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pmid: "37377410"
title: "Akkermansia muciniphila alivia a doença hepática gordurosa associada ao metabolismo relacionada à dieta rica em gordura ao modular a microbiota intestinal e os ácidos biliares."
authors: "Wu W, Kaicen W, Bian X, Yang L, Ding S, Li Y, Li S, Zhuge A, Li L"
journal: "Microbial biotechnology"
pubdate: "2023 Oct"
doi: "10.1111/1751-7915.14293"
source: "PMC Full Text"

Akkermansia muciniphila alivia a doença hepática gordurosa associada ao metabolismo relacionada à dieta rica em gordura ao modular a microbiota intestinal e os ácidos biliares.

Autores

Wu W, Kaicen W, Bian X, Yang L, Ding S, Li Y, Li S, Zhuge A, Li L

Periodico

Microbial biotechnology (2023 Oct)

Conteudo

Akkermansia muciniphila alivia a doença hepática gordurosa associada ao metabolismo relacionada à dieta rica em gordura através da modulação da microbiota intestinal e dos ácidos biliares
Abstract
Foi relatado que Akkermansia muciniphila melhora o metabolismo do hospedeiro e reduz a inflamação; no entanto, seus efeitos potenciais no metabolismo dos ácidos biliares e nos padrões metabólicos na doença hepática gordurosa associada ao metabolismo (MAFLD) são desconhecidos. Neste estudo, analisamos camundongos C57BL/6 sob três condições de alimentação: (i) um grupo de dieta baixa em gordura (LP), (ii) um grupo de dieta rica em gordura (HP) e (iii) um grupo de dieta rica em gordura suplementado com A. muciniphila (HA). Os resultados mostraram que a administração de A. muciniphila aliviou o ganho de peso, a esteatose hepática e a lesão hepática induzidas pela dieta rica em gordura. A. muciniphila alterou a microbiota intestinal com uma diminuição em Alistipes, Lactobacilos, Tyzzerella, Butyricimonas e Blautia, e um enriquecimento de Ruminiclostridium, Osclibacter, Allobaculum, Anaeroplasma e Rikenella. As alterações na microbiota intestinal correlacionaram-se significativamente com os ácidos biliares. Enquanto isso, A. muciniphila também melhorou a tolerância à glicose, as barreiras intestinais e a disbiose das adipocinas. Akkermansia muciniphila regulou o eixo FXR-FGF15 intestinal e remodelou a construção dos ácidos biliares, com redução de ácidos biliares secundários no ceco e no fígado, incluindo DCA e LCA. Essas descobertas fornecem novos insights sobre as relações entre probióticos, microbiota e distúrbios metabólicos, destacando o papel potencial de A. muciniphila no manejo da MAFLD.
Akkermansia muciniphila melhora a disbiose de adipocinas e a esteatose hepática induzidas pela dieta rica em gordura. Akkermansia muciniphila remodela uma microbiota intestinal diferenciada e perfis de ácidos biliares. Akkermansia muciniphila regulou positivamente o eixo FXR-FGF15 intestinal.
INTRODUÇÃO
Doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é uma doença hepática metabólica crônica que inclui várias condições, como esteatose simples, esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), fibrose hepática, cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). A prevalência de DHGNA está aumentando globalmente, e atualmente é considerada uma das principais causas de transplante hepático (Younossi et al., ). Recentemente, o termo DHGNA foi substituído por doença hepática gordurosa associada ao metabolismo (DHGAM) para refletir melhor a fisiopatologia e os fatores de risco da doença (Eslam et al., ). O desenvolvimento da DHGAM envolve diversos fatores patogênicos, incluindo resistência à insulina (RI), disfunção do tecido adiposo, disfunção imunológica e flora intestinal. A circulação entero-hepática de sangue e linfa carrega um influxo constante de produtos derivados do intestino (por exemplo, antígenos) para o fígado, o que desempenha um papel fundamental no desencadeamento da inflamação hepática (Balmer et al., ; Barrow et al., ). Esses fatores de risco podem atuar em conjunto para induzir o início e a progressão da DHGAM (Buzzetti et al., ). No entanto, a medicação atual para DHGAM/EHNA ainda é limitada, e o manejo primário da DHGAM continua sendo a intervenção no estilo de vida e o controle de comorbidades.

Nos últimos anos, a microbiota intestinal e os ácidos biliares foram descobertos como tendo um papel importante no desenvolvimento e progressão da doença hepática gordurosa associada ao metabolismo (DHGAM) e da esteato-hepatite não alcoólica (EHNA). A disbiose da microbiota intestinal foi observada em pacientes obesos com DHGAM, com aumento de Lactobacillus, Dorea, Robinsoniella e Roseburia (Raman et al., ). A microbiota pode afetar o desenvolvimento de DHGAM induzida por dieta rica em gordura em camundongos sob os mesmos antecedentes genéticos (Le Roy et al., ). A microbiota intestinal metaboliza ácidos biliares primários (ABPs) para produzir ácidos biliares secundários (ABSs), e ambos são reabsorvidos através do epitélio entérico. A disbiose dos ácidos biliares tem sido associada à DHGAM, e o aumento da síntese de ABPs foi observado em pacientes com EHNA (Xue et al., ). Os ABs podem regular o metabolismo e a imunidade do hospedeiro por meio do receptor farnesóide X (FXR), que é ativado por ácidos biliares (Pathak et al., ). A microbiota intestinal pode modular a secreção intestinal de fatores de crescimento de fibroblastos (FGF15 em camundongos, FGF19 em humanos) por meio da ativação do FXR pelos ABs. FGF15/19 tem sido encontrado para modular o metabolismo do hospedeiro e a síntese de ácidos biliares no fígado (Betrapally et al., ). Os probióticos foram encontrados para reduzir a absorção de ácidos biliares e promover a síntese hepática de ácidos biliares através do eixo entero-hepático FXR-FGF15 (Degirolamo et al., ). Portanto, o uso de probióticos para modular a microbiota intestinal e melhorar as doenças hepáticas é uma área promissora de pesquisa.
Akkermansia muciniphila é o único membro isolado do filo Verrucomicrobia e tem sido demonstrado ser benéfico em distúrbios metabólicos e imunes por degradar mucina, que pode ser utilizada como nutriente pelos enterócitos ou outros micróbios comensais intestinais (Grander et al., ; Qin et al., ). A depleção de A. muciniphila tem sido associada a permeabilidade intestinal alterada e aumento do lipopolissacarídeo (LPS) plasmático, causando inflamação sistêmica e MAFLD em camundongos (Shi et al., ). Por outro lado, a suplementação com A. muciniphila demonstrou melhorar a obesidade relacionada à dieta rica em gordura, aumentando a barreira intestinal e melhorando a disglicemia (Everard et al., ; Li et al., ; Plovier et al., ). As evidências sugerem que A. muciniphila pode ser um candidato promissor como novo probiótico (Derrien et al., ; Zhang et al., ). Nosso estudo anterior mostrou que a reposição de curto prazo com altas concentrações de A. muciniphila pode remodelar a microbiota intestinal e influenciar a resposta dos camundongos à injeção de concanavalina A (Wu et al., ). No entanto, o efeito benéfico de A. muciniphila na MAFLD é limitado. Este estudo tem como objetivo investigar os papéis específicos e mecanismos regulatórios de A. muciniphila no desenvolvimento da MAFLD sob a perspectiva do eixo intestino-fígado.
PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Cultura de cepas e tratamentos em animais
Akkermansia muciniphila MucT (ATCC BAA‐835) foi adquirida da ATCC e cultivada conforme descrito anteriormente (Wu et al., ). Resumidamente, as bactérias vivas foram coletadas após centrifugação repetida e lavagem com PBS. A concentração final de A. muciniphila viva em PBS estéril atingiu 1,5 * 1010 UFC/mL.
Camundongos machos C57BL/6 de seis semanas de idade, livres de patógenos específicos (SPF) do SLAC Laboratory, Xangai, foram criados em um ambiente SPF. Após 2 semanas de alimentação adaptativa, todos os camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos (LP, HP e HA). Os camundongos do grupo LP (LFD + PBS) foram alimentados com uma dieta baixa em gordura como controle saudável, enquanto os camundongos dos grupos HP (HFD + PBS) e HA (HFD + A. muciniphila) foram alimentados com uma dieta rica em gordura (Research Diet D12492) por 21 semanas para construir modelos de MAFLD. Os camundongos do grupo HA foram tratados com gavagem oral diária com 0,2 mL de suspensão de A. muciniphilaus viva (aproximadamente 1,5 * 109 UFC totais), enquanto os camundongos dos grupos HP e LP receberam PBS em vez disso. Após 21 semanas, os camundongos foram eutanasiados, e amostras de sangue, fígado, íleo, cólon e gordura foram coletadas e imediatamente armazenadas a −80°C. Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Local de Uso e Proteção Animal e foram realizados de acordo com os critérios do Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
Permeabilidade da barreira intestinal in vivo
Dextrano marcado com FITC (FD4) foi pesado e completamente dissolvido em PBS estéril para preparar uma solução estoque de FD4 a 100 mg/mL. Antes da detecção, os camundongos foram mantidos em jejum por 4 h e receberam 60 mg/100 g de FD4 por gavagem oral; em seguida, os camundongos foram mantidos em jejum por mais 4 h. O sangue venoso foi então coletado, e o valor de fluorescência no plasma foi detectado com um leitor de microplacas de fluorescência com comprimento de onda de excitação de 485 nm e comprimento de onda de recepção de 528 nm. Uma curva padrão foi traçada, com base na qual a concentração de FD4 nas amostras foi calculada.

Teste de tolerância à glicose intraperitoneal (IPGTT)

Os camundongos foram mantidos em jejum por 6 h para garantir os níveis basais de glicose. A glicemia total foi medida na veia da cauda com tiras-teste ACCU-CHEK Sensor Comfort (Roche), e esse valor foi considerado o nível de glicemia no tempo 0 min. Em seguida, uma solução de glicose a 20% foi injetada por via intraperitoneal na dose de 1 g/1 kg de peso corporal. Os níveis de glicemia foram medidos aos 15, 30, 60 e 120 min após a injeção. Os níveis de glicemia foram plotados em função do tempo para traçar uma curva glicêmica. A área sob a curva do teste de tolerância à glicose (GTT) foi calculada.

Análise histológica

Amostras de tecido foram coletadas e imediatamente colocadas em tampão de fixação com formalina a 10%. Os tecidos fixados foram embebidos em blocos de parafina. Secções de parafina com 4 μm de espessura foram produzidas e coradas com hematoxilina e eosina. O Escore de Atividade da DHGNA (NAS) foi aplicado para avaliar a gravidade das lesões hepáticas de acordo com diferentes aspectos, incluindo grau de esteatose (0–3), inflamação lobular (0–3) e balonização (0–2). O acúmulo de lipídios foi determinado usando coloração com Oil Red O. A camada de muco do cólon foi medida por coloração com Azul Alciano. Para imunofluorescência, secções de parafina foram coradas com anticorpos marcados por fluorescência (ocludina e tjp1) e escaneadas por um microscópio confocal de fluorescência (Zeiss).

Detecção de função hepática, LBP sistêmico e fatores metabólicos

As concentrações séricas de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato transaminase (AST) foram detectadas usando um analisador automatizado (SRL). A proteína de ligação a LPS (LBP) no plasma foi medida usando um kit de ELISA de acordo com as instruções do fabricante. O Bio-Plex Pro Mouse Diabetes oito-Plex Assay e o Adiponectin Assay (Bio-Rad) foram usados para determinar fatores relacionados ao metabolismo no soro, incluindo insulina, grelina, peptídeo semelhante ao glucagon 1 (GLP-1), resistina, glucagon, peptídeo inibitório gástrico, leptina, inibidor do ativador do plasminogênio-1 (PAI-1) e adiponectina.

Isolamento de RNA e detecção por PCR quantitativa em tempo real
O RNA foi extraído e purificado, e transcrito reversamente em cDNA usando o Prime Script™ RT Master Mix (TaKaRa Biotechnology). A PCR quantitativa em tempo real por fluorescência (RT–PCR) foi realizada utilizando um sistema de PCR em tempo real 7500 (Applied Biosystems). As condições da reação foram definidas da seguinte forma: uma etapa de pré-desnaturação a 95°C por 30 s, seguida por 40 ciclos de desnaturação em PCR de duas etapas (95°C por 5 s) e extensão de anelamento (60°C por 34 s). A expressão relativa dos genes alvo foi calculada de acordo com o método 2−∆∆CT e normalizada usando β-actina como referência (iniciadores mostrados na Tabela S1).

Análise do perfil de ácidos biliares

Aproximadamente 10 mg de ceco foram pesados, e 10 mg de esferas de óxido de zircônio pré-resfriadas e 15 μL de água ultrapura foram adicionados. Padrões internos (LCA-d4, UDCA-d4, GCDCA-d4, TCA-d4, GCA-d4, CA-d4, GDCA-d4, DCA-d4, TCDCA-d9 e β-CA-d5) foram utilizados, e suas concentrações foram controladas para 150 nM em todos os pontos de calibração. Uma mistura pré-resfriada de acetonitrila e metanol foi preparada com uma proporção de volume de 80:20, e os padrões internos acima foram adicionados. Em seguida, a mistura foi adicionada à solução cecal processada. Após centrifugação a 13.500 g e 4°C por 20 min, 50 μL do sobrenadante foram cuidadosamente coletados e suavemente misturados com 150 μL de solução de acetonitrila/água (50:50, v/v) para detecção posterior.

Para amostras de fígado, 10 mg de tecido foram pesados e misturados com esferas pré-resfriadas e água ultrapura. As amostras foram então homogeneizadas com acetonitrila/metanol (8:2), bem como padrões internos, e centrifugadas. O líquido sobrenadante coletado foi liofilizado. O pó da amostra liofilizada, os calibradores secos e as amostras de controle de qualidade (QCs) do BAP Ultra foram reconstituídos com acetonitrila/metanol (80/20, v/v) e água ultrapura. Finalmente, o sobrenadante centrifugado foi coletado para detecção posterior.

Um sistema UPLC–MS/MS (Waters Corp) foi utilizado para a quantificação de AB seguindo protocolos anteriores (Xie et al.,). O software QuanMET (versão 1.0, Metabo-Profile) foi aplicado para processamento adicional dos dados. Uma curva padrão foi traçada para calcular a equação de regressão. O tempo de retenção no cromatograma de íons foi comparado para identificar os componentes específicos na amostra, e sua concentração correspondente foi calculada de acordo com o valor do sinal desta equação (Xie et al.,).

Sequenciamento do 16S rDNA fecal e análise de bioinformática

Os genomas bacterianos fecais foram extraídos. Iniciadores universais com códigos de barras específicos direcionados às regiões conservadas V3-V4 do 16S rDNA foram utilizados (341F: 5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′, 806R: 5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′). A PCR de alta fidelidade do genoma foi realizada usando o Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix com um GC Buffer Kit (New England Biolabs, Inc.).
Uma biblioteca de clones foi gerada pelo Ion Plus Fragment Library Kit e sequenciada pelo Ion S5TM XL (Thermo Fisher Scientific Inc.). Leituras de extremidade única (400 pb/600 pb) foram adquiridas e processadas para obter leituras limpas. Sequências com similaridade superior a 97% foram agrupadas em uma unidade taxonômica operacional (UTO). UTOs representativas foram extraídas e anotadas com o Mothur com base no banco de dados Silva. A diversidade alfa e a diversidade beta foram calculadas pelo software QIIME. A análise de coordenadas principais (PCoA) baseada na distância UniFrac foi realizada para comparar as distribuições da comunidade, e a significância foi analisada pelo Anosim. O teste de soma de postos de Wilcoxon ou o teste T foi adotado para análise intergrupos. A constituição da comunidade em vários níveis taxonômicos (filos, famílias, gêneros, espécies) foi analisada pelo MetaStat, e o valor Q foi obtido corrigindo o valor p.

Análise estatística
O SPSS 20.0 (SPSS, Inc.) foi utilizado para análise de dados, e um valor p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Um teste t não pareado ou teste U de Mann-Whitney foi aplicado para comparações de dois grupos, enquanto ANOVA ou teste de Kruskal-Wallis foi empregado quando três grupos estavam envolvidos, de acordo com a distribuição dos dados. As figuras foram geradas usando o software Prism 6.0 (GraphPad Software.).

RESULTADOS
Akkermansia muciniphila alivia o ganho de peso, a esteatose hepática e a lesão hepática
A MAFLD induzida por dieta hiperlipídica compartilha características histológicas e patogênicas semelhantes à MAFLD clínica, apresentando obesidade concomitante e RI (Lau et al., ). Portanto, nosso estudo utilizou uma dieta hiperlipídica para construir um modelo de MAFLD em camundongos. Descobrimos que camundongos alimentados com DHA (grupo HP) ganharam peso mais rapidamente do que camundongos alimentados com uma dieta de baixo teor de gordura (DBG; grupo LP), e A. muciniphila inibiu notavelmente o ganho de peso induzido por DHA (Figura 1A). Essa significância permaneceu até o final do experimento (grupo HA vs. HP, 35,95 ± 4,88 vs. 43,92 ± 5,26 g, p < 0,001, na semana 21, Figura 1B). Em comparação ao grupo LP, o volume hepático do grupo HP aumentou com extensa deposição de lipídios em todos os lobos, e isso foi melhorado pelo tratamento com A. muciniphila (Figura 1C,D). A DHA induziu o acúmulo de gotículas lipídicas nos hepatócitos, como observado na coloração Oil Red O, e esses vacúolos lipídicos intracelulares foram reduzidos nos camundongos tratados com A. muciniphila (Figura 1D). A coloração HE mostrou lóbulos hepáticos desordenados com degeneração balonizante, o corpúsculo de Mallory característico e infiltração inflamatória dispersa. O escore NAS histológico foi muito maior nos camundongos alimentados com DHA do que no grupo LP e foi reduzido nos camundongos tratados com A. muciniphila (Figura 1E). Além disso, os triglicerídeos intra-hepáticos (TGs) aumentaram significativamente no grupo modelo (HP), acompanhados por níveis elevados de ALT e AST. A intervenção com Akkermansia muciniphila reduziu acentuadamente a concentração de TGs intra-hepáticos, bem como a ALT e AST séricas (Figura 1F,G).
Akkermansia muciniphila alivia o ganho de peso, a esteatose hepática e a lesão hepática induzidos por dieta hiperlipídica. (A) curvas de peso corporal durante os experimentos: camundongos foram distribuídos aleatoriamente em três grupos (n = 10–12 por grupo, círculo vermelho representa o grupo modelo alimentado com HFD (HP), quadrado azul representa o grupo tratado com A. muciniphila (HA), e triângulo verde representa o grupo controle (LP); (B) peso corporal e (C) peso do fígado ao final dos experimentos; (D) visão macroscópica do tecido hepático, coloração HE e Oil-red O; (E) escores NAS da histopatologia hepática; (F) concentração de triglicerídeos hepáticos; (G) ALT e AST séricas. Teste estatístico: ANOVA; Comparações post hoc significativas: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; Os dados são apresentados como média ± EPM.
Akkermansia muciniphila modula a disbiose da microbiota intestinal induzida por HFD
Para explorar a alteração da microbiota intestinal, avaliamos as comunidades microbianas fecais usando análise de sequenciamento de 16S rDNA. O agrupamento PCoA foi empregado para discriminar a estrutura com distâncias UniFrac não ponderadas e ponderadas (Figura 2A). Em contraste com o grupo LP, os camundongos MAFLD apresentaram uma estrutura distinta (p < 0,01, análise multivariada ANOSIM). No entanto, em comparação com o grupo HP, os camundongos tratados com A. muciniphila mostraram um agrupamento díspar de micróbios comensais com base em um gráfico PCoA não ponderado e ponderado (p < 0,01, análise multivariada ANOSIM).
Akkermansia muciniphila modula a disbiose da microbiota intestinal induzida por dieta hiperlipídica. (A) Análise de coordenadas principais (PCoA) entre os três grupos com base nas distâncias UniFrac não ponderadas (esquerda) e ponderadas (direita), cada ponto representa uma amostra (azul, grupo LP; verde, grupo HP; vermelho, grupo HA); (B) mapa de calor de táxons em nível de gênero entre os três grupos, cada linha representa um grupo, a significância entre grupos (HP e HA) foi determinada usando MetaStat, losango laranja indicando p < 0,05, losango marrom indicando p < 0,01, losango branco indicando p > 0,05.
Para elaborar mudanças específicas na composição taxonômica, a abundância microbiana em diferentes níveis taxonômicos foi analisada. No grupo LP, o filo Bacteroidetes foi considerado a população dominante, seguido por Firmicutes, Proteobacteria e Actinobacteria (Figura S1), o que estava de acordo com achados anteriores. No entanto, no grupo HP, houve uma diminuição significativa em Bacteroides e Actinobacteria, com um aumento correspondente em Firmicutes, indicando uma mudança na composição da microbiota intestinal em direção a um estado não saudável (Figura S2, q ajustado < 0,05, comparado ao grupo LP). Curiosamente, a administração de A. muciniphila não reverteu significativamente a alteração no nível de filo. No entanto, a abundância relativa dos 35 principais gêneros revelou uma distribuição dispar no grupo HA em comparação com o grupo HP (Figura S3). Vários gêneros, como Alistipes, Lactobacilli, Tyzzerella, Butyricimonas e Blautia, foram bastante reduzidos no grupo HA em comparação com o grupo HP, enquanto outros gêneros, como Ruminiclostridium, Osclibacter, Allobaculum, Anaeroplasma e Rikenella, foram enriquecidos no grupo HA (Figura 2B, p < 0,05, por MetaStat). Esses achados sugeriram que o tratamento com A. muciniphila teve um efeito seletivo sobre gêneros específicos da microbiota intestinal, em vez de um efeito amplo sobre a composição geral da microbiota intestinal.

A microbiota intestinal modificada por Akkermansia muciniphila está relacionada aos perfis de ácidos biliares
Os ácidos biliares primários são modificados e transformados em ácidos biliares secundários por micróbios comensais intestinais, como espécies de Clostridia e Bacteroidetes. Assim, a concentração de ácidos biliares foi quantificada e a correlação entre a flora intestinal e os ácidos biliares do ceco foi analisada. Vários gêneros foram significativamente correlacionados com os ácidos biliares cecais (Figura 3). Allobaculum foi negativamente relacionado a vários ácidos biliares, incluindo CDCA, α-MCA, LCA, DCA, UDCA e TDCA (Figura 3), que estavam enriquecidos no grupo HP. A abundância de Allobaculum foi reduzida no grupo HP, mas elevada após a suplementação com A. muciniphila (Figura S3). O DCA foi negativamente correlacionado com Anaeroplasma (R = -0,48) e positivamente correlacionado com Tyzzerella (R = 0,57). Anaeroplasma foi enriquecido no grupo HA, enquanto Tyzzerella foi enriquecido no grupo HP. O LCA foi positivamente relacionado a vários gêneros, incluindo Alistipes, Lactobacillus, Tyzzerella, Lachnoclostridium, Clostridium_sensu_stricto_1 e Roseburia, a maioria dos quais estava aumentada no grupo HP. Esses achados sugeriram que as mudanças na microbiota intestinal resultantes da intervenção com A. muciniphila estavam associadas a alterações na estrutura dos perfis de ácidos biliares.

Mapa de calor de correlação entre microbiota intestinal e ácidos biliares do ceco. A correlação não paramétrica rho de Spearman foi adotada, relações significativas com *p < 0,05 e **p < 0,01.

Akkermansia muciniphila inibe a hipertrofia de adipócitos e melhora a disbiose de adipocinas
Adiposidade e perfis alterados de adipocinas (incluindo leptina, adiponectina e resistina) são considerados envolvidos na patogênese da MAFLD. Assim, medimos o aumento do tecido adiposo branco (TAB) e das adipocinas secretadas pelo TAB no soro (Figura 4). Consistentemente com achados anteriores, o tratamento com A. muciniphila inibiu significativamente o desenvolvimento do TAB total, subcutâneo (sTAB), mesentérico (mTAB) e epididimal (eTAB) em camundongos alimentados com uma HFD (Figura 4A‐C). O tamanho do tecido eTAB (Figura 4C) bem como dos adipócitos (Figura 4D) no grupo HA foi menor do que no grupo HP. A hiperplasia do TAB foi associada à disbiose das adipocinas, pois a concentração sérica de insulina, leptina e resistina no grupo HP aumentou grandemente, e a concentração de adiponectina diminuiu obviamente em comparação com o grupo LP. Akkermansia muciniphila eliminou significativamente insulina, leptina e resistina (Figura 4E, p < 0,05), enquanto a adiponectina foi comparável entre os grupos HP e HA. Além disso, A. muciniphila melhorou obviamente a tolerância à glicose, com uma menor AUC do IPGTT na semana 21 (Figura 4F). Esses achados sugeriram que A. muciniphila pode ter potencial terapêutico para MAFLD ao melhorar o metabolismo de adipócitos e as adipocinas relacionadas.

Akkermansia muciniphila melhora a hipertrofia de adipócitos, a disbiose de adipocinas e a tolerância à glicose. (A) massa total do TAB; (B) porcentagem de massa do TAB subcutâneo, mesentérico e epididimal; (C) tecidos do TAB epididimal; (D) coloração HE do TAB epididimal e diâmetro dos adipócitos; (E) concentração sérica de adipocinas; (F) teste de tolerância ao piruvato intraperitoneal e área média sob a curva (AUC) medida entre 0 e 120 min após a injeção de glicose. Teste estatístico: ANOVA; Comparações post hoc significativas: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001; Os dados são apresentados como médias ± EPM.
Akkermansia muciniphila fortalece as barreiras intestinais
Pacientes com MAFLD apresentam aumento da permeabilidade das barreiras intestinais, o que pode levar à translocação de metabólitos comensais, componentes bacterianos e das próprias bactérias, resultando em inflamação sistêmica (Cani et al., ). A camada de muco e as junções oclusivas desempenham um papel na modulação da permeabilidade intestinal. Em comparação ao grupo LP, a camada de muco azul evidenciada pela coloração com azul alciano era mais fina no grupo HP e foi espessada por A. muciniphila (Figura 5A). Além disso, a expressão de estruturas relacionadas às junções oclusivas (OCCLUDIN e TJP1) foi mais forte e mais contínua nos grupos LP e HA em comparação ao grupo HP (Figura 5B, C). A expressão de mRNA de occludin e tjp1 também foi suprimida no grupo HP em comparação ao grupo LP (Figura 5D, E, p < 0,05), mas foi regulada positivamente pela intervenção com A. muciniphila (p < 0,01). A permeabilidade intestinal in vivo foi medida avaliando a concentração sistêmica de FD4 após gavagem intragástrica. Os resultados mostraram que após 4 h de gavagem com FD4 em camundongos em jejum, a concentração plasmática de FD4 foi significativamente maior no grupo HP do que no grupo LP, indicando aumento da permeabilidade intestinal no grupo HP. No entanto, essa elevação foi bastante atenuada pela suplementação com A. muciniphila (Figura 5F). Observamos que camundongos alimentados com HFD apresentaram concentrações aumentadas de LBP no plasma, enquanto a suplementação com A. muciniphila resultou em uma tendência de menor LBP, embora essa tendência não tenha atingido significância estatística (Figura 5G, p = 0,08). O intestino permeável pode levar ao início da inflamação sistêmica e à progressão da MAFLD. O TNF-α e a infiltração de macrófagos estão intimamente relacionados à inflamação hepática e à resistência à insulina (Sell et al., ). Nosso estudo descobriu que tnf-α e f4/80 estavam significativamente elevados no grupo HP em comparação aos seus níveis no grupo LP, mas foram significativamente diminuídos sob a administração de A. muciniphila (Figura 5H, p < 0,05). Os resultados acima sugeriram que a permeabilidade da barreira intestinal aumentou durante a modelagem da MAFLD, enquanto A. muciniphila melhorou a função da barreira intestinal, reduziu a translocação de endotoxinas e aliviou a inflamação intra-hepática.

Akkermansia muciniphila fortalece as barreiras intestinais. (A) imagens representativas de azul alciano da camada de muco, barra de escala, 100 mm; (B) e (C) imunofluorescência representativa de OCCLUDIN (verde) e TJP1 (vermelho) no cólon, barra de escala, 100 mm; (D) e (E) expressão de mRNA de occludin e Tjp1 no cólon; (F) e (G) concentração plasmática de FD4 e LBP, ng/mL; (H) expressão de mRNA de tnf-α e f4/80 no fígado. Teste estatístico: ANOVA; Comparações post hoc significativas: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; Os dados são apresentados como média ± EPM.

Akkermansia muciniphila regula positivamente o FGF15 e inibe a síntese hepática de ácidos biliares
O eixo FXR-FGF15 é uma via regulatória que desempenha um papel importante na regulação do metabolismo do hospedeiro e é considerado um alvo terapêutico para obesidade e MAFLD (Arab et al., ). Propusemos que a microbiota remodelada poderia, por sua vez, afetar a ativação dos receptores de BA e a circulação entero-hepática de BA. Descobrimos que a expressão de mRNA de fxr e shp no íleo foi significativamente inibida no grupo HP (p < 0,05), enquanto a expressão de mRNA de fxr e shp foi significativamente aumentada no grupo HA. Correspondentemente, a concentração de mRNA de fgf15 no íleo foi diminuída no grupo HP (p < 0,05, em comparação ao grupo LP) e significativamente revertida pela suplementação com A. muciniphila (Figura 6A). O FGF15 pode ativar o receptor hepático de tirosina quinase FGFR4 através do refluxo venoso portal, inibindo assim a expressão de CYP7A1, uma importante enzima limitante da taxa para a síntese de ácidos biliares. Além disso, os BAs podem se ligar diretamente e ativar os receptores FXR hepáticos, inibindo assim a expressão de CYP7A1 através do fator de transcrição SHP (Li et al., ). Descobrimos que o nível de mRNA de fgfr4 no grupo HA aumentou muito em comparação aos grupos HP e LP (Figura 6B, p < 0,05), enquanto os níveis de mRNA de fxr e shp intra-hepáticos foram comparáveis entre os três grupos. Além disso, observou-se que a alimentação com HFD aumentou significativamente o nível hepático de mRNA de cyp7a1 (HP vs. LP, p < 0,001, Figura 6B), mas a suplementação com A. muciniphila aparentemente inibiu a superexpressão de cyp7a1 (p < 0,01).

Akkermansia muciniphila regula positivamente o FGF15 e inibe a síntese hepática de ácidos biliares. (A) Expressão de mRNA de fxr, shp e fgf15 no íleo; (B) Expressão de mRNA de fgfr4, fxr, shp e cyp7a1 no fígado; (C) Concentração de BAs totais, primários e secundários no ceco e no fígado. Teste estatístico: ANOVA; Comparações post hoc significativas: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; Os dados são apresentados como médias ± EPM.

Conforme mostrado na Figura 6C, os camundongos com MAFLD apresentaram uma concentração distintamente maior de BAs totais no ceco (HP vs. LP, p < 0,001), que foi principalmente atribuída ao aumento de sBAs (HP vs. LP, p < 0,001). Uma alteração semelhante foi observada com uma concentração elevada de BAs totais no tecido hepático do grupo HP, em contraste com a do grupo LP. Além dos sBAs, os pBAs intra-hepáticos foram maiores no grupo HP (HP vs. LP, p < 0,01). Akkermansia muciniphila reduziu consideravelmente a concentração de BAs totais e secundários tanto no ceco quanto no fígado (HA vs. HP, p < 0,05), além de diminuir os pBAs hepáticos. Os resultados acima sugeriram que A. muciniphila poderia promover o fgf15 derivado do intestino, que por sua vez poderia suprimir a síntese de ácidos biliares ao inibir a expressão de cyp7a1 hepático.
Akkermansia muciniphila regula a construção de BAs intestinais e reduz os BAs secundários
Para explorar melhor a alteração detalhada da circulação entero-hepática de AB, a composição de 18 principais ácidos biliares no ceco e fígado entre os três grupos foi analisada. Como visto na Figura 7A, os camundongos do grupo LP apresentaram um perfil hepático de AB único, com TCA e β‐MCA como os principais componentes. Em contraste, os camundongos com MAFLD do grupo HP mostraram um perfil hepático de AB alterado, com TCDCA, LCA e TDCA elevados, e GCA, ω‐MCA e Tω‐MCA diminuídos. Akkermansia muciniphila restaurou parcialmente o perfil hepático de AB perturbado ao reduzir TCDCA, LCA e TDCA, bem como ao restaurar ω‐MCA e Tω‐MCA (Figura 7A). No ceco, os ABs secundários não conjugados foram a principal proporção de ABs nos camundongos controle alimentados com LFD, com ω‐MCA como o AB predominante, seguido por DCA, β‐MCA, HDCA, LCA e α‐MCA. As dietas HFD reestruturaram a constituição dos ABs. A porcentagem de DCA foi marcadamente elevada após a alimentação com HFD (43,63 ± 4,35% vs. 32,39 ± 12,52%, HP vs. LP, p < 0,05). Além disso, LCA e TDCA foram maiores no grupo HP. No entanto, A. muciniphila reduziu significativamente os níveis aumentados de DCA e LCA e mostrou uma tendência de diminuição nos níveis de TDCA (p = 0,08, Figura 7B).

Akkermansia muciniphila regula a construção de ABs intestinais e reduz vários ABs secundários. (A) porcentagem relativa de 18 principais ácidos biliares no fígado; (B) porcentagem relativa de 18 principais ácidos biliares no ceco. Teste estatístico: ANOVA ou teste de Kruskal‐Wallis de acordo com a distribuição dos dados; Comparações post hoc significativas: *p < 0,05; **p < 0,01; Os dados são apresentados como média ± EPM.
DISCUSSÃO
Vários estudos investigaram os papéis benéficos de A. muciniphila em doenças metabólicas e os mecanismos associados. Este estudo adotou um modelo de MAFLD induzido por HFD porque sua patogênese é semelhante ao curso clínico da MAFLD. Observamos que o tratamento com A. muciniphila inibiu o ganho de peso e reduziu a deposição lipídica nos hepatócitos. Curiosamente, descobrimos que camundongos tratados com A. muciniphila apresentaram flora intestinal e perfis de ácidos biliares diferenciados, além de função de barreira intestinal aprimorada e inflamação sistêmica melhorada. Propusemos que os mecanismos estejam relacionados à regulação do eixo FXR‐FGF15 no intestino e fígado e à melhora do metabolismo lipídico e de ácidos biliares no fígado.
O aumento da permeabilidade da barreira intestinal está relacionado à disfunção metabólica do tecido adiposo visceral (Lam et al., ). A endotoxina derivada do intestino pode desencadear a inflamação da gordura, que é considerada o principal impulsionador da inflamação sistêmica na síndrome metabólica por meio da liberação de adipocinas (Schaffler & Scholmerich, ). O tecido adiposo pode sintetizar e liberar citocinas pró-inflamatórias e adipocinas, incluindo leptina, adiponectina e resistina; e esses fatores constituem um dos mecanismos propulsores da RI (Brunt, ). As adipocinas podem promover a ocorrência de fígado gorduroso simples e estão relacionadas à progressão da MAFLD para NASH ou até cirrose hepática (Polyzos et al., ). Como se sabe, o TAM é mantido em uma faixa normal sob condições fisiológicas, mantendo suas citocinas e adipocinas secretadas em equilíbrio. No entanto, a hipertrofia do TAM pode resultar na superprodução de leptina e resistina, levando à resistência insulínica sustentada e à esteatose hepática. Além disso, a leptina e a resistina podem promover inflamação e fibrose hepática (Polyzos et al., ). A adiponectina é significativamente reduzida quando o fígado gorduroso simples progride para NASH (Polyzos et al., ). Nosso estudo descobriu que A. muciniphila inibiu a hipertrofia do TAM em camundongos com MAFLD e melhorou os distúrbios das adipocinas. Schneeberger et al. descobriram que a abundância de A. muciniphila diminui progressivamente com a alimentação com HFD e está inversamente correlacionada com a inflamação do TAM e as concentrações séricas de leptina e insulina (Schneeberger et al., ). Li et al. também descobriram que a administração de A. muciniphila pode reduzir a inflamação metabólica em camundongos Apoe−/−, melhorando assim a aterosclerose (Li et al., ). Amuc_1100, uma proteína de membrana derivada de A. muciniphila, demonstrou ser capaz de ativar a via AC3/PKA/HSL, o que pode levar à ativação da lipólise e do escurecimento (Zheng et al., ). Assim, A. muciniphila tem um efeito favorável ao inibir a hipertrofia do tecido adiposo e regular o equilíbrio das adipocinas.
Como receptor de ácidos biliares, o FXR é expresso pelas células epiteliais intestinais. Quando o FXR é ativado, ele induz a secreção de FGF15 a jusante, que desempenha um papel na regulação da síntese e do metabolismo dos ácidos biliares. Vários ácidos biliares, incluindo CDCA, TCA, DCA, LCA e CA, podem ativar o FXR in vitro. No entanto, na presença de CDCA, que está presente em condições fisiológicas, DCA e LCA parecem ser antagonistas do receptor FXR (Parks et al., ; Yu et al., ). Isso sugere que o equilíbrio de diferentes ácidos biliares seja importante na regulação da sinalização do FXR e do metabolismo dos ácidos biliares. Além disso, DCA e LCA são citotóxicos, e o DCA está associado ao desenvolvimento de câncer de cólon (Bernstein et al., ). Jiao et al. descobriram que pacientes com MAFLD apresentam ácidos biliares primários e secundários elevados, entre os quais a proporção de DCA está aumentada e a de CDCA está diminuída. Adicionalmente, a expressão hepática de CYP7A1 é aumentada. Em camundongos alimentados com dieta rica em gordura, há uma mudança significativa no perfil dos ácidos biliares intestinais, enquanto os BAs totais, BAs primários e BAs secundários, incluindo CA, GCA, TDCA, DCA e LCA, são grandemente aumentados (Zheng et al., ). De forma consistente, nosso estudo também observou um perfil diferencial de BAs intestinais em camundongos alimentados com HFD, com enriquecimento de BAs secundários, especialmente DCA e LCA.
Nosso estudo revelou que A. muciniphila não influenciou significativamente a expressão hepática de fxr em camundongos alimentados com HFD, enquanto o fgf15 intestinal foi aumentado e o fgfr4 hepático foi regulado positivamente. O FGFR4 regula negativamente a expressão de CYP7A1, reduzindo assim a síntese hepática de ácido biliar (Li et al., ). Pesquisas anteriores mostraram que camundongos fgf15−/− alimentados com HFD por 24 semanas apresentam perfis de ácidos biliares mais desequilibrados, resistência à insulina mais grave e triglicerídeos séricos mais elevados do que camundongos WT alimentados com HFD (Schumacher et al., ). É reconhecido que o FGF15 secretado pelo intestino também desempenha um papel fundamental na regulação do metabolismo energético e na regeneração das células hepáticas (Potthoff et al., ). Camundongos fgf15−/− mostram superexpressão de cd36, que atua como um receptor principal dos hepatócitos para a captação de ácidos graxos livres (Schumacher et al., ). Portanto, especula-se que A. muciniphila previne a MAFLD induzida por HFD por meio da diminuição da síntese intra-hepática de ácidos biliares mediada por fgf15.
Os ácidos biliares primários sintetizados no fígado são secretados no trato gastrointestinal, onde são metabolizados e modificados pela microbiota intestinal para serem convertidos em ácidos biliares secundários. Assim, diferentes estruturas da flora intestinal influenciarão a modificação dos ácidos biliares. Uma dieta hipercalórica desestrutura a microbiota intestinal, levando ao crescimento excessivo de bactérias oportunistas e/ou pró-inflamatórias (Kong et al., ). Shen et al. sequenciaram a construção microbiana intestinal de pacientes com MAFLD, observando um enriquecimento de Proteobacteria, Enterobacteriaceae e Streptococcaceae; além disso, o aumento de Escherichia coli e Blautia está correlacionado com a progressão de MAFLD para NASH e fibrose hepática (Shen et al., ). Alistipes é um residente comum do trato digestivo, e sua abundância foi relatada como positivamente associada à gravidade da lesão hepática alcoólica (Llopis et al., ). Alistipes pode produzir ácido succínico (Liu et al., ), que está significativamente aumentado nas fezes, soro e tecido hepático de pacientes com MAFLD (Loomba et al., ; Schofield et al., ). O ácido succínico pode ativar o receptor GPR91 das células estreladas hepáticas e, assim, promover a progressão da MAFLD (Li et al., ). Oscillibacter foi encontrado associado à obesidade (Xu et al., ), e sua abundância é negativamente correlacionada com a função de barreira intestinal (Lam et al., ). Roseburia e Blautia podem produzir ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs), como ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico (Canfora et al., ). Sabe-se que os AGCCs estão relacionados à regulação do balanço energético. No entanto, o papel dos AGCCs na MAFLD permanece controverso. A produção excessiva de AGCCs no trato intestinal pode ser absorvida e convertida em lipídios ou glicose pelo fígado. Além disso, acredita-se que a gliconeogênese esteja associada ao desenvolvimento de MAFLD. Assim, o enriquecimento de Blautia e seu efeito na MAFLD ainda precisam de mais estudos. Sabe-se que os ácidos biliares têm um impacto direto nas populações microbianas. A abundância de Bilophila e Blautia aumenta imediatamente após 1 dia de intervenção com uma dieta rica em gordura, o que pode estar relacionado à sua capacidade de tolerar sais biliares (Zheng et al., ). Além disso, descobrimos que Tyzzerella estava enriquecida no grupo MAFLD. Tyzzerella pode formar esporos e está associada a doença cardíaca coronariana (Kelly et al., ). Bactérias contendo hidrolase de sais biliares (BSH) são um pré-requisito para a hidrólise de BA conjugados.
Algumas bactérias do gênero Lactobacillus, como Lactobacillus plantarum, possuem atividade enzimática BSH (Kumar et al., ). Neste estudo, descobrimos que a abundância relativa de Lactobacillus estava significativamente enriquecida no grupo HP e altamente associada com TDCA e LCA. A administração de Akkermansia muciniphila reduziu o enriquecimento de Lactobacillus induzido por HFD, o que pode ser uma das razões para a diminuição dos ácidos biliares secundários. Pesquisas recentes descobriram que A. muciniphila aumenta a oxidação mitocondrial e o metabolismo dos ácidos biliares no eixo intestino-fígado, levando à remodelação da microbiota intestinal (Rao et al., ). Nossos resultados sugeriram que A. muciniphila melhorou o metabolismo dos ácidos biliares ao alterar a estrutura e a função da microbiota intestinal. Isso pode incluir promover o crescimento de bactérias benéficas envolvidas no metabolismo dos ácidos biliares ou inibir o crescimento de bactérias prejudiciais que perturbam a homeostase dos ácidos biliares. Foi relatado que as vesículas da membrana externa liberadas por A. muciniphila são capazes de restaurar a disbiose da microbiota intestinal ao promover seletivamente a proliferação de bactérias benéficas (Wang et al., ). E A. muciniphila pode modular o sistema imunológico e influenciar a interação microbiota-hospedeiro através da produção de lipídios imunomoduladores (Zhang et al., ). Além disso, Li et al. também descobriram que A. muciniphila pode suprimir a tumorigênese associada à esteato-hepatite não alcoólica ao regular as células T assassinas naturais CXCR6+. Essas evidências sugerem um papel importante de A. muciniphila na regulação da microbiota intestinal e do eixo intestino-fígado.
No entanto, existem algumas limitações neste estudo. Os mecanismos exatos pelos quais A. muciniphila regula o eixo intestinal FXR‐FGF15 e a microbiota intestinal não são completamente compreendidos. Mais pesquisas são necessárias para identificar os mecanismos moleculares específicos e comparar seus efeitos com os de outros micróbios intestinais.

CONCLUSÃO
No geral, nossos resultados revelam um mecanismo potencial subjacente aos efeitos benéficos de A. muciniphila na MAFLD. A Akkermansia muciniphila pode melhorar o metabolismo dos ácidos biliares ao regular o eixo intestinal FXR‐FGF15 e alterar a estrutura e função da microbiota intestinal. Este estudo fornece evidências para apoiar o uso de A. muciniphila como um potencial probiótico para a MAFLD no futuro.

CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES
Wenrui Wu: Conceituação (igual); metodologia (igual); validação (igual); visualização (igual); escrita – rascunho original (igual); escrita – revisão e edição (igual). Wang Kaicen: Conceituação (igual); curadoria de dados (igual); metodologia (igual); validação (igual); visualização (igual). Xiaoyuan Bian: Conceituação (igual); curadoria de dados (igual); metodologia (igual); validação (igual); visualização (igual). Liya Yang: Conceituação (igual); curadoria de dados (igual); metodologia (igual); validação (igual); visualização (igual). Shi Ding: Conceituação (igual); curadoria de dados (igual); metodologia (igual); validação (igual); visualização (igual). Yating Li: Conceituação (igual); curadoria de dados (igual); metodologia (igual); validação (igual); visualização (igual). Shengjie Li: Conceituação (igual); curadoria de dados (igual); metodologia (igual); validação (igual); visualização (igual). Aoxiang Zhuge: Curadoria de dados (igual); metodologia (igual); validação (igual); visualização (igual). Lanjuan Li: Conceituação (igual); metodologia (igual); supervisão (igual); validação (igual); visualização (igual); escrita – rascunho original (igual); escrita – revisão e edição (igual).

INFORMAÇÕES DE FINANCIAMENTO
Este estudo foi financiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da China (81790631); pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82100601); e pelo Projeto de Pesquisa do Laboratório Shandong de Biomedicina Microecológica de Jinan (JNL‐2022001A).

DECLARAÇÃO DE CONFLITO DE INTERESSES
Nenhum.

DECLARAÇÃO DE ÉTICA
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Local de Uso e Proteção Animal e foram realizados de acordo com os critérios do “Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório”.

Informações de apoio

DECLARAÇÃO DE DISPONIBILIDADE DE DADOS
Os dados de sequência estão disponíveis em https://doi.org/10.6084/m9.figshare.19624749.v1. Todos os dados estão disponíveis mediante solicitação razoável ao autor correspondente.

REFERÊNCIAS
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