pmid: "37165987"
title: "Vesículas extracelulares derivadas de Akkermansia muciniphila promovem a placentação e mitigam a pré-eclâmpsia em um modelo de camundongo."
authors: "Chen Y, Ou Z, Pang M, Tao Z, Zheng X, Huang Z, Wen D, Li Q, Zhou R, Chen P, Situ B, Sheng C, Huang Y, Yue X, Zheng L, Huang L"
journal: "Journal of extracellular vesicles"
pubdate: "2023 May"
doi: "10.1002/jev2.12328"
source: "PMC Full Text"
Vesículas extracelulares derivadas de Akkermansia muciniphila promovem a placentação e mitigam a pré-eclâmpsia em um modelo de camundongo.
Autores
Chen Y, Ou Z, Pang M, Tao Z, Zheng X, Huang Z, Wen D, Li Q, Zhou R, Chen P, Situ B, Sheng C, Huang Y, Yue X, Zheng L, Huang L
Periodico
Journal of extracellular vesicles (2023 May)
Conteudo
Extracellular vesicles derived from Akkermansia muciniphila promote placentation and mitigate preeclampsia in a mouse model
Resumo
A pré-eclâmpsia (PE) é uma doença multissistêmica com altas taxas de morbidade e mortalidade materna. Atualmente, nenhuma abordagem terapêutica prática está disponível para prevenir a progressão da PE, exceto o parto precoce. A disbiose intestinal está associada ao desenvolvimento da PE. Dados anteriores mostraram que a abundância de Akkermansia muciniphila (Am) era menor em pacientes com PE do que em mulheres grávidas normotensas. Aqui, neste estudo, foi observada uma diminuição na abundância de Am em um modelo de camundongo com PE. Além disso, descobrimos que a administração de Am poderia atenuar significativamente a pressão arterial sistólica, promover o crescimento fetal e melhorar a patologia placentária em camundongos com PE. Além disso, vesículas extracelulares derivadas de Am (AmEVs) foram transferidas do trato gastrointestinal (TGI) para a placenta e mitigaram os sintomas pré-eclâmpticos em camundongos com PE. Esses efeitos benéficos das AmEVs foram mediados pelo aumento da invasão trofoblástica da artéria espiralada (AE) e remodelação da AE através da ativação da via de sinalização do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)–fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K)–proteína quinase B (AKT). Coletivamente, nossos achados revelaram o benefício potencial do uso de AmEVs para o tratamento da PE e destacaram importantes interações hospedeiro-microbiota.
Am produziu EVs no TGI. As AmEVs podem atravessar a barreira intestinal e alcançar a placenta nas mães. As AmEVs podem interagir com os trofoblastos para melhorar a proliferação, migração e invasão trofoblástica, ativando a via de sinalização EGFR-PI3K-AKT, que promove ainda mais a remodelação da AE. O resumo gráfico foi criado com o BioRender.com. AE, artéria espiralada; TGI, trato gastrointestinal.
INTRODUÇÃO
A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome específica da gravidez que afeta 2%–8% de todas as gestações (Gestational Hypertension & Preeclampsia: ACOG Practice Bulletin, Number 222,). A PE é a principal causa de morbidade materna e é responsável por 75.000 mortes maternas em todo o mundo a cada ano (Duley,). As complicações devido à PE têm consequências imediatas e duradouras tanto para o feto quanto para a mãe (Garovic et al.,). Apesar de sua alta incidência e mau prognóstico, atualmente não existem terapias disponíveis para intervenção na PE. O parto oportuno continua sendo a única cura definitiva para a PE, o que por sua vez aumenta o risco de mortalidade e morbidade neonatal (Gestational Hypertension & Preeclampsia: ACOG Practice Bulletin, Number 222,; Steegers et al.,). Portanto, terapias emergentes que visam os mecanismos subjacentes da doença são urgentemente necessárias para o manejo da PE.
A microbiota intestinal (MI), uma população microbiana complexa, é considerada moduladora da saúde materna e fetal durante a gestação (Koren et al.,; Siena et al.,; Viennois & Chassaing,). Os insights sobre os papéis funcionais da MI no desenvolvimento e nas doenças tornaram a MI tanto uma ferramenta atraente quanto um alvo para novas abordagens terapêuticas. Os resultados de vários estudos sugeriram que a desregulação da MI é um fator causal para muitas doenças; além disso, a modulação microbiana intestinal mostrou-se promissora em ensaios pré‑clínicos (Drago et al.,; Paramsothy et al.,; Sung et al.,; Van Nood et al.,). Recentemente, a disbiose intestinal foi identificada em pacientes com PE (Chen et al.,; Lv et al.,). Anteriormente, caracterizamos a MI em pacientes com PE e descobrimos uma abundância aumentada de Fusobacterium e Veillonella, e diminuição da abundância de Akkermansia e Faecalibacterium; a colonização com tais amostras de MI disbiótica induziu características pré‑eclâmpticas típicas em camundongos (Chen et al.,). Jin et al. relataram que a inoculação oral com Akkermansia muciniphila (Am) melhorou os sintomas de PE por meio de seus metabólitos (ácidos graxos de cadeia curta) em um modelo murino de PE. No entanto, os mecanismos subjacentes às importantes interações hospedeiro‑microbiota na patogênese da PE permanecem pouco compreendidos. Além disso, permanece incerto se a modulação microbiana direcionada pode servir como uma abordagem potencial para o desenvolvimento de medicamentos para a PE.
As vesículas extracelulares bacterianas (EVs) são vesículas membranares esféricas de bicamada geradas por bactérias parentais de maneira programada (Engevik et al.,; Kaparakis‑Liaskos & Ferrero,; Kulp & Kuehn,; Turner et al.,; Vanaja et al.,). Dados anteriores mostraram que essas vesículas nanométricas encapsulavam muitos componentes biológicos das bactérias parentais e evitavam efetivamente a degradação e desnaturação extracelular (Kulp & Kuehn,). As EVs bacterianas podem se translocar para órgãos distais, onde desempenham papéis cruciais na transferência horizontal de genes, exportação de metabólitos celulares e comunicações hospedeiro‑micróbio (Elmi et al.,; Engevik et al.,; Stentz et al.,; Yang et al.,). Por exemplo, EVs produzidas por Bacteroides thetaiotaomicron podem entrar na corrente sanguínea e educar células dendríticas, levando a respostas imunes locais e sistêmicas equilibradas (Durant et al.,; Jones et al.,). Recentemente, Lactobacillus animalis e suas EVs foram relatados como atenuantes dos sintomas em um modelo murino de osteonecrose induzida por glicocorticoides (Chen et al.,). No entanto, permanece incerto se as EVs bacterianas medeiam os efeitos das interações MI‑hospedeiro na PE.
Aqui, encontramos uma redução significativa de Am em modelos murinos de PE. O potencial terapêutico de Am foi demonstrado em camundongos com PE induzida por cloridrato de NG-nitroarginina metil éster (L-NAME, um inibidor da atividade da óxido nítrico sintase). Em seguida, demonstramos que os EVs produzidos por Am alcançaram a placenta e promoveram a placentação por meio da via de sinalização do receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR)–fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K)–proteína quinase B (AKT). No geral, nossos achados revelam novas interações hospedeiro–microbioma associadas à PE e sugerem probióticos que podem ser potencialmente usados para intervenção na PE.
MATERIAIS E MÉTODOS
Cultura bacteriana
A cepa Am ATCC BAA‐835 foi cultivada em meio modificado à base de mucina e cultivada a 37°C em condições estritamente anaeróbicas com 80% N2, 10% H2 e 10% CO2 por 3–5 dias até a densidade óptica = 1 a 600 nm, conforme descrito anteriormente (Ou et al.,). Em seguida, o meio de cultura foi centrifugado a 2000 × g por 10 min, e os pellets resultantes foram ressuspensos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril e armazenados a −80°C até estudo posterior. Unidades formadoras de colônia (UFC) foram medidas por diluição seriada das amostras e plaqueamento em placas à base de mucina.
Isolamento e caracterização de EVs
Para isolar vesículas extracelulares derivadas de Am (AmEVs), amostras de caldo de cultura foram coletadas e centrifugadas sequencialmente a 3000 × g e 10.000 × g (10 min para cada etapa de centrifugação). Os sobrenadantes bacterianos foram filtrados através de filtros estéreis de 0,22 μm (Millipore, MA, EUA). Os EVs foram subsequentemente peletizados por duas ultracentrifugações em um rotor SW 32 Ti (Optima XPN-100; Beckman Coulter, EUA) a 135.000 × g e 4°C por 70 min. Os pellets finais foram ressuspensos em PBS, e a proteína total foi quantificada usando o Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA), após o que os EVs foram armazenados a −80°C para uso subsequente. Os conteúdos totais de proteína em amostras de Am e AmEVs foram avaliados via eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio seguida de coloração com Azul Brilhante de Coomassie, com uma quantidade de carga de 30 μg de proteína. A expressão da proteína de membrana externa A (OmpA) e LPS de Am e seus EVs foi avaliada via western blotting usando um anticorpo anti-OmpA (diluição 1:1000, Q52657, Cusabio https://www.cusabio.com/, Wuhan, China) e anticorpo anti-LPS (diluição 1:1000, MA1-83152, Invitrogen, EUA). A quantidade de proteína em cada poço foi de 30 μg.
Microscópio eletrônico de transmissão (MET)
A morfologia dos EVs foi observada utilizando um microscópio eletrônico de transmissão (Hitachi H‐7650, Japão) conforme descrito anteriormente (Bachurski et al.,). Resumidamente, AmEVs isolados foram misturados com paraformaldeído a 4% e então adsorvidos em grades de cobre revestidas com formvar‐carbono para Microscopia Eletrônica (EM) (Agar Scientific) por 20 min. As amostras foram lavadas com PBS e fixadas novamente com glutaraldeído a 1% por 2 min, que foram ainda lavadas com água deionizada e contrastadas por 4 min com acetato de uranila a 1,5%. As grades foram secas ao ar e mantidas em ambiente escuro e livre de poeira até a observação. Imagens foram adquiridas com magnificação de 20.000× para as imagens com barra de escala de 200 nm.
Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
Para analisar a distribuição de tamanho dos EVs, a NTA foi realizada utilizando um instrumento NanoSight NS300 (Malvern, Reino Unido). Os EVs precipitados foram dissolvidos uniformemente em PBS e então diluídos para uma concentração entre 10⁸/mL a 10⁹/mL, que foram carregados em uma seringa de 1 mL. O nível da câmera foi ajustado para 13, equipado com laser embutido de 405 nm e câmera sCMOS. As amostras foram injetadas na célula de amostra na velocidade da seringa de 40 μL/s, após testar a calibração da máquina com nanoesferas de poliestireno. As configurações de análise de tamanho de desfoque e distância máxima de salto estavam no modo automático. O NanoSight NS300 capturou três vídeos de amostra de 30 s, que foram analisados utilizando o software NanoSight NTA3.2 Dev Build 3.2.16. O limiar de detecção foi ajustado para 4, para incluir o maior número possível de partículas com as restrições de que 10−100 cruzes vermelhas foram contadas enquanto apenas <10% não estavam associadas a partículas distintas. A contagem de cruzes azuis foi limitada a 5 (Bachurski et al.,).
Experimentos com animais
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Guia do Instituto Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, e os protocolos foram aprovados pelo Comitê Local de Cuidado e Uso de Animais da Southern Medical University (número de aprovação L2020098).
Camundongos C57BL/6J (6‐8 semanas de idade), adquiridos do Centro de Animais Experimentais da Southern Medical University, tiveram acesso ad libitum a comida e água e foram alojados em uma instalação livre de patógenos específicos com um ciclo claro‐escuro de 12 h. Camundongos fêmeas receberam 200 μL de Am (1 × 10⁸ UFC/mL) ou o mesmo volume de veículo (PBS) em dias alternados por 2 semanas. Em seguida, foram alojadas durante a noite com camundongos machos na proporção de 2:1. O dia em que a gravidez foi confirmada, pela observação do tampão copulatório, foi designado como E0.5. Após o acasalamento noturno, atribuímos aleatoriamente seis camundongos prenhes de cada grupo ao estudo; os camundongos restantes foram excluídos do estudo.
Para modelar a PE, camundongos prenhes receberam L‐NAME (125 mg/kg/dia, cloridrato de NG‐nitroarginina metil éster, MedChemExpress, EUA) por injeção subcutânea, começando em E10,5, por 8 dias (Bakrania et al.,). Camundongos que receberam PBS por gavagem foram subdivididos em dois grupos tratados com L‐NAME (grupo PLN) ou o controle veicular (PBS; grupo CTRL). Outros camundongos, que receberam Am, foram injetados com L‐NAME (grupo AmLN). Outro lote de camundongos recebeu administração exógena de AmEVs (20 μg por camundongo) ou o mesmo volume de veículo (PBS) em dias alternados até E17,5. Após um regime de tratamento de 2 semanas, as fêmeas foram alojadas com machos, conforme descrito acima. Camundongos prenhes que receberam PBS por via oral foram randomizados em dois grupos e inoculados por via subcutânea com L‐NAME (grupo PLN, n = 6) ou o mesmo volume de PBS (grupo CTRL, n = 6). Camundongos tratados com AmEVs foram expostos ao L‐NAME (grupo AmEVLN, n = 6) de E10,5 a E17,5.
A pressão arterial sistólica (PAS) foi medida usando um instrumento de pressão arterial não invasivo por manguito de cauda (Softron Biotechnology, Pequim, China) no dia do início e em E0,5, E4,5, E8,5, E12,5 e E16,5, em cada caso entre 9 e 11 h da manhã. Amostras de urina foram coletadas no dia anterior ao acasalamento e em E17,5 para analisar as concentrações de albumina. Em E17,5, as camundongos prenhes foram anestesiadas com pentobarbital (1,5% [p/v]); 60 mg/kg de peso corporal). O sangue materno foi coletado e centrifugado a 3000 × g e 4°C por 15 min para separar o soro. Os rins e úteros foram então removidos. Os fetos e placentas foram dissecados e pesados separadamente. O conteúdo cecal de cada grupo foi coletado para analisar os perfis microbianos usando sequenciamento de 16S rDNA e análises de PCR quantitativa com transcriptase reversa (RT‐qPCR). Os órgãos foram congelados rapidamente e posteriormente preservados a −80°C ou imediatamente fixados em paraformaldeído a 4% (v/v) e embebidos em parafina seguindo procedimentos padrão.
Para investigar o efeito de Am e AmEVs na fertilidade dos camundongos, realizamos ainda ensaios de fertilidade natural. Os animais foram divididos aleatoriamente em três grupos com 12 camundongos em cada grupo, e receberam o mesmo volume de PBS, Am e AmEVs, respectivamente, em dias alternados até o final do estudo. Uma semana depois, as fêmeas foram alojadas com machos na proporção de 2:1 por 7 dias consecutivos. As fêmeas prenhes foram alojadas separadamente após a observação de um tampão vaginal. A fertilidade foi avaliada em todos os camundongos pelas taxas de prenhez após o acasalamento. Os resultados da gestação foram avaliados pelo tamanho da ninhada e pelo número de descendentes vivos.
Ensaio imunoenzimático (ELISA)
Amostras de soro de camundongos foram analisadas quantitativamente usando kits comerciais de ELISA (Bioswamp, Wuhan, China) para citocinas pró‐inflamatórias, incluindo interleucina (IL)‐6, IL‐1β e fator de necrose tumoral (TNF)‐α, e citocinas anti‐inflamatórias (IL‐10), de acordo com as instruções do fabricante.
As amostras de urina foram obtidas por centrifugação a 800 × g por 5 minutos para remover os detritos das amostras. As concentrações de albumina foram detectadas usando um kit de ELISA para albumina de camundongo (Bioswamp, Wuhan, China) de acordo com o protocolo do fabricante. As densidades ópticas foram medidas a 450 nm usando um leitor de microplacas (Bio‐Rad, Hercules, CA, EUA). As concentrações de citocinas séricas e albumina urinária foram calculadas de acordo com as instruções do fabricante.
Experimentos de captação de trofoblastos
A membrana celular dos AmEVs foi corada com cellmask (C10046, Invitrogen, EUA) e, subsequentemente, sedimentada por ultracentrifugação em um rotor SW 60 Ti (Optima XPN‐100, Beckman Coulter, EUA) a 135.000 × g e 4°C por 43 minutos. O veículo (PBS) sem AmEVs foi incubado com cellmask e submetido aos mesmos procedimentos para evitar interferência do corante residual. Os AmEVs marcados com cellmask e o veículo controle foram incubados com a linhagem celular de trofoblasto HTR‐8/SVneo por 4 horas em uma incubadora umidificada a 37°C com 5% de CO2. Após isso, as células foram lavadas com PBS e coradas com Hoechst. As imagens foram coletadas usando um microscópio Confocal Olympus FV3000 com uma lente de imersão em óleo de 100×.
Biodistribuição dos AmEVs
Para determinar a biodistribuição dos AmEVs, os EVs foram incubados com PKH26 (Sigma‐Aldrich, EUA) ou PBS por 3 minutos. Após a incubação, a reação foi interrompida com um volume igual de soro fetal bovino depletado de exossomos por 1 minuto. O excesso de PKH26 foi removido por ultracentrifugação em um rotor SW 60 Ti a 135.000 × g e 4°C por 43 minutos, e os sedimentos foram ressuspensos em PBS. Camundongos receberam por via oral EVs marcados (20 μg/200 μL) e EVs tratados com PBS (200 μL). Após 5 horas, a fluorescência foi monitorada usando um sistema de rotação animal multimodal (Bruker FX Pro, EUA), após o qual os camundongos foram imediatamente sacrificados e os órgãos foram coletados para analisar a distribuição da fluorescência.
Coloração por hematoxilina e eosina (H&E), ácido periódico‐Schiff (PAS) e imuno-histoquímica
As placentas e rins de camundongos foram lavados com PBS estéril e fixados em paraformaldeído a 4% (v/v) por 48 horas. Os tecidos foram então desidratados, embebidos em parafina e seccionados em cortes seriados de 4 μm de espessura. As secções de tecido placentário foram coradas com H&E, e as secções renais foram coradas com PAS para análise posterior (Chen et al.,).
Para a coloração imuno-histoquímica, as secções foram desparafinizadas, reidratadas e aquecidas em tampão citrato de sódio (10 mM, pH 6,0) para recuperação dos antígenos. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada utilizando H2O2 a 3%. Os antígenos inespecíficos foram bloqueados com soro de cabra a 10% (v/v). Em seguida, as secções de tecido foram incubadas com anticorpos monoclonais primários de coelho contra CK7 (1:100, ab181598, Abcam, Reino Unido) e αSMA (1:2000, ab124964, Abcam) a 4°C durante a noite. Subsequentemente, as secções foram incubadas com um anticorpo secundário anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (1:2000, Abcam) por 45 min a 37°C. A atividade da peroxidase de rábano foi visualizada utilizando uma solução de diaminobenzidina, seguida de contra-coloração com hematoxilina. Finalmente, as secções foram desidratadas e montadas com uma lamínula utilizando um meio de montagem. As imagens foram adquiridas utilizando o sistema de imagem EVOS FL Auto (Thermo Fisher Scientific, EUA). O mesmo sistema foi utilizado para medir a distância máxima de invasão de células positivas para CK7 na zona decidual (Vogtmann et al.,) e a espessura de células positivas para αSMA ao redor das artérias espiraladas (Menkhorst et al.,).
Cultura de células
Uma linhagem celular de trofoblasto humano (célula HTR‐8/SVneo) foi adquirida da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e mantida em meio RPMI 1640 (Biological Industries, Israel) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (Data Inventory Biotechnology, Hong Kong, China). As células foram cultivadas em uma incubadora umidificada a 37°C com 5% de CO2. Para estabelecer um modelo celular de trofoblasto de PE, as células HTR‐8/SVneo foram cultivadas a 37°C por 8 h sob condições de hipóxia (2% O2), seguidas por 16 h de reoxigenação (H/R) sob 5% CO2/ar; as células foram cultivadas sob 5% CO2/ar a 37°C e serviram como controles (Zhang & Zhang,). Para testar o impacto dos AmEVs, as células foram pré-tratadas com diferentes concentrações (1, 10, 20 ou 50 μg/mL) de AmEVs em meio de cultura fresco por 24 h, e então submetidas a 8 h de hipóxia e 16 h de reoxigenação.
Ensaio de contagem celular kit‐8 (CCK‐8)
As células foram semeadas durante a noite em placas de 96 poços a uma densidade de 1 × 10³/poço. As células foram então pré-tratadas com AmEVs em meio de cultura fresco por 24 h, e depois submetidas a 8 h de hipóxia e 16 h de reoxigenação. Em seguida, as células foram incubadas com uma solução de CCK-8 (Data Inventory Biotechnology, Hong Kong, China) em meio fresco por 90 min a 37°C, e a absorbância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas (Bio‐Rad, Hercules, CA, EUA).
Ensaio de migração
Para o ensaio de migração, as células foram plaqueadas a uma densidade de 1 × 10⁶/poço em placas de 6 poços. AmEVs foram adicionados a cada poço em meio de cultura fresco e pré-tratados por 24 h até formarem uma monocamada. Em seguida, pontas de pipeta de 200 μL foram utilizadas para introduzir um risco linear em cada poço. Os detritos e as células destacadas foram lavados com PBS. Imagens foram adquiridas imediatamente utilizando o sistema de imagem EVOS FL Auto (Thermo Fisher Scientific, EUA) e consideradas como o tempo 0 h.
As placas foram cultivadas por 24 h sob condições normais ou de H/R, após as quais imagens das feridas foram obtidas usando o sistema de imageamento EVOS FL Auto e consideradas como o ponto de tempo de 24 h. As áreas das feridas foram medidas usando o software ImageJ, e os dados foram analisados conforme descrito anteriormente (Feng et al.). Esses experimentos foram realizados em triplicata.
Análise de Western blot
As proteínas foram liberadas de células HTR‐8/SVneo e de tecidos placentários de camundongos usando o tampão de lise RIPA com um coquetel de inibidores de protease e fosfatase (APExBIO, EUA). Os níveis de expressão proteica foram determinados usando Western blot conforme descrito anteriormente (Feng et al.). Os anticorpos primários contra E‐caderina (1:5000, 20874‐1‐AP, Proteintech, Wuhan, China), N‐caderina (1:5000, 66219‐1‐lg, Proteintech), Vimentina (1:1000, Beyotime, Xangai, China), MMP‐9 (1:1500, 10375‐2‐AP, Proteintech), p‐PI3K (Ser1070; 1:1000, bs‐6417R, Bioss, Pequim, China), PI3K (1:1000, #T40064, Abmart, Xangai, China), p‐AKT (Ser473; 1:1000, #T40067, Abmart), AKT (1:3000, 10176‐2‐AP, Proteintech), EGFR (1:8000, T55112, Abmart) e β‐actina (1:5000, 66009‐1‐lg, Proteintech) foram utilizados para a análise de Western blot. As bandas foram embebidas em solução de trabalho do substrato ECL (Fude Bio, China) por 1 min e, em seguida, expostas em um equipamento de imageamento por quimioluminescência GeneGeome com seu sistema GeneTools integrado (Syngene, Reino Unido). A expressão proteica foi analisada quantitativamente com ImageJ em relação à expressão de β‐actina.
Extração de DNA e RNA e análise de RT‐qPCR
O DNA foi extraído dos conteúdos cecais usando o kit QIAamp PowerFecal Pro DNA (Qiagen, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante. As concentrações e purezas do DNA foram medidas usando um espectrofotômetro NanoDrop One. O RNA total da placenta foi isolado usando o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA) e transcrito reversamente em cDNA usando um kit comercial (Vazyme, Nanquim, China). Para a análise da expressão gênica, a RT‐qPCR foi realizada em um instrumento LightCycler® 96 (Roche) usando o ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Nanquim, China) seguindo as instruções do fabricante. As sequências dos iniciadores para os genes alvo foram as seguintes: 16s RNA: forward: 5′‐GTGSTGCAYGGYTGTCGTCA‐3′, reverse: 5′‐ACGTCRTCCMCACCTTCCTC‐3′; Am forward: 5′‐AGCCTGAACGCATTATCCGC‐3′, reverse: 5′‐AGGGCAGTTCTTCCAGCGTA‐3′; 18s RNA: forward: 5′‐AGTCCCTGCCCTTTGTACACA‐3′, reverse: 5′‐CGATCCGAGGGCCTCACTA‐3′; egfr forward: 5′‐GCCATCTGGGCCAAAGATACC‐3′, reverse: 5′‐GTCTTCGCATGAATAGGCCAAT‐3′. O rRNA 18s e o rRNA bacteriano 16s foram usados como referências internas e as alterações na expressão gênica (fold‐change) foram quantificadas usando o método 2−(ΔΔCt) com normalização para o gene de referência correspondente.
Sequenciamento do gene 16S rDNA e análise bioinformática
Após a extração de DNA, a região V4 do 16S rDNA foi amplificada via PCR sob as seguintes condições de termociclagem: 94°C por 5 min; 30 ciclos a 94°C por 30 s, 52°C por 30 s e 72°C por 30 s; uma etapa de alongamento final a 72°C por 10 min. Os amplicons foram sequenciados utilizando a plataforma Illumina Hiseq2500 (leituras pareadas de 2 × 250 pares de bases [pb]).
As sequências de adaptadores foram removidas utilizando o software Trimmomatic (Liu et al.,). As leituras brutas pareadas foram posteriormente desruídas usando a plataforma QIIME 2, e variantes de sequência de amplicons de alta qualidade foram geradas usando o algoritmo DADA2 (Bolyen et al.,; Callahan et al.,). A anotação de espécies foi realizada contra o banco de dados GreenGenes (Desantis et al.,) e transformada em abundância relativa nos níveis de filo, classe, ordem, família, gênero e espécie. Dados indicando abundância relativa <0,001 ou taxa de presença <70% em todos os grupos foram removidos para obter os táxons bacterianos centrais para análises posteriores. As análises de diversidade alfa e beta, plotagem de estrutura e análise de correlação foram realizadas usando o pacote EasyMicroPlot do software R (Liu et al.,).
Sequenciamento de RNA e análise bioinformática
A PCR foi realizada usando a DNA polimerase Phusion High-Fidelity, primers universais de PCR e o Primer Index (X). As amostras agrupadas foram sequenciadas usando a plataforma Novaseq (Illumina) para obter leituras pareadas de 150 pb. As amostras FASTQ foram aparadas para obter leituras limpas de alta qualidade. As leituras pareadas limpas foram alinhadas ao genoma de referência usando Hisat2 v2.0.5. Os números de leituras mapeadas para cada gene foram contados usando o software featureCounts (v1.5.0-p3). O número esperado de fragmentos por kilobase de sequência de transcrito por milhão de pares de bases sequenciados (FPKM) de cada gene foi calculado com base no comprimento do gene e no número de leituras para o gene correspondente.
Genes com contagens ≥3 em pelo menos duas amostras em qualquer grupo foram definidos como genes expressos durante a análise DESeq2. O DESeq2 foi usado para detectar genes diferencialmente expressos (DEGs), que foram determinados usando p ajustado < 0,05. Genes relacionados à PE foram identificados a partir da literatura, e genes humanos foram convertidos em homólogos de camundongos usando o banco de dados Biomart. A significância foi avaliada por meio de bootstrap com reposição (1000 bootstraps) de todos os ensaios tanto no conjunto de genes expressos quanto no conjunto de genes diferencialmente expressos, e calculando a proporção de ensaios com atividade positiva, indicando genes relacionados à PE, após cada bootstrap (testes exatos de Fisher bilaterais foram realizados para calcular os valores de p). Análises da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) e Ontologia Genética (GO) foram realizadas usando clusterProfiler, e as vias KEGG enriquecidas foram determinadas com base em um valor de p < 0,05 e um valor de q < 0,2. Os processos biológicos, componentes celulares e funções moleculares enriquecidos foram determinados com base em um p ajustado (padj) < 0,05. Os níveis de expressão relativa dos DEGs nas amostras foram baseados nos valores de FPKM.
Análise estatística
O software GraphPad Prism (v. 8.0.2) foi utilizado para a análise estatística. A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de Shapiro–Wilk. Para dados com distribuição normal, o teste t foi realizado para comparar as diferenças entre dois grupos. Análise de variância de uma via (ANOVA) e ANOVA de duas vias, seguidas pelo teste post-hoc de Bonferroni, foram conduzidas para comparar os grupos. Para variáveis não normais, o teste de Mann–Whitney U foi realizado para comparar dois grupos, e o teste de Kruskal–Wallis foi realizado para comparar medianas entre grupos, seguido pelo teste de Dunn. Um valor de p <0,05 foi considerado para refletir uma diferença estatisticamente significativa.
RESULTADOS
A abundância de Am diminuiu em camundongos com PE.
Anteriormente (Chen et al.,), descobrimos que a abundância de Akkermansia (especialmente Am [Lv et al., ]) era marcadamente menor na GM de pacientes com PE do que na dos controles saudáveis. Aqui, estabelecemos um modelo de camundongo com PE induzida por L‐NAME e exploramos se ele compartilhava características semelhantes de GM com pacientes com PE (Figura 1a). A PAS e os níveis de proteína na urina de um grupo de camundongos gavados com PBS e depois tratados com L‐NAME (grupo PLN) aumentaram notavelmente após a exposição ao L‐NAME (Figura S1a,b), enquanto o peso fetal diminuiu (Figura S1c), sugerindo que o modelo de PE foi estabelecido com sucesso. Curiosamente, os constituintes da GM em ambos os grupos mostraram diferenças substanciais nos níveis de espécies (Figura 1b). Embora os valores de α‐diversidade (índices de Pielou e Simpson) não tenham mostrado diferenças estatísticas entre os dois grupos no nível de espécies (Figura 1c), a análise de coordenadas principais com a métrica de distância de Bray–Curtis mostrou separação da GM de ambos os grupos em dois clusters distintos, implicando que a estrutura da GM se desviou notavelmente em camundongos com PE (Figura 1d). Correlações entre a microbiota central e parâmetros clínicos associados à PE foram observadas com base na correlação de Spearman calculada para todas as mães (Figura 1e). Am (V1), Paraprevotella (V28), Rikenellaceae (V31), R. gnavus (V35) e Coriobacteriaceae (V49) mostraram correlação inversa com a PAS e proteinúria, e correlação positiva com o peso fetal; enquanto os coeficientes de correlação para B. S24.7 (V2), Prevotella (V14), Sutterella (V16), Lactobacillus (V18), C. methylpentosum (V46) e Coriobacteriaceae (V60) apresentaram o oposto. Notavelmente, comparações de abundância de espécies microbianas centrais entre os dois grupos mostraram enriquecimento para Lactobacillus (V18) e Coriobacteriaceae (V60) em camundongos PLN, enquanto depleção significativa de Am (V1), Coriobacteriaceae (V49), Rikenellaceae (V31) e Corprococcus (V9) foi observada (Figura 1f). Dentre eles, Am apresentou a maior abundância e exibiu fortes correlações com índices clínicos, que mostraram diferença significativa entre os dois grupos, conforme verificado por análise de RT‐qPCR (Figura 1g). Consistente com resultados anteriores de indivíduos com PE (Chen et al.,), nossos achados sugeriram que mudanças profundas na GM também existiam no modelo de camundongo com PE, com uma associação implícita entre Am e PE. Portanto, hipotetizamos que Am desempenha um papel essencial no desenvolvimento da PE.
Disbiose da GM em camundongos com PE induzida por L‐NAME. (a) Representação esquemática da estratégia de modelagem utilizada neste estudo. (b) Composição microbiana geral no nível de espécie, com a abundância relativa das espécies microbianas centrais exibidas de alta a baixa, independentemente da significância. (c) Comparação dos índices de diversidade alfa da GM (índice de Pielou e Simpson) de camundongos dos grupos CTRL e PLN. Os dados foram analisados usando testes t. (d) Gráfico de análise de coordenadas principais da diversidade beta (com base na matriz de Bray–Curtis) mostrou que a composição microbiana do grupo PLN era notavelmente distinta da do grupo CTRL no nível de espécie. Os dados foram analisados usando testes t. (e) Correlações entre a abundância relativa das espécies microbianas centrais e os fenótipos observados das mães. O teste de correlação de Spearman foi utilizado para análise estatística. (f) Comparação da abundância relativa das espécies microbianas centrais, que são estatisticamente significativas entre os grupos CTRL e PLN. (g) RT‐qPCR foi realizada para confirmar a abundância relativa de Am. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Os dados no Painel f foram apresentados como média ± DP e analisados usando testes t. Os dados no Painel g foram apresentados como mediana e intervalo interquartil (IIQ) e analisados usando o teste U de Mann–Whitney. PAS, pressão arterial sistólica; AsEs, artérias espirais; E12,5, dia embrionário 12,5; E16,5, dia embrionário 16,5; AU, albumina urinária; A. muciniphila, Akkermansia muciniphila; B. S24.7, Bacteroidales S24.7; C. methylpentosum, Clostridium methylpentosum; R. gnavus, Ruminococcus gnavus.
A suplementação com Am atenuou os fenótipos de PE em camundongos prenhes
Para explorar se a suplementação com Am atenua o desenvolvimento de PE, camundongos foram inoculados oralmente com Am e depois tratados com L‐NAME (grupo AmLN) (Figura 2a). A PAS elevada e o extravasamento de proteínas urinárias, causados pelo L‐NAME, foram notavelmente prevenidos pelo pré‐tratamento com Am (Figura 2b,c), sem alterações estruturais nos rins (Figura S2a). As massas e pesos fetais foram marcadamente maiores no grupo AmLN do que no grupo PLN (Figura 2d,e), indicando uma melhora notável no crescimento fetal sob a exposição ao Am. Correspondentemente, a razão peso embrião:placenta foi significativamente aumentada em camundongos pré‐tratados com Am em comparação com o grupo PLN (Figura 2f). Nenhuma diferença foi observada no peso placentário ou na taxa de reabsorção entre os grupos PLN e AmLN (Figura S2b,c). Os níveis séricos de IL‐6, TNF‐α, IL‐1β e IL‐10 não foram estatisticamente diferentes entre os três grupos (Figura S2d–g), o que sugeriu que o impacto benéfico do Am no tratamento da PE foi independente da imunomodulação neste estudo.
A suplementação com Am atenuou os sintomas de PE induzidos por L-NAME. (a) Estratégia experimental utilizada para os experimentos com animais. Para explorar os efeitos da Am no desenvolvimento de PE, camundongos foram pré-tratados com PBS ou Am. No E10.5, os camundongos foram divididos nos grupos CTRL, PLN e AmLN (n = 6/grupo) com base na injeção subcutânea ou não de L-NAME. (b) As PAS de todos os três grupos (n = 6/grupo) foram medidas no dia −17 (basal) e E0.5, E4.5, E8.5, E12.5 e E16.5 (Os dados foram apresentados como média ± DP; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, CTRL versus PLN; + p < 0,05, ++ p < 0,01, +++ p < 0,001, PLN versus AmLN, conforme determinado por ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni). (c) Os níveis de proteína urinária em cada grupo (n = 6/grupo) foram medidos no dia −3 (antes do acasalamento) e E17.5 (A comparação entre grupos em diferentes momentos foi analisada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). (d) Fotografia representativa de fetos e placentas de todos os três grupos (barra de escala = 1 cm). (e) Os pesos dos embriões no grupo PLN foram acentuadamente menores do que os do grupo CTRL, enquanto a Am protegeu contra a restrição do crescimento fetal. A linha pontilhada indica o 10º percentil dos fetos do grupo controle. (f) A eficiência placentária dos três grupos foi avaliada pela razão entre o peso do embrião e o peso da placenta. (g) Imagens representativas de coloração H&E das placentas de camundongos de cada grupo; as setas indicam lesões de infarto na zona labiríntica. As áreas demarcadas nas imagens de baixa ampliação (100×, barra de escala = 400 μm) são mostradas em maior ampliação (400×, barra de escala = 100 μm). Artérias espiraladas (SpAs) coradas com anti-αSMA na decídua no E17.5 (barra de escala = 100 μm); as pontas de seta denotam células positivas para αSMA. SpAs positivas para anti-CK7 na decídua no E17.5 (barra de escala = 200 μm); as linhas pontilhadas com pontas de seta mostram a profundidade de invasão das células positivas para CK7 na zona decidual. (h) Quantificação de células positivas para αSMA ao redor das SpAs deciduais; n = 6/grupo. (i) Distância máxima de invasão das células positivas para CK7 na decídua materna (n = 6/grupo). (j, k) Imagens representativas de western blot e quantificação da expressão placentária de E-caderina, N-caderina, MMP-9 e vimentina (normalizada para a expressão de β-actina; n = 6/grupo). Os dados nos Painéis c, e, f, h, i e k foram apresentados como mediana e IQR. Nos Painéis e e f, os dados foram analisados usando o teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste de Dunn. Nos Painéis h, i e k, uma ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni foi usada para análise estatística. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. αSMA, actina do músculo liso alfa; Am, Akkermansia muciniphila; CK7, citoqueratina 7; E10.5, dia embrionário 10.5; ns, não significativo; PAS, pressão arterial sistólica; SpAs, artérias espiraladas.
Como a PE é comumente aceita como um distúrbio placentário primário (Melchiorre et al.,), determinamos se o pré-tratamento com Am afeta a placenta. A histologia placentária mostrou que as alterações patológicas na placenta induzidas por L-NAME não eram aparentes no grupo AmLN (Figura 2g). A proporção das áreas da zona labiríntica para a zona de junção foi marcadamente maior nas placentas das mães com PE, enquanto nenhuma diferença significativa foi encontrada entre camundongos pré-tratados com Am ou o controle (CTRL) pré-tratados apenas com PBS (Figura S2h,i). A remodelação deficiente da artéria espiralada (SpA) está intimamente associada a lesões placentárias na PE e resulta da invasão anormal de citotrofoblastos (Falco et al.,; Granger et al.,). Portanto, as SpAs foram submetidas à imuno-histoquímica com anticorpos contra alfa actina de músculo liso (αSMA, um marcador de células musculares lisas vasculares) e citoqueratina 7 (CK7, um marcador de trofoblastos) para avaliar o efeito do Am na invasão trofoblástica. Notavelmente, a expressão de αSMA diminuiu ao redor das artérias deciduais no grupo AmLN (Figura 2h, Figura S2h). Além disso, foi observada uma distância invasiva maior de trofoblastos positivos para CK7 na camada decidual em resposta à suplementação com Am em comparação com o grupo PLN (Figura 2i, Figura S2h). Marcadores de transição epitélio-mesenquimal (EMT) e metaloproteinases da matriz (MMPs) na placenta foram detectados por análise de western blot. A expressão de N-caderina, vimentina e MMP9 aumentou após o tratamento com Am, enquanto a expressão de E-caderina diminuiu (Figura 2j,k). No geral, esses resultados indicaram que o Am pode modificar os sintomas da PE ao promover a invasão trofoblástica durante a remodelação da SpA. Os AmEVs foram transferidos para a placenta e melhoraram os sintomas da PE.
Como as AmEVs são consideradas veículos funcionais para as bactérias parentais (Elmi et al.,; Engevik et al.,; Stentz et al.,; Yang et al.,), determinamos se as EVs podem mediar a resposta positiva de Am contra a progressão da PE. As AmEVs foram isoladas por ultracentrifugação. O diâmetro médio das AmEVs foi de 119,2 ± 3,4 nm, conforme medido por NTA (Figura 3a). A microscopia eletrônica de transmissão revelou que as AmEVs apresentavam uma estrutura bicamada esférica (Figura 3b). Evidências mostraram que LPS e OmpA são os marcadores específicos para EVs bacterianas (Tulkens et al.,). Como esperado, a expressão de OmpA e LPS foi observada tanto em Am quanto em suas EVs. Perfis de proteínas totais de Am e AmEVs foram usados como controles de carregamento por coloração com Azul de Coomassie Brilhante (Villoria et al.,), com quantidades iguais de proteína carregada (Figura 3c). Para explorar se as EVs podem entrar na placenta, as AmEVs foram marcadas com PKH26 e inoculadas por via oral em camundongos com PE no E17.5. Curiosamente, a fluorescência do PKH26 foi detectada na placenta e nos fetos após 5 h de gavagem (Figura 3e). Para investigar melhor a função das AmEVs na placenta, a membrana celular das AmEVs foi corada com cellmask e incubada com a linhagem de trofoblastos HTR-8/SVneo por 4 h. Após a incubação, os sinais fluorescentes do cellmask (vermelho) foram detectados ao redor do DNA corado em azul, sugerindo que as AmEVs foram internalizadas pelas células HTR-8/SVneo (Figura 3d). Esses resultados indicaram que as AmEVs podem desempenhar um papel comunicativo entre Am e a placenta, interagindo com os trofoblastos.
EVs derivadas de Am entraram na placenta e foram internalizadas pelas células HTR-8/SVneo. (a) O diâmetro médio das AmEVs, conforme medido por NTA (Os dados foram apresentados como média ± erro padrão). (b) Morfologia das AmEVs ao microscópio eletrônico de transmissão (barra de escala = 200 nm). (c) Am e AmEVs foram examinadas por imunoblot para OmpA e LPS. As proteínas totais foram visualizadas usando coloração com Azul de Coomassie Brilhante como controle de carregamento. Foram carregadas quantidades iguais de proteína de 30 μg. (d) Internalização das AmEVs marcadas com cellmask pelas células HTR-8/SVneo. Hoechst para DNA em azul, AmEVs em vermelho (barra de escala = 20 μm). (e) A distribuição das AmEVs marcadas com PKH26 nos fetos e na placenta de camundongos foi detectada ex vivo por imagem fluorescente após administração oral de PKH26 e AmEV-PKH26 por 5 h (n = 3/grupo).
Para determinar se Am funciona através de AmEVs in vivo, camundongos tratados com L‐NAME receberam AmEVs (grupo AmEVLN) por 2 semanas antes da concepção até a gestação (Figura 4a). Observamos uma diminuição notável nos níveis de PAS em camundongos gavados com AmEVs após o dia embrionário 10,5 (E10,5; Figura 4b). O extravasamento de proteínas para a urina foi significativamente menor no grupo AmEVLN do que no grupo PLN (Figura 4c), enquanto não foram observadas alterações histopatológicas visíveis nos tecidos renais (Figura S3a). A insuficiência placentária foi sugerida pela massa fetal reduzida após a exposição ao L‐NAME, enquanto massas fetais notavelmente maiores foram observadas nas mães que receberam AmEVs (Figura 4d). A razão peso embrião/placenta foi notavelmente aumentada no grupo AmEVLN em comparação ao grupo PLN, devido ao aumento dos pesos fetais no grupo AmEVLN (Figura 4e,f). Não foram observadas diferenças significativas no número de fetos ou na taxa de reabsorção entre os grupos AmEVLN e PLN (Figura S3b,c).
AmEVs atenuaram fenótipos de PE em camundongos com PE induzida por L‐NAME. (a) Ilustração esquemática dos experimentos animais. Camundongos foram gavados oralmente com PBS ou AmEVs em dias alternados durante todo o experimento. No E10,5, os camundongos foram divididos nos grupos CTRL (n = 6), PLN (n = 6) e AmEVLN (n = 6), com base na inoculação subcutânea ou não com L‐NAME. (b) As PAS de cada grupo (n = 6/grupo) foram medidas no início e no E0,5, E4,5, E8,5, E12,5 e E16,5 (Os dados foram apresentados como média ± DP; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 CTRL vs. PLN; +
p < 0,05, ++
p < 0,01, +++
p < 0,001 PLN vs. AmEVLN, conforme determinado usando ANOVA de duas vias seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni). (c) As concentrações de proteína na urina foram medidas nos grupos CTRL, PLN e AmEVLN no dia −3 (antes do acasalamento) e E17.5 (A comparação entre grupos na pré-gestação foi analisada pelo teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste de Dunn. ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni foi usada para comparar diferenças entre grupos no E17.5. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001) (d) Aparências representativas de fetos e placentas de todos os três grupos (barra de escala = 1 cm). (e, f) Os AmEVs aliviaram a restrição de crescimento fetal e melhoraram a eficiência placentária em camundongos com PE. A linha pontilhada indica o 10º percentil de fetos do grupo controle. (g) As placentas de cada grupo foram coletadas no E17.5 e coradas com H&E ou imunocoradas com anticorpo anti-αSMA ou anti-CK7. Lesões de infarto na zona labiríntica estão marcadas com setas (baixa ampliação, 100×, barra de escala = 400 μm; zona labiríntica em maior ampliação, 400×, barra de escala = 100 μm). As cabeças de seta denotam células positivas para αSMA ao redor das SpAs (barra de escala = 100 μm). As linhas pontilhadas com cabeças de seta indicam a invasão máxima de células positivas para CK7 na zona decidual (barra de escala = 200 μm). (h) A razão da área labirinto:zona junctional de cada grupo é mostrada. Os compartimentos labiríntico e junctional são demarcados com linhas pontilhadas. (i) Quantificação de células positivas para αSMA ao redor das SpAs deciduais; n = 6/grupo. (j) Distância máxima de invasão de células positivas para CK7 na decídua materna (n = 6/grupo). (k) Os níveis relativos de expressão de E-caderina, N-caderina, MMP-9 e vimentina nas placentas de todos os três grupos foram analisados por western blotting. Os dados foram apresentados como mediana e IQR; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, conforme determinado usando ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni em (e, f) e (h‑k). αSMA, actina do músculo liso alfa; AmEVs, vesículas extracelulares derivadas de Akkermansia muciniphila; CK7, citoqueratina 7; SBP, pressão arterial sistólica; SpAs, artérias espiraladas.
Avaliamos ainda se a inoculação oral com AmEVs afeta a placenta, comparando os resultados da coloração histológica obtidos com amostras de placenta dos três grupos. Semelhante aos achados observados com suas bactérias parentais, as lesões de infarto na área labiríntica observadas no grupo PLN foram mais evidentes do que aquelas em camundongos pré-tratados com AmEVs (Figura 4g). Além disso, a razão entre a área labiríntica e a zona juncional foi significativamente menor no grupo AmEVLN do que no grupo PLN (Figura 4h). A invasão trofoblástica é a etapa primária na remodelação das SpA, cujo comprometimento pode finalmente causar PE (Pijnenborg,). Algumas células positivas para αSMA permaneceram ao redor das artérias deciduais em camundongos tratados com AmEVs (Figura 4g,i), o que indicou que os AmEVs poderiam restaurar significativamente a remodelação defeituosa das SpA. Além disso, uma profundidade aumentada de células positivas para CK7 foi observada no compartimento decidual do grupo AmEVLN (Figura 4g,h). Os níveis de expressão de marcadores associados à melhora na invasão trofoblástica (N-caderina, vimentina e MMP9) foram aumentados com o tratamento com AmEVs, enquanto a expressão de um marcador inibidor (E-caderina) foi reduzida em comparação com o grupo PLN (Figura 4k). Esses resultados indicaram fortemente que os AmEVs tiveram um efeito benéfico na PE.
Efeitos do pré-tratamento com Am e AmEVs na fertilidade
Para investigar os efeitos de Am e AmEVs na fertilidade de camundongos, realizamos ensaios de fertilidade natural. Todo o procedimento experimental e o tratamento das camundongas grávidas estão ilustrados na Figura S4a. As taxas de fertilidade foram de 66,7% e 75% em fêmeas pré-tratadas com Am e AmEVs, respectivamente, valores superiores aos do grupo controle (50%) (Figura S4b). No entanto, não houve diferença significativa na taxa de fertilidade após uma semana de acasalamento entre os três grupos (CTRL vs. Am, razão de chances (OR) 0,5, IC 0,096−2,602, p = 0,680; CTRL vs. AmEVs, OR 0,333, IC 0,059−1,877, p = 0,400; Am vs. AmEVs, OR 0,667, IC 0,113‐3,93, p = 1,000) (Figura S4b,c). Foi observada uma elevação transitória do peso corporal nas fêmeas do grupo Am no E14.5, que logo retornou ao nível observado nos grupos controle e AmEVs no E18.5 (Figura S4d). Em contraste, os pesos dos filhotes vivos do grupo Am foram menores do que os dos grupos CTRL e AmEVs, enquanto não houve diferença significativa entre esses dois últimos grupos (Figura S4e). Vale a pena notar que os pesos da maioria dos filhotes foram superiores ao décimo percentil, indicando que a maioria dos filhotes vivos apresentou peso dentro da faixa normal. Além disso, as fêmeas expostas a Am ou AmEVs apresentaram número equivalente de filhotes vivos, em comparação com o grupo controle (Figura S4f,g). De acordo com esses resultados, nenhum impacto tóxico na fertilidade ou na prole foi encontrado na gavagem pré-concepcional de Am e AmEVs.
Os AmEVs modularam o transcriptoma placentário em camundongos com PE
Com base nos resultados mencionados acima, a mitigação da PE induzida por Am pode ser alcançada por meio de EVs que aumentam a eficiência placentária. No entanto, o mecanismo potencial subjacente às respostas benéficas aos AmEVs durante a placentação não está claro. Para investigar o papel dos AmEVs na expressão de transcritos na placenta, caracterizamos as assinaturas do transcriptoma placentário dos grupos PLN e AmEVLN. A administração de AmEVs a camundongos com PE modulou a expressão de 424 genes, dos quais 237 foram superexpressos e 187 foram regulados negativamente (Figura 5a). Um total de 16.699 genes foram detectados por sequenciamento do transcriptoma, entre os quais 2.777 genes haviam sido relatados como associados à PE. Além disso, descobrimos que dos 424 genes expressos diferencialmente na placenta AmEVLN, 98 genes estavam relacionados ao desenvolvimento de PE (PE_DEGs), implicando que os DEGs estavam enriquecidos com genes relacionados à PE (Figura 5b, Tabela S1). Os 20 principais DEGs associados à PE foram classificados de acordo com a taxa de falsas descobertas e destacados no heatmap; destes, 13 foram regulados positivamente e sete foram regulados negativamente nas placentas dos camundongos pré-tratados com AmEV (Figura 5c). Análises de enriquecimento de vias KEGG e enriquecimento funcional dos PE_DEGs foram realizadas (Figura 5d,e). Foram identificados enriquecimentos em várias vias, incluindo a via de sinalização PI3K–AKT, interação ECM (matriz extracelular)-receptor, proteoglicanos em câncer e resistência a inibidores de tirosina quinase do EGFR (Figura 5d, Tabela S2). Notavelmente, uma análise do nosso conjunto de dados sugeriu ainda que os PE_DEGs estavam envolvidos na via de sinalização PI3K–AKT em nosso conjunto de dados, pois os seguintes genes apresentaram taxas de falsas descobertas < 0,05: Egfr, Csf1, Lamc2, Pdgfra, Igf1r, Il6ra, Fn1, Pdgfb, Rps6 e Col6a3 (Figura 5f).
O transcriptoma placentário foi alterado em camundongos com PE que receberam Am. (a) Número de DEGs em AmEVLN em comparação com mães PLN no E17.5, com padj < 0,05 (n = 3/grupo). (b) Os DEGs foram enriquecidos para genes relacionados à PE. 'Expected' denota amostragem aleatória de tentativas do conjunto de dados de 16.699 genes expressos, enquanto 'DEGs' indica amostragem aleatória de tentativas do conjunto de dados de 424 genes expressos diferencialmente (teste exato de Fisher bilateral foi usado para calcular o valor p, estimado usando método de bootstrap com 1000 reamostragens. p < 0,05). (c) DEGs entre placentas dos grupos PLN e AmEVLN (padj < 0,05, n = 3). Os 20 principais DEGs relacionados à PE (PE_DEGs) são indicados. (d) Vias previstas para serem afetadas nas placentas de camundongos pré-tratados com AmEVs. Vias gênicas significativamente enriquecidas foram identificadas com base em DEGs e PE_DEGs com p < 0,05 e q < 0,2. (e) Os cinco principais processos biológicos enriquecidos dos PE_DEGs (padj < 0,05). (f) Os níveis de expressão relativa dos genes que contribuem para a via de sinalização PI3K‐AKT com base nos valores de fragmentos por quilobase de modelo de éxon por milhão de fragmentos mapeados (FPKM).
Evidências anteriores revelaram que o EGFR é expresso em baixos níveis no tecido placentário de pacientes com PE (Armant et al.,; Xiao et al.,). Curiosamente, os níveis de expressão do EGFR foram menores nos grupos experimentais do que no grupo CTRL (Figura 6a,b). Os AmEVs elicitaram maior expressão de EGFR (Figura 6a,b), de acordo com a regulação positiva observada da transcrição do EGFR. Dada a expressão diferencial do EGFR e as análises da via KEGG mencionadas acima, postulamos que os AmEVs poderiam regular positivamente a expressão do EGFR e estimular a via de sinalização PI3K–AKT a jusante. No presente estudo, um aumento significativo na ativação de PI3K e AKT foi observado nas placentas do grupo AmEVLN, em apoio à nossa hipótese (Figura 6b). Esses resultados indicaram que os AmEVs foram transferidos para a placenta e captados pelos trofoblastos, o que elevou a expressão do EGFR e ativou ainda mais a via de sinalização PI3K–AKT na placenta.
Os AmEVs ativaram a via de sinalização EGFR‐PI3K‐AKT na placenta. (a) Expressão relativa do EGFR em camundongos entre três grupos (n = 6/grupo; dois poços réplica para cada camundongo). (b) Imens representativas de western blot e análise quantitativa dos níveis de EGFR, p‐PI3K, PI3K, p‐AKT e AKT nas placentas de camundongos tratados com AmEVs (n = 6/grupo). Os dados foram apresentados como mediana e IQR; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, conforme determinado por ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Bonferroni.
Os AmEVs modularam a viabilidade, migração e invasão de trofoblastos humanos via via EGFR‐PI3K‐AKT
A translocação dos AmEVs na placenta e a remissão dos sintomas de PE em camundongos pré-tratados com AmEVs nos levaram a investigar o mecanismo potencial dos AmEVs em linhagem celular humana. Assim, utilizamos a linhagem celular de trofoblasto humano do primeiro trimestre HTR‐8/SVneo para estabelecer um modelo de hipóxia/reoxigenação (H/R) a fim de mimetizar o estado do trofoblasto na PE, com base em estudos anteriores (Zhang & Zhang,). A taxa de proliferação celular foi significativamente maior nos grupos pré-tratados com 10 ou 20 µg/mL de AmEVs do que no grupo H/R (Figura 7a). A migração celular foi consideravelmente promovida após pré-tratamento com 10 ou 20 µg/mL de AmEVs, em comparação com o grupo H/R (Figura 7b,c). Em contraste, não foram observadas diferenças significativas na proliferação ou migração celular entre os grupos de 1 µg/mL de AmEVs, 50 µg/mL de AmEVs ou H/R (Figura 7a–c). Correspondentemente, os níveis de expressão de N‐caderina, vimentina e MMP9 foram consideravelmente maiores no grupo tratado com 20 µg/mL de AmEVs do que no grupo H/R, enquanto a expressão de E‐caderina foi substancialmente menor (Figura 7D). Além disso, nossos dados sugeriram que o pré-condicionamento com AmEVs regulou positivamente o EGFR e estimulou a via PI3K–AKT em células trofoblásticas humanas HTR‐8/SVneo (Figura 7e). Coletivamente, nossos resultados indicaram que os AmEVs podem promover a viabilidade, migração e invasão de células trofoblásticas humanas através da via de sinalização EGFR–PI3K–AKT.
AmEVs promoveram proliferação e invasão de trofoblastos ativando a via de sinalização EGFR‑PI3K‑AKT. (a) AmEVs afetaram a proliferação de células HTR‑8/SVneo de maneira concentração‑dependente (n = 3/grupo). (b, c) A cicatrização de feridas das células HTR‑8/SVneo foi significativamente potencializada por AmEVs de forma dose‑dependente (barra de escala = 400 μm; n = 6/grupo). (d) Imunoblotes representativos da expressão de E‑caderina, N‑caderina, MMP‑9 e vimentina em células HTR‑8/SVneo submetidas a diferentes tratamentos; o gráfico de barras apresenta a quantificação das bandas (n = 3/grupo). (e) Níveis proteicos de EGFR, p‑PI3K, PI3K, p‑AKT e AKT em células HTR‑8/SVneo submetidas a diferentes tratamentos, conforme determinado por análise de western blot (n = 3/grupo). Os dados foram apresentados como mediana e IQR em (a) e (c–e) e analisados por ANOVA de uma via seguida pelo teste post‑hoc de Bonferroni. (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).
DISCUSSÃO
A PE é uma das doenças mais graves durante a gravidez, que aumenta o risco de parto prematuro e restrição do crescimento fetal, além de colocar em risco a sobrevivência materna. Relatos recentes revelaram aberrações específicas da GM em pacientes com PE (Chen et al.,; Liu et al.,; Lv et al.,). O enxerto de camundongos tratados com antibióticos com uma GM desregulada causou fenótipos pré-eclâmpticos; assim, a disbiose intestinal foi reconhecida como crítica para a etiologia da PE (Chen et al.,; Jin et al.,). Na última década, a modulação microbiana intestinal tem sido explorada como uma opção terapêutica para uma lista crescente de indicações (Drago et al.,; Paramsothy et al.,; Sung et al.,; van Nood et al.,). No entanto, ainda não está claro se a GM está envolvida na patogênese da PE. Consistente com estudos anteriores de pacientes com PE (Chen et al.,; Liu et al.,; Lv et al.,), observamos disbiose intestinal em nosso modelo de PE induzida por L-NAME através da análise do conteúdo cecal. Também encontramos uma abundância reduzida de Am, que mostrou forte associação com dados fenotípicos, e indicou uma possível ligação entre a patogênese da PE e a Am. A Am, uma bactéria comensal intestinal que coloniza a camada mucosa, tem efeitos benéficos no metabolismo do hospedeiro, na imunomodulação adaptativa e nas respostas antitumorais (Ansaldo et al.,; Depommier et al.,; Routy et al.,; Wang et al.,; Yoon et al.,). Aqui, descobrimos que camundongos pré-tratados com Am exibiram níveis significativamente reduzidos de PAS e proteína na urina, indicando que a Am pode potencialmente ter um papel terapêutico na PE. Embora a Am tenha sido relatada anteriormente como exercendo um efeito anti-inflamatório na PE (Jin et al.,), neste estudo, não observamos mudança significativa nos níveis séricos de fatores inflamatórios em camundongos de três grupos diferentes, o que sugeriu que o efeito protetor da Am na PE pode não se restringir à imunomodulação. No entanto, essa falta de resposta imune pode ser parcialmente devida ao momento e à dosagem da injeção de L-NAME, pois a administração precoce do fármaco e altas doses podem induzir alterações sistêmicas nas citocinas inflamatórias (Shu et al.,). Estudos futuros são necessários para otimizar a administração do fármaco e explorar melhor as potenciais propriedades imunomoduladoras da Am sob desregulação da GM em um estado inflamatório.
Até o momento, o mecanismo subjacente ao papel do Am na PE ainda é incerto. Um estudo anterior revelou que o meio de cultura do Am poderia promover a polarização de macrófagos em direção ao fenótipo M2 e, por sua vez, suprimir respostas inflamatórias na placenta (Jin et al.,). No entanto, ainda não está claro qual componente do sobrenadante atua na PE. Aqui, utilizamos EVs para desenvolver uma nova estratégia para investigar como o Am interage com a fisiologia do hospedeiro. Essas vesículas nanométricas, produzidas por bactérias in vitro e in vivo, contêm múltiplos componentes derivados da bactéria parental (Kaparakis‐Liaskos & Ferrero,; Kulp & Kuehn,). Com base em sua estrutura e composição, EVs bacterianos têm sido desenvolvidos para aplicações biomédicas (como vacinas e veículos de liberação de fármacos) e explorados como mediadores de interações bactéria–hospedeiro importantes para a patogênese de diferentes doenças (Chen et al.,; Engevik et al.,; Jain & Pillai,; Van Der Pol et al.,). Aqui, foi observada a captação celular de AmEVs, que pareciam ser agregados de pequenos grânulos nas regiões perinucleares das células. Esses resultados indicaram que os AmEVs foram transferidos do lúmen intestinal para a placenta/feto e internalizados por trofoblastos in vitro, mediando a resposta do hospedeiro ao Am, o que representou uma nova via de interações placenta‐intestino. Além disso, estudos mostraram que a disbiose intestinal materna durante a gravidez afeta o neurodesenvolvimento fetal, o que prejudica ainda mais a sensibilidade tátil de camundongos adultos descendentes (Vuong et al.,). Vale destacar que EVs liberados por micróbios foram relatados como capazes de ultrapassar a barreira hematoencefálica (BBB) em modelo de camundongo (Bittel et al.,; Xie et al.,). No entanto, neste estudo, não se sabe se os AmEVs poderiam circular através da BBB dos fetos. Estudos futuros são necessários para explorar o impacto dos AmEVs no neurodesenvolvimento fetal. Nossos resultados também revelaram o potencial preventivo dos AmEVs para a PE, o que é importante, considerando a limitação da introdução de células bacterianas probióticas e a possibilidade de resistência e colonização GM persistente (Kristensen et al.,; Maldonado‐Gómez et al.,; Zmora et al.,). Esforços futuros para equipar EVs com ligantes específicos da placenta por meio da engenharia genética da bactéria parental podem facilitar a entrega direcionada de AmEVs à placenta. Uma série de estudos será necessária para identificar os componentes ativos dos EVs que medeiam as respostas do hospedeiro ao Am na PE.
O remodelamento adequado das artérias espiraladas (SpA) uterinas é essencial para o desenvolvimento placentário (Huppertz,). A invasão insuficiente do trofoblasto extraviloso (EVT) fundamenta um remodelamento inadequado das SpA, o que induz a pré-eclâmpsia (PE) (Brosens et al.,; Redman & Sargent,). Curiosamente, a inoculação da microbiota intestinal (GM) de pacientes com PE desencadeou uma redução substancial na invasividade das células trofoblásticas e, em última análise, induziu uma placentação deficiente em roedores (Chen et al.,; Jin et al.,), sugerindo que um desequilíbrio da GM relacionado à PE pode contribuir para a placentação superficial. Aqui, descobrimos que a administração exógena de AmEVs facilitou a invasão trofoblástica com uma potência semelhante à da bactéria parental e promoveu a placentação. Além disso, a análise transcriptômica da placenta identificou um aglomerado de genes diferencialmente expressos (DEGs) no grupo AmEVLN, entre os quais o Egfr foi predominante. A proteína EGFR pertence à família das receptor-tirosina quinases, que desempenha papéis fundamentais na diferenciação, proliferação, migração e invasão celular (Shepard et al.,). Notavelmente, foi demonstrado que a placenta expressa os níveis mais elevados de EGFR entre todos os outros tecidos não malignos do corpo humano (Wu et al.,). A expressão aberrante de EGFR foi previamente associada a defeitos placentários e PE (Faxén et al.,). Neste estudo, a suplementação profilática com AmEVs regulou positivamente o EGFR na placenta, o que promoveu a ativação das moléculas de sinalização a jusante, PI3K e AKT, nos trofoblastos. Consistentes com nossas descobertas, a ativação da sinalização de EGFR foi relatada anteriormente como reguladora positiva da invasão trofoblástica e do remodelamento das SpA na placenta (Armant et al.,; Fang et al.,). No entanto, estudos adicionais são necessários para decifrar o mecanismo regulatório entre as EVs e a sinalização dependente de EGFR.
Em resumo, os resultados deste estudo verificaram a presença de disbiose intestinal no modelo murino de PE. Além disso, descobrimos o papel protetor da Am contra a progressão da PE, que pareceu ser mediado principalmente através das AmEVs. Essas vesículas nanométricas viajaram do trato gastrointestinal para a placenta e subsequentemente interagiram com os trofoblastos para promover a invasão do EVT e a transição epitélio-mesenquimal (EMT), melhorando assim os fenótipos de PE em um modelo murino. Pesquisas futuras, incluindo estudos de coorte, são necessárias para explorar ainda mais o mecanismo subjacente à comunicação cruzada entre AmEVs e placenta e avaliar o efeito preventivo das AmEVs. Em conjunto, nossos resultados fornecem novas perspectivas sobre a interação entre a placenta e o intestino, e revelam ainda um candidato terapêutico eficaz para a PE.
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES
Yun Chen: Conceituação; Curadoria de dados; Investigação; Metodologia; Administração do projeto; Redação - rascunho original. Zihao Ou: Conceituação; Curadoria de dados; Investigação; Metodologia; Administração do projeto; Visualização; Redação - revisão e edição. Menglan Pang: Curadoria de dados; Investigação; Validação. Zixin Tao: Curadoria de dados; Investigação; Metodologia; Administração do projeto; Visualização; Redação - rascunho original. Xifen Zheng: Curadoria de dados; Investigação; Metodologia; Visualização. Zhipeng Huang: Curadoria de dados; Metodologia; Validação. Dongni Wen: Investigação. Qianbei Li: Investigação; Metodologia. Ruisi Zhou: Investigação. Peng Chen: Análise formal; Validação; Redação - revisão e edição. Bo Situ: Administração do projeto; Supervisão. Chao Sheng: Análise formal; Validação. Yingying Huang: Validação. Xiaojing Yue: Metodologia; Validação. Lei Zheng: Aquisição de financiamento; Recursos; Supervisão; Redação - revisão e edição. Liping Huang: Aquisição de financiamento; Recursos; Supervisão; Redação - revisão e edição.
DECLARAÇÃO DE CONFLITO DE INTERESSES
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Informações de suporte
DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
Dados disponíveis mediante solicitação aos autores
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