pmid: "37405118"
title: ""
authors: "Ghasemi MR, Ranjbar A, Tamri P, Pourmoslemi S, Nourian A, Dastan D"
journal: "Journal of pharmacopuncture"
pubdate: "2023 Jun 30"
doi: "10.3831/KPI.2023.26.2.167"
source: "PMC Full Text"

Autores

Ghasemi MR, Ranjbar A, Tamri P, Pourmoslemi S, Nourian A, Dastan D

Periodico

Journal of pharmacopuncture (2023 Jun 30)

Conteudo

Atividade Antibacteriana In vitro e Efeitos na Cicatrização de Feridas do Óleo Essencial de Achillea millefolium em Ratos
Objetivos
Neste estudo, objetivamos avaliar a atividade antibacteriana in vitro e as propriedades de cicatrização de feridas do óleo essencial de Achillea millefolium (AMEO) em modelo de ferida de espessura total em ratos. A atividade antibacteriana do AMEO foi avaliada contra Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa utilizando o método de diluição em caldo.
Métodos
Feridas excisionais de espessura total de 2 cm × 2 cm foram criadas no dorso dos animais. A terapia tópica foi aplicada duas vezes ao dia usando pomadas de AMEO a 1%, 2% e 3% p/p, e a medição da área das feridas foi realizada a cada 3 dias, após o que a porcentagem de fechamento da ferida foi calculada nesses dias. O conteúdo de hidroxiprolina e a avaliação histopatológica das amostras de tecido da ferida foram realizados nos dias 7 e 14 após a ferida. A eucerina foi utilizada para o tratamento do grupo controle veículo e o grupo controle negativo não recebeu tratamento.
Resultados
Nossos resultados revelaram a atividade bacteriostática do AMEO contra S. aureus e P. aeruginosa. A avaliação da atividade de cicatrização de feridas do AMEO mostrou aumento significativo (p < 0,05) nas porcentagens de fechamento da ferida em ratos tratados com AMEO 1% e 2% em comparação com o grupo sem tratamento. Além disso, os teores de hidroxiprolina do tecido aumentaram significativamente (p < 0,01) no AMEO 1% e 2% em comparação com o grupo sem tratamento. As avaliações histopatológicas das amostras de tecido da ferida nos dias 7 e 14 demonstraram maior acúmulo de fibras de colágeno, redução de edema e inflamação e também formação de apêndices teciduais nos grupos tratados com AMEO 1% e 2% em comparação com o grupo sem tratamento.
Conclusão
Os resultados deste estudo indicaram que o AMEO tem potencial para ser utilizado como um agente de cicatrização de feridas seguro e eficaz.
INTRODUÇÃO
A cicatrização de feridas é um processo complexo que consiste em quatro etapas complexas: hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação. A fase de hemostasia da cicatrização de feridas, compreendendo vasoconstrição, agregação plaquetária e coagulação, ocorre rapidamente. A segunda fase é iniciada logo após a lesão e consiste em sinalização celular, migração de diferentes células, como macrófagos, para o local da ferida, o processo de sinalização em cascata celular, liderado por citocinas, e finalmente a ativação e proliferação de fibroblastos, o que leva à reconstrução e reabilitação da estrutura de colágeno. A fase final é a restauração das características normais do local da ferida.
Vários fatores podem interromper ou atrasar os processos mencionados acima, e estes incluem infecções bacterianas oportunistas. Os sinais clínicos de uma ferida infectada são dor tópica e eritema, exsudato infeccioso e mau odor. A infecção em uma ferida causada por bactérias é a principal razão para feridas crônicas, o que pode levar a distúrbios de mobilidade, disfunção de múltiplos órgãos e até situações mais ameaçadoras à vida. Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa são os dois patógenos mais comuns isolados de feridas crônicas.
Existem uma variedade de agentes terapêuticos e técnicas para tratar feridas. No entanto, feridas crônicas e que não cicatrizam são um dos problemas de saúde mais comuns no mundo e podem frequentemente levar à incapacidade ou até à mortalidade. Portanto, pesquisar novas técnicas e medicamentos para acelerar a cicatrização de feridas é fundamental. Nos últimos anos, plantas medicinais e seus derivados, como óleos essenciais, têm sido considerados por pesquisadores como fontes para a produção de novos agentes eficazes na cicatrização de feridas.
Achillea millefolium, também conhecida como milefólio, é uma espécie da família Asteraceae e tem uma longa história de usos tradicionais no tratamento de distúrbios gastrointestinais, doenças hepáticas, dor reumática, pneumonia e cicatrização de feridas em várias culturas da Ásia e Europa. Os efeitos anti-inflamatórios do óleo essencial de A. millefolium (OEAM), causados pela inibição de proteases, foram amplamente demonstrados em vários estudos. A análise por GC-MS do OEAM identificou vários componentes ativos, como eucaliptol, cânfora, α-terpineol, β-pineno e borneol.
Estudos in vitro do OEAM demonstraram propriedades antioxidantes e antimicrobianas contra Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringens, Candida albicans, Mycobacterium smegmatis, Acinetobacter lwoffii e Candida krusei.
O objetivo principal deste estudo foi avaliar o potencial de cicatrização de feridas e a atividade antibacteriana do OEAM contra dois microrganismos comuns (S. aureus e P. aeruginosa) envolvidos na infecção de feridas.
MATERIAIS E MÉTODOS

1. Avaliação da atividade antibacteriana do OEAM
   Cepas padrão de S. aureus (S. aureus, ATCC6538) e P. aeruginosa (P. aeruginosa, ATCC 27853) foram adquiridas da Coleção de Culturas Tipo Persa na Organização de Pesquisa Iraniana para Ciência e Tecnologia (IROST), Teerã, Irã. As bactérias foram cultivadas em ágar nutriente (AN). Um padrão 0,5 McFarland (a concentração final de 10^8 UFC/mL de cada organismo individualmente) foi preparado pela coleta dos organismos e suspensão em uma solução salina.
   Concentrações inibitórias mínimas (CIMs) do AMEO contra S. aureus e P. aeruginosa foram determinadas pelo método de diluição em caldo. Diluições seriadas do AMEO em caldo (0,0625, 0,125, 0,5, 1, 1,5 e 2 mL/mL) foram preparadas em tubos de ensaio; em seguida, 100 µL de suspensão bacteriana (107 UFC/mL de cepas de S. aureus e P. aeruginosa) com 1 mL de SCDB (Caldo de Digestão de Caseína de Soja) foram inoculados em cada tubo de ensaio, antes de serem incubados a 37°C por 24 h. Os tubos controle (controle do meio e controle do organismo + meio) também foram preparados para cada cepa. A menor concentração do AMEO que não produz turbidez (nenhum crescimento visível) foi considerada a CIM.

2. Preparação das pomadas de AMEO
   O óleo essencial de Achillea millefolium foi adquirido da Shafa Kurdistan Inc. (Irã, Curdistão) e 1, 2 e 3 g de óleo essencial foram misturados em 100 g de Eucerin para preparar pomadas de AMEO a 1%, 2% e 3% p/p, respectivamente.

3. Animais
   30 ratos Wistar (pesando 200 ± 30 g) de ambos os sexos foram utilizados neste estudo. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais sob condições padrão de temperatura (22 ± 2°C), umidade relativa (50-55%) e ciclos claro-escuro de 12:12 h. Os animais foram permitidos adaptar-se às condições laboratoriais por sete dias antes do experimento.

4. Procedimento de ferida
   Os ratos foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n = 5). O grupo controle negativo não recebeu tratamento, o grupo veículo recebeu Eucerin tópico, e os grupos teste receberam pomada de AMEO a 1%, 2% e 3%, respectivamente. Creme de fenitoína a 1% foi usado como controle positivo. Após anestesiar os ratos com injeção IP de cetamina (60 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg), os pelos do local da ferida foram raspados e a área foi desinfetada com etanol 70%; em seguida, uma ferida excisional de espessura total com dimensões de 2 cm × 2 cm foi criada no dorso de cada animal. Os tratamentos das feridas foram tipicamente aplicados duas vezes ao dia, começando duas horas após a criação da ferida até o fechamento completo da ferida.
   As áreas das feridas foram medidas a cada três dias através da análise de fotografias das feridas usando o software ImageJ, enquanto a porcentagem de fechamento da ferida foi calculada usando a seguinte equação:

5. Coleta de biópsia
   Amostras de secção transversal de espessura total foram coletadas nos dias 7 e 14 pós-ferida. Para o estudo histopatológico, as amostras foram fixadas em formalina 10%, enquanto para o ensaio de hidroxiprolina, as amostras de pele foram homogeneizadas e centrifugadas, e o sobrenadante foi aliquotado e armazenado a –80°C até o momento do uso.

6. Ensaio de hidroxiprolina
   A hidroxiprolina é um dos componentes estruturais do colágeno. A determinação das quantidades de hidroxiprolina no tecido indica a quantidade de colágeno sintetizado no tecido. O kit de ensaio de hidroxiprolina foi adquirido da KiaZist life sciences, Irã. O ensaio do teor de hidroxiprolina das amostras de tecido foi conduzido de acordo com as diretrizes do fabricante sete e 14 dias após a criação da ferida.

7. Histopatologia
   Os estudos histopatológicos das amostras foram realizados utilizando coloração por hematoxilina e eosina (H&E) e tricrômico de Masson. Inflamação, re-epitelização, angiogênese, formação de tecido de granulação e deposição de matriz extracelular foram avaliados pela coloração H&E, enquanto o grau de deposição de colágeno foi observado usando a coloração tricrômico de Masson.

8. Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± DP, e a análise dos dados foi realizada utilizando GraphPad Prism por meio de ANOVA de uma via e testes post-hoc de Tukey. O nível de significância foi p < 0,05 para todas as análises.

RESULTADOS

1. Atividade antibacteriana

A determinação da CIM pelo método de diluição em caldo foi utilizada para avaliar a atividade antibacteriana do AMEO. Os resultados mostraram que o AMEO pode inibir o crescimento de S. aureus e P. aeruginosa. As CIMs do AMEO para ambos os microrganismos foram a uma concentração de 1 mg/mL.

2. Cicatrização da ferida

O tempo médio para o fechamento completo da ferida para os grupos AMEO 1%, AMEO 2%, AMEO 3%, Fenitoína, Eucerina e controle negativo foram 19,4, 22, 26, 27, 26 e 26 dias, respectivamente. O tempo de fechamento completo da ferida do grupo tratado com AMEO 1% foi significativamente menor do que os dos outros grupos (p < 0,01), exceto para o grupo AMEO 2%. O tempo de fechamento completo da ferida do AMEO 2% foi significativamente menor do que os dos grupos AMEO 3%, Fenitoína, Eucerina e controle negativo (p < 0,01). Curiosamente, o grupo controle positivo, que eram as feridas tratadas com Fenitoína, teve a taxa de fechamento mais lenta.

Três dias após a criação da ferida, os grupos tratados com AMEO 1% e 2% demonstraram uma taxa de fechamento da ferida significativamente maior (34,4% ± 7,1 e 32,75% ± 4,43, respectivamente) em comparação com o grupo controle negativo (19,92% ± 1,372) (p < 0,05). No dia 6 pós-lesão, a taxa de fechamento da ferida foi significativamente maior nos ratos tratados com pomada de AMEO 1% (48,3% ± 4,02) em comparação com o controle negativo (33,65% ± 8,42) e os grupos veículo (35,2% ± 7,44) (p < 0,01). Nos dias 9 e 12 pós-lesão, as taxas de fechamento da ferida nos ratos tratados com AMEO 1% (69,8% ± 4,7 e 78,45% ± 5,9, respectivamente) e AMEO 2% (62,95% ± 3,39 e 75,1% ± 2,17, respectivamente) foram significativamente maiores quando comparadas às do grupo controle negativo (50,31% ± 5,39 e 61,45% ± 4,45, respectivamente) (p < 0,05). Não houve diferenças significativas na taxa de fechamento da ferida entre os animais tratados com Eucerina (veículo) e o grupo controle negativo nos dias 3, 6, 9 ou 12 (Fig. 1).

3. Ensaio de hidroxiprolina

Os resultados do ensaio de hidroxiprolina são mostrados na Fig. 2. Os conteúdos de hidroxiprolina das amostras de tecido obtidas de animais tratados com AMEO 1% (170,4 ± 5,98 e 196 ± 7,6 µg/mg de tecido nos dias 7 e 14, respectivamente) e AMEO 2% (171,6 ± 6,94 e 193,6 ± 4,636 µg/mg de tecido nos dias 7 e 14, respectivamente) foram significativamente (p < 0,01) maiores do que os do grupo controle negativo (153,2 ± 8,87 e 164,8 ± 4,76 µg/mg de tecido nos dias 7 e 14, respectivamente) (Fig. 2).

4. Estudo histopatológico
   O estudo histopatológico do tecido da ferida nos diferentes grupos experimentais mostrou resposta inflamatória atenuada e maior deposição de colágeno no grupo tratado com AMEO 1% em comparação com os outros grupos experimentais no 7º dia pós-ferimento (Fig. 3, 4).
   A formação da camada epidérmica com mais camadas celulares, a formação de protrusões epidérmicas e papilas dérmicas, o reaparecimento de anexos cutâneos e uma redução do edema e da inflamação no tecido de granulação foram observados em amostras obtidas de animais tratados com AMEO 1% no 14º dia pós-ferimento. O estudo histopatológico das amostras obtidas dos grupos tratados com AMEO 3%, Eucerina e controle negativo não mostrou nova camada epidérmica ou coágulo, bem como uma redução do edema e da inflamação no tecido de granulação. Além disso, redução da hiperemia vascular e acúmulo de fibras de colágeno no tecido de granulação foram observados nesses grupos no 14º dia pós-lesão. Um estudo das amostras obtidas de animais tratados com AMEO 2% no 14º dia revelou a formação de uma fina camada epidérmica e uma redução do edema, inflamação e hiperemia vascular, bem como um acúmulo significativo de fibras de colágeno no tecido de granulação (Fig. 5, 6).
   DISCUSSÃO
   As feridas cutâneas são os problemas de saúde mais comuns que as pessoas enfrentam ao longo da vida, portanto, desenvolver novos métodos e medicamentos para promover a cicatrização ideal de feridas é essencial. Plantas medicinais e seus derivados podem ser usados como uma fonte importante para o desenvolvimento de potenciais novos medicamentos eficazes para a cicatrização de feridas.
   Neste estudo, avaliamos o potencial de cicatrização de feridas do óleo essencial de Achillea millefolium em um modelo de ferida de espessura total em ratos. Considerando que uma das principais razões para a cicatrização retardada de feridas é uma infecção causada por bactérias como Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, a atividade antibacteriana in vitro do óleo essencial de A. millefolium contra esses dois microrganismos também foi investigada. Os resultados deste estudo mostraram que o AMEO em uma concentração de 2% ou menos (com a pomada de AMEO 1% sendo a concentração mais eficaz) tem o potencial de acelerar a cicatrização de feridas ao atenuar a resposta inflamatória e aumentar a síntese de colágeno e a atividade antibacteriana. Achillea tem sido usada na medicina tradicional para o tratamento de feridas em todo o mundo; e o nome Achillea é derivado de Aquiles, o herói grego que usou mil-folhas para curar as feridas dos soldados durante a Guerra de Troia. A atividade de cicatrização de feridas dos extratos de A. millefolium foi avaliada em vários estudos, embora, até o momento, nenhum estudo tenha investigado os efeitos do óleo essencial de A. millefolium na cicatrização de feridas.
   Monoterpenos e sesquiterpenos são as moléculas mais representativas do óleo essencial de Achillea e cada um dos monoterpenos avaliados demonstrou propriedades de cicatrização de feridas. Os efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios dos monoterpenos e sesquiterpenos são frequentemente associados à atividade de cicatrização de feridas.
   O colágeno é a proteína mais abundante no corpo e o componente mais importante da matriz extracelular. Considerando que o aminoácido hidroxiprolina existe exclusivamente na proteína colágeno, medimos a quantidade de hidroxiprolina nas amostras de tecido obtidas dos grupos estudados para estimar o conteúdo de colágeno no tecido de cicatrização de feridas dos diferentes grupos experimentais. O ensaio de hidroxiprolina mostrou que AMEO 1% e 2% aumentaram significativamente o conteúdo de hidroxiprolina no tecido. Esses resultados parecem indicar que o aumento da síntese de colágeno é um dos possíveis mecanismos pelos quais o AMEO pode cicatrizar feridas. O aumento da síntese de colágeno pode ser devido à presença de grandes quantidades de terpenos no AMEO. É provável que o AMEO estimule a migração de fibroblastos para o local da ferida e os ative para produzir colágeno. O aumento da produção de colágeno nos grupos tratados com AMEO 1% e 2% também foi confirmado por estudos histológicos.
   Outro achado importante deste estudo foi a atividade antibacteriana demonstrada pelo AMEO contra S. aureus e P. aeruginosa, as bactérias mais comuns isoladas de feridas crônicas, que frequentemente formam um biofilme resistente a muitos antibióticos. A coinfecção com essas duas cepas bacterianas é um grande desafio no tratamento de feridas crônicas. Curativos antibacterianos para feridas diminuem o risco de infecção bacteriana durante a cicatrização e evitam que as feridas se tornem crônicas. Com base nos resultados deste estudo, o AMEO tem potencial para ser usado como curativo antibacteriano para feridas em combinação com biomateriais sintéticos.
   CONCLUSÃO
   Este estudo mostrou que o AMEO tem potencial para tratar feridas. O AMEO acelerou o processo de cicatrização de feridas ao atenuar a resposta inflamatória e estimular tanto a síntese de colágeno quanto a angiogênese. Além disso, a atividade antibacteriana do AMEO contra S. aureus e P. aeruginosa pode reduzir o risco de infecção da ferida, o que significa que ele tem potencial para ser usado em combinação com antibióticos padrão no tratamento de feridas infectadas. Além disso, poderia ser usado em combinação com biomaterial sintético para a preparação de curativos antibacterianos para feridas.
   APROVAÇÃO ÉTICA
   Todos os procedimentos de experimentação animal foram realizados de acordo com as diretrizes para cuidado e uso de animais de laboratório aprovadas pelo comitê de ética em pesquisa biomédica da Universidade de Ciências Médicas de Hamadan (código ético: IR.UMSHA.REC.1400.097).
   CONFLITOS DE INTERESSE
   Os autores declaram não haver potenciais conflitos de interesse em relação à pesquisa, autoria e publicação deste artigo.
   FINANCIAMENTO
   Este estudo foi adaptado de uma tese de PharmD na Universidade de Ciências Médicas de Hamadan. O estudo foi financiado pelo Vice-Chanceler de Pesquisa e Tecnologia da Universidade de Ciências Médicas de Hamadan, Hamadan, Irã (número de subsídio: 140003252548).
   REFERÊNCIAS
   Um novo modelo de biofilme de ferida crônica que sustenta a coexistência de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus adequado para testar o efeito antibiofilme de soluções antimicrobianas e curativos para feridas
   Desafios no tratamento de feridas crônicas
   Atividade de cicatrização de feridas do óleo essencial de Bursera morelensis, em camundongos
   Achillea millefolium L. s.l. revisitada: descobertas recentes confirmam o uso tradicional
   Uma revisão sobre fitoquímica e propriedades medicinais do gênero Achillea
   Isolamento dos princípios anti-inflamatórios de Achillea millefolium (Compositae)
   Achillea millefolium L. s.l. -- a atividade anti-inflamatória é mediada pela inibição de protease?
   Quantificação simultânea de 14 compostos em Achillea millefolium por análise de GC-MS e espectroscopia no infravermelho próximo combinadas com técnicas multivariadas
   Atividade antioxidante e antimicrobiana do óleo essencial e extratos metanólicos de Achillea millefolium subsp. millefolium Afan. (Asteraceae)
   Eficácia antibacteriana do mel cru e processado
   Validação de um método de microdiluição em caldo para determinação da atividade antibacteriana de óleos essenciais
   Investigação dos efeitos cicatrizantes do ácido cinâmico em um modelo de ferida de espessura total em coelho
   ImageJ: um método gratuito, fácil e confiável para medir úlceras de perna usando imagens digitais
   Medição de hidroxiprolina no colágeno com três métodos diferentes
   Conceitos atuais em terapia antibiótica combinada para pacientes gravemente enfermos
   Extratos de plantas exibem sinergismo com diferentes classes de antibióticos
   Atividade sinérgica de antibióticos e extratos vegetais bioativos: um estudo contra bactérias gram-positivas e gram-negativas
   Efeito sinérgico de extratos de Thymbra spicata L. com antibióticos contra cepas de Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae multirresistentes
   Bioatividades do óleo essencial de Achillea millefolium e seus principais terpenos do Irã
   Efeitos promotores da síntese de colágeno do óleo de andiroba e seus constituintes limonoides em fibroblastos dérmicos humanos normais
   Atividade antibacteriana e efeito sinérgico entre extratos de agrião, 2-feniletila isotiocianato e antibióticos contra 11 isolados de Escherichia coli de origem clínica e animal
   Porcentagens de fechamento da ferida nos grupos estudados nos dias 3, 6, 9, 12 após a lesão. Os dados são apresentados como média ± DP% de fechamento da ferida. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 indicam diferenças significativas em relação ao grupo não tratado. #p < 0,05 e ##p < 0,01 indicam diferenças significativas em relação ao grupo tratado com Eucerina.
   O conteúdo de hidroxiprolina das amostras de tecido da ferida nos grupos estudados nos dias 7 e 14 após a lesão. Os dados são apresentados como média ± DP µg/mg de tecido de hidroxiprolina. **p < 0,01 mostra as diferenças em relação ao grupo não tratado.
   Micrografias histopatológicas de amostras de tecido da ferida obtidas dos grupos estudados no dia 7 após a ferida usando coloração H&E. Barra de escala é 100 µm, AMEO, óleo essencial de Achillea millefolium; Estrela preta, coágulo; Estrela branca, tecido de granulação.
   Micrografias histopatológicas de amostras de tecido da ferida dos grupos estudados no dia 7 após a lesão, utilizando coloração tricrômica de Mason. Barra de escala é 100 µm, AMEO, óleo essencial de Achillea millefolium; Ponta da seta, colágeno; Seta, vasos sanguíneos; Estrela preta, coágulo.

Micrografias histopatológicas de amostras de tecido da ferida obtidas dos grupos estudados no dia 14 após a lesão, utilizando coloração HE. Barra de escala é 100 µm, AMEO, óleo essencial de Achillea millefolium; Estrela branca, tecido de granulação; A, anexos cutâneos; P, papila dérmica; R, protuberâncias epidérmicas; Seta, epiderme.

Micrografias histopatológicas de amostras de tecido da ferida dos grupos estudados no dia 14 após a lesão, utilizando coloração tricrômica de Mason. Barra de escala é 100 µm, AMEO, óleo essencial de Achillea millefolium; Ponta da seta, colágeno; Seta, vasos sanguíneos; Estrela preta, coágulo.