pmid: "39833898"
title: "Akkermansia muciniphila e seu metabólito ácido propiônico mantêm a divisão mitocondrial neuronal e a homeostase da autofagia durante o processo patológico da doença de Alzheimer via GPR41 e GPR43."
authors: "Wang Z, Wang C, Yuan B, Liu L, Zhang H, Zhu M, Chai H, Peng J, Huang Y, Zhou S, Liu J, Wu L, Wang W"
journal: "Microbiome"
pubdate: "2025 Jan 20"
doi: "10.1186/s40168-024-02001-w"
source: "PMC Full Text"
Akkermansia muciniphila e seu metabólito ácido propiônico mantêm a divisão mitocondrial neuronal e a homeostase da autofagia durante o processo patológico da doença de Alzheimer via GPR41 e GPR43.
Autores
Wang Z, Wang C, Yuan B, Liu L, Zhang H, Zhu M, Chai H, Peng J, Huang Y, Zhou S, Liu J, Wu L, Wang W
Periodico
Microbiome (2025 Jan 20)
Conteudo
Akkermansia muciniphila e seu metabólito ácido propiônico mantêm a homeostase da divisão mitocondrial neuronal e da autofagia durante o processo patológico da doença de Alzheimer via GPR41 e GPR43
Background
A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa (DN) prevalente. Nos últimos anos, múltiplos estudos clínicos e em animais mostraram que a disfunção mitocondrial pode estar envolvida na patogênese da DA. Além disso, os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) produzidos pelo metabolismo da microbiota intestinal têm sido considerados fatores importantes que afetam a homeostase do sistema nervoso central (SNC). Entre os principais mediadores das interações hospedeiro-microrganismo, os ácidos graxos voláteis desempenham um papel crucial. No entanto, a influência e as vias dos microrganismos e seus metabólitos na doença de Alzheimer (DA) permanecem incertas.
Results
Neste estudo, apresentamos diferenças nos níveis de AGCC no sangue e nas fezes e na composição da microbiota entre indivíduos saudáveis e aqueles diagnosticados com DA. Descobrimos que pacientes com DA apresentaram uma diminuição na abundância de Akkermansia muciniphila e uma diminuição no ácido propiônico tanto nas fezes quanto no sangue. Para revelar ainda mais os efeitos e os mecanismos do ácido propiônico na prevenção da DA, exploramos sistematicamente os efeitos da administração de ácido propiônico em camundongos modelo de DA e em células neuronais hipocampais cultivadas. Os resultados mostraram que a suplementação oral de propionato melhorou o comprometimento cognitivo em camundongos com DA. O propionato regulou negativamente a proteína de fissão mitocondrial (DRP1) via receptor acoplado à proteína G 41 (GPR41) e aumentou a mitofagia mediada por PINK1/PARKIN via receptor acoplado à proteína G 43 (GPR43) na fisiopatologia da DA, o que contribui para manter a homeostase mitocondrial tanto in vivo quanto in vitro. A administração de A. muciniphila a camundongos com DA antes do início da doença mostrou melhora na cognição, divisão mitocondrial e mitofagia em camundongos com DA.
Conclusions
Em conjunto, nossos resultados demonstram que A. muciniphila e seu metabólito propionato protegem contra eventos patológicos semelhantes à DA em modelos de camundongos com DA, visando a homeostase mitocondrial, tornando-os candidatos terapêuticos promissores para a prevenção e tratamento da DA.
Video Abstract
Supplementary Information
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1186/s40168-024-02001-w.
Introduction
A doença de Alzheimer (DA) é uma doença degenerativa do sistema nervoso central. Ela representa a principal causa de demência em todo o mundo, afetando mais de 50 milhões de pessoas. Os sintomas da DA incluem perda de memória, déficits cognitivos em áreas como linguagem, pensamento abstrato, orientação e alterações comportamentais, como perda de mobilidade. Duas características neuropatológicas clássicas da DA incluem placas amiloides formadas pela deposição de β-amiloide (Aβ) mal dobrado no cérebro e emaranhados neurofibrilares causados pela hiperfosforilação da proteína Tau. Além disso, a etiologia e a patogênese da DA dependem de vários fatores, incluindo fatores internos, como barreira imunológica e sistema nervoso frágeis, ritmo circadiano perturbado, série de disfunções celulares e organelares, etc., e fatores externos, como dieta e estilo de vida desequilibrados, estresse crônico, a composição da microbiota intestinal, etc. Devido aos mecanismos intrincados que impulsionam sua patogênese e fisiopatologia, tratamentos clínicos eficazes para essa condição permanecem elusivos.
Devido ao seu consumo de altos níveis de energia, o cérebro é altamente vulnerável ao comprometimento do metabolismo energético e ao estresse oxidativo; mesmo pequenas mudanças na transdução de sinais e no metabolismo podem ter um impacto significativo. Por exemplo, moléculas derivadas do intestino, como ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) digeridos a partir de gorduras, podem ser translocados do intestino para o cérebro e modular as funções imunológicas da micróglia, promovendo a deposição de placas de Aβ. Estudos recentes demonstraram que os níveis de AGCCs no líquido cefalorraquidiano podem potencialmente ser usados como biomarcadores de doenças neurodegenerativas. Os AGCCs podem entrar nas mitocôndrias sem a ajuda de transportadores de membrana e, em seguida, ser oxidados pelas enzimas localizadas na matriz mitocondrial. Nesses cenários, é crucial manter um pool saudável e dinâmico de mitocôndrias para garantir a longevidade do cérebro e suas altas demandas energéticas. Como as células cerebrais são pós-mitóticas, elas dependem fortemente da fosforilação oxidativa para a produção de energia. A patologia intracerebral da DA frequentemente leva à morfologia e funções prejudicadas das mitocôndrias neuronais.
A qualidade de uma rede mitocondrial saudável depende da mobilização e distribuição ininterruptas de mitocôndrias para atender às altas demandas energéticas de neurônios de longa vida, indicando que mudanças contínuas na fusão e fissão mitocondrial, e na mitofagia, são indispensáveis. Tanto clinicamente quanto experimentalmente, pesquisadores encontraram alterações na expressão de proteínas associadas à fusão, fissão e mitofagia mitocondrial em resposta ao processo patológico da DA. A proteína de fissão mitocondrial DRP1 é superativada em cérebros de pacientes com DA, na substância branca de camundongos com DA e em oligodendrócitos maduros expostos a peptídeos Aβ tóxicos. A perda de Drp1 afeta o desenvolvimento dendrítico e axonal normal e a mobilidade das mitocôndrias neuronais. Estudos anteriores mostraram que a abundância de DRP1 aumenta com a progressão da DA. Além disso, a inibição de Drp1 em modelos de DA melhorou os déficits cognitivos, o comprometimento da plasticidade sináptica e a deposição de Aβ.
Outra proteína, PINK1/PARKIN, desempenha um papel significativo na mitofagia e regula vários processos de sinalização, incluindo ubiquitinação e fosforilação, essenciais para a remoção de mitocôndrias danificadas. No entanto, a sinalização de PINK1/PARKIN é altamente desregulada em modelos da doença de Alzheimer (DA). Além disso, a superexpressão de PINK1/PARKIN demonstrou melhorar a mitofagia em modelos de DA, o que é benéfico para manter a dinâmica mitocondrial.
A microbiota intestinal é considerada crucial para o desenvolvimento do cérebro humano, fisiologia e metabolismo corporal. Ensaios de transplante de microbiota fecal demonstraram os efeitos terapêuticos de uma microbiota saudável. Localizada no intestino humano, a Akkermansia muciniphila, que serve como um microrganismo produtor de mucina e SCFAs, é essencial para a homeostase intestinal. O ácido propiônico é um dos principais metabólitos da Akkermansia muciniphila.
O presente estudo avaliou os efeitos protetores do ácido propiônico e da Akkermansia muciniphila no modelo de camundongos com DA. Seus impactos na morfologia mitocondrial neuronal, fissão e mitofagia foram examinados tanto in vitro quanto in vivo. Nossas descobertas oferecem novos caminhos no campo da pesquisa mitocondrial em modelos de neurodegeneração, fornecendo uma nova perspectiva sobre o tratamento da DA direcionado à dieta e à intervenção no eixo intestino-cérebro (GBA).
Resultados
Níveis reduzidos de ácido propiônico sérico e fecal em pacientes com DA
Níveis de SCFAs nas fezes e no soro de pacientes com doença de Alzheimer e indivíduos saudáveis. A-F Quantificação das concentrações de SCFAs fecais em indivíduos saudáveis e pacientes com doença de Alzheimer usando análise baseada em GC/MS (média ± EPM, n = 17–19, *P < 0,05 pelo teste t). G-L Quantificação das concentrações de SCFAs séricos em indivíduos saudáveis e pacientes com doença de Alzheimer usando análise baseada em GC/MS (média ± EPM, n = 8–12, *P < 0,05, **P < 0,01 pelo teste t).
Realizamos análise de GC-MS para determinar a quantificação absoluta de seis AGCCs críticos em amostras fecais e séricas obtidas de 19 pacientes com DA e 18 voluntários saudáveis. Nossos achados revelaram que os níveis de ácido propiônico (p < 0.0001) e ácido n-butírico (p < 0.0001) foram substancialmente reduzidos nas amostras fecais dos pacientes com DA em comparação com os controles saudáveis (Fig. 1A e D). Não houve diferenças intergrupos significativas nos níveis fecais de ácidos acético, isobutírico, isovalérico e n-valérico (Fig. 1B-C e E-F). Além disso, observamos níveis séricos significativamente menores de ácido n-butírico (p < 0.005) e ácido propiônico (p < 0.0002) em pacientes com DA do que em controles saudáveis normais (Fig. 1G e J). Os níveis séricos de ácidos acético, isobutírico, isovalérico e n-valérico não diferiram significativamente entre os dois grupos (Fig. 1H-I e K-L).
O ácido propiônico melhora a disfunção cognitiva em modelo de camundongos com DA
O propionato de sódio melhora a função cognitiva em camundongos modelo de DA.
A Diagrama esquemático do protocolo experimental para a administração de propionato de sódio (400 mmol/L) ou cloreto de sódio na água de beber de camundongos de 3,5 meses de idade por 8 semanas. B Concentrações de ácido propanóico no sangue de camundongos SPF e 5 × FAD tratados com propionato de sódio oral ou cloreto de sódio por 8 semanas (média ± EPM, n = 4, *P < 0.05 por ANOVA de uma via). C Concentrações de ácido propanóico no líquido cefalorraquidiano de camundongos SPF e 5 × FAD tratados com propionato de sódio oral ou cloreto de sódio por 8 semanas (média ± EPM, n = 4–8, **P < 0.01 por ANOVA de uma via). D Latência para encontrar a plataforma oculta no teste do labirinto aquático de Morris após 8 semanas de administração oral diária de SP (média ± EPM, n = 6, *P < 0.05, **P < 0.01 por ANOVA de duas vias). E Trajetórias representativas da distância percorrida no teste do labirinto aquático de Morris no dia 6 para diferentes grupos de tratamento. F–H Resultados do teste do labirinto aquático de Morris no dia 6: número de vezes que cruzou a plataforma alvo; tempo gasto no quadrante onde a plataforma está localizada; distância percorrida no quadrante onde a plataforma está localizada (média ± EPM, n = 6, *P < 0.05, **P < 0.01 por ANOVA de uma via). I Trajetórias representativas das distâncias percorridas por diferentes grupos de tratamento no teste de campo aberto. J Distância percorrida no centro (9 quadrados do meio) como porcentagem da distância total percorrida (média ± EPM, n = 6, *P < 0.05, **P < 0.01 por ANOVA de uma via). K Avaliação da função motora pela velocidade de movimento no campo aberto
Para investigar melhor se o ácido propiônico impacta a progressão da DA, o modelo de camundongos com DA foi alimentado com água potável contendo propionato de sódio (SP) por 8 semanas (Fig. 2A). A intervenção com SP resultou em uma elevação notável nos níveis de ácido propiônico tanto no soro (Fig. 2B) quanto no líquido cefalorraquidiano (Fig. 2C) de camundongos 5×FAD em comparação com seus equivalentes não tratados. Em contraste, os níveis de ácidos acético, isobutírico, butírico, isovalérico e valérico dos camundongos 5×FAD não foram significativamente diferentes em comparação com os controles (Figuras S1A-J). Além disso, o tratamento com SP não afetou o peso corporal, a ingestão diária de alimentos e a ingestão diária de água dos camundongos (Figuras S2A-B). De acordo com os resultados do teste do labirinto aquático de Morris, os camundongos 5×FAD levaram mais tempo para alcançar a plataforma oculta nos dias 3 e 5 e passaram significativamente menos tempo e distância no quadrante alvo em comparação com os camundongos WT (Fig. 2D e G-H), indicando comprometimento das funções de aprendizado e memória nos camundongos 5×FAD. É digno de nota que, em comparação com os camundongos 5×FAD não tratados, os camundongos 5×FAD tratados com SP passaram mais tempo no quadrante alvo (Fig. 2G-H). Assim, esses achados indicaram que o tratamento com SP aumentou a preferência dos camundongos 5×FAD pela localização da plataforma alvo (Fig. 2E), encurtando o atraso para alcançar a plataforma oculta (Fig. 2D). Os resultados do teste de campo aberto mostraram que o tratamento com SP levou a uma redução na área de atividade dos camundongos 5×FAD na região central, a função motora dos camundongos não foi alterada (Fig. 2I-K). Os resultados do teste do labirinto em cruz elevado também demonstraram que o tratamento com SP resultou na redução do tempo de atividade e da distância na região do braço aberto do modelo de camundongos 5×FAD (Figuras S2C-F). O teste de campo aberto e o teste do labirinto aquático de Morris não mostraram diferença substancial na distância total percorrida ou na velocidade de movimento entre os vários grupos de camundongos (Fig. 2F e K-L), indicando função motora normal em todos os grupos experimentais. Em conjunto, os achados indicaram que o tratamento com SP melhorou significativamente o aprendizado espacial e a memória dos camundongos 5×FAD.
O ácido propiônico melhora a função mitocondrial das células HT22
Propionato de sódio protege a função mitocondrial em células HT22. A O efeito protetor do SP (5 mM) em células HT22 tratadas com Aβ foi determinado usando o método CCK-8 (média ± EPM, n = 3, *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 por ANOVA de uma via). O efeito protetor do SP (5 mM) em células HT22 tratadas com Aβ foi determinado pela avaliação de ROS (B), ATP (C) e potencial de membrana mitocondrial (D), respectivamente (média ± EPM, n = 3, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 por ANOVA de uma via). E-J A expressão de proteínas relacionadas à função mitocondrial, como a proteína de fissão mitocondrial Drp1, a proteína de fusão mitocondrial Opr1, a proteína associada a microtúbulos de cadeia leve 3 LC3, o gene de geração mitocondrial PGC1-α, a proteína densa pós-sináptica 95 (PSD-95), a sinaptofisina, foi avaliada por RT-qPCR (média ± EPM, n = 3, **P < 0,01, ***P < 0,001 por ANOVA de uma via). K Imagens representativas baseadas na coloração DAPI (Azul) e Drp1 (Verde). Barra de escala: 200 µm. L-M Expressão dos receptores de propionato GPR41 e GPR43 avaliada por RT-qPCR (média ± EPM, n = 3, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 por ANOVA de duas vias)
Para experimentos in vitro, usamos células HT22 como modelo de neurônio hipocampal. A dose ideal de SP foi avaliada pela viabilidade celular usando o ensaio CCK8 (Figura S3A-C). Em comparação com controles não tratados, observamos proliferação celular significativamente menor (Fig. 3A) e produção de ATP (Fig. 3C) e um acúmulo intracelular significativamente maior de espécies reativas de oxigênio (ROS) (Fig. 3B) em células HT22 tratadas com 40 µM de oligômeros de Aβ. No entanto, o pré-tratamento com 5 mM de SP reverteu significativamente os efeitos induzidos por Aβ (Fig. 3A-C). Também examinamos o potencial de membrana mitocondrial em células tratadas com Aβ após o tratamento com SP usando coloração com MitoTracker. Imagens fluorescentes representativas são mostradas na Fig. 3D, a intervenção com Aβ teve uma tendência a reduzir a intensidade de fluorescência em células HT22, o tratamento com SP resgatou a redução da intensidade de fluorescência do MitoTracker induzida por Aβ. Em conjunto, esses resultados sugerem que o SP diminuiu a toxicidade do Aβ e o dano induzido por estresse oxidativo. Enquanto isso, focamos nos níveis de expressão de genes relacionados à divisão mitocondrial, fusão mitocondrial, mitofagia mitocondrial, produção mitocondrial e plasticidade sináptica (Fig. 3E-K). Descobrimos que o desafio com Aβ induz fissão excessiva mitocondrial e redução na fusão mitocondrial em células HT22, sugerindo que a intervenção visando a homeostase da fissão e fusão mitocondrial pode ser uma abordagem potencial na prevenção da DA. O tratamento com Aβ causou a expressão do mRNA da proteína pós-sináptica de membrana e da sinaptofisina foi reduzida pelo tratamento com Aβ, e isso foi revertido pelo pré-tratamento com propionato. A expressão de GPR41 e GPR43 foi significativamente aumentada pela adição de SP ao meio de cultura celular (Fig. 3L-M). Esses resultados sugerem que o SP melhorou a função mitocondrial, a produção de ATP e a plasticidade sináptica em neurônios hipocampais, o que pode contribuir para a recuperação neuronal da toxicidade induzida por Aβ.
O ácido propiônico melhora a divisão mitocondrial e a mitofagia no hipocampo de camundongos 5 × FAD
O propionato de sódio apoia a melhora da função mitocondrial no hipocampo do modelo de camundongo com DA. A-D Imunoblotagens para a proteína de fissão mitocondrial Drp1, a proteína de mitofagia mitocondrial Pink 1 e Parkin no hipocampo de camundongos de 5,5 meses de idade, com níveis semiquantitativos mostrados nas barras (média ± EPM, n = 3, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; NS, não significativo por ANOVA de uma via). E–G) PCR quantitativo em tempo real do mRNA para Drp1, Pink1 e Parkin no hipocampo de camundongos de 5,5 meses de idade (média ± EPM, n = 3, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 por ANOVA de uma via). H Cortes coronais (7 µm) da região DG do hipocampo de camundongos de 5,5 meses de idade foram corados com anticorpo anti-Drp1 (verde) (dupla coloração com DAPI, azul). Barra de escala: 200 µm. I Cortes coronais (7 µm) da região DG do hipocampo de camundongos de 5,5 meses de idade foram corados com anticorpo anti-Pink 1 (vermelho) e recoloridos com DAPI (azul). Barra de escala: 200 µm. J Imagens de imunofluorescência duplamente marcadas de neurônios na região DG do hipocampo de camundongos mostrando expressão de Parkin (verde), coradas com anticorpo anti-Tomm20 para marcar mitocôndrias (vermelho) e duplamente coradas com DAPI (azul). Barra de escala: 200 µm. K Imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão (MET) de mitocôndrias de camundongos 5 × FAD/5 × FAD + SP e WT/WT + SP (5,5 meses de idade). As barras de escala são 2 µm (visão geral) ou 500 nm (detalhe). L Imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão (MET) de sinapses do tecido hipocampal em camundongos 5 × FAD/5 × FAD + SP e WT/WT + SP (5,5 meses de idade). Barra de escala = 500 nm. M–N Espessura da área densa pós-sináptica e distância entre as fendas sinápticas em diferentes grupos de tratamento (média ± EPM, n = 13 sinapses, n = 10 camundongos, **P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001; NS, não significativo por ANOVA de uma via)
Para elucidar os mecanismos subjacentes à melhora da função mitocondrial após o tratamento com SP, realizamos western blotting e PCR em tempo real para avaliar a expressão de genes relacionados à função mitocondrial. Em comparação com camundongos WT, observamos níveis mais elevados da proteína Drp1 no hipocampo de camundongos 5 × FAD, juntamente com níveis mais baixos de Pink1. No entanto, isso não alterou a expressão da proteína PARKIN envolvida na mitofagia mitocondrial (Fig. 4A-D). Nossos achados demonstraram que o tratamento com SP reduziu parcialmente a expressão do mRNA de Drp1 no hipocampo e aumentou a expressão do mRNA de Pink1 (Fig. 4E-G). Além disso, a análise de imunofluorescência mostrou que o tratamento com SP reduziu a expressão de Drp1 na região do giro denteado (GD) do hipocampo (Fig. 4H) e aumentou a expressão de Pink1 (Fig. 4I), enquanto a expressão da proteína PARKIN permaneceu inalterada. No entanto, as análises de co-localização revelaram que, em comparação com camundongos WT, os camundongos 5 × FAD apresentaram uma redução na co-localização da proteína PARKIN com a proteína da membrana mitocondrial externa TOM20. O tratamento com SP dos camundongos 5 × FAD normalizou a co-localização de PARKIN com TOM20 (Fig. 4J), o que indicou que o tratamento com SP levou ao aumento do recrutamento de PARKIN nas mitocôndrias, melhorando a mitofagia mitocondrial nos neurônios hipocampais. Para investigar melhor o efeito do ácido propiônico na função mitocondrial, em seguida observamos a morfologia mitocondrial usando microscopia eletrônica de transmissão. Encontramos vacuolização mitocondrial significativa e ausência de cristas mitocondriais nas mitocôndrias dos neurônios hipocampais de camundongos 5 × FAD. Em contraste, para os camundongos 5 × FAD tratados com SP, observamos a presença de cristas mitocondriais e agregação do retículo endoplasmático nas mitocôndrias danificadas nos neurônios hipocampais (Fig. 4K). Também descobrimos que o tratamento com SP levou a um aumento significativo na espessura da zona densa pós-sináptica, o que indicou que o SP melhorou a plasticidade sináptica, enquanto não houve diferença significativa entre os grupos nas fendas sinápticas (Fig. 4L-N).
O ácido propiônico melhora a divisão mitocondrial e a mitofagia em células HT22 via GPR41 e GPR43
GPR41 e GPR43 medeiam os efeitos do propionato de sódio em HT22. A-B Imuno-blots da proteína de fissão mitocondrial Drp1, das proteínas de mitofagia mitocondrial Pink1 e Parkin em células HT22 tratadas com SP, Aβ, inibidor de GPR41 (SHB) e inibidor de GPR43 (GLPG0974) antes da pré-proteção com SP e inibidor de ERK antes da pré-proteção com SP, respectivamente. C Histograma dos níveis semiquantitativos de Drp1, ****P < 0,0001 em comparação com o grupo tratado com Aβ em comparação com receptores de células WT (teste ANOVA de uma via) (média ± EPM, n = 3). D-E Histograma do nível quantitativo de Pink1, Parkin, Gráficos mostram média ± EPM, *P < 0,05 (n = 3, ANOVA de uma via). F-G PCR em tempo real a partir do mRNA da proteína de fissão mitocondrial Drp1, do autofagossomo mitocondrial LC3 em células HT22 tratadas com SP, tratadas com Aβ, tratadas com inibidor de GPR41 (SHB) e inibidor de GPR43 (GLPG0974) antes da pré-proteção com SP e tratadas com inibidor de ERK antes da pré-proteção com SP, respectivamente (média ± EPM, n = 3, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 por ANOVA de uma via). H Células HT22 foram transduzidas com três vetores lentivirais expressando short hairpin (sh) direcionados a GPR41 e GPR43, e a eficiência de knockdown foi detectada medindo a expressão de mRNA por RT-PCR. Os dados são média ± EPM (n = 3, ANOVA de duas vias). I-L A proteína de fissão mitocondrial Drp1, as proteínas de mitofagia mitocondrial Pink1 e Parkin foram detectadas por imuno-blotting em células HT22 tratadas com a adição de shGPR41 e shGPR43 antes do tratamento com SP, e os níveis quantitativos são mostrados no histograma (média ± EPM, n = 3, *P < 0,05, **P < 0,01, por ANOVA de uma via). M–N RT-PCR em tempo real foi realizada para detectar a expressão de mRNA de Drp1, LC-3 em células HT22 tratadas com a adição de shGPR41 e shGPR43 antes do tratamento com SP. (média ± EPM, n = 3, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 por ANOVA de uma via). O Imagens de imunofluorescência duplamente marcadas de neurônios hipocampais de células HT22 mostrando expressão de Parkin (verde), marcação de mitocôndrias com anticorpo anti-Tomm20 (vermelho) e dupla coloração com DAPI (azul). Barra de escala: 200 µm. P Imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão (MET) de mitocôndrias sob diferentes condições de tratamento. Barra de escala: 200 µm.
Sabe-se agora que o ácido propiónico atua principalmente por meio da sinalização mediada por receptores acoplados à proteína G, na qual os receptores GPR41 e GPR43 estão criticamente envolvidos. Para investigar mais os mecanismos subjacentes à regulação da função mitocondrial, células HT22 foram tratadas com inibidor de GPR41 (SHB) e inibidor de GPR43 (GLPG0974) ou três lentivírus shRNA para GPR41 e GPR43 (Fig. 5). Nossos resultados de Western blotting e RT-qPCR demonstraram que o SP inibiu a expressão de Drp1 de maneira dependente de GPR41 e aumentou a expressão de Pink1 por meio dos receptores GPR43 (Fig. 5A-N). Os resultados de imunofluorescência revelaram que o receptor GPR43 apresenta propensão a facilitar o acúmulo de PARKIN nas mitocôndrias, aumentando assim a mitofagia (Fig. 5O). Em células HT22 tratadas com Aβ, observamos que as mitocôndrias exibiam uma perda significativa de cristas mitocondriais, um aumento na vacuolização mitocondrial e nenhuma agregação do retículo endoplasmático nas mitocôndrias. Por outro lado, nas células pré-tratadas com ácido propiónico, observamos a presença de cristas mitocondriais e agregação do retículo endoplasmático em mitocôndrias danificadas. Quando o receptor GPR43 foi silenciado, o efeito benéfico do ácido propiónico na mitofagia mitocondrial foi eliminado, e o retículo endoplasmático não se agregou mais nas mitocôndrias danificadas (Fig. 5P).
O SP melhora a mitofagia mitocondrial no hipocampo de camundongos por meio do GRP43 e a divisão mitocondrial por meio do GRP41
GPR41 e GPR43 medeiam os efeitos do propionato de sódio em camundongos 5×FAD. A Diagrama esquemático do protocolo experimental para injeção estereotáxica cerebral de lentivírus GPR41 e GPR43 em camundongos com 2,5 meses de idade e tratamento com propionato de sódio (400 mmol/L) ou cloreto de sódio na água de beber por 8 semanas a partir dos 3,5 meses de idade. B-C O tecido hipocampal dos camundongos foi coletado e a eficiência do silenciamento foi determinada por RT-PCR em tempo real para detectar os níveis de mRNA de GPR41 e GPR43 (média ± EPM, n = 3, *P < 0,05, ***P < 0,001 por ANOVA de uma via). E–G Imunoblot da proteína de fissão mitocondrial Drp1, da proteína de mitofagia mitocondrial Pink1 e Parkin em camundongos com GPR41 e GPR43 silenciados na região DG do hipocampo antes da pré-proteção com SP, e os níveis semiquantitativos são mostrados no gráfico de barras (média ± EPM, n = 3, *P < 0,05, **P < 0,01 por ANOVA de uma via). H Coloração da região DG do hipocampo com anticorpo anti-PINK1 (verde) (dupla marcação com DAPI, azul). Barra de escala: 200 µm. I Imagem de imunofluorescência duplamente marcada da região DG do hipocampo mostrando a expressão de PRKIN (verde), corada com anticorpo anti-TOMM20 para marcar mitocôndrias (vermelho) e dupla marcação com DAPI (azul). Barra de escala: 200 µm. J Imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão (MET) de mitocôndrias no tecido hipocampal de camundongos sob diferentes condições de tratamento. As barras de escala são de 2 µm (visão geral) ou 500 nm (detalhe). K-L Western blot mostrando os níveis proteicos de p-ERK e ERK a partir do tratamento com SP em neurônios hipocampais HT22 após diferentes pontos de tempo correspondentes. A actina é usada como controle interno para a carga proteica (média ± EPM, n = 3, **P < 0,01, ****P < 0,0001 por ANOVA de uma via). (M–N) Western blot mostrando os níveis proteicos de p-ERK e ERK em tecidos do hipocampo de camundongos WT ou 5×FAD tratados com shCtrl, shGPR41 ou shGPR43 (média ± EPM, n = 3, **P < 0,01, ***P < 0,001 por ANOVA de uma via).
Para confirmar ainda mais os mecanismos subjacentes aos efeitos protetores do ácido propiônico no 5×FAD, camundongos 5×FAD com 2,5 meses de idade foram injetados estereotaxicamente com lentivírus shGPR41, shGPR43 ou shControle (vetor vazio) na região DG do hipocampo. Aos 3,5 meses de idade, os camundongos receberam SP por via oral através da água de beber, e aos 5,5 meses de idade, os camundongos foram eutanasiados e as amostras foram coletadas para testes moleculares (Fig. 6A) e análise dos efeitos do knockdown do shRNA (Fig. 6B e C). Os resultados de Western blotting e RT-qPCR mostraram que a expressão de Drp1 no hipocampo foi significativamente maior em camundongos AD em comparação com camundongos WT. Além disso, a expressão de Drp1 no hipocampo foi significativamente menor em camundongos 5×FAD tratados com SP em comparação com camundongos 5×FAD não tratados. No entanto, não houve diferença significativa na expressão de Drp1 entre camundongos 5×FAD não tratados e camundongos 5×FAD tratados com lentivírus shGPR41 e SP (Fig. 6D-E), demonstrando que o efeito benéfico do ácido propiônico na divisão mitocondrial foi mediado pelo receptor GPR41. A expressão de Pink1 no hipocampo foi significativamente menor em camundongos 5×FAD em comparação com camundongos WT. Além disso, a expressão de Pink1 no hipocampo foi significativamente maior nos camundongos 5×FAD tratados com SP em comparação com o grupo 5×FAD. No entanto, não houve diferença significativa na expressão de Pink1 entre camundongos 5×FAD não tratados e camundongos 5×FAD tratados com lentivírus shGPR43 e SP (Fig. 6D, G e H), demonstrando que o efeito benéfico do ácido propiônico na mitofagia mitocondrial foi mediado pelo receptor GPR43. Os resultados da análise de imunofluorescência na região DG do hipocampo dos camundongos foram consistentes com os resultados do Western blotting e RT-qPCR. Mais importante ainda, descobrimos que o tratamento com SP levou a um aumento na região de colocalização de PARKIN e TOM20. Entretanto, para camundongos 5×FAD infectados com lentivírus shGPR43, o tratamento com SP não pôde mais aumentar a região de colocalização de PARKIN e TOM20 (Fig. 6I). Nossas descobertas demonstraram que as mitocôndrias nos neurônios do hipocampo de camundongos 5×FAD exibiram um aumento notável na divisão mitocondrial, falta de cristas mitocondriais, vacuolização das mitocôndrias e nenhuma agregação do retículo endoplasmático. No entanto, em camundongos 5×FAD tratados com SP, cristas mitocondriais puderam ser detectadas nas mitocôndrias dos neurônios do hipocampo. O aparecimento de cristas mitocondriais e a agregação do retículo endoplasmático nas mitocôndrias danificadas indicaram a indução da mitofagia mitocondrial (Fig. 6J). Essas descobertas indicaram que o tratamento com SP melhora a mitofagia mitocondrial nos neurônios do hipocampo através da ativação de GPR43 e a divisão mitocondrial no hipocampo em camundongos 5×FAD através da ativação de GPR41.
O SP reduz a expressão de Drp1 e inibe a hiperdivisão mitocondrial neuronal ao suprimir a fosforilação de Erk.
Estudos anteriores mostraram que Erk é um gene regulador a montante de Drp1. No presente estudo, o western blotting revelou que o tratamento com SP em células HT22 levou à inibição significativa da ERK fosforilada (p-ERK) (Fig. 6K e L). Além disso, o tratamento de células HT22 com o inibidor de ERK U0126 levou à regulação negativa de Drp1 (Fig. 5A e C). Os resultados de estudos in vivo mostraram que os níveis de fosforilação de ERK eram significativamente maiores em camundongos 5×FAD do que em camundongos WT e que a administração oral de SP reduziu os níveis de p-ERK na região hipocampal dos camundongos. Não houve diferença nos níveis de fosforilação de ERK quando shGPR41 foi injetado na região do giro denteado do hipocampo de camundongos; no entanto, a injeção de shGPR43 reduziu a expressão de p-ERK (Fig. 6M e N), demonstrando que o SP reduz a expressão de Drp1 ao diminuir a fosforilação de ERK, suprimindo assim a hiperdivisão mitocondrial neuronal.
SP reduz a permeabilidade da barreira hematoencefálica em camundongos com DA
A barreira hematoencefálica está comprometida em indivíduos com DA e em modelos animais transgênicos de DA. Para avaliar melhor o efeito protetor do SP em casos de DA, analisamos a permeabilidade da barreira hematoencefálica em camundongos 5×FAD utilizando Azul de Evans. Nosso estudo revelou que o SP apresentou uma tendência a reduzir a permeabilidade da barreira hematoencefálica em camundongos 5×FAD (Figura S4A). Além disso, estabelecemos modelos in vitro de barreira hematoencefálica em Transwell utilizando células endoteliais microvasculares cerebrais humanas (HBMEC), pericitos vasculares cerebrais humanos (HBVP) e astrócitos humanos (HA1800). Os modelos in vitro de barreira hematoencefálica foram analisados utilizando fluoresceína sódica e TEER. Nossos resultados mostraram que o tratamento com SP poderia potencialmente reverter o comprometimento da barreira hematoencefálica induzido por Aβ (Figuras S4B-C). Os níveis de uma proteína de junção apertada, Ocludina, em HBMEC foram detectados por RT-qPCR. Nossas descobertas mostraram que o tratamento com SP levou ao aumento da regulação do mRNA de ocludina (OCLN) (Figura S4D). Os resultados acima sugerem o potencial do tratamento com SP para melhorar a permeabilidade da barreira hematoencefálica em modelos de DA. No entanto, o tratamento apenas com SP (sem Aβ) reduziu a expressão de mRNA de ocludina.
A microbiota intestinal de pacientes com DA difere da de indivíduos saudáveis.
Sequenciamento do gene 16S rRNA de fezes de indivíduos saudáveis e pacientes com doença de Alzheimer. A Estimador Chao1, riqueza de espécies observada, índice de diversidade de Shannon, índice de Simpson, diversidade filogenética de Faith, índice de uniformidade de Pielou e estimador de cobertura não paramétrico de Good foram usados para medir a diversidade alfa (P = 0,0043, 0,0052, 0,00093, 0,0017 e 0,00042, respectivamente, n = 18–19, **P < 0,01, ***P < 0,001 pelo teste U de Mann–Whitney). B Curvas de rarefação descrevendo a diversidade α. C-D Análise de componentes principais (PCA) e matriz de distância UniFraq ponderada para mapeamento PCoA de comunidades bacterianas baseadas no microbioma em indivíduos saudáveis ou pacientes com doença de Alzheimer. E Gráfico de barras de abundância relativa em nível de filo. F Quantificação absoluta de Akkermansia muciniphila nas fezes de controles saudáveis e pacientes com doença de Alzheimer (n = 18–19, *P < 0,05 pelo teste t).
Alterações na composição da microbiota intestinal têm sido associadas a várias doenças humanas, incluindo a DA. A microbiota intestinal de um indivíduo desempenha um papel vital na manutenção da homeostase metabólica do hospedeiro, e os metabólitos originados da microbiota intestinal também impactam as vias de sinalização envolvidas nas atividades do sistema nervoso central (SNC). Para determinar as diferenças na microbiota intestinal de pacientes com DA e de indivíduos saudáveis, analisamos a composição da microbiota intestinal de 19 pacientes com DA e 18 voluntários saudáveis usando o gene 16S rRNA. Nenhum desses indivíduos havia tomado antibióticos nos últimos dois meses e não apresentava doenças metabólicas ou crônicas importantes. Diferentes índices de diversidade (estimador Chao1, riqueza de espécies observada, índice de diversidade de Shannon, índice de Simpson, diversidade filogenética de Faith, índice de uniformidade de Pielou e estimador de cobertura não paramétrico de Good) foram utilizados para avaliar a diversidade da microbiota intestinal. Descobrimos que, em comparação com indivíduos saudáveis, observamos uma diminuição significativa no estimador Chao1, na riqueza de espécies observada, no índice de diversidade de Shannon, no índice de Simpson e no índice de uniformidade de Pielou dos pacientes com DA (P = 0,0043, 0,0052, 0,00093, 0,0017 e 0,00042, respectivamente; Fig. 7A). A análise de componentes principais (PCA) das comunidades bacterianas baseadas no microbioma e os gráficos PCoA das matrizes de distância UniFraq ponderadas revelaram diferenças significativas na diversidade beta da microbiota intestinal de pacientes com DA em comparação com indivíduos saudáveis (Figs. 7C-D). As curvas de rarefação mostraram ampla cobertura da biodiversidade (Fig. 7B). O histograma de abundância relativa em nível de filo mostra a diferença nas espécies dominantes entre pacientes com DA e controles saudáveis, com os pacientes com DA apresentando mais Proteobactérias (Fig. 7E). A quantificação absoluta dos níveis de Akkermansia muciniphila em pacientes com DA e indivíduos saudáveis revelou que os níveis de Akkermansia muciniphila eram significativamente mais baixos nos pacientes com DA do que nos indivíduos saudáveis (Fig. 7F).
Akkermansia muciniphila protege contra a disfunção cognitiva em camundongos com DA
Efeitos comportamentais da gavagem de Akkermansia muciniphila em camundongos. A Diagrama esquemático de um experimento no qual camundongos foram tratados com Akkermansia muciniphila (2 × 10⁸ UFC/mL) ou solução salina por gavagem em dias alternados durante 8 semanas. B Níveis de ácido propiônico no soro de camundongos após oito semanas de tratamento com gavagem (média ± EPM, n = 6, *P < 0,05, ANOVA de uma via). C Razão de absorbância do homogeneizado de cérebro e sangue periférico medida a 620 nm após 2 h de injeção na veia da cauda de Azul de Evans (0,5% em solução salina) em camundongos após quatro semanas de tratamento com gavagem. D Exemplos de aninhamento dos quatro grupos. E Escores do experimento de aninhamento dos quatro grupos de camundongos (média ± EPM, n = 10, *P < 0,05, **P < 0,01, ANOVA de uma via). F Tempo para detecção de plataformas ocultas no teste do labirinto aquático de Morris após 8 semanas de tratamento com gavagem (média ± EPM, n = 10, *P < 0,05, **P < 0,01, ANOVA de duas vias). G Trajetórias representativas das distâncias percorridas no teste do labirinto aquático de Morris no dia 6 para diferentes grupos de tratamento. H Velocidade de natação durante as tentativas do labirinto aquático de Morris (média ± EPM, teste ANOVA; NS, não significativo; n = 10). I-K Resultados do teste do labirinto aquático de Morris no dia 6: número de vezes que cruzou a plataforma alvo; distância percorrida no quadrante onde a plataforma está localizada; tempo gasto no quadrante onde a plataforma está localizada (média ± EPM, n = 10, *P < 0,05, **P < 0,01, ANOVA de uma via). L Esquema do teste de reconhecimento de novos objetos para os quatro grupos de tratamento. M Em um teste de reconhecimento de novos objetos, tempo de visita dos camundongos aos objetos (média ± EPM, teste ANOVA; NS, não significativo; n = 10). N Número de vezes que os camundongos foram expostos a novos objetos/percentual da exposição total aos objetos (média ± EPM, n = 10, *P < 0,05, ANOVA de uma via).
Nós hipotetizamos que, em comparação com indivíduos saudáveis, pacientes com DA apresentavam menores proporções de Akkermansia muciniphila na flora intestinal, resultando em níveis mais baixos de seu metabólito ácido propiônico e uma falta da capacidade do paciente de resistir à disfunção cognitiva. Para testar essa hipótese, o grupo experimental de camundongos foi suplementado com Akkermansia muciniphila via gavagem oral por 8 semanas a partir dos 3,5 meses de idade, enquanto os camundongos do grupo controle receberam gavagem com soro fisiológico. Ensaios comportamentais foram realizados aos 5,5 meses de idade, seguidos de eutanásia para análise molecular (Fig. 8A). Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos na ingestão de alimentos, ingestão de água, peso corporal e níveis de glicose no sangue (Figuras S5A-C, J). No entanto, observamos um aumento significativo nos níveis de ácido propiônico no grupo experimental (Fig. 8B). As diferenças restantes no conteúdo de ácidos graxos de cadeia curta permaneceram consistentes (Figuras S5E-I), e houve um aumento notável no conteúdo fecal de Akkermansia muciniphila após a gavagem (Figuras S5D). As avaliações comportamentais demonstraram que os camundongos com DA apresentaram pontuações de nidificação notavelmente menores do que os camundongos controle, mas a suplementação com Akkermansia muciniphila melhorou significativamente suas pontuações de nidificação (Fig. 8D-E). No experimento do labirinto aquático, em comparação com os camundongos com DA não tratados, os camundongos com DA tratados com Akkermansia muciniphila passaram mais tempo e percorreram maior distância no quadrante alvo (Fig. 8J-K), cruzaram a plataforma alvo com mais frequência (Fig. 8I), apresentaram preferência pela localização da plataforma alvo (Fig. 8G) e tiveram um atraso menor para alcançar a plataforma oculta (Fig. 8F). No teste de reconhecimento de novo objeto, não encontramos alteração no tempo total gasto visitando objetos novos ou antigos após a suplementação com Akkermansia muciniphila e um aumento na razão entre o número de vezes que os camundongos com DA foram expostos a novos objetos e o número total de vezes que foram expostos a objetos (Fig. 8L-N). Os experimentos acima demonstraram que a suplementação com Akkermansia muciniphila reverteu significativamente a disfunção cognitiva e a perda de memória espacial em camundongos 5×FAD, o que pode ser atribuído ao aumento nos níveis do metabólito ácido propiônico.
Akkermansia muciniphila protege a divisão mitocondrial e a homeostase da mitofagia no hipocampo de camundongos 5×FAD
Efeito da infusão de Akkermansia muciniphila na função mitocondrial em camundongos. A-D Imunotransferências para a proteína de divisão mitocondrial Drp1, proteína mitofágica mitocondrial Pink 1 e Parkin no hipocampo de camundongos de 5,5 meses de idade, com níveis semiquantitativos mostrados nas barras (média ± EPM, n = 3, *P < 0,05, ****P < 0,0001 por ANOVA de uma via). E Cortes coronais (7 µm) da região DG do hipocampo de camundongos de 5,5 meses de idade foram corados com anticorpo anti-Pink 1 (vermelho) e recortados com DAPI (azul). Barra de escala: 200 µm. F Imagens de imunofluorescência duplamente marcadas de neurônios na região DG do hipocampo de camundongos mostrando expressão de Parkin (verde), coradas com anticorpo anti-Tomm20 para marcar mitocôndrias (vermelho), e duplamente coradas com DAPI (azul). Barra de escala: 200 µm. G Imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de mitocôndrias de camundongos 5 × FAD/5 × FAD + Akk e WT/WT + Akk (5,5 meses de idade). As barras de escala são 2 µm (visão geral) ou 500 nm (detalhe). H Imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de sinapses do tecido hipocampal em camundongos 5 × FAD/5 × FAD + SP e WT/WT + SP (5,5 meses de idade). Barra de escala = 500 nm. I-J Espessura da região densa pós-sináptica e distância entre as fendas sinápticas em diferentes grupos de tratamento (média ± EPM, n = 13 sinapses, n = 10 camundongos, ****P < 0,0001 por ANOVA de uma via). K-L Coloração com azul Alciano para medir a espessura da camada de muco interno do cólon. Barra de escala: 20 nm, média ± EPM, ANOVA de uma via (I-J) ou teste t (L); NS, não significativo; n = 10.
Realizamos western blotting para detectar a expressão dos genes relacionados à função mitocondrial. Descobrimos que o tratamento com Akkermansia muciniphila em camundongos reduziu parcialmente a expressão de Drp1 no hipocampo e aumentou a expressão de Pink1, mas não alterou a expressão da proteína mitofágica mitocondrial PARKIN (Fig. 9A-D). Da mesma forma, os resultados de imunofluores
Este estudo revela o mecanismo protetor do ácido propiônico derivado da microbiota contra a doença de Alzheimer em três níveis: em pacientes idosos, em camundongos modelo e em células. Além disso, demonstra pela primeira vez que a pré-intervenção da divisão mitocondrial neuronal e da autofagia mediadas por GPR41 e GPR43 melhora a função cognitiva em camundongos modelo da doença de Alzheimer. Esse efeito foi produzido por uma diminuição na expressão de Drp1 mediada por GPR41 e um aumento na expressão de Pink1 e no movimento de Parkin para as mitocôndrias mediados por GPR43. A novidade do nosso estudo reside em demonstrar que o comprometimento cognitivo em camundongos modelo da doença de Alzheimer pode ser aliviado apenas restaurando a homeostase da dinâmica mitocondrial e a autofagia, sem a necessidade de intervenção direta no peptídeo amiloide ou na fosforilação da tau, embora não possamos descartar efeitos potenciais nas vias amiloide e tau. A Figura 10 resume o mecanismo do ácido propiônico na regulação da homeostase mitocondrial neuronal e enfatiza o papel potencial dos SCFAs derivados da microbiota na prevenção de doenças neurodegenerativas (DNs).
O efeito preventivo dos SCFAs, uma classe de metabólitos da flora intestinal, na DA é bem conhecido. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes ao efeito protetor do ácido propiônico em casos de DA permanecem obscuros. Alguns estudos mostraram que o ácido propiônico pode prevenir a doença de Alzheimer aumentando a gliose, mas há poucos relatos sobre HT22. Além disso, níveis mais altos de ácido propiônico no soro estão positivamente correlacionados com níveis cognitivos mais elevados. Na doença de Parkinson, o conteúdo de ácido propiônico fecal é menor do que em controles saudáveis.
Nosso estudo demonstrou que a administração de ácido propiônico antes do início da doença de Alzheimer (DA) pode melhorar os déficits cognitivos em camundongos e modelos celulares. Além disso, nossos achados sugerem que o SP pode retardar a progressão da DA, parcialmente por meio de modificações mediadas por mitocôndrias nos receptores ativados por SP em células neuronais do hipocampo Estudos anteriores demonstraram que os cérebros post-mortem de pacientes com DA exibiam morfologia e dinâmica mitocondrial prejudicadas, bem como metabolismo energético defeituoso. Outro estudo mostrou que pacientes com DA e modelos de camundongos exibem um desequilíbrio entre fissão e fusão mitocondrial (aumento da fissão e diminuição da fusão). Além disso, a divisão mitocondrial demonstrou ser regulada principalmente pela Drp1.
A atividade de restrição da progressão da DA do ácido propiônico é mediada principalmente por um dos dois receptores de ácidos graxos livres: GPR43 ou GPR41. Neste estudo, nossos resultados mostraram que o tratamento com SP levou à regulação negativa mediada por GPR41 da expressão de Drp1 em neurônios do hipocampo de camundongos.
Estudos recentes revelaram que existem dois tipos de fissão mediada por Drp1 nas mitocôndrias, com divisões na periferia eliminando material danificado em mitocôndrias menores e divisões na região média levando à proliferação de mitocôndrias. No entanto, qual tipo de fissão mitocondrial é mediado pela superexpressão de Drp1 em pacientes com DA permanece desconhecido.
Não usamos Seahorse para avaliar a função mitocondrial no hipocampo de camundongos, mas acreditamos que elucidamos parte do mecanismo do ácido propiônico e da mitofagia por fissão mitocondrial por meio de experimentos comportamentais.
A mitofagia mitocondrial é um processo celular protetor que inibe a formação de ROS. A mitofagia mitocondrial prejudicada é um fator crucial no envelhecimento, especialmente em indivíduos com distúrbios neurodegenerativos, como a doença de Alzheimer (DA). Estudos recentes sugerem que deficiências na mitofagia mitocondrial podem surgir antes do acúmulo de beta-amiloide durante a progressão da DA. A modulação da via da mitofagia mitocondrial tem sido proposta como uma modalidade terapêutica potencial para combater a progressão da DA. A deficiência de PINK1/PARKIN demonstrou exacerbar a disfunção cognitiva em camundongos com DA; no entanto, a superexpressão de proteínas associadas à mitofagia mitocondrial demonstrou melhorar esses fenótipos. No presente estudo, descobrimos que camundongos com DA apresentaram deficiência de Pink1 neuronal, enquanto o tratamento com SP aliviou os níveis de Pink1 em camundongos com DA e células HT22 através do receptor GPR43. Descobrimos que a expressão de Parkin permaneceu inalterada em camundongos com DA e células HT22; no entanto, a PARKIN não conseguiu se translocar para as mitocôndrias para mediar sua função de mitofagia. Estudos anteriores mostraram que o acúmulo da proteína Tau em células de neuroblastoma e modelos criptobactérias leva à inibição da mitofagia mitocondrial pela redução da translocação de Parkin nas mitocôndrias. No presente estudo, descobrimos que a PARKIN não conseguiu recrutar mitocôndrias em camundongos com DA e modelos de células neuronais do hipocampo com hipercarga de β-amiloide. O tratamento com SP desencadeou a agregação de PARKIN nas mitocôndrias através do receptor GPR43. A relação entre a perda da função mitocondrial e a disfunção cognitiva precisa ser investigada mais a fundo. Recentemente, foi sugerido que o dano mitocondrial induzido por ROS pode estar intimamente relacionado à sobrevivência neuronal, e a proteção das mitocôndrias contra o acúmulo de ROS pode ajudar a manter a função mitocondrial normal e a função cognitiva. Também foi indicado que a integridade mitocondrial, a conectividade cortical e a restauração do comportamento cognitivo mediada por antioxidantes tornam o estresse oxidativo um alvo terapêutico potencial para as DNs. Até onde sabemos, este foi o primeiro estudo demonstrando que a manutenção da função mitocondrial dos neurônios hipocampais (homeostase normal de fusão e mitofagia mitocondrial) em pacientes com DA pode ajudar a proteger contra a disfunção cognitiva.
A integridade deficiente da barreira hematoencefálica e o comprometimento da memória e das funções linguísticas estão intimamente associados a DN, como a DA. A microbiota intestinal influencia a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE). Estudos com camundongos livres de germes versus camundongos específicos livres de patógenos destacaram o papel potencial dos AGCC na manutenção da integridade da BHE. Animais livres de germes apresentaram aumento da permeabilidade da BHE e ruptura das junções oclusivas endoteliais cerebrais. Estudos anteriores demonstraram os efeitos protetores benéficos do ácido propiônico, um AGCC, na barreira hematoencefálica, aliviando a inflamação prejudicial e o estímulo oxidativo; no entanto, o efeito protetor do ácido propiônico no dano à barreira hematoencefálica em casos de DA raramente foi relatado. No presente estudo, acreditamos que o ácido propiônico tem potencial para aumentar a integridade da barreira hematoencefálica e a expressão de proteínas de junção oclusiva, cujo mecanismo exato precisa ser investigado mais a fundo.
Até onde sabemos, nosso estudo fornece a primeira visão sobre os efeitos protetores do SP em relação à doença de Alzheimer (DA), demonstrando uma nova abordagem usando metabólitos derivados da microbiota intestinal. Além disso, a redução na produção de AGCC no intestino, seja por mudanças na dieta ou por níveis reduzidos da microbiota intestinal, descobriu-se que leva ao comprometimento da função das células Treg em modelos animais de doenças autoimunes, como esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal e diabetes tipo 1. Em pacientes com esclerose múltipla, postulou-se que o ácido propiônico melhora a função inibitória das células Treg. Na doença de Parkinson, foi demonstrado que os AGCC atuam como neuroprotetores e/ou neuromoduladores por meio da regulação epigenética. Também foi sugerido que o aumento da produção de ácido propiônico microbiano, que pode ativar o FFAR3 nos neurônios intestinais, exerce um efeito protetor contra a progressão da doença de Parkinson. Portanto, os mecanismos subjacentes aos papéis protetores do ácido propiônico derivado da microbiota intestinal na fisiopatologia das DN podem ser complexos. Aqui, identificamos apenas algumas vias potenciais através das quais o ácido propiônico exerce seu papel protetor na DA, e as vias potenciais restantes precisam ser investigadas. A concentração de ácido propiônico usada neste estudo foi superior aos níveis fisiológicos. Estudos anteriores demonstraram que mesmo concentrações mais baixas de ácido propiônico podem melhorar a função mitocondrial e mitigar a neurodegeneração em neurônios. Selecionamos uma concentração mais alta principalmente para compensar a volatilidade do ácido propiônico e garantir exposição consistente ao longo dos experimentos celulares.
Dado o vínculo entre alterações na microbiota intestinal e variações na atividade cerebral, o microbioma intestinal emergiu como uma abordagem terapêutica promissora para a doença de Alzheimer (DA). A modulação da microbiota por meio de diversos métodos, como probióticos, terapia com prebióticos e transplante de microbiota fecal (TMF), demonstrou potencial para aliviar os déficits cognitivos em indivíduos com DA. Vários estudos agora sugerem que o microbioma intestinal ajuda a manter a função cognitiva normal ao regular a imunidade inata e adaptativa, estimular o nervo vago e afetar o sistema nervoso periférico e central por outras abordagens. Muito poucos estudos relataram os efeitos dos SCFAs, metabólitos do microbioma intestinal, na função mitocondrial em neurônios na DA. Ao mesmo tempo, a maioria dos dados disponíveis de estudos com animais se relaciona apenas aos estágios patológicos tardios da DA, e poucos pesquisadores focaram nos estágios iniciais da patogênese da DA. Nossas análises envolvendo intervenções microbianas e de SP em camundongos antes do início da DA revelaram que a modulação da função mitocondrial durante os estágios iniciais do início da DA pode ser uma via terapêutica potencial para melhorar o desfecho de indivíduos que sofrem de doenças neurodegenerativas (DNs).
Usando o sequenciamento do gene 16S rDNA, detectamos diferenças significativas na estrutura, abundância e diversidade do microbioma intestinal de pacientes com DA e indivíduos saudáveis. Além disso, a abundância de Proteobacteria em pacientes com DA foi significativamente maior do que em voluntários saudáveis, o que foi consistente com estudos anteriores. No entanto, estudos recentes propõem que modificações nas proporções de micro-organismos específicos não refletem necessariamente mudanças na estrutura da microbiota intestinal e seus efeitos no hospedeiro. Estudos que focam em proporções relativas de micróbios específicos frequentemente ignoram a possibilidade de que mudanças na abundância microbiana geral por si só possam ser uma causa importante por trás da doença subjacente do hospedeiro, indicando a importância dos níveis absolutos da microbiota.
Os AGCCs são os metabólitos da microbiota intestinal produzidos pela fermentação de carboidratos indigeríveis. A Akkermansia muciniphila é um dos micro-organismos intestinais representativos que produzem ácido propiônico como metabólito. No presente estudo, descobrimos que os níveis absolutos de Akkermansia muciniphila eram significativamente mais baixos em pacientes com DA do que em indivíduos saudáveis. Embora não tenhamos observado diretamente uma correlação entre níveis reduzidos de Akkermansia muciniphila e concentrações mais baixas de ácido propiônico em amostras clínicas, descobrimos em um modelo de camundongo que a administração oral de A. muciniphila levou ao aumento dos níveis de ácido propiônico tanto no soro quanto no líquido cefalorraquidiano. Dada a capacidade de A. muciniphila de produzir ácido propiônico, isso sugere que os níveis elevados de ácido propiônico nos animais modelo foram uma consequência da suplementação com A. muciniphila.
Um estudo anterior relatou que a suplementação com Akkermansia muciniphila retardou as alterações patológicas no cérebro de camundongos APP/PS1 alimentados com dieta rica em gordura e aliviou o déficit de aprendizagem espacial e memória através do manejo dos distúrbios metabólicos. No entanto, nosso estudo não revelou nenhum impacto substancial da suplementação com Akkermansia muciniphila no metabolismo de camundongos 5×FAD alimentados com dieta normal. No entanto, levantou-se a hipótese de que poderia melhorar a disfunção cognitiva através do reparo da função mitocondrial neuronal mediada pelo ácido propiônico. Esses resultados inconsistentes podem ser atribuídos à dieta, à idade dos camundongos e ao ciclo de gavagem com Akkermansia muciniphila. Em conclusão, nosso estudo revelou os efeitos benéficos da suplementação de ácido propiônico e da enterobactéria Akkermansia muciniphila como intervenção precoce em modelos de DA, portanto, visar a disfunção mitocondrial através da microbiota intestinal e seus metabólitos pode abrir uma nova via para a intervenção precoce em doenças neurodegenerativas.
Recrutamos um total de 19 pacientes com exames de PET amiloide positivos para biomarcadores da doença de Alzheimer. Estes incluíram 3 pacientes do sexo masculino e 16 pacientes do sexo feminino. Todos os pacientes foram diagnosticados com doença de Alzheimer provável de acordo com as diretrizes do National Institute on Aging-Alzheimer's Association, e todos os pacientes apresentaram uma pontuação no Mini-Exame do Estado Mental (MEEM) < 14/30 no início do estudo para serem elegíveis para o estudo. Também incluímos 19 controles saudáveis com pontuação no MEEM superior a 26/30, sem sintomas de memória, sem sinais de demência e sem outras doenças significativas. Este grupo foi composto por 2 controles saudáveis do sexo masculino e 17 controles saudáveis do sexo feminino. Os pacientes e voluntários saudáveis normais tinham entre 60 e 95 anos de idade, não haviam tomado antibióticos nos últimos dois meses e não apresentavam doenças metabólicas graves. Amostras de sangue e fezes foram coletadas pela manhã, após jejum noturno. Centrifugar a 4 °C e 3000 rpm por 10 min para obtenção de amostras de soro. Amostras de soro e fezes foram cuidadosamente coletadas em nitrogênio líquido e armazenadas a −80 °C até a análise. Apenas amostras de soro sem hemólise foram selecionadas para teste. Todos forneceram consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinque. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional local.
Camundongos
Modelo de camundongo AD - camundongos 5XFAD do Jackson Laboratory (número 006554). Esses camundongos transgênicos superexpressam tanto a APP humana (695) contendo as mutações FAD da Suécia (K670N, M671L), Flórida (I716V) e Londres (V717I), quanto a PS1 contendo as duas mutações FAD M146L e L286V. A expressão de ambos os transgenes é regulada por elementos neuronais específicos do promotor Thy1 de camundongo. Cruzamos camundongos 5×FAD com camundongos C57BL/6J por mais de 10 gerações. Camundongos controles selvagens (WT) SPF C57BL/6J da mesma ninhada (a mãe da primeira geração foi fornecida pelo YisiExperimental Animal Center, Changchun, China) foram criados no Centro de Animais Experimentais da Universidade de Agricultura e Engenharia de Zhongkai e serviram como controles. Este experimento foi conduzido utilizando camundongos fêmeas. Todos os camundongos foram alojados em grupos (2–5 camundongos por gaiola) em gaiolas ventiladas (Super Mouse 750, Lab Products) em uma faixa de 30–70%, a menos que um ciclo de 12 h claro/12 h escuro (claro às 06:00) fosse especificado, a 21–23 °C e umidade relativa de 45–55%. Nenhum método estatístico foi utilizado para predeterminar os tamanhos amostrais. Todos os experimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Agricultura e Engenharia de Zhongkai. Para os camundongos experimentais, camundongos SPF e 5×FAD foram transferidos e mantidos em gaiolas esterilizadas, alimentados com dieta de roedores PicoLab 5010 autoclavada (LadDiet) e receberam água potável autoclavada. Os camundongos 5×FAD utilizados neste estudo foram submetidos a testes comportamentais com 22 semanas de idade. Os critérios de exclusão incluem peso anormal e comportamento anormal (distúrbio de movimento e distúrbio de natação). Os camundongos SPF utilizados para comparação com os camundongos 5×FAD eram pareados por idade. Todos os experimentos foram realizados sob aprovação do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Agricultura e Engenharia de Zhongkai.
Tratamento com propionato de sódio
Camundongos adultos (14 semanas) foram tratados com propionato de sódio por 8 semanas. No experimento de tratamento com propionato de sódio, os camundongos receberam água potável contendo propionato de sódio (400 mmol/L) ou cloreto de sódio como controle. Trinta e dois camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: grupo controle, grupo controle com propionato de sódio, grupo 5×FAD e grupo 5×FAD + propionato de sódio. Adição de propionato de sódio à água potável em camundongos 5×FAD um mês antes do início da disfunção cognitiva (3,5 meses de idade). Água potável suplementada com propionato de sódio por dois meses. Amostras fecais foram coletadas frescas ao final de cada experimento. Todos os camundongos foram submetidos a testes comportamentais, e a administração de SP foi mantida durante todo o período de testes comportamentais. Os camundongos foram eutanasiados com pentobarbital e fenitoína sódica (Euthasol, 180 mg kg–1, Virbac) e foi realizada punção cardíaca para coleta de amostras de sangue. As amostras de sangue foram mantidas à temperatura ambiente por 1 h para garantir coagulação completa antes da centrifugação a 4 °C e 3000 rpm por 10 min para obtenção de amostras de soro. Tecidos e fezes foram cuidadosamente coletados em nitrogênio líquido e depois armazenados a –80 °C até a análise.
Coleta de líquido cefalorraquidiano
Os camundongos foram anestesiados e posicionados em decúbito ventral no instrumento estereotáxico. Uma incisão sagital foi feita na pele abaixo do occipício. Com o auxílio de um microscópio de dissecção, o tecido subcutâneo e os músculos do pescoço ao longo da linha média foram cuidadosamente separados. Um microretrator foi então utilizado para manter os músculos afastados. Posteriormente, o camundongo foi posicionado de modo que seu corpo formasse um ângulo de 135° com a cabeça fixa. Nesse ângulo, a dura-máter e a medula espinhal estavam visíveis, exibindo uma aparência brilhante distinta, e permitindo a observação das pulsações circulatórias na medula e no espaço adjacente do líquido cefalorraquidiano (LCR). A dura-máter foi penetrada usando um capilar de vidro de 6 cm de comprimento com ponta afilada, medindo 0,5 mm de diâmetro externo. Ao encontrar uma mudança perceptível na resistência durante a inserção do capilar, o LCR começou a fluir para dentro do capilar. Em média, aproximadamente 8 μl de LCR foram coletados de cada amostra. Todas as amostras foram prontamente armazenadas em tubos de polipropileno a –80 °C até o momento da injeção.
As células HT22 (gentilmente cedidas pela Universidade de Jilin) foram cultivadas em DMEM (Gibco, 11.965,118) com 10% de soro fetal bovino (Gibco, 10.091,148) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco, 15.140,122). As células foram mantidas a uma confluência inferior a 80% em 5% de CO2 a 37 °C. Digerir o meio de cultura com 0,25% de tripsina por 30–60 s durante a passagem, após o que as células foram inoculadas com meio DMEM completo. As células foram então inoculadas com meio DMEM completo em frascos de cultura de 25 cm² e incubadas em uma incubadora a 37 °C. A morfologia celular e a cor do meio foram observadas a cada dois dias e o meio foi trocado. As células endoteliais de vasos cerebrais humanos HBMEC, os pericitos de vasos cerebrais humanos HBVP e os astrócitos foram cultivados como acima, e modelos Transwell in vitro da barreira hematoencefálica foram estabelecidos usando as três células mencionadas. Os modelos foram avaliados por medições de resistência elétrica trans-endotelial (TEER) usando um voltímetro epitelial. Aβ25–35 (sintetizado pela Shanghai Sangon Biological Engineering Technology & Services Co) foi diluído em água destilada a uma concentração de 16 mmol/L e mantido a 37 °C por 7 dias para pré-envelhecer o peptídeo. As células foram privadas de soro por 4 h e então pré-tratadas com propionato (5 mM) por 2 h antes da adição de Aβ25–35. RNA ou proteína das células foi extraído após 24 h. Cada experimento foi repetido três vezes. A concentração de ATP nas células HT22 foi detectada por um kit de ensaio (Beyotime, Xangai, China). A medição da concentração de ATP foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Ensaio de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) O nível de ERO foi detectado pelo kit de ensaio (Beyotime, Xangai, China). Quando as células HT22 cresceram até cerca de 70%, as células foram coletadas em tubos EP, incubadas com DCFH-DA por 20 min e lavadas três vezes com DMEM sem soro. A medição do nível de ERO foi realizada seguindo as instruções do fabricante.
Triagem da concentração de tratamento com propionato de sódio
O kit de ensaio de viabilidade celular CCK-8 foi usado para triar a concentração segura de propionato de sódio (C0042, Beyotime Biotechnology, Xangai, China). Quando o crescimento celular atingiu 60% de confluência em uma placa de 96 poços, o meio de cultura celular foi substituído por meio DMEM de alto teor de glicose livre de SBF para um tratamento de 12 h, permitindo que todas as células fossem sincronizadas na mesma fase do ciclo celular. Posteriormente, o meio foi substituído por meio DMEM contendo 10% de SBF para obter concentrações de propionato de sódio de 0–50 mM e 0–10 mM, respectivamente, e incubado por 24 h. O meio foi então substituído por 100 μL de meio fresco contendo 10% de reagente CCK-8 por poço e incubado em uma incubadora de cultura de células a 37 °C por 2 h. A placa de 96 poços foi então removida e a absorbância foi medida a 450 nm usando um leitor de ELISA.
A Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835 foi cultivada a partir de –80 °C de acordo com as diretrizes de cultura da ATCC, triada em ágar BD Brain Heart Infusion (BHI) suplementado com 0,4% de mucina (Sigma) e incubada a 37 °C sob condições anaeróbicas (5% H2, 10% CO2, restante N2), e as A. muciniphila foram ressuspensas em PBS anaeróbico antes da dosagem, e os camundongos foram gavados a uma concentração de 4 × 10^8 UFC/mL (uma vez a cada dois dias).
Interferência de RNA
Interferência de RNA in vivo: Vírus lentos de shRNA-GPR41 (1,93 × 10^9 TU/ml), shRNA-GPR43 (2,60 × 10^9 TU/ml) e shRNA-controle (2,30 × 10^9 TU/ml) foram injetados no giro denteado (DG) do hipocampo de camundongos 5×FAD ou WT (com 2,5 meses de idade) sob anestesia com pentobarbital a 1%. Os camundongos foram colocados em um aparelho estereotáxico, suas cabeças foram raspadas e a pele foi desinfetada. Um pequeno orifício foi perfurado acima do local da injeção. A agulha de microinjeção foi lentamente inserida na área alvo e mantida em repouso por 5 min antes da injeção. De acordo com o atlas estereotáxico do cérebro de camundongo, 0,05 μl de vírus lento foi lentamente injetado na área DG bilateral do hipocampo, em relação às coordenadas do Bregma da seguinte forma: anteroposterior = −1,75 mm do bregma; lateral = ± 1,47 mm; profundidade = 2,45 mm. O tempo de injeção para cada lado foi de 5 min, e a agulha foi mantida no local por 5 min antes de ser lentamente retirada. O grupo sham recebeu injeção de igual quantidade de vírus vazio. Todos os procedimentos foram realizados sob condições estéreis, e a incisão na pele foi tratada com penicilina para fins antibacterianos, e a ferida foi suturada. Os camundongos receberam carprofeno (5 mg/kg) antes e durante a cirurgia, bem como 24 h após a cirurgia para minimizar o desconforto.
Interferência de RNA in vitro: O método de infecção dos vetores de interferência de vírus lento de GPR41 e GPR43 foi realizado de acordo com as instruções da Shanghai Sangon Biotech. Células HT22 foram cultivadas durante a noite em uma placa de seis poços (2 × 10^5 células/poço), infectadas com MOI = 5 e cultivadas por 24 h. Células GFP-positivas foram monitoradas sob um microscópio de fluorescência.
Lentivírus shRNA foram adquiridos da Sangon Biotech.
Testes comportamentais
As medições comportamentais foram realizadas na seguinte ordem: Construção de ninho, Campo aberto, Teste de reconhecimento de novos objetos, Teste do labirinto em cruz elevado, Labirinto aquático de Morris.
Labirinto aquático de Morris
A avaliação comportamental foi realizada conforme descrito anteriormente. Em resumo, os experimentos foram realizados em um tanque de 120 cm de diâmetro e 50 cm de profundidade preenchido com água opacificada mantida a 20 ± 1 °C. O tanque foi equipado com uma plataforma de 10 cm de diâmetro submersa 1 cm abaixo da superfície da água. Pistas espaciais foram colocadas na parede do labirinto aquático. O treinamento consistiu em sessões diárias por 5 dias consecutivos. Camundongos dos grupos WT, WT + SP, 5 × FAD e 5 × FAD + SP foram treinados 4 vezes ao dia. As posições de partida variaram pseudoaleatoriamente entre os 4 pontos cardeais. O intervalo médio entre tentativas foi de 90 min. Camundongos dos grupos WT, WT + Akkermansia muciniphila, 5 × FAD e 5 × FAD + Akkermansia muciniphila foram treinados 1 vez ao dia. A posição de partida está no quadrante oposto ao quadrante onde a plataforma está localizada. Cada tentativa terminou quando o animal alcançou a plataforma. Um tempo limite de 90 s foi utilizado, após o qual os camundongos foram gentilmente guiados até a plataforma. O período de exploração foi: 24 h após o último treinamento, após o qual a plataforma foi removida da piscina. Todos os camundongos foram testados por 60 s. Os animais foram rastreados por vídeo usando Flyde (Guangzhou Feidi Biotechnology, China) e os parâmetros comportamentais (velocidade de natação, distância percorrida, latência, porcentagem de tempo em cada quadrante, porcentagem de distância em cada quadrante) foram calculados automaticamente.
Teste do labirinto em cruz elevado
O teste do labirinto em cruz elevado foi conduzido seguindo procedimentos padrão. O aparato utilizado (EB Instrument) consistiu em dois braços abertos (35 × 5 cm), dois braços fechados (35 × 5 × 15 cm) e uma plataforma central quadrada (5 × 5 cm), posicionada 45 cm acima do solo. Cada camundongo foi colocado na plataforma central, voltado para o mesmo braço aberto, e permitido explorar por um total de 5 min. Durante esse tempo, o número de entradas tanto nos braços abertos quanto nos fechados, bem como a duração passada em cada um, foram registrados. A porcentagem de tempo gasto nos braços abertos foi calculada dividindo o tempo gasto nos braços abertos pelo tempo total.
Teste de campo aberto
O teste foi realizado conforme descrito anteriormente. Cada camundongo foi colocado próximo à borda de uma arena de campo aberto de 35 × 42 cm, que foi segmentada em 25 quadrados, com a área central compreendendo 9 quadrados e o restante formando a periferia. Os movimentos do camundongo foram registrados por 5 min usando uma câmera. As filmagens foram posteriormente analisadas usando o software EthoVision XT 7.0 (Noldus). Entre as tentativas, a arena foi desinfetada com etanol a 75%. Tanto o teste de campo aberto quanto as outras avaliações comportamentais foram conduzidos sob condições de iluminação fraca.
Teste de reconhecimento de objetos novos
Os testes foram realizados conforme descrito anteriormente. Cada tentativa consistiu em duas fases: uma sessão de familiarização e uma sessão de teste. Durante a familiarização, cada camundongo foi colocado em uma arena de teste de 45 × 45 × 30 cm com níveis de luz no centro ajustados para 100 ± 5 lx para minimizar a ansiedade. O camundongo teve 5 min para explorar livremente dois objetos idênticos (5 × 5 × 5 cm) posicionados diagonalmente na arena. Vinte e quatro horas depois, um dos objetos familiares foi substituído por um objeto novo de tamanho similar, mas com cor, forma e textura diferentes. Na sessão de teste, o camundongo novamente teve 5 min para explorar ambos os objetos. Camundongos que mantiveram a memória do objeto familiar tipicamente passaram mais tempo interagindo com o objeto novo. A atividade do camundongo foi rastreada usando o sistema Flyde (Guangzhou Feidi Biotechnology, China), e o tempo de exploração foi registrado quando o focinho do camundongo estava a menos de 2 cm do objeto. O índice de exploração foi calculado como o tempo gasto explorando ambos os objetos em relação ao tempo total da sessão, enquanto o índice de discriminação foi calculado como o tempo gasto explorando o objeto novo em relação à exploração combinada de ambos os objetos durante a sessão de teste.
Construção de ninho
Várias toalhas de papel sem perfume, de tamanho uniforme, foram colocadas na gaiola 1 h antes do início do ritmo noturno. Várias fotos foram tiradas 15 min antes do período de atividade para avaliar o comportamento de nidificação. Os critérios de pontuação (total de 5 pontos) incluem: (1) Toalhas de papel intactas (100%); (2) Toalhas de papel majoritariamente intactas (> 90% intactas); (3) Toalhas de papel majoritariamente rasgadas (< 90%), mas sem local de ninho identificável (plano se houver um ninho); (4) A toalha de papel está rasgada e há ninhos óbvios (> 90%, as toalhas de papel estão dispostas em uma determinada direção e o ninho está plano); (5) Um ninho quase perfeito (o ninho pode circundar completamente o camundongo).
Medições de SCFAs
Os testes foram realizados conforme descrito anteriormente. Para preparar a solução estoque, 0,1250 g de cada um dos ácidos acético, propiônico, isobutírico, n-butírico, isovalérico e n-valérico foram dissolvidos em um balão volumétrico de 100 mL com éter. Para o preparo das amostras, alíquotas de 1 mL, 0,75 mL, 0,5 mL e 0,25 mL da solução estoque foram retiradas e diluídas para 100 mL com éter em balões volumétricos separados. As amostras foram então analisadas e uma curva padrão foi gerada. Para processar as amostras, foram adicionados 2 mL de uma solução aquosa de ácido fosfórico 1:3, seguido de agitação em vórtex por 2 min. Éter (1 mL) foi adicionado para extração, e a mistura foi deixada em repouso por 10 min antes de centrifugar a 4000 rpm por 20 min (em banho de gelo para processamento em baixa temperatura). Um segundo 1 mL de éter foi adicionado, seguido por outra extração de 10 min e centrifugação na mesma velocidade. Os dois extratos foram combinados, concentrados até um volume de 1 mL e submetidos à análise. A quantificação dos AGCC foi realizada utilizando um sistema GCMS ISQ LT (Thermo Scientific, EUA), equipado com autoinjetor e detector de ionização de chama. A separação foi alcançada em uma coluna capilar DB-FFAP (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm). A amostra foi injetada com uma razão de divisão de 60:1. A temperatura do porta-injetor foi ajustada para 250 °C. A temperatura da coluna foi inicialmente mantida a 80 °C por 2 min, depois elevada para 150 °C a uma taxa de 10 °C/min por 2 min, e ainda aumentada para 180 °C a 15 °C/min por 5 min, com um tempo total de corrida de 18 min. Hélio (99,999%) serviu como gás de arraste com uma vazão de 3 mL/min. O MS foi operado no modo de impacto eletrônico a 70 eV, com temperatura da fonte de íons de 230 °C e temperatura da interface de 250 °C. O tempo de retardo do solvente foi de 1 min, e a aquisição de dados foi realizada no modo de monitoramento de íons selecionados com um intervalo de varredura de 0,3 s.
Coleta de amostras de tecido e perfusão
Os camundongos foram profundamente anestesiados (EEG achatado) e mortos (frequência cardíaca e respiração diminuídas para zero) por injeção intraperitoneal de uma mistura de pentobarbital e fenitoína sódica (Euthasol, 180 mg/kg, Virbac). Os tecidos dos camundongos para realização de PCR em tempo real e Western blotting foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido e mantidos a –80 °C antes do uso. Camundongos usados para realizar ensaios de imunofluorescência foram perfundidos com solução salina através do coração e depois perfundidos com paraformaldeído a 4% em tampão fosfato. Os cérebros foram então dissecados em gelo seco, o hipocampo foi removido e incubado em tampão fosfato com sacarose a 30%. Os tecidos foram então colocados em gelo seco e embebidos em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) (Tissue-Tek). Camundongos usados para microscopia eletrônica de transmissão foram perfundidos com uma mistura de tampão (pH 7,35) contendo paraformaldeído a 1,5% e glutaraldeído a 1,5% através do coração, enquanto quadrados de tecido hipocampal de 1 mm × 1 mm × 1 mm foram posteriormente fixados em glutaraldeído a 2,5%.
Coloração com azul alciano
Amostras de cólon armazenadas em metanol foram embebidas em parafina e seccionadas com espessura de 5 μm. As secções foram primeiro desparafinizadas em xileno e reidratadas com água destilada. Em seguida, foram incubadas em solução de azul alciano por 30 min, seguidas de enxágue de 2 min em água corrente. Após enxágue com água destilada, as secções foram desidratadas duas vezes e tratadas com álcool absoluto duas vezes por 3 min cada. Finalmente, as secções foram clarificadas em xileno três vezes por 3 min cada, após o que uma lamínula foi montada.
PCR em tempo real
Sinaptofisina: 5′- CCACTGACCCAGAGAACATTAT −3′ e
5′- CTTGAACACGAACCATAGGTTG-3′;
GPR41: 5′- AGTCGCCTGGTGTGGATACTGAG −3′ e
5′- GCCGAAGCAGACGAAGAAGATGAG-3′;
GPR43: 5′- GCTGACAGGCTTCGGCTTCTAC −3′ e
5′- CAGAGCAGCGATCACTCCATACAG-3′;
PSD-95: 5′- ATGTGCTTCATGTAATTGACGC −3′ e
5′- TTTAACCTTGACCACTCTCGTC-3′;
LC3: 5′- CCACCAAGATCCCAGTGATTAT −3′ e
5′- TGATTATCTTGATGAGCTCGCT-3′.
PGC1α: 5′- GGATATACTTTACGCAGGTCGA −3′ e
5′- CGTCTGAGTTGGTATCTAGGTC-3′.
Opa1: 5′- CTTACATGCAGAATC CTAACGC −3′ e
5′- CCAAGTCTGTAACAATACTGCG −3′.
Fis1: 5′- CCTGGTTCGAAGCAAATACAAT −3′ e
5′- CTTTTCATATTCCTTGAGCCGG-3′.
Drp1: 5′- ACTGATTCAATCCGTGATGAGT −3′ e
5′- GTAACCTATTCAGGGTCCTAGC-3′.
GAPDH: 5′-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3′ e
5′-CCTTCCACAATGCCAAAGTT-3′.
Células cultivadas ou tecido de camundongo foram armazenados em RNAlater (Ambion) ou transferidos diretamente para TRIzol (Invitrogen). O RNA extraído foi quantificado usando Nano Drop e 2000 ng de RNA foram utilizados para preparar o sistema de reação de transcrição reversa em tubos de PCR livres de RNase. A mistura da reação incluiu 5× Tampão HiScript II (4 μL), Transcriptase Reversa HiScript II (Vazyme, R2223) (1 μL) e ddH2O até um volume total de 20 μL. A reação foi realizada usando o seguinte programa: 25 °C por 5 min, 50 °C por 15 min e 85 °C por 2 min, resultando na síntese de cDNA. Para qPCR, a mistura da reação consistiu em 2× PerfectStart Green qPCR Super Mix (10 μL) (TransGen Biotech, AQ601), primer forward (0,4 μL), primer reverse (0,4 μL) e molde (cDNA diluído 10 vezes a partir da RT-PCR acima, 9,2 μL). O programa de amplificação incluiu as seguintes etapas: 94 °C por 30 s, 94 °C por 5 s, 55 °C por 15 s e 72 °C por 10 s (repetido por 40 ciclos da segunda à quarta etapa). Os resultados de expressão gênica são expressos em unidades arbitrárias relativas à expressão do gene de referência gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). As sequências dos primers são as seguintes:
Método de Western blot
Amostras de células cultivadas ou tecidos de camundongos foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e subsequentemente lisadas. Extratos proteicos foram separados em géis de SDS-poliacrilamida a 10%, transferidos para membranas de nitrocelulose e corados com anticorpos anti-Parkin (Abcam, ab77924, diluição 1:2000), anti-Drp1 (Abcam, ab184247, diluição 1:1000), anti-Pink1 (Proteintech, 23,274–1-AP, diluição 1:1000). O anticorpo β-actina (Cell Signaling Technology, 4970, diluição 1:1000) foi usado como controle de carregamento. As membranas foram então detectadas com o anticorpo secundário correspondente (Cell Signaling, 7074, diluição 1:3000) marcado com peroxidase de raiz-forte. As intensidades das bandas foram observadas por quimioluminescência usando o Kit Pierce ECL 2 Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific).
Ensaios de coloração por imunofluorescência
A coloração por imunofluorescência (IF) foi realizada conforme descrito anteriormente. Em resumo, células ou seções de tecido cultivadas em lâminas foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 20 min e tratadas com TritonX-100 a 0,5% por 5 min, bloqueadas com albumina sérica bovina a 1% por 120 min e coradas com anti-Drp1 (Abcam, ab184247, diluição 1:250), anti-Parkin (Abcam, ab77924, diluição 1:250), anti-Pink1 (Proteintech, 23,274–1-AP, diluição 1:250) e anti-TOMM20 (Abcam, ab283317, diluição 1:500), respectivamente. As lâminas foram lavadas e então incubadas com IgG anti-camundongo de cabra Dylight-594 (H + L) (Abbkine) e IgG anti-coelho de cabra Dylight-488 (H + L) (Abbkine). Os núcleos foram corados com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Beyotime).
Sequenciamento e análise do gene 16S rRNA
O teste foi realizado conforme descrito anteriormente. Em resumo, a região hipervariável V4 dos genes 16S rRNA foi amplificada em duplicata. Os produtos resultantes foram purificados usando contas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, CA, EUA) e quantificados usando o Kit Qubit dsDNA HS Assay (Life Technologies, CA, EUA). Adaptadores de sequenciamento Illumina, juntamente com códigos de barras de índice duplo, foram anexados aos amplicons purificados usando uma abordagem de PCR de ciclo limitado com o Kit Nextera XT Index (Illumina, CA, EUA). Amplicons de 96 amostras, incluindo controles, foram combinados em proporções equimolares. As bibliotecas combinadas foram adicionalmente purificadas por extração em gel, seguidas de quantificação usando reagentes Qiagen (Alemanha). O sequenciamento foi conduzido em uma plataforma Illumina MiSeq, empregando leituras pareadas de 300 pb com química v3. Após o sequenciamento, as leituras brutas foram demultiplexadas, pré-processadas, fundidas e filtradas por qualidade usando o pipeline DADA2. As sequências dos iniciadores foram removidas usando um script Python personalizado, e as leituras foram truncadas em 250 pb. As atribuições taxonômicas foram feitas com um banco de dados de referência SILVA modificado. Apenas amostras contendo pelo menos 2.000 leituras foram incluídas nas análises subsequentes. Para validar e enriquecer as classificações taxonômicas, sequências representativas de cada variante de sequência de amplicon foram submetidas a buscas BLAST contra os bancos de dados de proteínas não redundantes e de genes 16S rRNA do NCBI.
Análise de permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE)
A permeabilidade da BHE foi avaliada pelo extravasamento do corante azul de Evans (EB). O corante azul de Evans a 2% (30 mg/kg) foi injetado através da veia caudal e deixado circular por 120 min. Sob anestesia do animal, foram realizadas coleta de sangue cardíaco e perfusão cardíaca com PBS, seguidas da remoção do cérebro. O sangue foi centrifugado a 3500 RPM por 15 min, o sobrenadante foi aspirado, e as amostras de cérebro foram homogeneizadas em formamida. As amostras de cérebro homogeneizadas foram incubadas durante a noite a 55 °C e depois centrifugadas a 12.000 RPM por 45 min. A absorbância do azul de Evans a 620 nm foi medida no sobrenadante e no soro usando um espectrofotômetro (espectrofotômetro UV-Vis GENESYS 10S; Thermo Electron Corporation, Madison, WI).
MitoTracker
Cada frasco de MitoTracker® Red CMXRos contém 50 µg de sólido liofilizado. Para preparar uma solução estoque de 1 mM, esse sólido precisa ser dissolvido em 94,1 µL de DMSO de alta qualidade. A solução estoque de células HT22 foi diluída diretamente no meio de crescimento a uma concentração de 150 nM e incubada por 30 min a 37 °C. Após a incubação, as células são fixadas em metanol gelado a –20 °C por 15 min e depois lavadas três vezes com PBS por 5 min cada. Observar sob um microscópio de fluorescência invertido.
Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)
Para a análise convencional de TEM, as células foram colhidas e lavadas com PBS três vezes, seguidas de duas vezes com tampão CAB 0,1 M, pH 7,2. Em seguida, as células foram tratadas com fixador I (GA 2,5% e PFA 4% em tampão CAB 0,1 M, pH 7,2) à temperatura ambiente (TA) por 2 h. Após lavagem com tampão CAB 0,1 M três vezes (cada vez por 5 min), as células foram incubadas com fixador II (OsO4 1% em tampão CAB 0,1 M pH 7,2, 15 mg/mL de K4[Fe(CN)6]) à TA por 1 h, seguidas de duas lavagens com tampão CAB 0,1 M e três lavagens com água duplamente destilada (ddH2O). Em seguida, as células foram incubadas com acetato de uranila 0,4% a 4 °C por 1 h. Após lavagem extensiva com ddH2O, as células foram desidratadas em uma série graduada de etanol e embebidas em resina Spurr de acordo com as instruções do fabricante. As amostras embebidas foram aparadas e seccionadas com espessura de 70 nm por um ultramicrótomo EMUC7 (Leica, Wetzlar, Alemanha). As secções celulares foram coradas com acetato de uranila 0,4% à TA por 20 min e depois incubadas com solução de citrato de chumbo a 4% por 6 min. Micrografias eletrônicas foram obtidas com um microscópio eletrônico de transmissão Talos F200S (Thermo Fisher Scientific).
Desenho experimental
Nenhum método estatístico foi utilizado para pré-definir o tamanho da amostra. Todos os animais foram aleatoriamente designados para grupos de tratamento usando um gerador de lista aleatória em random.org. As amostras de todos os grupos foram processadas ao mesmo tempo e usando técnicas idênticas. Para todos os experimentos com animais, os grupos foram identificados por número para análises e só foram decodificados após a análise dos dados. O monitoramento dos camundongos foi realizado de forma cega.
Quantificação e análise estatística
Os dados foram expressos como média ± erro padrão das médias. Salvo indicação em contrário, os pontos individuais representam cada camundongo individual. Os dados foram analisados com teste t de amostras independentes ou por ANOVA de uma via / ANOVA de duas vias através do software GraphPad Prism8, conforme pode ser encontrado na legenda das figuras. A ANOVA de uma via utilizou o teste post hoc de Tukey. A correção da ANOVA de duas vias para comparações múltiplas foi realizada usando o método de Holm–Šídák ou o teste post hoc de Tukey, conforme apropriado. A significância é definida como: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.
Informações Suplementares
Abreviaturas
ND
Doença neurodegenerativa
PS1
Presenilina 1
Aβ
Proteína β-amiloide
APP
Proteína precursora amiloide
SP
Propionato de sódio
DRP1
Proteína 1 relacionada à dinamina
SCFAs
Ácidos graxos de cadeia curta
GBA
Eixo intestino-cérebro
PINK1
Proteína quinase
GPR41
Receptor acoplado à proteína G 41
GPR43
Receptor acoplado à proteína G 43
DG
Giro denteado
ERK
Quinases reguladas por sinal extracelular
BBB
Barreira hematoencefálica
HBMEC
Célula endotelial microvascular do cérebro humano
HBVP
Pericitos vasculares do cérebro humano
HA1800
Astrócitos humanos
CNS
Sistema nervoso central
PCA
Análise de componentes principais
MMSE
Mini-Exame do Estado Mental
CSF
Líquido cefalorraquidiano
ROS
Espécies reativas de oxigênio
Nota do Editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Zifan Wang, Cai Wang, Boyu Yuan e Li Liu contribuíram igualmente para este trabalho.
Contribuições dos autores
Wei Wang, Liyong Wu e Juxiong Liu forneceram o conceito inicial e desenharam o estudo. Zifan Wang, Boyu Yuan e Mingqiang Zhu realizaram a maioria dos experimentos, e Cai Wang, Li Liu coletaram os dados clínicos. Zifan Wang, Hongxia Chai, Jie Peng, Yanhua Huang e Shuo Zhou realizaram a análise dos dados e desenharam a figura. Zifan Wang, Haoming Zhang e Wei Wang escreveram o rascunho inicial do manuscrito. Todos os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versão submetida. A correspondência deve ser endereçada a Wei Wang.
Financiamento
Gostaríamos de agradecer à National Natural Science Foundation of China (Programa Geral: 31872442, 32172815) por fornecer apoio financeiro para este experimento.
Disponibilidade de dados
Os dados de sequência que suportam os resultados deste artigo estão disponíveis no National Center of Biotechnology Information (NCBI) sob o número de Bioprojeto PRJNA976899 (amostras SAMN35443212 a SAMN35443247). Todos os resultados de sequenciamento estão incluídos no seguinte link: https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA976899?reviewer=se2e3uo4r9h4g8a7nvo520nvi6.
Declarações
Aprovação ética e consentimento para participação
Pacientes e normais saudáveis deram consentimento informado de acordo com a Declaração de Helsinque. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Xuanwu da Universidade Médica de Capital institucional. Os pacientes ou o público apenas fornecem amostras de sangue e fezes e não estão envolvidos no planejamento, condução, relato ou planos de divulgação dos nossos estudos. Todos os experimentos com animais foram realizados sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Agricultura e Engenharia de Zhongkai.
Consentimento para publicação
Todos os autores aprovaram a submissão.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Referências
Diretrizes profissionais para o diagnóstico e manejo da doença de Alzheimer e doenças relacionadas, HAS (Haute Autorité de Santé) 2008
Demências rapidamente progressivas - etiologias, diagnóstico e manejo
A via da beta-amiloide na doença de Alzheimer
A patologia da tau no tronco encefálico na doença de Alzheimer é caracterizada pelo aumento da tau de três repetições e independente da beta-amiloide
Beta-amiloide e tau — um pas de deux tóxico na doença de Alzheimer
Mecanismo da degeneração neurofibrilar na doença de Alzheimer e a formação de emaranhados
Diretrizes do National Institute on Aging–Alzheimer's Association para a avaliação neuropatológica da doença de Alzheimer
Saúde do sono: regulação recíproca do sono e da imunidade inata
Sono, ritmo circadiano e microbiota intestinal
Dieta e demência de Alzheimer – Abordagem nutricional para modular a inflamação
A barreira hematoencefálica na doença de Alzheimer
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Resgate de energia cerebral: um conceito terapêutico emergente para distúrbios neurodegenerativos do envelhecimento
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O eixo microbiota-microglia em distúrbios do sistema nervoso central
Múltiplos papéis dos ácidos graxos de cadeia curta na doença de Alzheimer
Previsão das taxas relativas de transferência passiva de ácidos graxos de cadeia curta através de membranas lipídicas
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Novo inibidor da ciclofilina D resgata a função mitocondrial e cognitiva na doença de Alzheimer
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Desequilíbrio da fissão e fusão mitocondrial na doença de Alzheimer
Mitocôndrias e Cascatas Mitocondriais na Doença de Alzheimer
Estresse glicolítico oligodendroglial desencadeia ativação do inflamassoma e neuropatologia na doença de Alzheimer
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PINK1 regula a fissão/fusão mitocondrial e a neuroinflamação em modelos de doença de Alzheimer induzida por β-amiloide
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Lactobacillus plantarum PS128 previne a disfunção cognitiva em camundongos com doença de Alzheimer ao modular os níveis de ácido propiônico, a atividade da glicogênio sintase quinase 3 beta e a gliose
Exploração do Eixo Intestino-Cérebro através da Metabolômica Identifica Ácido Propiônico Sérica Associado a Maior Declínio Cognitivo em Idosos
Associação dos Níveis Fecais e Plasmáticos de Ácidos Graxos de Cadeia Curta com a Microbiota Intestinal e a Gravidade Clínica em Pacientes com Doença de Parkinson
Depleção região-específica de mitocôndrias sinápticas nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer
O inibidor da divisão mitocondrial 1 reduz a proteína relacionada à dinamina 1 e a atividade de fissão mitocondrial
A fissão mitocondrial requer DRP1, mas não dinaminas
Interações sistemas microbioma-hospedeiro: efeitos protetores do propionato sobre a barreira hematoencefálica
Assinaturas distintas de fissão preveem degradação ou biogênese mitocondrial
A acidificação defeituosa do autolisossomo em modelos de camundongos da doença de Alzheimer induz acúmulo autofágico de Aβ em neurônios, resultando em placas senis
Alvo da Mitofagia na Doença de Alzheimer
A sinalização PINK1 resgata a patologia amiloide e a disfunção mitocondrial na doença de Alzheimer
A superexpressão de Parkin melhora a potenciação de longa duração hipocampal e a carga de beta-amiloide em um modelo de camundongo da doença de Alzheimer
A tau associada à doença prejudica a mitofagia ao inibir a translocação de Parkin para as mitocôndrias
Relação entre Disfunção Cognitiva e Variabilidade Relacionada à Idade em Marcadores Oxidativos em Mitocôndrias Isoladas de Cérebros de Camundongos Transgênicos para Doença de Alzheimer
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Ruptura da barreira hematoencefálica no hipocampo humano envelhecido
Anormalidades na permeabilidade da barreira hematoencefálica no comprometimento cognitivo vascular
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Os metabólitos microbianos, ácidos graxos de cadeia curta, regulam a homeostase das células Treg do cólon
Interações dieta-microbiota como moderadoras do metabolismo humano
Ácidos Graxos da Dieta Impactam Diretamente a Autoimunidade do Sistema Nervoso Central via Intestino Delgado
Duscha A, et al. O Ácido Propiônico Molda o Curso da Doença de Esclerose Múltipla por um Mecanismo Imunomodulador. Cell 2020;180:1067–1080 e1016.
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O propionato derivado da microbiota intestinal medeia o efeito neuroprotetor da osteocalcina em um modelo de camundongo da doença de Parkinson
O ácido propiônico induz alterações na morfologia e dinâmica mitocondrial em células SH-SY5Y
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Ácido Propiônico e Fasudil como Tratamento Contra a Toxicidade da Rotenona em um Modelo In Vitro da Doença de Parkinson
O transplante de microbiota fecal aliviou a patogênese semelhante à doença de Alzheimer em camundongos transgênicos APP/PS1
Transplante de microbiota intestinal derivada de modelo de camundongo com doença de Alzheimer prejudica a função de memória e a neurogênese em camundongos C57BL/6
Transplante de Microbiota Fecal em Distúrbios Neurológicos
Silva YP, Bernardi A, Frozza RL. O Papel dos Ácidos Graxos de Cadeia Curta da Microbiota Intestinal na Comunicação Intestino-Cérebro. Front Endocrinol (Lausanne) 2020;11:25.
A administração periférica do inibidor solúvel de TNF XPro1595 modifica os perfis de células imunes cerebrais, diminui a carga de placas beta-amiloide e resgata a potenciação de longo prazo prejudicada em camundongos 5xFAD
Astrócitos e Micróglia: Na Saúde e na Doença
Estimulação do nervo vago como uma ferramenta promissora na melhora de distúrbios cognitivos
Microbiota na neuroinflamação e disfunção sináptica: um foco na doença de Alzheimer
Microbiota intestinal e pró/prebióticos na doença de Alzheimer
A microbiota intestinal regula as patologias da doença de Alzheimer e os distúrbios cognitivos via neuroinflamação associada a PUFA
Perfil quantitativo do microbioma relaciona a variação da comunidade microbiana à carga microbiana
Quantificando o viés introduzido pela coleta de amostras em medições relativas e absolutas do microbioma
Análise integrativa do microbioma e metaboloma da superfície mucosa intestinal humana revela inter-relações requintadas
Nicho de degradação de mucina como um motor da composição do microbioma e abundância de Akkermansia muciniphila em um modelo intestinal dinâmico é independente do doador
Ação e função de Akkermansia muciniphila na ecologia do microbioma, saúde e doença
Desenvolvimento de um modelo tridimensional, totalmente humano in vitro da barreira hematoencefálica usando modelos Transwell de mono-, co- e tricultura
Interleucina-2 melhora a patologia amiloide, a falha sináptica e a memória em camundongos com doença de Alzheimer
Haploinsuficiência de Arid1b interrompe o desenvolvimento de interneurônios corticais e o comportamento do camundongo
O selênio medeia a neurogênese adulta induzida por exercício e reverte déficits de aprendizado induzidos por lesão hipocampal e envelhecimento
O Ácido Gálico Alivia a Disfunção Intestinal e Aumenta as Atividades Imunes e Antioxidantes em Filhotes Sob Estresse Ambiental com Base na Análise de Microbioma-Metabolômica
Função microbiana e inflamação genital em mulheres jovens sul-africanas com alto risco de infecção pelo HIV