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pmid: "39342324"
title: "Akkermansia muciniphila melhora a disfunção cognitiva ao regular a via do BDNF e da serotonina no eixo intestino-fígado-cérebro."
authors: "Kang EJ, Cha MG, Kwon GH, Han SH, Yoon SJ, Lee SK, Ahn ME, Won SM, Ahn EH, Suk KT"
journal: "Microbiome"
pubdate: "2024 Sep 28"
doi: "10.1186/s40168-024-01924-8"
source: "PMC Full Text"

Akkermansia muciniphila melhora a disfunção cognitiva ao regular a via do BDNF e da serotonina no eixo intestino-fígado-cérebro.

Autores

Kang EJ, Cha MG, Kwon GH, Han SH, Yoon SJ, Lee SK, Ahn ME, Won SM, Ahn EH, Suk KT

Periodico

Microbiome (2024 Sep 28)

Conteudo

Akkermansia muciniphila melhora a disfunção cognitiva ao regular a via do BDNF e da serotonina no eixo intestino-fígado-cérebro

Contexto

Akkermansia muciniphila, um probiótico de nova geração, é conhecida como uma pedra angular na regulação do eixo intestino-órgão em várias doenças, mas o mecanismo subjacente ainda é pouco compreendido. Aqui, revelamos os efeitos neuronais e antifibróticos de A. muciniphila no eixo intestino-fígado-cérebro na lesão hepática.

Resultados

Para investigar a disfunção neurológica e as microbiota intestinais características, realizamos uma coorte de cirrose (154 pacientes com ou sem encefalopatia hepática) e uma coorte de cognição comunitária (80 participantes em uma região por três anos) e validamos a existência de comprometimento cognitivo em um modelo de camundongo com lesão hepática induzida por 3,5-dietoxicarbonil-1,4-di-hidrocolidina. Os efeitos da cepa candidata na cognição foram avaliados em modelos animais de lesão hepática. A expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e dos receptores de serotonina foi avaliada em pacientes com fibrose (100 pacientes) de acordo com o grau de fibrose e o gradiente de pressão venosa hepática. A proporção de A. muciniphila diminuiu em populações com encefalopatia hepática e disfunção cognitiva. Técnicas de coloração de tecidos confirmaram danos no eixo intestino-fígado-cérebro na lesão hepática, com expressão drástica de BDNF e serotonina no intestino e no cérebro. A administração de A. muciniphila reduziu significativamente o dano tecidual e melhorou a disfunção cognitiva e a expressão de BDNF e serotonina. A coloração do nervo vago isolado mostrou uma recuperação da expressão de serotonina sem afetar a via da dopamina. Por outro lado, no tecido hepático, a inibição da lesão através da supressão da expressão do receptor de serotonina (5-hidroxitriptamina 2A e 2B) foi confirmada. A gravidade da lesão hepática foi correlacionada com a abundância de serotonina, BDNF e A. muciniphila.

Conclusões

A. muciniphila, um probiótico de nova geração, é um candidato terapêutico para aliviar os sintomas de fibrose hepática e comprometimento cognitivo.

Resumo Gráfico

Informações Suplementares

A versão online contém material suplementar disponível em 10.1186/s40168-024-01924-8.

Contexto

A encefalopatia hepática (EH) é uma síndrome neuropsiquiátrica que ocorre em pacientes com doença hepática aguda ou crônica e envolve uma ampla gama de comprometimentos cognitivos e psiquiátricos. A EH é uma complicação grave da cirrose hepática descompensada e está associada a disbiose ou a uma microbiota intestinal alterada que contribui para um ambiente inflamatório sistêmico. Pacientes com cirrose hepática apresentam alterações atróficas no lobo frontal e perda neuronal no córtex cerebral, hipotálamo e hipocampo, que são responsáveis pelo comprometimento da função cognitiva. A forte ligação entre complicações da cirrose relacionadas ao cérebro e o microbioma intestinal é indicada pela capacidade da rifaximina, um agente antibacteriano não absorvível, de manter a remissão em pacientes com EH.
No entanto, o papel e a relação entre a microbiota intestinal e fatores neuropsiquiátricos na cirrose hepática ainda não estão claros, e os mecanismos envolvidos no fluxo do eixo intestino-fígado-cérebro permanecem por ser elucidados. Investigar quais moléculas de neurotransmissores estão conectadas através do eixo órgão-intestino é necessário para compreender as anormalidades neuropsiquiátricas comumente encontradas em pacientes cirróticos e para encontrar curas.

Akkermansia muciniphila é uma bactéria comensal anaeróbica que utiliza mucinas como fonte de carbono e nitrogênio. Numerosos estudos mostraram que a abundância dessa bactéria comensal está associada a múltiplas doenças. A. muciniphila melhora a função da barreira intestinal e a espessura da camada de muco, ao mesmo tempo que reduz as concentrações sistêmicas de endotoxinas em um modelo de camundongo alimentado com dieta rica em gordura. A administração de A. muciniphila a um modelo animal de doença hepática alcoólica preveniu lesão hepática, esteatose e infiltração de neutrófilos, preservou a espessura do muco e protegeu contra o vazamento intestinal induzido por etanol. Os efeitos desta bactéria em melhorar a função imune da barreira intestinal e melhorar doenças metabólicas em modelos animais foram investigados em vários estudos, e os efeitos também foram verificados através de recentes ensaios clínicos de prova de conceito. Recentemente, foi demonstrado que A. muciniphila modula a secreção e o metabolismo da serotonina no intestino.

Tanto a serotonina quanto o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) são moléculas importantes que desempenham papéis significativos na fisiopatologia de vários transtornos neuropsiquiátricos, incluindo demência e cirrose. O BDNF é um fator neurotrófico que apoia a sobrevivência e o crescimento dos neurônios, e é crítico para a neuroplasticidade, aprendizagem e memória. Além disso, o BDNF é altamente expresso nos neurônios entéricos e na glia do intestino e está envolvido na regulação de várias funções gastrointestinais, incluindo motilidade e secreção. Estudos anteriores mostraram que os níveis de BDNF estão diminuídos em pacientes com doença de Alzheimer e doença de Parkinson, e essa diminuição está associada a comprometimento cognitivo e disfunção motora. Além disso, estudos também mostraram uma redução nos níveis de BDNF em pacientes com cirrose, e essa diminuição está associada à EH, uma condição caracterizada por disfunção cognitiva.

Da mesma forma, a serotonina é expressa nos neurônios entéricos e atua como neurotransmissor e hormônio no trato gastrointestinal. A serotonina é um neurotransmissor que está envolvido em vários processos fisiológicos, incluindo regulação do humor, cognição e memória. Estudos anteriores mostraram que os níveis de serotonina estão alterados em pacientes com demência e cirrose. Especificamente, níveis reduzidos de serotonina foram observados em pacientes com doença de Alzheimer, que estão associados a comprometimento cognitivo. Em pacientes com cirrose, alterações na sinalização da serotonina foram implicadas no desenvolvimento de EH.
Embora experimentos científicos anteriores tenham confirmado que o BDNF e a serotonina são moléculas importantes envolvidas no comprometimento cognitivo e na hepatite, os mecanismos moleculares exatos envolvidos ainda não foram identificados até o momento. Portanto, utilizamos vários modelos animais de lesão hepática para analisar a correlação entre lesão hepática avançada e comprometimento cognitivo e para identificar novos mecanismos moleculares envolvendo BDNF/serotonina e o microbioma. Também avaliamos os efeitos terapêuticos da próxima geração de micróbios benéficos, especificamente A. muciniphila, na lesão hepática e no comprometimento cognitivo.
Materiais e métodos
Estudo humano
Comparação dos parâmetros clínicos entre controle saudável, cirrose sem encefalopatia e cirrose com encefalopatia
Características Controle saudável (n = 57) Cirrose sem HE (n = 58) Cirrose com HE (n = 39) Valor de p Idade, anos 61,7 ± 1,0 58,5 ± 1,6 63,2 ± 2,2 0,23 n.s Sexo (masculino [%]) 30 (53) 45 (78) 23 (59) IMC, kg/m2 23,9 ± 0,6 23,5 ± 0,6 23,7 ± 0,5 0,87 n.s ALT, U/L 22,8 ± 1,2a 72,3 ± 30,0b 21,2 ± 2,1a 0,0009 ** AST, U/L 25,0 ± 0,8a 103,5 ± 21,8b 51,7 ± 5,2bc  < 0,0001 ** GGT, U/L 39,9 ± 5,5a 390,5 ± 94,5b 76,1 ± 21,4a  < 0,0001 ** Colesterol total, mg/dL 190,4 ± 5,1a 133,5 ± 6,4b 106,8 ± 6,2c  < 0,0001 ** Creatinina, mg/dL 0,9 ± 0,1 0,8 ± 0,0 1,0 ± 0,1 0,23 n.s Triglicerídeos, mg/dL 154,4 ± 17,4a 134,6 ± 16,6a 74,9 ± 9,0b  < 0,0001 ** HDL, mg/dL 54,6 ± 2,8a 46,4 ± 3,9b 32,1 ± 2,9b  < 0,0001 **
Os dados são apresentados como média ± EPM. Letras sobrescritas diferentes indicam diferença significativa pelo teste não paramétrico de Kruskal–Wallis com teste de comparação múltipla de Dunn. * P < 0,05, ** P < 0,01, n.s., não significativo
HE Encefalopatia hepática, ALT Alanina aminotransferase, AST Aspartato aminotransferase, GGT Gama-glutamil transferase, HDL Lipoproteína de alta densidade colesterol
Um estudo de coorte hospitalar foi conduzido em hospitais universitários para avaliar as características microbianas de pacientes com cirrose (registro do estudo: NCT05786755, NCT04339725 e IRB nº 2016–134). Um total de 154 pacientes (idade > 40 anos e com cirrose hepática alcoólica) foram incluídos neste estudo. Os dados clínicos são apresentados na Tabela 1. A HE foi diagnosticada quando sintomas evidentes dos critérios de West Haven 1–2 estavam presentes. Pacientes sem sintomas evidentes (critério de West Haven 0) foram classificados como sem HE.
Realizamos tomografia computadorizada do cérebro e testes de função neuropsicológica, incluindo atenção, linguagem, visoespacial, memória verbal, memória visual e função frontal/executiva [Bateria de Triagem Neuropsicológica de Seul (SNSB)]. Pacientes com HE apresentaram alterações atróficas no lobo frontal, a principal região para função cognitiva, e disfunção cognitiva nos testes de função neuropsicológica.
No estudo de coorte de cognição comunitária, 80 pacientes foram inscritos para avaliar a função cognitiva entre janeiro de 2020 e dezembro de 2022 (registro do ensaio: cris KCT0008315 e IRB nº 2020–09-005). A função cognitiva foi medida em pacientes com perda de memória em uma determinada área por três anos (Tabela Suplementar 1). Realizamos este estudo de coorte em participantes (idade > 65 anos) que não apresentavam quaisquer doenças psiconeurológicas. Os participantes não tinham problemas na vida diária e a disfunção cognitiva foi diagnosticada por meio do CERAD-K (versão coreana do Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease Assessment Packet, Neuropsychological Assessment Collection).
Os pacientes foram classificados por meio de biópsia hepática e gradiente de pressão venosa hepática (HVPG) utilizando dados de um estudo anterior. Amostras de biópsia hepática foram enviadas a 1 centro e analisadas por 2 hepatopatologistas. O estágio de fibrose foi determinado usando o sistema de estadiamento METAVIR: 0, sem fibrose; 1, tratos portais fibróticos aumentados; 2, aumento dos tratos portais com septos periportais ou porto-portais raros; 3, numerosos septos sem cirrose; e 4, cirrose. Fibrose avançada é definida pelo escore METAVIR 3–4. O HVPG foi medido por um hepatologista. Um cateter balão de 6 French foi colocado na veia hepática direita por meio de punção da veia jugular direita para medição da pressão venosa hepática livre. A pressão venosa hepática enclausurada foi medida inflando o cateter balão na veia hepática direita. Em seguida, o HVPG foi determinado subtraindo a pressão venosa hepática livre da pressão venosa hepática enclausurada. Um HVPG ≥ 5 mmHg indica hipertensão portal, e um valor superior a 10 mmHg indica hipertensão portal clinicamente significativa. Em valores maiores que 12 mm Hg, pode ocorrer hemorragia varicosa. Dividimos os pacientes em três grupos: estágio 1, HVPG ≤ 5; estágio 2, 5 < HVPG ≤ 15; estágio 3, HVPG > 15.
Os protocolos do estudo estavam em conformidade com as diretrizes éticas da Declaração de Helsinque de 1975, conforme refletido na aprovação prévia pelo conselho de revisão institucional para pesquisa em humanos de todos os hospitais participantes. O consentimento informado para participação no estudo foi obtido de cada paciente.
Avaliações basais foram realizadas, incluindo história familiar e história de consumo de álcool, ultrassonografia abdominal ou tomografia computadorizada com contraste, raio-X, eletrocardiografia, hemograma completo, eletrólitos, teste de função hepática, marcadores virais e endoscopia. O sangue foi analisado utilizando metodologias padrão. Os parâmetros bioquímicos séricos incluíram bilirrubina, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), gama glutamil transpeptidase, fosfatase alcalina, albumina, sódio, bilirrubina total, tempo de protrombina, proteína total, glicemia, razão normalizada internacional e níveis de colesterol total. Os níveis de HAV (anti-HAV IgG e IgM), HBV (anti-HBc IgM, HBsAg e anti-HBs), anti-HEV IgG e IgM, HIV e HCV (anti-HCV com/sem HCV-RNA) foram testados em todos os pacientes. Testes de CMV, EBV, HSV, anticorpo antinuclear, anticorpo antimitocondrial e anticorpo anti-músculo liso também foram realizados. Todos os experimentos utilizando amostras de sangue humano seguiram as regulamentações éticas relevantes.

Estudo animal
Camundongos C57BL/6 J machos, livres de patógenos, com cinco semanas de idade, foram obtidos da Doo Yeol Biotech (Seul, República da Coreia). Todos os camundongos foram alojados em gaiolas individuais mantidas a 24 °C ± 2 °C em um ciclo claro/escuro de 12 h. Durante todo o experimento, água e alimento foram fornecidos ad libitum, e os animais foram monitorados diariamente. O delineamento experimental incluiu um período de adaptação para todos os grupos, durante o qual os camundongos foram alimentados com uma dieta normal por uma semana.
Os camundongos foram alimentados com ração normal (Doo Yeol Biotech, Seul, República da Coreia) ou uma dieta contendo 3,5-dietoxicarbonil-1,4-diidrocolidina (DDC, 2018S, Doo Yeol Biotech, Seul, República da Coreia). As combinações de coquetel de antibióticos [ampicilina (100 mg/kg, Sigma-Aldrich, Alemanha), vancomicina (50 mg/kg, Sigma-Aldrich, Alemanha), metronidazol (100 mg/kg, Sigma-Aldrich, Alemanha), neomicina (100 mg/kg, Sigma-Aldrich, Alemanha) e anfotericina B (1 mg/kg, Supelco, Alemanha)] foram utilizadas de acordo com um método previamente relatado. O cloridrato de sarpogrelato, que é um antagonista do 5HTR2A/2B, foi administrado por via oral na dose de 50 mg/kg de peso corporal a cada 2 dias. Após uma semana de adaptação, camundongos C57BL/6 J machos de seis semanas de idade foram submetidos à cirurgia de ligadura do ducto biliar (BDL). Sob anestesia, a cavidade abdominal foi aberta, e o ducto biliar foi ligado duas vezes com seda cirúrgica 5–0. O ducto biliar foi cortado entre as ligaduras. A cirurgia simulada (sham) foi realizada de forma semelhante, exceto que a ligadura e a dissecção do ducto biliar não foram realizadas. A administração oral da cepa bacteriana foi iniciada 1 semana após a cirurgia de BDL. A cepa bacteriana foi administrada por via oral 3 vezes por semana a uma concentração de aproximadamente 10⁹ UFC/ml em 200 μl. Os camundongos foram eventualmente sacrificados por meio de uma overdose de anestesia inalatória com isoflurano (Hana Pharm, Seul, República da Coreia) ao final do período de tratamento.
Os camundongos foram tratados de forma humanitária, e todos os aspectos do estudo animal foram realizados em conformidade com as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade Hallym (Hallym 2022–53).

Análise do microbioma
O DNA metagenômico foi extraído usando um kit QIAamp para fezes (Qiagen, Hilden, Alemanha). Após a primeira amplificação da região V3—V4 do gene bacteriano 16S rRNA, a segunda amplificação foi realizada usando primers universais com código de barras. Um sistema Agencourt AMPure XP (Beckman, EUA) foi utilizado para purificar os amplicons. PicoGreen e PCR quantitativa foram utilizados para quantificar os amplicons purificados. Após o agrupamento dos amplicons com código de barras, um sequenciador MiSeq na plataforma Illumina (CJ bioscience Inc., República da Coreia) foi usado para o sequenciamento de acordo com as especificações do fabricante. A plataforma de Perfil Taxonômico Microbiano baseada em 16S do EzBioCloud Apps (CJ bioscience Inc., República da Coreia) foi utilizada para o perfil do microbioma. Após o perfil taxonômico de cada amostra, uma análise comparativa das amostras foi realizada em comparação com o banco de dados EzBioCloud. O banco de dados 16S rRNA (DB ver. PKSSU4.0) da CJ bioscience foi usado para a atribuição taxonômica das leituras. A seleção de OTUs foi realizada com UCLUST e CDHIT utilizando um ponto de corte de similaridade de 97%. A beta-diversidade, que inclui agrupamento por PCoA e UPGMA, foi exibida no analisador MTP comparativo.

Consulte os dados suplementares para detalhes sobre outros materiais e métodos.

Resultados
A. muciniphila é drasticamente reduzida no microbioma fecal de indivíduos humanos com doenças associadas à disfunção cognitiva
O estudo incluiu 97 pacientes diagnosticados com cirrose hepática (sem HE, n = 58; com HE, n = 39) e 57 controles saudáveis. Além disso, 48 indivíduos com comprometimento cognitivo (pontuação no Mini-Exame do Estado Mental [MMSE]-KC ≤ 24) e 32 controles saudáveis (pontuação no MMSE-KC ≥ 25) classificados por um exame da pontuação do MMSE foram incluídos. A Tabela 1 e a Tabela S1 apresentam as características detalhadas de cada grupo, incluindo perfis clínicos, metabólicos e bioquímicos. Pacientes cirróticos com HE apresentaram níveis mais baixos de ALT (P = 0,0009) (Fig. Suplementar 1A), AST (P < 0,0001) (Fig. Suplementar 1A), gama-glutamil transferase (P < 0,0001), colesterol total (P < 0,0001) e triglicerídeos (P < 0,0001) do que pacientes cirróticos sem HE. Não foram observadas diferenças nos perfis bioquímicos sanguíneos entre os grupos de teste classificados usando o MMSE.
Pacientes cirróticos com encefalopatia hepática e pacientes com comprometimento cognitivo apresentaram diminuição da abundância fecal bacteriana de Akkermansia muciniphila, que também foi identificada em modelos animais. a Resumo de táxons no nível de filos bacterianos obtido por sequenciamento de 16S rDNA de amostras fecais. b Diversidade alfa microbiana Chao1 no contexto das classificações de progressão da doença. **P < 0,01; teste de soma de postos de Wilcoxon. c Abundâncias relativas de espécies com representações significativamente diferentes em grupos humanos. Os dados representam as médias ± EPM; **P < 0,01; ANOVA de uma via. d Abundância relativa no nível de filos bacterianos obtida por sequenciamento de 16S rDNA de amostras fecais. e Diversidade alfa microbiana em pacientes com comprometimento cognitivo. f Abundâncias relativas de A. muciniphila no grupo controle saudável e no grupo com comprometimento cognitivo. Os dados representam as médias ± EPM; *P < 0,05, teste t não pareado. g Coeficientes de correlação de Pearson, valores de p e relações lineares da abundância relativa (%) de A. muciniphila e o escore MMSE-KC. h Esquema da intervenção com dieta DDC (vermelho) durante as 3 semanas de 4 semanas do modelo animal de lesão hepática induzida por DDC. i Abundância relativa de filo, família e A. muciniphila em camundongos controle e camundongos com dieta DDC. AKK, Akkermansia muciniphila; AKKp, Akkermansia muciniphila pasteurizada. Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 3; *P < 0,05; teste t não pareado
Analisamos dados de sequenciamento do gene 16S rRNA para comparar a distribuição das proporções microbianas de acordo com a presença ou ausência de doença. As proporções de táxons dominantes nos níveis de filo (Fig. 1A) e família são mostradas (Fig. Suplementar 1B). Diferenças significativas nas proporções gerais foram observadas entre o grupo controle saudável e o grupo cirrótico. Confirmamos que a abundância de Bacteroidetes diminuiu (P < 0,0001); inversamente, a abundância de Proteobacteria (P < 0,0001) e Actinobacteria (P = 0,033) aumentou nas amostras fecais do grupo cirrose com ou sem HE (Fig. 1A). Além disso, no nível de família, Rumunococcaceae (P < 0,0001), Lachnospiraceae (P = 0,0007) e Prevotellaceae (P < 0,0001) foram esgotadas, mas os níveis de Enterococcaceae (P = 0,052) e Lactobacillaceae (P = 0,0065) estavam elevados (Fig. Suplementar 1A). A diversidade alfa foi determinada com base nos índices Chao1, ACE e Shannon (Fig. 1B e Fig. Suplementar 1C). Em comparação com o grupo controle saudável, todos os grupos cirróticos apresentaram diminuições significativas (P < 0,01) na riqueza de espécies (Chao1 e ACE) e nos índices de diversidade (Shannon). Em termos de diferenças entre os grupos cirróticos com e sem HE, foi observada uma diminuição nos índices de diversidade do em pacientes cirróticos com HE (Chao1, P = 0,0014; ACE, P = 0,0009; Shannon, P = 0,025). Confirmamos a abundância de táxons específicos de acordo com diferenças em doenças hepáticas (Fig. 1C). Ruminococcaceae (P < 0,0001) e Lachnospiraceae (P < 0,0001) foram significativamente diminuídas nas amostras fecais do grupo de pacientes cirróticos. Além disso, também analisamos quais espécies variavam por grupo de pacientes, e uma cepa específica na microbiota intestinal foi A. muciniphila (P = 0,0039).

Realizamos uma análise de sequenciamento do gene 16S rRNA de amostras fecais de pacientes com comprometimento cognitivo para compreender os sintomas de comprometimento cognitivo em pacientes cirróticos. Nenhuma diferença significativa na diversidade alfa ou nas proporções de táxons nos níveis de filo e família foi detectada entre os grupos controle saudável e comprometimento cognitivo (Fig. 1D e E, Fig. Suplementar 1D e 1E). Curiosamente, observamos que a abundância de A. muciniphila foi reduzida (P = 0,032) no grupo de pacientes com comprometimento cognitivo, mas não no grupo controle saudável, o que foi consistente com os resultados de sequenciamento de 16S rRNA das amostras fecais dos pacientes cirróticos (Fig. 1F). Portanto, uma correlação positiva (R = 0,015; P = 0,09) foi observada entre a abundância de A. muciniphila e o escore MMSE-KC, que é um critério para comprometimento cognitivo (Fig. 1G). Na análise de tamanho do efeito da discriminação linear (LEfSe) realizada para confirmar diferenças na composição da comunidade bacteriana entre os grupos, diferenças em A. muciniphila de acordo com a doença foram comumente identificadas em ambos os modelos (Fig. Suplementar 1G).
Para demonstrar a ligação entre os fenômenos da doença hepática humana e a disbiose intestinal, investigamos modelos animais de doença hepática em camundongos que receberam 3,5-dietoxicarbonil-1,4-diidrocolidina (DDC) por via oral (Fig. 1H). Um desequilíbrio do microbioma intestinal foi observado ao nível de filo e família, e para espécies específicas, a abundância de A. muciniphila diminuiu (P = 0,07) com a progressão do dano hepático através do consumo da dieta DDC (Fig. 1I). Esses resultados indicam que a abundância de A. muciniphila no intestino está provavelmente relacionada ao comprometimento cognitivo e à progressão da lesão hepática, podendo ser um fator importante. Curiosamente, em um modelo animal de administração oral de DDC que mimetiza a doença hepática humana, sintomas cirróticos e comprometimento cognitivo semelhantes foram observados. Além disso, uma avaliação histológica do tecido hepático usando coloração H&E revelou que a hepatite estava significativamente aumentada (P = 0,018) no grupo da dieta DDC. (Fig. Suplementar 3A e 3B). Notavelmente, detectamos morte neuronal no hipocampo associada ao comprometimento cognitivo em modelos animais de lesão hepatocelular induzida por DDC usando coloração IHC (Fig. Suplementar 3C e 3D). Detectamos danos na camada nervosa entérica com o anticorpo PGP 9.5, que cora células neuronais entéricas (Fig. Suplementar 3E e 3F). Além disso, déficits cognitivos devido à morte neuronal hipocampal foram observados no grupo da dieta DDC (Fig. Suplementar 3G). Através desses resultados, estabelecemos com sucesso um modelo animal de doença hepática e identificamos a depleção de A. muciniphila, consistente com as anormalidades neuropsiquiátricas observadas em pacientes humanos.
Efeitos protetores de A. muciniphila na inflamação intestinal e lesão hepatocelular em um modelo animal de dieta DDC
Administração oral de A. muciniphila alivia lesão hepática e protege a barreira intestinal em um modelo de camundongo. a Níveis plasmáticos de ALT e bilirrubina total. Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 4; **P < 0,01, *P < 0,05; ANOVA de uma via. b, c Avaliação histológica da lesão hepática com imagens representativas de cortes hepáticos corados com H&E e tricrômico de Masson. Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 3; **P < 0,01, *P < 0,05; ANOVA de uma via. Barra de escala, 200 μm. d, e Coloração TUNEL no fígado de camundongo. Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 3; **P < 0,01; ANOVA de uma via. Barra de escala, 50 μm. f Expressão de mRNA hepático de genes hepáticos (Col1a, Tgfβ, Timp1 e α-sma). Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 4; **P < 0,01, *P < 0,05; ANOVA de uma via. g Avaliação histológica da cripta do cólon com imagens representativas de cortes do cólon corados com H&E. Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 3; **P < 0,01, *P < 0,05; ANOVA de uma via. Barra de escala, 200 μm. h Caracterização da disfunção do trato gastrointestinal medida pelo comprimento do cólon. Os dados representam as médias ± EPM; n = 3; *P < 0,05; ANOVA de uma via. i Coloração imuno-histoquímica do NFκB fosforilado no cólon do camundongo. Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 3; ****P < 0,0001; ANOVA de uma via. Barra de escala, 200 μm. j Expressão de mRNA no cólon de genes relacionados a junções oclusivas (Zo-1, Ocludina). Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 4; **P < 0,01, *P < 0,05; ANOVA de uma via. k Nível plasmático de FD4 (dextrano isotiocianato de fluoresceína 4) do ensaio de permeabilidade intestinal in vivo. Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 4; **P < 0,01; ANOVA de uma via.
Administramos A. muciniphila viva ou pasteurizada a camundongos C57BL/6 alimentados com dietas DDC por 8 semanas para investigar o efeito protetor de A. muciniphila no dano hepático (Figura Suplementar 4A). Em seguida, verificamos os níveis plasmáticos de ALT e bilirrubina total nos camundongos, que consequentemente diminuíram nos grupos tratados com DDC + A. muciniphila e DDC + A. muciniphila pasteurizada em comparação ao grupo DDC (Fig. 2A). O efeito de A. muciniphila em aliviar a lesão hepática foi confirmado pela coloração H&E e tricrômico de Masson (Fig. 2B e C). Adicionalmente, um aumento na apoptose no modelo DDC foi observado usando coloração TUNEL, confirmando o efeito do tratamento com A. muciniphila ou A. muciniphila pasteurizada na diminuição da apoptose (Fig. 2D e E). A expressão de mRNA de genes hepáticos (Col1a1, Tgfβ, Timp1 e α-sma) também foi regulada negativamente nos grupos tratados com DDC + A. muciniphila e DDC + A. muciniphila pasteurizada em comparação ao grupo tratado apenas com DDC (Fig. 2F). O efeito protetor de A. muciniphila no dano à camada nervosa entérica foi confirmado pela coloração H&E (Fig. 2G).
Também medimos o encurtamento do comprimento do cólon, que é uma medida de inflamação intestinal, e os sintomas de encurtamento foram atenuados tanto nos grupos tratados com DDC + A. muciniphila quanto nos tratados com DDC + A. muciniphila pasteurizada (Fig. 2H). Além disso, o nível do fator nuclear kappa B fosforilado (pNF-kB), que é um marcador de doenças inflamatórias crônicas, no cólon dos camundongos foi medido por coloração IHC, e foi significativamente reduzido em ambos os grupos tratados com DDC + A. muciniphila e DDC + A. muciniphila pasteurizada (Fig. 2I). A expressão de mRNA da citocina pró-inflamatória Tnfα foi regulada negativamente no plasma. Adicionalmente, uma diminuição significativa (P < 0,05) na concentração de TNFα foi detectada em amostras de lisado de tecido hepático (Fig. Suplementar 4B).
Medimos os níveis de expressão de mRNA das proteínas de junção apertada Zo-1 e Ocludina no tecido do cólon de camundongos para avaliar se A. muciniphila previne o vazamento intestinal. Os resultados mostraram que a administração de DDC levou a uma diminuição na expressão de mRNA das proteínas de junção apertada Zo-1 e Ocludina no tecido colônico, que foi restaurada pela administração de A. muciniphila (Fig. 2J). O isotiocianato de fluoresceína-dextrana 4 kDa (FD4) foi aplicado na mucosa intestinal e rastreado sistemicamente no plasma para quantificar o vazamento intestinal, e A. muciniphila reduziu a translocação sistêmica de FD4 (Fig. 2K). Também medimos as concentrações plasmáticas de lipopolissacarídeo (LPS)/proteína de ligação a lipopolissacarídeo (LBP) e descobrimos que a administração de A. muciniphila reduziu (P ≤ 0,05) as concentrações de endotoxina plasmática (Fig. Suplementar 4C).
Além disso, modelos animais de doença hepática foram criados por meio de cirurgia de ligadura do ducto biliar (BDL) para determinar a eficácia de A. muciniphila em vários modelos animais de lesão hepática (Fig. Suplementar 5A). Administramos A. muciniphila ao modelo de cirurgia BDL, que causa lesão hepatocelular e apoptose de células hepáticas, e subsequentemente atenuou a lesão hepática (Fig. Suplementar 5B). Da mesma forma, os níveis de expressão de mRNA dos genes hepáticos (Col1a1, Timp1 e α-sma) foram menores nos camundongos que receberam A. muciniphila em comparação com aqueles do grupo apenas com cirurgia BDL (Fig. Suplementar 5C). Por outro lado, o nível de expressão de mRNA não se alterou.
Redução da inflamação intestinal e da morte de células neuronais entéricas por A. muciniphila em um modelo animal de dieta DDC
Deficiência de serotonina e ativação de mecanismos neuroinflamatórios no eixo intestino-cérebro de um modelo animal de doença hepática e morte de células neuronais atenuadas pela administração de A. muciniphila.
a, b Imuno-histoquímica de 5-HT no cólon de camundongos. Análise quantitativa de células positivas para 5-HT. Os dados representam a média ± EPM; dados representativos de 3 amostras; ****P < 0,0001; N.S. = não significativo, ANOVA de uma via. Barra de escala, 100 μm.
c Imunofluorescência de anti-5-HT/anti-Iba-1 no cólon de camundongos e os sinais fluorescentes foram quantificados (d) Imunofluorescência de anti-Iba-1/anti-PGP9.5 no cólon de camundongos e os sinais fluorescentes foram quantificados (e) Barra de escala, 10 μm. Os dados representam a média ± EPM; dados representativos de 3 amostras; ****P < 0,0001; N.S. = não significativo, ANOVA de uma via.
f Barra de escala, 10 μm. Os dados representam a média ± EPM; dados representativos de 3 amostras; ****P < 0,0001; N.S. = não significativo, ANOVA de uma via.
g, h O efeito terapêutico dos grupos tratados com AKK ou AKK pasteurizada (AKKp) no nervo vago de camundongos foi analisado por imuno-histoquímica. Barra de escala, 20 μm. Os dados representam a média ± EPM; dados representativos de 3 amostras; ****P < 0,0001; N.S. = não significativo, ANOVA de uma via.
Analisamos o nível de serotonina em tecidos intestinais por meio de coloração IHC utilizando anticorpos específicos para serotonina, a fim de identificar morte de neurônios entéricos e inflamação intestinal em um modelo animal de doença hepática gerado pela administração oral de DDC. Observamos uma diminuição significativa na expressão de 5-HT (5-hidroxitriptamina) no sistema nervoso entérico (SNE) no grupo tratado com DDC em comparação ao grupo controle com ração padrão. No entanto, no grupo tratado com A. muciniphila e A. muciniphila pasteurizada, observamos aumento na expressão de 5-HT. Também validamos a melhora no vazamento intestinal por meio da análise estrutural de seções de tecido do cólon com base no isolamento da camada nervosa entérica (Fig. 3A e B). Para avaliar se o DDC regula a expressão de Iba-1, PGP 9.5 (marcador neural entérico) e 5-HT no cólon, realizamos coimunofluorescência para 5-HT/Iba-1 ou Iba-1/PGP9.5. No grupo de tratamento com DDC, a quantidade de 5-HT diminuiu e a expressão de Iba-1, que indica micróglia ativada, aumentou em comparação ao grupo controle, mas a resposta inflamatória foi significativamente melhorada no grupo tratado com A. muciniphila ou A. muciniphila pasteurizada em combinação com DDC (Fig. 3C). O gráfico que quantifica os resultados abaixo da imagem representativa confirma essa descoberta (Fig. 3E). Além disso, o aumento na expressão de Iba-1 foi acompanhado por uma diminuição na expressão de PGP9.5 no grupo tratado com DDC, e um aumento na expressão de PGP9.5 foi observado no grupo tratado com A. muciniphila ou A. muciniphila pasteurizada, confirmando que A. muciniphila atenuou o vazamento intestinal e a inflamação (Fig. 3D e F). Notavelmente, a coloração imuno-histoquímica do nervo vago com um anticorpo específico para 5-HT revelou alta expressão de 5-HT nos grupos de tratamento com A. muciniphila e A. muciniphila pasteurizada. Esse resultado fornece evidência direta de que A. muciniphila regula especificamente a expressão em interneurônios serotoninérgicos (Fig. 3G e H).
Morte de neurônios hipocampais com comprometimento cognitivo em modelos animais de doença hepática
Tanto o BDNF quanto a 5-HT são reduzidos no hipocampo do grupo tratado apenas com DDC, enquanto aumentam no grupo tratado com A. muciniphila. a, b, c Análise de co-imunofluorescência com anti-5-HT/anti-MAP2 na região CA1 do hipocampo de camundongos e os sinais fluorescentes (a, b) foram quantificados (c). Barra de escala, 100 μm. Os dados representam a média ± EPM; dados representativos de 3 amostras; ****P < 0,0001; N.S. = não significativo, ANOVA de uma via. d, e, f, g Co-imunofluorescência de anti-BDNF/anti-MAP2 (d, f) e anti-Iba-1/anti-MAP2 (e, g) no hipocampo dos animais acima. Barra de escala, 100 μm. Os dados representam a média ± EPM; dados representativos de 3 amostras; ****P < 0,0001; N.S. = não significativo, ANOVA de uma via. h Análise de Western blot de lisados de hipocampo dos animais tratados apenas com DDC ou com ambos DDC + grupo AKK ou DDC + grupo AKKp. i Gráfico do tempo de imobilidade do teste de suspensão pela cauda. Os dados representam a média ± EPM; n ≥ 11; *P < 0,05, **P < 0,01; N.S. = não significativo, teste t não pareado. j Testes de comprometimento cognitivo do teste do objeto novo e teste do labirinto aquático (k) foram realizados. Os dados representam a média ± EPM; n ≥ 4; *P < 0,05, **P < 0,01; N.S. = não significativo, teste t não pareado.

Medimos os níveis de serotonina e a expressão do marcador neuronal proteína associada a microtúbulos-2 (MAP2) na região do hipocampo para determinar a importância do eixo intestino-fígado-cérebro em modelos animais de doença hepática. Surpreendentemente, a expressão de serotonina e MAP2 foi significativamente reduzida no grupo que recebeu DDC por via oral em comparação ao grupo controle. Além disso, a diminuição induzida por DDC na expressão de serotonina e MAP2 foi revertida no grupo tratado com A. muciniphila e A. muciniphila pasteurizada (Fig. 4A, B e C). Ademais, para determinar se A. muciniphila também afeta a expressão de dopamina, examinamos a expressão de dopamina na substância negra do cérebro e no intestino e nos gânglios vagais e descobrimos que a expressão de dopamina foi reduzida pelo DDC, mas não foi restaurada por A. muciniphila (Fig. Suplementar 6A, S6B e S6C). O nervo vago transmite sinais neurais moldados pela neurotransmissão periférica e central.
Além disso, os níveis de BDNF, uma molécula que desempenha um papel importante na função cognitiva do cérebro, e de Iba-1, um marcador de micróglia ativada, foram medidos em cada grupo. De forma semelhante aos resultados anteriores, a expressão de BDNF foi reduzida no grupo tratado com DDC (Fig. 4D), e a expressão de Iba-1 foi significativamente aumentada (Fig. 4E). Em contraste, análises quantitativas e qualitativas confirmaram que a expressão de BDNF aumentou e a expressão de Iba-1 diminuiu nos grupos tratados com DDC + A. muciniphila ou DDC + A. muciniphila pasteurizada (Fig. 4F e G). Observações semelhantes foram confirmadas por immunoblotting. Aumento da morte neuronal e depleção de 5-HT foram observados no grupo apenas com DDC, enquanto a perda de neurônios hipocampais e de 5-HT intracelular foi prevenida nos grupos tratados com DDC + A. muciniphila ou DDC + A. muciniphila pasteurizada (Fig. 4H). Também realizamos experimentos comportamentais em animais relacionados à função cognitiva e depressão para determinar os efeitos da morte neuronal no hipocampo e da expressão reduzida de BDNF e serotonina, e descobrimos que o grupo tratado com DDC apresentou depressão e disfunção cognitiva, as quais melhoraram nos grupos tratados com A. muciniphila e A. muciniphila pasteurizada (Fig. 4I, J e K). Além disso, o efeito terapêutico de A. muciniphila também foi confirmado no modelo de cirurgia BDL (Fig. Suplementar 6D e 6E). Essas análises científicas sugerem que o mecanismo inflamatório e a apoptose de neurônios intestinais e cerebrais em modelos animais de doença hepática podem ser regulados por A. muciniphila, que regula a expressão de BDNF e serotonina.
O Sarpogrelato inativa os receptores 5-HT2A/2B no tecido hepático, mas não afeta os receptores 5-HT/5-HT no intestino ou cérebro através do eixo intestino-órgão.
Sarpogrelato é um antagonista dos receptores 5-HT2A e 2B que demonstrou inibir a ação da serotonina no organismo. No fígado, a serotonina é sintetizada e liberada pelas plaquetas e contribui para o desenvolvimento de lesão hepática e hipertensão portal em pacientes com cirrose. Para investigar os mecanismos inflamatórios e a disfunção cognitiva dos neurônios serotoninérgicos cerebrais melhorados pelo aumento da secreção de serotonina por A. muciniphila em combinação com sarpogrelato, tratamos o modelo animal de lesão hepática induzida por DDC com sarpogrelato por 5 semanas (Figura Suplementar 7A). Consequentemente, o efeito do sarpogrelato na atenuação da lesão hepática foi confirmado pela coloração H&E (Figura Suplementar 7B), e a expressão de mRNA de genes hepáticos (Col1a, Tgfβ, Timp1 e α-sma) também foi regulada negativamente nos grupos tratados com DDC + sarpogrelato + A. muciniphila ou DDC + sarpogrelato + A. muciniphila pasteurizada em comparação ao grupo tratado sem sarpogrelato (Figura Suplementar 7C). No entanto, descobrimos que o sarpogrelato não teve efeito sobre os mecanismos inflamatórios e a disfunção cognitiva, ou sobre os neurônios serotoninérgicos no cérebro (Figura Suplementar 8). Esses resultados sugerem a existência de uma conexão do eixo intestino-cérebro mediada pelo gânglio vago e um mecanismo de sobrevivência para neurônios serotoninérgicos na região hipocampal do cérebro que é mediado exclusivamente por neurotransmissores não sanguíneos.
A administração de A. muciniphila alivia a lesão hepática ao suprimir a expressão dos receptores 5-HT2A/2B
A expressão dos receptores 5-HT2A/2B está aumentada no tecido hepático do grupo tratado apenas com DDC, enquanto reduzida no grupo tratado com A. muciniphila. a, b, c, d análise de imunofluorescência de anti-5-HTR2A no tecido hepático de camundongos e os sinais fluorescentes (a, b) foram quantificados (c, d). Barra de escala, 100 μm. Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 3; **P < 0,01, *P < 0,05; ANOVA de uma via. e, f, g, h análise de imunofluorescência de anti-5-HTR2B no tecido hepático dos camundongos acima. Os sinais fluorescentes (e, f) foram quantificados (g, h). Barra de escala, 100 μm. Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 3; ***P < 0,005, **P < 0,01; ANOVA de uma via.
Para investigar se a A. muciniphila alivia a lesão hepática através dos receptores de serotonina, medimos os níveis de expressão de 5-HTR2A/2B no tecido hepático de camundongos (Fig. 5A, C, E e G). A expressão de 5-HTR2A/2B aumentou significativamente no grupo que recebeu DDC por via oral em comparação com o grupo controle. Além disso, o aumento na expressão de 5-HTR2A/2B induzido pelo DDC foi reduzido nos grupos tratados com A. muciniphila e A. muciniphila pasteurizada. A expressão dos receptores foi examinada no tecido hepático de um modelo de camundongo com lesão hepatocelular tratado com sarpogrelato para determinar se o antagonista de 5-HTR2A/2B tem efeito na redução da expressão induzida por A. muciniphila (Fig. 5B, D, F e H). Além disso, confirmamos se os níveis de expressão de 5-HTR2A/2B mudam em experimentos celulares. Quando a linhagem celular de células estreladas hepáticas humanas LX-2 foi tratada com sarpogrelato ou A. muciniphila pasteurizada, os níveis de expressão de 5-HTR2A/2B diminuíram, o que foi consistente com os resultados do modelo animal (Figura Suplementar 7D). Em conjunto, esses resultados sugerem que a administração de A. muciniphila ou A. muciniphila pasteurizada pode alcançar a remissão da lesão hepática ao inibir 5-HTR2A/2B, que contribui para a atividade da lesão hepática ao se ligar à serotonina.
Validação da correlação entre os níveis de BDNF/serotonina e a progressão da doença em indivíduos humanos com fibrose hepática e cirrose
Como a A. muciniphila teve um efeito positivo no eixo intestino-fígado-cérebro através da regulação da serotonina e da recuperação dos níveis de BDNF no cérebro, intestino e fígado no modelo animal de lesão hepática, verificamos os níveis plasmáticos de serotonina no modelo animal, que foram marcadamente reduzidos pelo DDC e recuperados pela A. muciniphila (Figura Suplementar 9A). Adicionalmente, a expressão do mRNA de 5-HT2A/2B no tecido hepático de camundongos foi confirmada (Figura Suplementar 9B). Nenhuma diferença significativa foi observada na expressão do receptor 5-HT2A, mas o nível de expressão do receptor 5-HT2B foi significativamente diminuído pela A. muciniphila pasteurizada.
BDNF/serotonina está associado à progressão da cirrose hepática. a Expressão de mRNA do receptor 5-HT2A e do receptor 5-HT2B, e BDNF em biópsia hepática humana. Análise de Western blot do receptor 5-HT2A e do receptor 5-HTR2B em biópsia hepática humana. Os dados representam as médias ± EPM; n = 10; **P < 0,01, *P < 0,05. ANOVA de uma via. b Concentrações de serotonina e BDNF medidas no sangue portal de pacientes com cirrose hepática. Os dados representam as médias ± EPM; n ≥ 12; **P < 0,01, *P < 0,05. ANOVA de uma via. c Coeficientes de correlação de Pearson, valores de P e relações lineares da concentração de serotonina e BDNF, abundância relativa de A. muciniphila e HVPG. d Coeficientes de correlação de Pearson, valores de p e relações lineares da concentração de serotonina e BDNF, abundância relativa de A. muciniphila e escore de Child–Pugh.
Verificamos as alterações na serotonina e no BDNF de acordo com a exacerbação da cirrose hepática, analisando sangue portal e biópsias hepáticas de indivíduos humanos (Fig. 6). Amostras de biópsia de pacientes com doença hepática confirmaram a expressão de mRNA do receptor 5-HT2A/2B e do BDNF (Fig. 6A). A expressão do receptor 5-HT2A aumentou em pacientes com hepatite estágio 2 em comparação com pacientes com doença hepática gordurosa (estágio 1). No entanto, foi observada uma redução em pacientes no estágio 3 ou em pacientes com fibrose avançada (cirrose). Em contraste, o receptor 5-HT2B foi ativado e seus níveis aumentaram significativamente em pacientes no estágio 3 e em pacientes com cirrose grave. Observações semelhantes foram confirmadas por imunotransferência. A expressão do receptor 5-HT2A aumentou do estágio 1 para o estágio 2 e diminuiu no estágio 3. Além disso, a expressão do receptor 5-HT2B aumentou à medida que o estágio progredia (Fig. 6A). Descobrimos que o BDNF diminui constantemente com a progressão da doença hepática, um padrão consistente com os achados em pacientes com doença hepática e em vários modelos animais de doença hepática (Fig. 6B). O sangue portal hepático que coletamos estava associado à hipertensão portal, um sintoma comum em pacientes com hepatopatia, o que nos permitiu identificar especificamente o aumento da serotonina associado ao aumento das células sanguíneas.
Confirmamos a correlação entre HVPG, serotonina, BDNF e abundância de A. muciniphila e validamos a associação com a cirrose hepática (Fig. 6C). Uma correlação positiva foi observada entre as concentrações de serotonina e o HVPG, enquanto uma correlação negativa foi observada com as concentrações de BDNF. Além disso, foi observada uma correlação negativa entre o HVPG e a abundância relativa de A. muciniphila, a qual foi confirmada como tendo um efeito positivo no fígado e na função cognitiva em modelos animais. Esses resultados foram os mesmos mesmo quando o grupo de pacientes foi dividido com base no escore de Child-Pugh (Fig. 6D). Portanto, os resultados atuais sugerem que o BDNF é outra molécula importante, além da serotonina, na progressão da doença hepática humana e na cirrose.
Discussão
Observamos uma diminuição na abundância de Lachnospiraceae e Ruminococcaceae e uma alteração na diversidade alfa na microbiota intestinal de pacientes com cirrose hepática, conforme relatado anteriormente, mas nenhuma alteração significativa foi observada no microbioma intestinal de indivíduos com comprometimento cognitivo simples. Curiosamente, encontramos uma depleção comum de A. muciniphila em indivíduos com cirrose e comprometimento cognitivo. Vários estudos relataram efeitos preventivos e protetores contra o comprometimento cognitivo que ocorre em transtornos neuropsiquiátricos por meio da suplementação com A. muciniphila. A disfunção cognitiva causada pela encefalopatia hepática, uma complicação importante da cirrose hepática, se manifesta pela ruptura do eixo intestino-fígado-cérebro, e levantamos a hipótese de que a depleção de A. muciniphila está fortemente correlacionada com a doença hepática e a função cognitiva.
Antes da validação em modelos animais, um plano para induzir doença hepática por meio da administração de uma dieta DDC foi estabelecido e avaliado para imitar o estado de comprometimento cognitivo causado por lesão hepática. Considerando o efeito sobre a microbiota intestinal, a lesão hepática foi induzida por dieta em vez de medicamentos, e a ocorrência de distúrbios no eixo intestino-fígado-cérebro e uma diminuição na abundância de A. muciniphila foram confirmadas para indicar sua adequação como modelo animal. Em vários estudos, a avaliação e a eficácia de A. muciniphila no tratamento de doenças metabólicas e diabetes foram verificadas, e o efeito da pasteurização foi confirmado. A pasteurização pode ser eficaz no hospedeiro, pois pode aumentar a acessibilidade de certos compostos bacterianos que têm um efeito positivo. Curiosamente, nos experimentos animais, a lesão de hepatócitos induzida por lesão biliar foi efetivamente inibida pelo tratamento com A. muciniphila pasteurizada. Surpreendentemente, a serotonina (5-HT), que está associada à função cognitiva, foi detectada no plexo entérico e no nervo vago em um modelo de camundongo de lesão hepatocelular induzida por DDC. Embora vários outros neurotransmissores também tenham sido depletados, a serotonina foi o único neurotransmissor cujos níveis foram restaurados pela reintrodução de A. muciniphila. O mecanismo pelo qual 90% da serotonina é sintetizada pelas células enterocromafins do intestino (incluindo células enteroendócrinas do tipo neuropódio), bem como pelos neurônios serotoninérgicos entéricos no intestino. Essa via vagal destaca uma comunicação ativa intestino-fígado-cérebro. O mesmo efeito foi observado no modelo animal de lesão hepática induzida por cirurgia de BDL.

Em particular, a redução nos níveis de Tnfα no plasma foi maior após o tratamento com A. muciniphila pasteurizada, sugerindo que a inflamação causada pelos compostos bacterianos foi reduzida. Uma investigação mais aprofundada do mecanismo molecular detalhado pelo qual a pasteurização e os compostos bacterianos produzidos pela pasteurização aliviam a lesão hepática é necessária.

Estudos anteriores mostraram que a serotonina e a sinalização do receptor de serotonina estão correlacionadas com a doença hepática. A esteatose hepática pode ser melhorada pela redução da sinalização hepática de 5-HTR2A. Além disso, a estimulação de 5-HTR2B nas células estreladas hepáticas ativadas desempenha um papel importante na direção do equilíbrio entre regeneração celular e fibrose, e o antagonismo de 5-HTR2B atenua a fibrose. No geral, o sistema de sinalização da serotonina no fígado desempenha um papel importante na lesão hepática e na regeneração celular e, consequentemente, sua modulação pode ser utilizada como uma abordagem terapêutica. No entanto, o modo de ação desse sistema de sinalização da serotonina e a identificação de fatores reguladores precisam de confirmação adicional no futuro.
Verificamos que a administração de A. muciniphila poderia atuar como um desses moduladores. A. muciniphila antagonizou a expressão de 5-HTR2A/2B no fígado e aliviou a lesão hepática. A expressão do mRNA no tecido hepático não refletiu a expressão exata, mas a avaliação histológica através da coloração por imunofluorescência confirmou uma tendência de diminuição da expressão desses receptores.

Além disso, em biópsias hepáticas coletadas de pacientes com doença hepática, a expressão de 5-HTR2A estava elevada em pacientes com hepatite e diminuída em pacientes com cirrose. Considerando que 5-HTR2A contribui para a esteatose hepática, confirmamos que 5-HTR2A é ativado até o estágio de hepatite, após o qual sua atividade diminui à medida que o fígado entra em cirrose, e então a fibrose é ativada através do aumento da expressão de 5-HTR2B. Consistentemente com a expressão dos receptores de serotonina, os níveis de serotonina na veia porta aumentam com a progressão da cirrose. A importância da serotonina na patogênese da hipertensão portal foi destacada em estudos anteriores e está fortemente ligada à encefalopatia portal sistêmica reversível. Além disso, confirmamos que o nível da molécula BDNF, que está ligada ao comprometimento cognitivo comumente encontrado em pacientes cirróticos, estava significativamente reduzido em pacientes com cirrose e hepatite.

Em relação à relação causal entre o comprometimento cognitivo cerebral induzido por lesão hepática e A. muciniphila, até o momento, nenhum estudo mostrou essa associação causal com fortes evidências. Poucos relatos provaram indiretamente a relação entre o comprometimento cognitivo cerebral induzido por lesão hepática e A. muciniphila. Em pacientes com cirrose sarcopênica, uma proporção diminuída de A. muciniphila está correlacionada com desfechos desfavoráveis. Além disso, A. muciniphila foi associada à diminuição da neuroinflamação em camundongos colonizados após transplante de microbiota fecal de humanos com cirrose. Da mesma forma, Verrucomicrobiaceae, à qual A. muciniphila pertence, foi correlacionada com melhora cognitiva e redução da inflamação após transplante de microbiota fecal. Em nosso estudo, mostramos pela primeira vez o efeito terapêutico de A. muciniphila na disfunção cognitiva e fibrose hepática e verificamos esse efeito através de experimentos animais e análises de tecido humano.

Metabólitos derivados da microbiota foram relatados como reguladores-chave de várias doenças. A. muciniphila também está associada ao controle de doenças através de metabólitos. Em nosso estudo, a administração de A. muciniphila recuperou os níveis de citocinas pró-inflamatórias, endotoxina (LPS e LBP), função cognitiva associada à serotonina e lesão hepática, sugerindo que A. muciniphila atua como uma pedra angular na regulação do eixo intestino-fígado-cérebro.
Além disso, após administração oral de A. muciniphila em um modelo animal de lesão hepática, a análise de RNA do tecido hepático revelou aumento da expressão de várias moléculas que desempenham papéis importantes na neuroplasticidade, sendo o BDNF identificado como a molécula-chave. Essa proteína é uma molécula sobreposta que foi identificada em pacientes com encefalopatia hepática e está associada a doença hepática em humanos e animais. Em conjunto, a identificação da regulação das moléculas de serotonina e BDNF por A. muciniphila sugere uma nova farmacologia molecular para identificar os mecanismos da terapia microbiana. No geral, sugerimos que A. muciniphila pode ser benéfica para pacientes com doença hepática e comprometimento cognitivo.

Informações Suplementares

Abreviaturas
A. muciniphila
Akkermansia muciniphila
BDNF
Fator neurotrófico derivado do cérebro
LPS
Lipopolissacarídeo
LBP
Proteína de ligação ao lipopolissacarídeo
BDL
Ligadura do ducto biliar
HVPG
Gradiente de pressão venosa hepática
HE
Encefalopatia hepática
ENS
Sistema neuronal entérico
ALT
Alanina aminotransferase
AST
Aspartato aminotransferase
GGT
Gama-glutamil transferase
5-HT
5-Hidroxitriptamina
5-HTT
Transportador de serotonina (SERT)
DDC
3,5-Dietoxicarbonil-1,4-diidrocolidina
TH
Tirosina hidroxilase
MAP2
Proteína associada a microtúbulos-2

Nota do Editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Eun Ji Kang, Min-Gi Cha, Goo-Hyun Kwon, Sung-Min Won, Eun Hee Ahn e Ki Tae Suk contribuíram igualmente para este trabalho.

Histórico de alterações
10/17/2025
O artigo original foi atualizado: a Figura 4 e o arquivo suplementar foram atualizados.

Histórico de alterações
11/4/2025
Uma correção a este artigo foi publicada: 10.1186/s40168-025-02247-y

Contribuições dos autores
K.T.S., E.H.A. e S.M.W. desenvolveram a justificativa e desenharam os experimentos, analisaram os dados e escreveram o manuscrito. E.J.K., M.G.C. e G.H.K. realizaram a maioria dos experimentos e análise de dados. E.H.A. e E.J.K. realizaram estudos em experimentos comportamentais em animais e análise de dados do eixo cérebro-intestino. M.G.C., G.H.K., S.H.H. e S.J.Y. forneceram assistência técnica e análise de dados do eixo fígado-cérebro. S.K.L., M.E.A. e K.T.S. auxiliaram na análise e interpretação de dados de pacientes humanos com manuseio crítico de amostras de pacientes humanos.

Financiamento
Esta pesquisa foi apoiada pela National Research Foundation of Korea (NRF) concedida pelo governo da Coreia (MSIT) (No. 2022R1C1C1006166) e pelo Hallym University Research Fund, 2021 (HRF-202103-009) a E.H.A. Esta pesquisa foi apoiada pelo Hallym University Research Fund, pelo Basic Science Research Program através da NRF financiada pelo Ministry of Education, Science and Technology (NRF-2020R1A6A1A03043026), Korea Institute for Advancement of Technology (P0020622).

Disponibilidade de dados e materiais
Os autores declaram que todos os dados que apoiam os resultados deste estudo estão disponíveis no artigo e em seus arquivos de informações complementares ou podem ser solicitados ao autor correspondente.
Declarações
Aprovação ética e consentimento para participação
Os protocolos do estudo estavam em conformidade com as diretrizes éticas da Declaração de Helsinque de 1975, conforme refletido na aprovação a priori pelo conselho de revisão institucional para pesquisa em seres humanos de todos os hospitais participantes. O consentimento informado para participação no estudo foi obtido de cada paciente.
Consentimento para publicação
Não aplicável.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Referências
Encefalopatia Hepática na Cirrose: Patologia e Fisiopatologia
Amônia - um inimigo persistente - O que a avaliação do metabolismo da amônia em todo o corpo pode nos ensinar sobre cirrose e terapias para tratar a encefalopatia hepática
Diretrizes de prática clínica da KASL para cirrose hepática: Varizes, encefalopatia hepática e complicações relacionadas
Falência hepática aguda sobre crônica na cirrose
Efeitos do Álcool no Cérebro na Cirrose: Além da Encefalopatia Hepática
Tratamento com rifaximina na encefalopatia hepática
Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., uma bactéria degradadora de mucina intestinal humana
Integridade intestinal e Akkermansia muciniphila, um membro degradador de mucina da microbiota intestinal presente em lactentes, adultos e idosos
Bactérias mucolíticas com prevalência aumentada na mucosa da DII aumentam a utilização in vitro de mucina por outras bactérias
O efeito do consumo moderado de álcool na doença hepática gordurosa não alcoólica
A recuperação da depleção de Akkermansia muciniphila induzida por etanol melhora a doença hepática alcoólica
Suplementação com Akkermansia muciniphila em voluntários humanos com sobrepeso e obesos: um estudo exploratório de prova de conceito
Modulação da sinalização/metabolismo da serotonina por Akkermansia muciniphila e suas vesículas extracelulares através do eixo intestino-cérebro em camundongos
Efeito de Akkermansia muciniphila, Faecalibacterium prausnitzii e suas vesículas extracelulares no sistema serotoninérgico em células epiteliais intestinais
Mecanismos da doença: patogênese da doença de Crohn e colite ulcerativa
Pacientes com doença de Alzheimer (DA) e Comprometimento Cognitivo Leve (CCL) são caracterizados por níveis séricos aumentados de BDNF
A repressão de BDNF e Netrina-1 por C/EBPbeta no intestino desencadeia patologias da doença de Parkinson, associadas a constipação e disfunções motoras
O papel das bactérias na patogênese da doença inflamatória intestinal
Antagonistas do receptor CB1 para o tratamento da dependência de nicotina
Fisiopatologia da encefalopatia hepática: um novo olhar sobre a amônia
Manejo conservador da síndrome serotoninérgica grave com coma, mioclonia e reflexo cruzado extensor complicado por encefalopatia hepática
O uso clínico das medidas de HVPG na doença hepática crônica
Podemos confiar nas mudanças na HVPG em pacientes com cirrose?
A depleção do microbioma induzida por antibióticos altera a homeostase metabólica ao afetar a sinalização intestinal e o metabolismo do cólon
Pesquisa e agrupamento ordens de magnitude mais rápidos que o BLAST
Efeitos antioxidantes do ginsenosídeo Re em cardiomiócitos
Iniciação da doença de Parkinson do intestino ao cérebro pela delta-secretase
O aumento de Helicobacter hepaticus desencadeia degeneração dopaminérgica e distúrbios motores em camundongos com doença de Parkinson
Níveis de serotonina no plasma e nas plaquetas em pacientes com cirrose hepática
Sarpogrelato, um antagonista seletivo do receptor serotoninérgico 5-HT2A, inibe o espasmo da artéria coronária induzido por serotonina em um modelo suíno
Medição do gradiente venoso-portal hepático (HVPG): pérolas e armadilhas
A suplementação com Akkermansia muciniphila previne o comprometimento cognitivo em camundongos privados de sono ao modular a fagocitose de sinapses pela micróglia
Efeitos protetores de Akkermansia muciniphila sobre déficits cognitivos e patologia amiloide em um modelo murino de doença de Alzheimer
A microbiota fecal é superior à saliva na distinção entre cirrose e encefalopatia hepática usando aprendizado de máquina
Akkermansia muciniphila pasteurizada aumenta o gasto energético total e a excreção fecal de energia em camundongos obesos induzidos por dieta
Akkermansia muciniphila pasteurizada protege contra o ganho de massa gorda, mas não contra a perda óssea
A interleucina-33 facilita a regeneração hepática através do eixo intestino-fígado envolvendo serotonina
Choi W, Namkung J, Hwang I, Kim H, Lim A, Park HJ, et al. A serotonina sinaliza através de um eixo intestino-fígado para regular a esteatose hepática. Nat Commun. 2018;9(1):4824.
Estimulando a regeneração de tecidos saudáveis ao direcionar o receptor 5-HT2B na doença hepática crônica
A modulação do eixo Triptofano Hidroxilase 1/Monoamina Oxidase-A/5-Hidroxitriptamina/Receptor de 5-Hidroxitriptamina 2A/2B/2C regula a proliferação biliar e a fibrose hepática durante a colestase
Efeitos hemodinâmicos de longo prazo da cetanserina, um bloqueador da 5-hidroxitriptamina, em pacientes com hipertensão portal
O conteúdo de serotonina (5-HT) nas plaquetas está diminuído em pacientes com cirrose hepática alcoólica, mas elevado na síndrome de Gilbert
Disbiose intestinal e calprotectina fecal predizem a resposta a inibidores de checkpoint imunológico em pacientes com carcinoma hepatocelular
Caracterização do eixo intestino-fígado-músculo em pacientes cirróticos com sarcopenia
A neuroinflamação na cirrose murina depende do microbioma intestinal e é atenuada pelo transplante fecal
Bajaj JS, Salzman N, Acharya C, Takei H, Kakiyama G, Fagan A, et al. A mudança funcional microbiana está ligada aos resultados clínicos após transplante fecal capsular na cirrose. JCI Insight. 2019;4(24):e133410.
Da microbiota intestinal ao apetite do hospedeiro: metabólitos derivados da microbiota intestinal como reguladores-chave
Akkermansia muciniphila melhora a infecção por Clostridioides difficile em camundongos ao modular o microbioma intestinal e os metabólitos