Como ponto de partida, foi formulada uma pergunta de revisão. A pergunta de revisão escolhida para conduzir a pesquisa foi “Quais são os melhores tratamentos enzimáticos para produzir peptídeos bioativos potentes com atividades inibidoras da ECA a partir de proteínas de soja e feijão-veludo?” Esta questão científica foi escolhida para melhor esclarecer os objetivos desta revisão, que foram demonstrar as condições hidrolíticas ideais que produzem uma alta atividade inibidora da ECA de um peptídeo bioativo e avaliar a influência dos fatores estruturais do(s) peptídeo(s) bioativo(s) identificado(s) na atividade inibidora da ECA. Com base nisso, a pergunta de revisão foi categorizada em uma ferramenta de busca, denominada PEO, que foi usada para organizar a estrutura dos conceitos principais. PEO significa população, exposição e desfecho. Neste estudo, as proteínas precursoras da soja e do feijão-veludo, as condições de preparo enzimático e os peptídeos bioativos com atividade inibidora da ECA foram considerados como população, exposição e desfecho, respectivamente.
Além disso, os estudos ou artigos incluídos foram selecionados com base em vários critérios considerados importantes para a seleção de referências. Primeiramente, apenas estudos publicados em inglês foram incluídos. Não houve limitações quanto às datas de publicação. Adicionalmente, estudos não relacionados às preparações enzimáticas de peptídeos bioativos de feijão-veludo ou soja com efeito inibidor da ECA foram excluídos.
4.2. Condução e Revisão da Busca
As referências correspondentes a este trabalho foram selecionadas utilizando as diretrizes “Preferred Reporting Items for Systematic reviews and Meta-Analysis” (PRISMA) (Figura 2 e Figura 3), por serem consideradas a diretriz comum para a condução de revisões sistemáticas. As etapas a seguir foram utilizadas na condução desta pesquisa: (1) Coleta de dados (realização de buscas de artigos relevantes para este trabalho em bases de dados); (2) Triagem de dados (seleção dos artigos com base em critérios ou classificação previamente determinados); (3) Integração de dados (integração das referências selecionadas encontradas e realização da seleção); (4) Análise de dados (análise dos dados integrados); (5) Conclusão dos dados (apresentação dos resultados da revisão).
Estudos relevantes para a revisão foram buscados em bases de dados como Google Scholar (; acessado em 30 de maio de 2020) e Wiley (; acessado em 30 de maio de 2020). Essas bases de dados foram escolhidas por serem consideradas bases de dados comuns que suportam a busca booleana. A busca booleana é uma busca estruturada em que os usuários podem incluir várias operações (AND, OR, NOT) para especificar ou ampliar os resultados da busca. Na busca de dados ou referências relacionadas aos peptídeos inibidores da ECA da soja, a expressão booleana utilizada foi “enzymatic preparation” AND “bioactive peptide” AND soybean AND (“blood pressure” OR hypertension). Para o feijão-veludo, a expressão booleana utilizada foi “bioactive peptide” AND (Mucuna OR “velvet bean”) AND (“blood pressure” OR hypertension).
Registros de referências relacionados ao tópico de pesquisa de peptídeos inibidores da ECA da soja resultaram em um total de 120 registros provenientes de buscas em bases de dados e 20 registros de buscas antigas. As buscas ancestrais também foram utilizadas para adicionar mais referências correspondentes a este estudo. As buscas ancestrais são conduzidas examinando as referências dos artigos selecionados para obter mais fontes de dados. O gerenciamento e rastreamento dos registros foram feitos pelo Mendeley (Mendeley Ltd., Elsevier, Amsterdam, Países Baixos), um gerenciador de referências que auxilia na coleta de referências e organização de citações. Não foram encontradas duplicatas, embora houvesse quatro artigos em idiomas diferentes do inglês. As referências provenientes tanto das bases de dados quanto das buscas ancestrais foram triadas com base nos critérios de inclusão e exclusão descritos acima. Após um processo adicional de triagem, nove registros sobre soja foram utilizados e avaliados nesta pesquisa. O último processo de triagem consistiu em remover textos que não tratavam especificamente da soja ou que não discutiam especificamente a atividade inibidora da ECA. Quanto à mucuna, foi encontrado um total de 50 registros de buscas em bases de dados e um registro de buscas antigas. Após a mesclagem de duplicatas e a remoção dos artigos em idiomas diferentes do inglês, restaram 56 registros para triagem com base na conformidade do título e resumo com o tópico de pesquisa. Os textos excluídos aqui foram estudos que não tratavam especificamente da mucuna ou que não discutiam especificamente a atividade inibidora da ECA. Isso resultou na inclusão de três artigos relacionados a peptídeos inibidores da ECA da mucuna nesta revisão.
5. Conclusões
A preparação de peptídeos inibidores da ECA a partir da soja, na maioria da literatura, é realizada pela atividade proteolítica de endopeptidases. Os melhores tratamentos enzimáticos para a produção de peptídeos inibidores da ECA a partir das proteínas precursoras da soja são os seguintes: atividade proteolítica pela Protease P (Amano-P de Aspergillus sp.), temperatura de 37 °C, tempo de reação de 18 h, pH 8,2 e relação E/S de 2%. O peptídeo inibidor da ECA identificado com IC50 de 1,69 µM é o VLIVP. Este peptídeo possui uma massa molecular relativamente baixa de 450 Da, o que é presumivelmente importante para que ele se aloje no sítio ativo da ECA. Mais importante ainda, este peptídeo possui V e P nas porções N- e C-terminal, respectivamente, uma configuração preferencial para aumentar a atividade inibidora da ECA. Vale ressaltar que, além da massa molecular de um peptídeo inibidor da ECA, outros fatores estruturais, como a hidrofobicidade do peptídeo e os tipos de resíduos de aminoácidos presentes na cadeia peptídica, também influenciam no aumento da atividade inibidora da ECA.
Quanto à mucuna, as enzimas utilizadas para as ações hidrolíticas são uma combinação de exo- e endo-peptidases. Os melhores tratamentos enzimáticos para produzir hidrolisados peptídicos com alta atividade inibidora da ECA são os seguintes: atividade hidrolítica sequencial pela combinação de pepsina–pancreatina, uma razão E/S para cada uma de 10%, a temperatura e o tempo de reação para cada uma são 37 °C e 0,74 h, respectivamente, o pH para a pepsina é 2, enquanto para a pancreatina é 7. Os estudos sobre a hidrólise enzimática das proteínas da mucuna para a produção de peptídeos inibidores da ECA são limitados. Além disso, não há estudos relacionados à identificação das estruturas moleculares dos peptídeos inibidores da ECA. Uma vez que a mucuna também possui um alto teor de proteínas, ela é, portanto, considerada uma fonte potente de peptídeos inibidores da ECA. Portanto, o interesse de pesquisa deve ser direcionado para essa área no futuro.
Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Contribuições dos Autores
Conceitualização, A.B.S., J.E.P., N.S.P. e E.H.; metodologia, A.B.S., J.E.P., N.S.P. e E.H.; análise formal, A.B.S., J.E.P. e N.S.P.; investigação, A.B.S. e J.E.P.; curadoria de dados, J.E.P.; recursos, A.B.S., E.S. e S.B.; redação—preparação do rascunho original, A.B.S., J.E.P. e N.S.P.; redação—revisão e edição, A.B.S., N.S.P., E.H., E.S. e S.B.; supervisão, A.B.S. e N.S.P.; aquisição de financiamento, A.B.S., E.S. e S.B. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento
WCR Program 2325/IT3.L1/PN/2021.
Declaração do Comitê de Revisão Institucional
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Compartilhamento de dados não aplicável.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Disparidades globais na prevalência e controle da hipertensão
Uma avaliação comparativa de risco da carga de doenças e lesões atribuível a 67 fatores de risco e agrupamentos de fatores de risco em 21 regiões, 1990–2010: Uma análise sistemática para o estudo da carga global de doenças 2010
Diretriz ACC/AHA de 2019 sobre a prevenção primária de doenças cardiovasculares: Um Relatório da Força-Tarefa do American College of Cardiology/American Heart Association sobre Diretrizes de Prática Clínica
Captopril no tratamento da hipertensão clínica e insuficiência cardíaca
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Correlação entre a atividade inibidora da ECA e o peso molecular do peptídeo. Os valores de PM e IC50 são retirados da Tabela 4.
Diretrizes PRISMA para a inclusão de artigos sobre a preparação enzimática de peptídeos inibidores da ECA a partir de proteínas de soja.
Diretrizes PRISMA para a inclusão de artigos sobre a preparação enzimática de peptídeos inibidores da ECA a partir de proteínas de feijão-veludo.
Condições de hidrólise enzimática de proteínas de soja usando endopeptidases para produzir peptídeos inibidores da ECA.
Enzima Substrato Temp. (°C) Tempo (h) pH Relação Enzima/Substrato E/S Sequência Peptídica Ref. Pepsina Concentrado proteico 37 24 2 6% IA Chen et al. TLAGAG PPL ITLL VMALPG Pepsina Isolado proteico 39 12 2 3% - Chen et al. Proteína precipitada por ácido Alcalase Concentrado proteico 50 12 9 4% - Wu & Ding Proteinase ácida de M. purpureus β-conglicinina 37 10 3,3 - LAIPVNKP Kuba et al. LPHF Glicinina SPYP WL Tripsina bovina Glicinina 37 18 8,2 2% VLIVP Gouda et al. Quimotripsina bovina 37 18 8,2 Protease de gengibre 50 16 6 Protease P (Amano-P de Aspergillus sp.) 37 18 8,2 Protease D3 da cepa JM109 de E. coli Isolado proteico 37–40 24–48 4,5 0,2% YVVFK Kodera & Nio PNNKPFQ NWGPLV IPPGVPYWT Pepsina Isolado proteico 37 1 5,3 4% - Lo & Li-Chan Pancreatina 37 2 7,5 Alcalase Isolado proteico 55 1 8 - - Rayaprolu et al. Alcalase Isolado proteico 30 0,25 9 6% - Li et al.
Condições de hidrólise enzimática do concentrado proteico de feijão-veludo para produzir peptídeos inibidores da ECA.
Enzima Tipo de Enzima Condições de Hidrólise Ref. Temp. (°C) Tempo (h) pH Relação Enzima/Substrato E/S Pepsina Endopeptidase 37 0,75 2 10% Herrera-Chale et al. Pancreatina Exopeptidase 37 0,75 7,5 Alcalase Endopeptidase 50 0,75 8 Flavourzyme Exopeptidase 50 0,75 7 Pepsina Endopeptidase 37 0,75 2 10% Tuz & Campos Pancreatina Exopeptidase 37 0,75 7 Pepsina Endopeptidase 37 0,75 2 10% Segura-Campos et al. Pancreatina Exopeptidase 37 0,75 7 Alcalase Endopeptidase 50 0,75 8 Flavourzyme Exopeptidase 50 0,75 7
Peptídeos inibidores da ECA identificados e suas proteínas específicas de soja correspondentes como fontes.
Proteína de Soja Peso Molecular Total/MW (Da) Entrada UniProt Fita Peptídica Localização da Fita Peptídica a partir do N-Terminal Peptídeo Inibidor da ECA Identificado na Literatura Resíduos de AA MW (Da) Ref. Glicinina G1 55.706 P04776 LIAVPTGVAW 141–150 IA 202 Chen et al. ALSWLRLSAE 351–360 WL 317 Kuba et al. VLIVPQNFVV 411–420 VLIVP 540 Gouda et al. G2 54.391 P04405 ALWLLKLSAQ 341–350 WL 317 Kuba et al. TWNPNNKPFQ 51–60 PNNKPFQ 844 Kodera & Nio G3 - G4 63.797 P02858 HLPSYSPYPR 81–90 SPYP 462 Kuba et al. MIIIAQGKGA 91–100 IA 202 Chen et al. SFNTNEDIAE 241–250 IA 202 Chen et al. ENIARPSRAD 391–400 IA 202 Chen et al. YEGNWGPLVN 541–550 NWGPLV 586 Kodera & Nio G5 57.956 P04347 GLEYVVFKTH 461–470 YVVFK 655 Kodera & Nio β-conglicinina α 70.306 P0DO16 VSFGIAYWEK 21–30 IA 202 Chen et al. NENLRLITLAIPVNKPGRFE 301–320 LAIPVNKP 851 Kuba et al. LLPHFNSKA 451–460 LPHF 513 Kuba et al. α’ 72.228 P11827 VSFGIAYWEK 21–30 IA 202 Chen et al. RMITLAIPVNKPGRFESFFL 321–340 LAIPVNKP 851 Kuba et al. β 50.476 P25974 QNLKIIKLAIPVNKPGRYDD 141–160 LAIPVNKP 851 Kuba et al. EGALLLPHFN 281–290 LPHF 513 Kuba et al. Albumina 2S 18.460 P19594 LLFCIAHTCS 11–20 IA 202 Chen et al.
Pesos moleculares e valores de inibição de peptídeos bioativos inibidores da ECA.
Nº Sequência PM (Da) IC50 da ECAi (μM) Ref. 1 IA 200 153 Chen et al. 2 WL 317 65 Kuba et al. 3 PPL 330 37 Chen et al. 4 ITLL 460 42 5 SPYP 462 850 Kuba et al. 6 TLAGAG 490 14 Chen et al. 7 LPHF 513 670 Kuba et al. 8 VLIVP 540 1.69 Gouda et al. 9 VMALPG 590 39 Chen et al. 10 YVVFK 655.62 21 Kodera & Nio 11 NWGPLV 686.56 33 12 PNNKPFQ 844.59 44 13 LAIPVNKP 851 70 Kuba et al. 14 IPPGVPYWT 1029.69 64 Kodera & Nio