---

pmid: "37153067"
title: "Farmacognosia, fitoquímica e estudos moleculares de uma importante erva medicinal."
authors: "Kumar P, Shruthi R, Bindu I, Raghavendra P"
journal: "Ayu"
pubdate: "2021"
doi: "10.4103/ayu.ayu_401_21"
source: "PMC Full Text"

Farmacognosia, fitoquímica e estudos moleculares de uma importante erva medicinal.

Autores

Kumar P, Shruthi R, Bindu I, Raghavendra P

Periodico

Ayu (2021)

Conteudo

Farmacognosia, fitoquímica e estudos moleculares de uma importante erva medicinal Achillea millefolium L.

Contexto:
Achillea millefolium L. é uma erva medicinal tradicionalmente importante, usada para o tratamento de várias doenças há séculos. Estudos recentes mostraram suas atividades biológicas na febre do feno, distúrbios hepato-biliares e como medicamento estimulante do apetite. Também é relatado seu uso para tratamentos de inflamações cutâneas, feridas, cortes e abrasões.

Objetivo:
Investigar parâmetros farmacognósticos, fitoquímicos e moleculares preliminares das partes aéreas da droga.

Materiais e métodos:
A. millefolium foi identificada e coletada na região do Himalaia. O material foi devidamente seco, submetido a avaliação macro e microscópica, estudos fitoquímicos e moleculares de acordo com os padrões de controle de qualidade e diretrizes da OMS.

Resultados:
As folhas são pinnadamente lobadas, inflorescência em corimbo composto. Os tricomas não glandulares são uniseriados, multicelulares e de parede lisa; os tricomas glandulares são bicelulares, presentes em todas as partes aéreas. A endoderme é evidente no caule e o mesofilo foliar é equifacial. A análise parcial da sequência do genoma mostrou similaridade com a espécie estudada, o que pode claramente distingui-la de outras espécies do gênero Achillea. A melhor separação cromatográfica foi observada com Ascentis Express C18, 2,7 μm, 100 mm × 4,6 mm. Os flavonoides e ácidos fenólicos apresentaram absorbância máxima a 330 nm. Os parâmetros de adequação do sistema, como prato teórico, fator de cauda e resolução, atenderam aos critérios de aceitação da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP).

Conclusão:
Os achados deste estudo serão úteis para a identificação precisa da droga bruta de A. millefolium em relação às suas espécies intimamente aparentadas.

Introdução
Achillea millefolium L. é comumente conhecida como milefólio ou mil-folhas, pertencente à família Asteraceae. É uma planta alpina de alta altitude, com distribuição circumboreal no hemisfério norte, incluindo Ásia, Europa e América do Norte. Na Índia, foi registrada na região do Himalaia, em Jammu e Caxemira, Himachal Pradesh, Uttaranchal, em uma faixa de altitude de 1050–3600 m. O nome do gênero "Achillea" é derivado da palavra mitológica grega "Achilles" e o epíteto específico "millefolium" refere-se aos muitos segmentos de sua folhagem ou folhas. É comumente chamada de Biranjasipha e Gandana em sânscrito, Bhut Kesi em hindi e Chopandiga em caxemira. A planta milefólio tem sido usada por suas propriedades medicinais desde os tempos antigos e utilizada como erva cicatrizante na medicina popular e tradicional por centenas de anos. Devido às suas notáveis propriedades medicinais, as partes aéreas são relatadas como um tônico amargo, usado para tratar distúrbios gastrointestinais, apoiando o fluxo adequado da bile; estimula a circulação sanguínea para hipertensão arterial e a decocção da planta inteira é usada para tratar hemorroidas sangrantes e distúrbios renais. Também foi usada como chá de ervas na África do Sul para o tratamento de artrite e doenças relacionadas, desintoxicação geral, diabetes, náuseas e tonturas.
Também é descrito que as pontas das flores ou inflorescências são as partes medicinalmente ativas, com efeito estimulante suave e usadas para tratar vários problemas alérgicos de muco, como distúrbios de febre do feno. Folhas frescas são mastigadas para dor de dente aguda e usadas como enxaguante bucal para promover a cicatrização de cortes na boca e para limpeza dos dentes. Na medicina popular, é consumida como chá de ervas para tratar distúrbios gastrointestinais, dor de cabeça, distúrbios hepatobiliares e como medicamento estimulante do apetite. Externamente, é aplicada como loção ou pomada para inflamações da pele, feridas, cortes e abrasões. A planta milefólio e seus extratos também têm um benefício promissor para propriedades antimicrobianas e antioxidantes em produtos farmacêuticos e cosméticos. Também é considerada um suplemento alimentar seguro e foi introduzida como uma nova fonte para tingir lã, sendo considerada com bom potencial agronômico como corante natural no Irã. O milefólio é descrito como "Panaceia negligenciada", onde esta erva medicinal emergiu como foco de numerosos estudos científicos que avaliam e revisam a etnobotânica, a fitoquímica relatada e a bioatividade relacionada da planta.
Existem oportunidades para substituição ou adulteração dos ingredientes brutos de produtos fitoterápicos em pó, que podem ser intencionais ou não intencionais, ou devido à longa cadeia de suprimentos desde o local de colheita até o mercado. Por essa razão, o reconhecimento correto das plantas utilizadas para fins medicinais, associado à sua naturalidade e ausência de adulteração, bem como a uma aplicação segura, tem sido cada vez mais focado. A tecnologia de identificação molecular, como o código de barras de ácido desoxirribonucleico (DNA), tem sido reconhecida como uma ferramenta importante e confiável para a identificação de plantas medicinais. O marcador ITS é o mais eficiente para identificar espécies com base na sequência de "melhor correspondência próxima"; da mesma forma, a combinação trnH-psbA + ITS também demonstrou resultados satisfatórios. Portanto, o presente estudo selecionou esses dois marcadores e padronizou a técnica de identificação molecular.

A. millefolium contém uma variedade de fitoconstituintes, como terpenos, taninos, alcaloides, esteróis, vitaminas, flavonoides e ácidos fenólicos. Dentre todos os fitocompostos, a matéria-prima é rica em flavonoides e ácidos fenólicos. Muitos glicosídeos flavonoides e agliconas foram relatados nesta planta. O glicosídeo flavonoide inclui vicenina, vitexina e sweticina. Muitas espécies de Achillea têm sido relatadas como fontes ricas de flavonas, flavonoides e lignanas.

Com base em revisões da literatura, existem muitos estudos sobre atividades fitoquímicas, farmacológicas, imunológicas, biológicas e outras atividades terapêuticas que revelaram a presença de muitos componentes ativos. No entanto, estudos detalhados sobre farmacognosia e identificação molecular são limitados para a identificação da planta autêntica real utilizada como matéria-prima ativa na indústria fitoterápica. O estabelecimento de parâmetros farmacognósticos, como estudos macroscópicos e microscópicos, ajudará a identificar e autenticar o verdadeiro medicamento, e os caracteres diagnósticos são úteis para a padronização adicional do medicamento autêntico e reduzem as possibilidades de adulteração, diferenciando-o de adulterantes e misturas. O presente estudo foi realizado e padronizou a autenticação da matéria-prima de A. millefolium através de estudos farmacognósticos, técnicas moleculares e fitoquímicos.

Materiais e métodos
As partes aéreas de A. millefolium foram coletadas em várias localidades [Tabela 1] e plantas taxonomicamente identificadas [Figura 1], e o espécime de herbário foi depositado no Herbário e Repositório de Drogas Brutas da Fundação para Revitalização das Tradições Locais de Saúde (FRLHT), Bangalore, Karnataka, Índia, com o número de voucher "123417". As partes aéreas coletadas foram picadas e secas ao sol. O material seco foi utilizado como amostra de referência para caracterização farmacognóstica, como identificação organoléptica, macroscópica, histoquímica, fitoquímica e molecular e estabelecimento.

Localizações geográficas da coleta de Achillea millefolium
Localização Coordenadas GPS Altitude (m) Vale de Solang, Manali, Himachal Pradesh N32° 19.776' E77° 09.287' 2643 Parashar, Distrito de Mandi, Himachal Pradesh N31° 45.319' E77° 06.034' 2586 Tihri, Distrito de Mandi, Himachal Pradesh N31° 48.396' E77° 04.450' 2151
GPS: Sistema de Posicionamento Global
Achillea millefolium – Habitat
O código de barras de DNA foi realizado conforme descrito nos métodos de controle de qualidade.
Observações organolépticas, macroscópicas e microscópicas
Caracteres organolépticos como cor, odor e sabor foram registrados a partir das matérias-primas secas de plantas taxonomicamente autenticadas. Caracteres macroscópicos como natureza, textura e características externas também foram anotados. Secções manuais foram realizadas para registrar as características microscópicas, seguidas de estudos histoquímicos realizados com vários corantes, como safranina, azul de toluidina e soluções de iodo de Lugol. As características microscópicas foram registradas e as imagens capturadas usando o microscópio de campo claro Olympus BX53.
Estudos de identificação molecular
A amostra de referência coletada foi submetida ao isolamento e código de barras de DNA. O DNA genômico total foi isolado do material vegetal seco usando o Kit NucleoSpin® Plant II DNA (MACHEREY-NAGEL, Alemanha) e o protocolo seguido conforme o manual. As amplificações por reação em cadeia da polimerase (PCR) de ITS e PsbA-trnH seguiram os protocolos do Centro Canadense de Código de Barras de DNA (CCDB) e foram realizadas em um sistema de reação em cadeia da polimerase (PCR) Proflex (Applied Biosystems, EUA) usando 12 μl de mistura de Taq PCR 2X (Himedia MBT-061), 5 μl de DNA genômico, 2 μl (10 picomoles) de cada primer direto e reverso e o volume da reação completado para 25 μl usando água de grau de biologia molecular. Após a amplificação, o produto é testado para sua confirmação. As condições de PCR para rbcL: 94°C por 1 min, seguido de 35 ciclos de 94°C por 30 s, 55°C por 20 s e 72°C por 50 s, e uma etapa final a 72°C por 5 min. PsbA-trnH: 94°C por 1 min, seguido de 35 ciclos de 94°C por 30 s, 60°C por 20 s e 72°C por 50 s, e uma etapa final a 72°C por 5 min [Tabela 2].
Primers utilizados para o código de barras de DNA de Achillea millefolium
Região do primer Sequência (5’- 3’) ITS2 (White et al., 1990) Primer direto: 5’- GGAAGGAGGAGTCGTAAAAG-3’Primer reverso: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ PsbA-trnH (Tate e Simpson, 2003) Primer direto: 5’- GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’Primer reverso: 5’- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’
Visualização do produto da reação em cadeia da polimerase
Cinco microlitros do produto da PCR foram misturados com tampão de carregamento 6X (ML 015-Himedia) e carregados em gel de agarose a 2% em tampão Tris-acetato EDTA juntamente com marcador de DNA de 10 kb (Fermentos). A eletroforese foi realizada a 110V por 60 min e a fotografia foi tirada sob unidade de documentação de gel ultravioleta (UV) (Syngene, EUA). Os produtos amplificados bem-sucedidos foram analisados para sequenciamento Sanger na Eurofins Genomics Private Limited, Bengaluru.
Os traços cromatográficos (*.ab1 files) obtidos após o sequenciamento foram convertidos para o formato FAST All’ (FASTA) e editados usando a ferramenta ExPASy Translator. As sequências editadas foram selecionadas usando o algoritmo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) para identificar a sequência mais próxima da região ITS-2 e PsbA-trnH no banco de dados de nucleotídeos do GenBank, do National Centre for Biotechnology Information (NCBI) e pelo banco de dados Barcode of Life Data (BOLD) systems.

Análise fitoquímica

Produtos químicos e reagentes

Os produtos químicos utilizados no estudo foram de grau de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O ácido trifluoroacético foi adquirido da Merck Life Science Pvt. Ltd, Acetonitrila da Fischer Scientific, Metanol da Standard Reagents Pvt. Ltd., Etanol da Honyon Intl, Inc. Acetato de etila, Butanol e Ácido fórmico foram adquiridos da Rankem. O padrão de Rutina hidratada (Número CAS: 207671–50-9) foi adquirido da Sigma Aldrich.

Estudos fitoquímicos

As partes aéreas de A. millefolium foram secas, pulverizadas e extraídas com hidroálcool, que foi filtrado e concentrado até extrato seco. O extrato submetido à análise fitoquímica revelou a presença de flavonoides, que foram quantificados por espectrofotômetro UV-visível (UV-VIS). Os flavonoides apresentam coloração amarela quando tratados com o reagente cloreto de alumínio. As soluções estoque padrão e da amostra, de 0,05 mg/ml e 2 mg/ml respectivamente, foram preparadas em metanol, e 2 ml de cada uma dessas soluções foram pipetados em dois balões volumétricos diferentes de capacidade de 10 ml. A estes, foi adicionado 1 ml do reagente cloreto de alumínio e o volume foi completado para 10 ml com etanol. As soluções foram bem misturadas e a absorbância foi medida contra o branco do reagente preparado a 410 nm. A validação do método para a quantificação dos flavonoides foi realizada. As análises físico-químicas, como cinzas totais, perda por dessecação, cinzas insolúveis em ácido, valores extrativos em água e metanol, foram avaliadas usando as diretrizes da OMS para o controle de qualidade de medicamentos fitoterápicos.

Perda por dessecação

Dez gramas de amostra pulverizada foram transferidos para uma cápsula de evaporação tarada e secos a 105°C por 5 h e pesados. O processo foi continuado até que um resultado concordante fosse observado.

Cinzas totais

Dois gramas de material pulverizado foram pesados em um cadinho de sílica previamente pesado e incinerados, primeiro suavemente, e a temperatura foi aumentada gradualmente para 675°C ± 25°C até ficar livre de carbono.

Cinzas insolúveis em ácido

As cinzas obtidas foram tratadas com 25 ml de ácido clorídrico 2M e fervidas por 5 min. O material insolúvel foi coletado em um cadinho Gooch, lavado com água quente e incinerado a 600°C ± 25°C.

Valor extrativo solúvel em água
Cinco gramas de material em pó foram macerados com 100 ml de mistura de clorofórmio-água em um frasco fechado por 24 h, agitados continuamente por 6 h e deixados em repouso por 18 h. A solução foi filtrada, e 25 ml do filtrado foram secos completamente em uma placa rasa de fundo chato tarada a 105°C e pesados, o que fornece a porcentagem do valor extrativo solúvel em água.
Valor extrativo solúvel em álcool
Cinco gramas de material em pó foram macerados com 100 ml de álcool absoluto em um frasco fechado por 24 h. Foi agitado continuamente por 6 h e mantido em repouso por 18 h. A solução foi filtrada, e 25 ml do filtrado foram transferidos para um frasco de fundo chato e secos a 105°C e pesados, o que fornece o valor extrativo solúvel em álcool.
Análise por cromatografia líquida de alta eficiência
Um método que acopla HPLC com detector de arranjo de fotodiodos (PDA) foi utilizado para a separação e identificação de flavonoides e ácidos fenólicos. Diferentes composições de fase móvel foram escolhidas para obter o cromatograma com boa separação. Foi utilizado um HPLC analítico de fase reversa Shimadzu equipado com detector PDA, amostrador automático SIL-20 ACHT, desgaseificador DGU-20A5, bomba LC-20 AD, controlador de sistema CBM-20 A, forno CTO-10ASvp e software LC solutions.
Impressão digital por cromatografia em camada delgada
A impressão digital por cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada para a identificação de flavonoides e ácidos fenólicos no extrato. A amostra de extrato seco 50 mg/ml em metanol foi aplicada em placas de sílica gel 60F 254 pré-revestidas (Merck) usando o aplicador de amostras CAMAG Linomat V. A fase móvel empregada foi acetato de etila: butanol: ácido fórmico: água na proporção 5:3:1:1. A placa foi desenvolvida e visualizada sob UV 254 nm, 366 nm antes da imersão e imersa com solução de cloreto de alumínio e observada a 366 nm.
Resultados e Discussão
Caracteres organolépticos e macroscópicos
Partes aéreas secas, como fragmentos de caule, folhas e hastes de inflorescência com capítulos florais, foram estudadas. [Figura 2] A granel, a cor da amostra de referência seca varia de verde a marrom e preto suave, com odor levemente aromático e sabor ligeiramente amargo. Os caules são herbáceos, com cerca de 5 mm de espessura, cilíndricos e ligeiramente angulares nas extremidades cortadas devido a estrias longitudinais. São ramificados, com medula oca ou macio-esponjosa, quebram-se facilmente ao manuseio e as extremidades quebradas apresentam fratura fibrosa. A superfície é opaca, áspera, pubescente e com estrias longitudinais. As folhas são várias vezes pinatilobadas, altamente frágeis e enroladas. Folhas pinatissecadas com lâminas foliares de contorno linear a lanceolado, margem inteira e ápice agudo. A inflorescência é constituída pelo pedúnculo e capítulos florais. O pedúnculo é do tipo corimbo composto, com numerosos ramos. As flores mais jovens estão fixadas no topo da inflorescência com haste curta, e as flores mais velhas estão na base com haste longa. O pedúnculo apresenta numerosas cristas ou estrias longitudinais e, às vezes, encolhimento longitudinal com fratura fibrosa e textura lisa. Os capítulos florais têm até 0,5–0,7 mm de comprimento, com invólucro de brácteas.

Amostra autêntica de partes aéreas de A. millefolium

Características microscópicas

Seção transversal do caule

A seção transversal do caule mostra contorno circular com cristas e sulcos. [Figura 3] É composta por epiderme, córtex, vasculatura e medula central. A epiderme mais externa é uniestratificada, formada por células de formato quadrado a retangular, cobertas por cutícula e tricomas tectores ou não glandulares. Os tricomas medem cerca de 300–600 μ de comprimento, são não ramificados, unisseriados, multicelulares, de parede lisa, com célula basal bulbosa, 4–6 células curtas do pedúnculo e uma célula terminal longa com ponta afiada. O córtex é diferenciado em colênquima externo e parênquima interno. O colênquima tem 3–5 camadas e é multicamadas abaixo das cristas. O parênquima tem 6–8 camadas, formado por células simples, de paredes finas, de formato arredondado a poligonal, dispostas regularmente. A camada mais externa dos feixes vasculares é representada por uma camada distinta de endoderme, seguida pelo periciclo. O periciclo é o círculo descontínuo de fibras agrupadas, lignificadas, de paredes espessas com lúmen claramente visível, seguido pela região vascular, composta por floema externo e xilema interno. O floema é estreito, formado por células pequenas, de paredes finas, de formato arredondado a poligonal. O xilema apresenta vasos, fibras, células parenquimáticas e raios. Os raios são unisseriados ou, às vezes, bisseriados. A medula ocupa a maior parte, formada por células parenquimáticas de paredes finas, formato arredondado a poligonal, ou às vezes oca. A película epidérmica do caule mostra numerosos tricomas tectores e muito poucos tricomas glandulares. [Figura 4]

Seção transversal do caule corada com azul de toluidina mostra epiderme externa (ep) com tricoma (tr), córtex (co), endoderme (en), xilema (xy), floema (ph) e medula (pi)

Película epidérmica de folha corada com azul de toluidina mostra tricomas não glandulares (seta indicada)
Corte transversal de folha pinatissecta

Apresenta formato em “T”, com epiderme superior e inferior, envolvendo o tecido fundamental e o feixe vascular. [Figura 5] A epiderme é uniestratificada, composta por células quadradas revestidas por cutícula e apresenta tricomas semelhantes aos do caule, além da presença de alguns tricomas glandulares. O tecido fundamental é diferenciado em 2–3 camadas externas de células colenquimáticas compactamente arranjadas e camadas internas de células parenquimáticas de paredes finas, frouxamente arranjadas, com espaços intercelulares. Os feixes vasculares são em número de três, um feixe principal no meio e outros dois feixes acessórios em cada canto. Cada feixe vascular possui um grupo descontínuo de células de capuz do feixe esclerenquimáticas em ambas as superfícies. A película epidérmica da folha mostra tricomas não glandulares e glandulares. Os tricomas glandulares são representados como corpos redondos escuros e os estômatos são do tipo anomocítico, com células epidérmicas ligeiramente onduladas. [Figura 6]

Corte transversal de folha composta corado com azul de toluidina mostra epiderme externa (ep), tecido fundamental interno (gt) e feixe vascular central (vb)

Película epidérmica de folha corada com azul de toluidina mostra tricoma glandular (seta indicada)

Corte transversal do pedúnculo

Apresenta contorno circular com cristas e sulcos; mostra epiderme externa, córtex, região vascular e medula oca central [Figura 7]. A epiderme é uniestratificada, composta por células de formato arredondado a poligonal, com tricomas de cobertura ou não glandulares, longos, unicelulares e não ramificados. O córtex nas cristas é composto por faixas de células colenquimáticas, seguidas por células parenquimáticas. Nos sulcos, o córtex é diferenciado em células colenquimáticas e parenquimáticas. A estela é semelhante à do caule, mas apresenta medula mais larga.

CT do pedúnculo corado com azul de toluidina mostra epiderme externa (ep) com tricomas (tr), feixe vascular (vb) e medula parenquimatosa e parcialmente oca (pi)

Tricomas não glandulares, multicelulares, com célula terminal alongada e célula basal bulbosa foram relatados de forma semelhante em estudos anteriores. Tricomas glandulares são uni ou bisseriados, com base curta ou indistinta e cabeça bicelular, conforme relatado em Achillea clypeolata. Células do pedúnculo bicelulares e célula da cabeça única; tricoma glandular bisseriado. As células foliares são isobilaterais, com paliçada composta por 1–3 camadas, e paliçada uniestratificada também é relatada, enquanto o mesofilo é equifacial, com 6–8 camadas e indistinto, conforme observado de forma semelhante na Farmacopeia Americana. A endoderme é uniestratificada e distinta, conforme observado de forma semelhante em Achillea sivasica. Cristais de oxalato de cálcio estão ausentes, conforme relatado anteriormente de forma semelhante, embora contraditoriamente relatado por outro autor, onde estão presentes.

Microscopia do pó
O pó tem coloração esverdeada a marrom-esverdeada a marrom, com textura macia e grossa. Apresenta elementos vasculares, células parenquimáticas simples de paredes finas do córtex e da medula, células de paredes espessas e tricomas são abundantemente observados em toda parte. Vasos com espessamento espiralado [Figura 8a], espessamento escalariforme [Figura 8b], fibras [Figura 8c], fibras pericíclicas lignificadas de paredes espessas [Figura 8d], tricomas não glandulares, não ramificados, unisseriados, multicelulares [Figura 8e], células parenquimáticas de paredes finas [Figura 8f] e células dos raios [Figura 8g] são observados no caule. Alguns outros componentes celulares, como a descamação epidérmica, mostram estômatos e células epidérmicas [Figura 8h], e fragmentos de bráctea involucral também são observados aqui e ali [Figura 8i].
(a-i). Microscopia do pó de A. millefolium mostrando vasos (vs), fibras (fb), tricomas (tr), parênquima (pa), células dos raios (ry), epiderme (ep) e elementos de bráctea involucral (ib). A. millefolium: Achillea millefolium
Estudos de identificação molecular
Sequências parcialmente alinhadas foram submetidas à análise no NCBI BLAST e no banco de dados BOLD, e os resultados estão ilustrados na Tabela 3.
Confirmação de Achillea millefolium por análise de sequência parcial de ITS2 e PsbA-trnH
Nome do primer Comprimento da sequência Espécie correspondente no banco de dados de referência NCBI BOLD ITS2 (genoma ribossômico) 493 pares de bases A. millefolium -99,13% A. millefolium - 100% PsbA-trnH (genoma do cloroplasto) 713 pares de bases A. millefolium -98,00% Não aplicável
A. millefolium: Achillea millefolium, BOLD: Barcode of Life Data System, NCBI: National Center for Biotechnology Information
O DNA genômico isolado da espécie A. millefolium e a amplificação por PCR dos marcadores ITS e PsbA-trnH. A amplificação por PCR dos marcadores ITS e PsbA-trnH foi bem-sucedida, e obtivemos tamanhos esperados de 650 e 450 pares de bases, respectivamente. A região ITS consiste em ITS1, 5.8S rDNA e ITS2. Os sítios ribossômicos de 5.8S rRNA e 28S rRNA são altamente conservados. A partir da análise de sequência no NCBI BLAST, observou-se que o gene ITS apresentou 100% de similaridade de sequência homóloga com A. millefolium, bem como no banco de dados BOLD. Para confirmar esses resultados, outro marcador, PsbA-trnH, também mostrou similaridade de 98,89% quando comparado ao banco de dados NCBI. A análise dos resultados de ambos os genes distingue claramente a espécie A. millefolium de outras espécies, como Achillea ptarmica e Achillea alpina [Tabela 4]. Para a identificação precisa da espécie vegetal, os métodos baseados em DNA têm várias vantagens sobre a análise morfológica e química, pois dependem de genótipos em vez de fenótipos. Portanto, os resultados não seriam afetados por fatores ambientais ou pela idade do material vegetal. A presente investigação prova que o DNA Barcoding é um método consistente para diferenciar as espécies proximamente relacionadas de Achillea.
Sequências parcialmente alinhadas de ITS2 e PsbA-trnH
Nome da sequência parcial Sequência direta Sequência parcial (ITS2) >A. millefolium ITS2 gene Sequência direta CCCTTGGGACTGCGGAAGGATCATTGTCGAACCCTGCAAAGCAGAACGACCCGTGAACAC GTAAAAACAA CT GAGCGTCGAGTGGATTAAGCGTTTG TTTGATCCTCTCGATGCTTTGTCGATGTGC ATTTACTTGTGTTCTTTTTAGGACCTGGTGAATGTGTCATTGAC GCA ATAACAACCCCCGGCACAA TGTGTGCCAAGGAAAACTAAACTTGAGAAGGCTTGTTTCATGTTGCCCCGTTCGCGGTGCGCTCATGGAATG TGGCTTCTTTTTAATTACAAACGACTCTC GGCAACGGATATCTCGGCTCACGCATCGATGAAGAACGTAG CAAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC CGTGAACCATCGAGTTTTTGAACGCAAG TTGCGCCCGAAGCCTTTTGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGT CACGCATCGCGTCGCCCCCAACAA ATATCTGTTGGGGGCGGATATTGGTCTCCCGTGCTCATGGTGTGGTTGGCCAAAATAAGAGTCCC TTCGATGG ACACACGAACTAGTGGTGGTCGTA AAAACCCTCGTTCTTTGTTCTGTGTTAGTCGCA AGGAAAAACTCTTCAGATACCCCCAACGCGTTGTCTTAGG ATGACGCTTCGACCGCGACCC CAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAG TTTAAGCATATCATAAACCCGGGAAGAAAAA Sequência parcial (PsbA-trnH) >A. millefolium PsbA-trnH gene Sequência direta AAACGGATGTGCATCGCCATGTCGCGAGCTCCTCTACAATGGATAAGACTTTGGTC TGATTGTATAGGAGTTTTTGAACTAATAAAAAAGGAGCA ATAGCTTTCCTCTTGTTTTATCAAGAGG GCGTTATTGCTCCTTTTTTTATTTAGTACTATTTGCCTTGCACAGTTTCTTTAAAAATAATAAGGACTTT TTATAGTTTGGTTTGATTCGTGTGTT TTCGCTTTGTATTCATTTATATTATAGGTTTGTATATTCT ATTCCAAATTTTTTATGAAGTTTTATTTCCAATTCAATTTCAAAACAAAATCTATCAAAATTTAATTTTT GCTATTACTTTTATTTCATAAATAAA AAAGAAATAATATGCTCTTTTTTATGTTGAGGTAAAAATAT AGATAATACTATACTAGATAGATATATAGTAGAGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGG CAGT GGATTGTGAATCCCCCCACACACACCC CGAAA

A. millefolium: Achillea millefolium

Estudos fitoquímicos
As análises físico-químicas realizadas incluem perda por dessecação, cinzas totais, cinzas insolúveis em ácido e valores extrativos [Tabela 5]. A porcentagem do valor extrativo em água e metanol forneceu o rendimento do princípio ativo no respectivo solvente. O resultado revelou que os fitoconstituintes são mais solúveis em água do que em metanol. A quantidade de material inorgânico na forma de areia e outros adulterantes junto com a planta foi determinada pelo valor de cinzas. O valor mínimo e máximo de cinzas observado foi de 7,9% e 8,3%, respectivamente. A estimativa do teor de umidade na amostra é uma ferramenta significativa para determinar a possibilidade de degradação devido ao alto teor de umidade. A porcentagem mínima e máxima de teor de umidade observada foi de 9,1% p/p e 9,9% p/p.
Parâmetros físico-químicos das partes aéreas de Achillea millefolium
Parâmetro Valores (% p/p) Perda por dessecação 9,50±0,40 Cinzas totais 8,03±0,23 Cinzas insolúveis em ácido 1,33±0,25 Valor extrativo em água 18,50±1,35 Valor extrativo em metanol 6,47±0,31
O extrato seco hidrometanólico revelou a presença de flavonoides, que foram quantificados usando Rutina como padrão. O rendimento percentual de flavonoides observado foi de 3,7% p/p, quantificado por método espectrofotométrico UV-VIS validado. O método de HPLC realizado neste estudo teve como objetivo desenvolver um sistema cromatográfico capaz de resolver flavonoides e ácidos fenólicos. No desenvolvimento do método de HPLC, muitos ensaios foram conduzidos usando diferentes sistemas de solventes e colunas. A separação cromatográfica foi obtida usando ácido trifluoroacético 0,1% em água e acetonitrila 100% como fase móvel, com eluição em gradiente linear (0–10 min, conc. B 10%–30%, 15–18 min, conc. B 30%–40%, 18–22 min, conc. B 40%–80%, 22–26 min, conc. B 80%, 28–30, conc. B 10%) a uma vazão de 1,0 ml/min e temperatura da coluna de 35°C. Os picos de ácidos fenólicos e flavonoides foram bem resolvidos a 330 nm.

A melhor separação foi obtida com a coluna Ascentis Express C18 (100 × 4,6) mm, tamanho de partícula: 2,7 μ. Os flavonoides e ácidos fenólicos apresentaram absorbância máxima a 330 nm [Figura 9]. Os parâmetros de adequação do sistema, como prato teórico, fator de cauda e resolução, atenderam aos critérios de aceitação. Os compostos fenólicos e flavonoides foram eluídos nos tempos de retenção de 5,68; 6,28; 7,19; 9,38; 19,557; 20,267 e 12,636; 14,156; 14,409; 14,967; 15,198; 18,149; 20,781 e 21,408, respectivamente [Figuras 10 e 11].

Cromatograma da amostra do extrato hidrometanólico de A. millefolium. A. millefolium: Achillea millefolium

Espectro UV dos ácidos fenólicos no extrato hidrometanólico de A. millefolium. UV: Ultravioleta, A. millefolium: Achillea millefolium

Espectro UV dos flavonoides no extrato hidrometanólico de A. millefolium. UV: Ultravioleta, A. millefolium: Achillea millefolium

A impressão digital por CCD da amostra é apresentada [Figura 12]. A UV-366 nm, antes da pulverização com cloreto de alumínio, bandas de supressão azul escuro representam ácidos fenólicos e, após a pulverização, bandas amarelas representam flavonoides. As amostras coletadas de várias localidades e do fornecedor foram analisadas e comparadas para estudos macroscópicos, microscópicos, moleculares e fitoquímicos.

Impressão digital por CCD do extrato hidrometanólico de A. millefolium. CCD: Cromatografia em Camada Delgada
As plantas medicinais com ricos metabólitos secundários possuem grande valor medicinal e têm sido amplamente utilizadas como fármacos na indústria farmacêutica. Os fitoquímicos, particularmente os compostos fenólicos vegetais (ácidos fenólicos e flavonoides), constituem um grupo importante de compostos que atuam como antioxidantes primários. A presença de ácidos fenólicos e flavonoides revelou que a parte aérea de A. millefolium poderia ser utilizada como um promissor antioxidante natural. O conhecimento de fitomarcadores é a abordagem preliminar para identificar novos metabólitos secundários no ingrediente botânico e seu extrato. A pesquisa amostral realizada pelos pesquisadores sobre A. millefolium no passado recente revelou a importância desta planta para uso como fármaco. O presente estudo revelou a farmacognosia e a fitoquímica de A. millefolium para explorar seu potencial terapêutico e oportunidades de pesquisa. O método de CLAE desenvolvido e proposto demonstrou alta especificidade na detecção a 330 nm de compostos fenólicos e flavonoides nos extratos de A. millefolium, e este método pode ser aplicado para a identificação rotineira. Os dados analíticos dos fitoquímicos nesta planta são a abordagem básica para a identificação e quantificação de compostos fenólicos e flavonoides abundantes. O fenol apresenta absorção maior ou menor na região UV devido à presença de ligações duplas conjugadas e anéis aromáticos. Os ácidos fenólicos com o esqueleto carbônico do ácido benzoico apresentam seus máximos na faixa de 200–290 nm e derivados do ácido cinâmico. A conjugação adicional mostra uma banda de absorbância ampla de 270 a 360 nm. Os espectros UV da maioria dos flavonoides consistem em dois máximos de absorção principais, um dos quais ocorre na faixa de 240–285 nm e o outro na faixa de 300–400 nm; a partir dos dados espectrais de UV, conclui-se que os picos eluídos nos tempos de retenção de 5,68; 6,28; 7,19; 9,38; 19,557 e 20,267 pertencem a ácidos fenólicos derivados do ácido cinâmico, e os picos em 12,636; 14,156; 14,409; 14,967; 15,198; 18,149; 20,781 e 21,408 pertencem a flavonoides. Os resultados estavam em conformidade com as diretrizes do Conselho Internacional de Harmonização (ICH). O método quantitativo desenvolvido foi aplicado com sucesso para a análise de flavonoides no extrato de A. millefolium. O método de CLAE proposto retrata a identificação de ácidos fenólicos e flavonoides que são bem resolvidos a 330 nm. Além disso, este método pode ser aplicado para a padronização de fitoterápicos multicomponentes com extrato de A. millefolium. O presente estudo permitirá abrir uma janela na busca de fitomarcadores como compostos bioativos.
Avaliar a segurança e eficácia de medicamentos fitoterápicos continua problemático, com métodos inadequados ou inconsistentes sendo usados para sua identificação precisa. A identificação de A. millefolium é difícil de estabelecer apenas com base em características morfológicas. Portanto, as amostras de A. millefolium foram coletadas de plantas taxonomicamente identificadas e padronizadas sistematicamente quanto aos seus parâmetros de autenticidade com base em avaliação farmacognóstica, análise de código de barras de DNA e estudos fitoquímicos. Os resultados deste trabalho são úteis na identificação precisa de A. millefolium.
Apoio financeiro e patrocínio
Este trabalho é apoiado pelo Centro de P&D, Himalaya Wellness Company, Makali, Tumakuru Road, Bengaluru, Karnataka, Índia, CEP 562162.
Conflitos de interesse
Não há conflitos de interesse.
Etnobotânica e fitoquímica do mil-folhas, Achillea millefolium, Compositae
Achillea millefolium L um promissor auxiliar de saúde na farmacologia moderna
Farmacognosia, fitoquímica e propriedades farmacológicas de Achillea millefolium L
Brinjasif (Achillea millefolium Linn):Uma medicina Unani eficaz
Mil-folhas (Achillea millefolium Linn) Uma planta medicinal fitoterápica com amplo uso terapêutico – Uma revisão
Chás medicinais fitoterápicos da África do Sul
Medicamentos botânicos para saúde bucal
Tendências emergentes do cuidado fitoterápico em odontologia
Estudo etnobotânico de plantas medicinais no distrito central do condado de Zanjan, província de Zanjan
Atividade antibacteriana do óleo essencial de Achillea clavennae contra patógenos do trato respiratório
A composição do óleo essencial de Tenuifolia L cultivada sob condição tropical na Índia
Achillea spp:Uma revisão abrangente sobre sua etnobotânica, fitoquímica, fitofarmacologia e aplicações industriais
Minirrevisão sobre Achillea millefolium Linn
Achillea – Uma nova fonte de corante natural para tingimento de lã
Mil-folhas (Achillea millefolium L):Uma panaceia negligenciada?Uma revisão de etnobotânica, bioatividade e pesquisa biomédica
Identificação de Plantas Medicinais Usando a Técnica de Código de Barras de DNA,
ITS e trnH-psbA como códigos de barras de DNA eficientes para identificar angiospermas lenhosas comerciais ameaçadas das florestas tropicais atlânticas do sul do Brasil
Extrato da erva Achillea millefolium L:Atividade antioxidante e efeito nas funções mitocondriais do coração de rato
Análise comparativa de flavonoides em Achillea sp Seção Millefolium e seção ptarmica
Investigações fitoquímicas sobre constituintes químicos de Achillea tenuifolia Lam
A promessa do código de barras de DNA para a taxonomia
Gapped BLAST e PSI-BLAST:Uma nova geração de programas de busca em banco de dados de proteínas
Caracterização da atividade antioxidante do extrato de Artemisia vulgaris
Micromorfologia de Achillea clypeolata:Contribuição ao perfil farmacognóstico
Investigações anatômicas da espécie turca criticamente ameaçada:Achillea sivasica Çelik et Akpulat (Asteraceae)
Identificação, caracterização e palinologia de plantas medicinais de alto valor
Padronização de algumas plantas medicinais hepatoprotetoras
Métodos de extração, separação e detecção de ácidos fenólicos e flavonoides
Flavonas