pmid: "39888270"
title: "Quercetina-Impulsionada Akkermansia Muciniphila Alivia a Obesidade ao Modular o Metabolismo dos Ácidos Biliares através de um ILA/m"
authors: "Liu J, Liu Y, Huang C, He C, Yang T, Ren R, Xin Z, Wang X"
journal: "Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany)"
pubdate: "2025 Mar"
doi: "10.1002/advs.202412865"
source: "PMC Full Text"

Quercetina-Impulsionada Akkermansia Muciniphila Alivia a Obesidade ao Modular o Metabolismo dos Ácidos Biliares através de um ILA/m

Autores

Liu J, Liu Y, Huang C, He C, Yang T, Ren R, Xin Z, Wang X

Periodico

Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) (2025 Mar)

Conteudo

Quercetina-Conduzida Akkermansia Muciniphila Alivia a Obesidade por meio da Modulação do Metabolismo dos Ácidos Biliares via Sinalização ILA/m6A/CYP8B1

Resumo
A saúde global está cada vez mais desafiada pela crescente prevalência da obesidade e suas complicações associadas. A quercetina, um dos flavonoides dietéticos mais importantes, está sendo explorada como uma terapia eficaz para a obesidade, embora seu mecanismo permaneça pouco estudado. Neste estudo, demonstra-se que a intervenção com quercetina reverte significativamente os fenótipos relacionados à obesidade através da remodelação da estrutura geral da microbiota, especialmente aumentando a colonização do comensal intestinal benéfico Akkermansia muciniphila (A. muciniphila). O enriquecimento de A. muciniphila leva à geração de mais ácido indol-3-láctico (ILA) para regular positivamente a expressão da 12α-hidroxilase (CYP8B1) por meio da proteína associada à massa gorda e obesidade (FTO)/ N 6-metiladenosina (m6A)/YTHDF2, facilitando assim a conversão do colesterol em ácido cólico (CA). O CA, por sua vez, suprime drasticamente o acúmulo de lipídios ao ativar o receptor farnesóide X (FXR) no tecido adiposo. Este trabalho introduz um novo alvo terapêutico para abordar a obesidade e amplia o atual entendimento limitado da função mediadora das modificações m6A no metabolismo dos ácidos biliares (AB) influenciado por microrganismos.
A intervenção com quercetina remodela a estrutura geral da microbiota e aumenta significativamente a abundância do comensal intestinal benéfico A. muciniphila. O enriquecimento de A. muciniphila leva à geração de mais ILA para facilitar a conversão do colesterol em CA de maneira coordenada FTO/m6A/CYP8B1, revertendo assim os fenótipos relacionados à obesidade ao ativar o FXR no tecido adiposo.

Introdução
A obesidade e as doenças metabólicas crônicas associadas, que prevaleceram rapidamente em todo o mundo nas últimas décadas, emergiram como um desafio substancial de saúde pública.[ ] Um interesse crescente foi despertado no desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes para melhorar a obesidade e a desregulação metabólica. Como alternativa às abordagens farmacológicas, os polifenóis naturais de plantas estão sendo explorados como uma terapia potencialmente eficaz para a obesidade devido à sua alta eficácia e risco mínimo de efeitos colaterais, apesar dos mecanismos subjacentes pouco compreendidos.
Quercetina (3,3′,4′,5,7‐pentahidroxi‐2‐fenilcromen‐4‐ona),[ ] um flavonoide natural representativo amplamente abundante em vários tipos de ervas e alimentos, apresenta um potencial particular como tratamento para diversas doenças devido às suas propriedades antioxidantes, antiobesidade, antienvelhecimento, anti-inflamatórias, antivirais e antineoplásicas.[ ] Estudos anteriores revelaram que a ação protetora da quercetina envolve o inflamassoma do domínio pirina da família NLR contendo 3 (NLRP3),[ ] fator nuclear kappa B (NF-κB),[ ] via sirtuína 1 (SIRT1)/Akt,[ ] proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), quinase c-Jun N-terminal (JNK), quinase regulada por sinal extracelular (ERK) e muitas outras vias anti-inflamatórias.[ ] É notável que a microbiota intestinal serve como um importante intermediário na regulação da nutrição dietética sobre os processos biológicos do hospedeiro. A quercetina comumente e indiretamente exerce suas funções probióticas através da interação com a microbiota intestinal devido às características complexas da estrutura química.[ ] Porra et al. descobriram que a quercetina mitiga a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) modulando o desequilíbrio da microbiota intestinal.[ ] Tentar explorar a partir da perspectiva dos microrganismos e depois identificar funções precisas de bactérias específicas pode ajudar a melhorar a compreensão mecanística da quercetina.

N6-metiladenosina (m6A) é a modificação de RNA mais prevalente em eucariotos e atua como um elemento crítico no ajuste fino do metabolismo do mRNA, incluindo splicing, exportação, localização, tradução e estabilidade do mRNA.[ ] Evidências extensas mostraram uma forte conexão entre a modificação m6A do mRNA e a patogênese de várias doenças, especialmente a obesidade.[ ] Notavelmente, Akkermansia muciniphila (A. muciniphila) e Lactobacillus plantarum alteram modificações específicas de m6A no ceco e no fígado.[ ] Fusobacterium nucleatum induz um declínio dramático nas modificações m6A mediadas por METTL3 em células de câncer colorretal (CCR), exacerbando a agressividade do CCR.[ ] A infecção por Salmonella typhimurium morta pelo calor aumenta marcadamente os níveis globais de m6A do mRNA em células THP-1 (tohoku hospital pediatrics-1).[ ] Todos esses estudos implicam que a metilação m6A pode exercer um papel inegável na modulação da nutrição dietética ou da microbiota intestinal nos processos biológicos do hospedeiro.

Neste estudo, rastreamos e identificamos A. muciniphila como um mediador crucial nas melhorias da desregulação metabólica causada pela quercetina dietética. Mecanicamente, demonstramos que A. muciniphila e seu metabólito ácido indol-3-láctico (ILA) modulam o metabolismo do ácido cólico (CA) aumentando a expressão da 12α-hidroxilase (CYP8B1) na sinalização FTO-m6A-YTHDF2. A expressão aumentada de CYP8B1 facilita a conversão do colesterol em CA, que por sua vez suprime significativamente o acúmulo de lipídios através da ativação do receptor X farnesoide (FXR) no tecido adiposo.

Resultados
A Quercetina Melhora a Obesidade Induzida por HFD e Distúrbios Metabólicos Relacionados
Para investigar o impacto fisiológico da quercetina no metabolismo e no acúmulo de gordura in vivo, camundongos machos C57BL/6J foram submetidos a dieta normal (NCD), NCD suplementada com quercetina (NCD+Que), dieta rica em gordura (HFD) ou HFD suplementada com quercetina (HFD+Que) por um período de 10 semanas (Figura 1A). Conforme mostrado nas fotografias representativas da Figura 1B, os camundongos HFD desenvolveram características típicas de obesidade em comparação com os camundongos NCD, indicando o estabelecimento bem-sucedido do modelo de obesidade. A administração oral de quercetina levou a uma redução significativa no peso corporal (Figura 1B–D), no percentual de massa gorda (Figura 1F), no tecido adiposo branco inguinal (iWAT) e no tecido adiposo branco epididimal (eWAT) (Figura 1B,G) em camundongos sob condições de alta gordura, apesar da ingestão alimentar diária média comparável (Figura 1E). Além disso, a gavagem com quercetina conseguiu mitigar efetivamente o aumento dos adipócitos no WAT causado pela HFD, conforme evidenciado pela coloração com hematoxilina e eosina (HE) (Figura 1H). Considerando que a obesidade está comumente associada a irregularidades metabólicas, também empregamos o teste de tolerância à glicose (GTT) e o teste de tolerância à insulina (ITT) para avaliar o papel da quercetina na manutenção da homeostase metabólica. Conforme esperado, os camundongos HFD+Que exibiram melhor capacidade de disposição da glicose (Figura 1I,J) e maior sensibilidade à insulina (Figura 1K,L) em comparação com os camundongos HFD. No entanto, sob alimentação com NCD, nenhuma variação significativa foi observada no consumo alimentar, peso corporal, composição corporal, peso dos tecidos, tamanho dos adipócitos, tolerância à glicose ou sensibilidade à insulina após o tratamento com quercetina em camundongos (Figura 1). Em resumo, essas observações demonstram que a quercetina oferece proteção contra a obesidade induzida por HFD e disfunções metabólicas relacionadas.
A quercetina melhora a adiposidade induzida pela dieta e os distúrbios metabólicos associados. A) Ilustração esquemática do desenho experimental para administração de quercetina em camundongos C57BL/6J. B) Fotografias representativas da forma corporal dos camundongos, iWAT, eWAT, BAT e fígado. C) Mudanças dinâmicas no peso corporal dos camundongos (n = 9). D) Ganho de peso corporal relativo dos camundongos ao final do estudo (n = 9). E) Ingestão alimentar dos camundongos. F) Parâmetros de composição corporal dos tecidos magro e adiposo dos camundongos (n = 6). G) Pesos de iWAT, eWAT e BAT ao final do estudo (n = 6). H) Coloração representativa de H&E de iWAT e eWAT de camundongos. Barras de escala, 100 µm. I,J) Níveis de glicose no sangue dos camundongos após injeção intraperitoneal de glicose para testes de tolerância à glicose (GTT). A área sob a curva (AUC) foi calculada com base nos resultados do GTT (I) (n = 6). K,L) Níveis de glicose no sangue dos camundongos após injeção intraperitoneal de insulina para testes de tolerância à insulina (ITT). A área sob a curva (AUC) foi calculada com base nos resultados do ITT (L) (n = 6).
A quercetina remodela a estrutura geral da microbiota, elevando especialmente a abundância de A. Muciniphila
Quercetina, um polifenol natural, é geralmente pouco biodisponível devido à sua intrincada estrutura química e formas poliméricas.[ ] Até 90%–95% dos polifenóis dietéticos não conseguem ser absorvidos no intestino delgado, mas passam para o cólon, onde interagem com a microbiota intestinal para exercer suas funções probióticas.[ ] Considerando isso, analisamos subsequentemente as configurações da microbiota intestinal modificadas pela quercetina por meio do sequenciamento de amplicon do rDNA 16S. Os resultados da árvore de agrupamento hierárquico (Figura S1A, Informações de Suporte) e da análise de coordenadas principais (PCoA) baseada na distância de Bray-Curtis (Figura S1B, Informações de Suporte) no nível de OTU mostraram uma separação significativa na estrutura da microbiota entre os quatro grupos. Camundongos HFD exibiram diversidade microbiana (índice de Shannon) (Figura S1C, Informações de Suporte) e riqueza microbiana (índice Ace) (Figura S1D, Informações de Suporte) substancialmente reduzidas em comparação com camundongos NCD, enquanto a gavagem de quercetina mitigou a redução e exibiu um índice de saúde do microbioma intestinal (GMHI) mais elevado sob alimentação com HFD (Figura S1E, Informações de Suporte). Além disso, a abundância relativa de muitas bactérias foi marcadamente alterada entre camundongos HFD e HFD+Que (Figura S1F–H, Informações de Suporte). Para filtrar melhor os gêneros bacterianos diferenciais chave, realizamos análise LEfSe e teste de soma de postos de Wilcoxon. Notavelmente, o gênero A. muciniphila, um probiótico promissor,[ ] foi enriquecido em camundongos HFD+Que (Figura 2A; Figura S1I, Informações de Suporte). Sua abundância relativa também foi maior devido ao tratamento com quercetina sob condições de dieta basal (Figura S1J, Informações de Suporte). Além disso, a análise de correlação de Spearman revelou que A. muciniphila foi o único microrganismo correlacionado de forma dramática e inversa com parâmetros metabólicos, como ganho de peso corporal, porcentagem de massa gorda e peso do iWAT (Figura 2B). Os resultados do sequenciamento acima indicam que a suplementação de quercetina altera a estrutura da microbiota e aumenta a abundância de A. muciniphila, levando-nos a hipotetizar que A. muciniphila pode desempenhar um papel crucial nas melhorias metabólicas induzidas pela quercetina.
A quercetina reestrutura o microbioma e aumenta a abundância de A. muciniphila. A) Análise LEfSe identifica diferenças essenciais na abundância bacteriana (do nível de Gênero a OUT) entre os grupos HFD e HFD+Que. São mostrados apenas os táxons com escore LDA maior que 3 (n = 9). B) Coeficientes de correlação de Spearman entre a abundância bacteriana fecal e parâmetros metabólicos selecionados (NCD n = 7, NCD+Que n = 7, HFD n = 9, HFD+Que n = 9). C) Ilustração esquemática do desenho experimental para administração de A. muciniphila em camundongos C57BL/6J. D) Ganho de peso corporal relativo dos camundongos ao término do estudo (n = 8). E) Parâmetros de composição corporal dos tecidos magro e adiposo dos camundongos (n = 8). F) Níveis séricos de triglicerídeos totais (TG) em camundongos (n = 8). G) Pesos do iWAT, eWAT e BAT ao término do estudo (n = 8). H) Coloração representativa de H&E do iWAT e eWAT dos camundongos. Barras de escala, 100 µm. I) Níveis de glicose no sangue dos camundongos após injeção intraperitoneal de glicose para GTT (n = 8). * diferença significativa entre os grupos HFD e HFD+A. m. # diferença significativa entre os grupos HFD e HFD+P‐A. m. J) Níveis de glicose no sangue dos camundongos após injeção intraperitoneal de insulina para ITT (n = 8). * diferença significativa entre os grupos HFD e HFD+A. m. # diferença significativa entre os grupos HFD e HFD+P‐A. m.
Para determinar se A. muciniphila pode aliviar a desregulação metabólica e definir o componente protetor de A. muciniphila, administramos por via oral solução salina tamponada com fosfato (PBS), A. muciniphila viável ou A. muciniphila pasteurizada para camundongos C57BL/6J machos sob alimentação com HFD por um período de 10 semanas, referidos como HFD, HFD+ A. m e HFD+P‐A. m, respectivamente (Figura 2C). O modelo de obesidade foi construído com sucesso (Figura S2A, Informações de Suporte). O tratamento com A. muciniphila aumenta efetivamente a abundância de A. muciniphila nas fezes dos camundongos (Figura S2B, Informações de Suporte). Consistente com os resultados do tratamento com quercetina (Figura 1) e com a literatura anterior,[ ] nenhuma alteração significativa no consumo médio diário de alimentos foi observada após o tratamento com A. muciniphila viável ou pasteurizada (Figura S2D, Informações de Suporte), enquanto sua suplementação resultou em menor peso corporal (Figura 2D; Figura S2C, Informações de Suporte) e menor porcentagem de massa gorda (Figura 2E) em comparação com camundongos HFD tratados com PBS, predominantemente devido à redução significativa nos depósitos de iWAT, eWAT e tecido adiposo marrom (BAT) (Figura 2G). Além disso, uma diminuição notável nos níveis séricos de triglicerídeos totais (TG) (Figura 2F) e no tamanho dos adipócitos (Figura 2H), bem como uma melhora na homeostase da glicose (Figura 2I; Figura S2E, Informações de Suporte) e na sensibilidade à insulina (Figura 2J; Figura S2F, Informações de Suporte), também foram observadas nos camundongos HFD+ A. m e HFD+P‐A. m. Embora tanto A. muciniphila viável quanto pasteurizada tenham demonstrado potencial no combate à obesidade, é importante destacar que A. muciniphila viável exibiu propriedades protetoras mais pronunciadas, sugerindo que o efeito protetor observado provavelmente depende principalmente de metabólitos microbianos e não dos componentes bacterianos. Em conjunto, esses achados confirmam que A. muciniphila é benéfica para a homeostase metabólica e está correlacionada negativamente com as características da obesidade.
A. Muciniphila Aumenta os Níveis Séricos de CA, que Suprime o Acúmulo de Lipídios via Sinalização FXR
Metabólitos produzidos ou influenciados por microrganismos fazem a ponte do diálogo dinâmico entre microbiotas e tecidos‐alvo periféricos.[ ] Para identificar potenciais metabólitos que poderiam regular a deposição lipídica, foi realizado o perfil metabolômico não direcionado das amostras de soro coletadas de camundongos HFD e HFD+A. m. A análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS‐DA) indicou uma composição de metabólitos circulantes substancialmente alterada após a gavagem com A. muciniphila (Figura S3A, Informações de Suporte). Um conjunto de 20 metabólitos exibiu alterações notáveis: 19 metabólitos foram claramente regulados positivamente, enquanto 1 metabólito foi marcadamente regulado negativamente em camundongos HFD+A. m em comparação com camundongos HFD (Figura 3A; Figura S3B, Informações de Suporte). Esses metabólitos diferenciais foram enriquecidos em vias metabólicas, biossíntese primária de bile, secreção biliar, metabolismo da vitamina B6, metabolismo da tirosina e alguns outros processos biológicos (Figura S3C, Informações de Suporte). Entre eles, focamos particularmente no ácido cólico (CA), um dos BAs primários, pois estava enriquecido em múltiplas vias (Figura S3D,E, Informações de Suporte) e muitos estudos relataram que os BAs têm importantes efeitos regulatórios contra doenças metabólicas, inflamatórias, infecciosas e neoplásicas.[ ] Curiosamente, os níveis circulantes de CA também foram predominantemente elevados após a suplementação com quercetina sob alimentação com HFD (Figura S3F, Informações de Suporte). Com base nos resultados acima, especulamos que o CA impulsionado por A. muciniphila poderia suprimir o acúmulo de lipídios. Para validar isso, células primárias da fração vascular estromal (SVF) foram isoladas do iWAT de camundongos C57BL/6J machos, induzidas a se diferenciar in vitro e tratadas com várias concentrações de CA durante todo o processo de diferenciação (Figura 3B). Como esperado, a diferenciação adipogênica foi acentuadamente inibida por CA de maneira dependente da concentração (Figura 3C; Figura S3G, Informações de Suporte), enquanto o tratamento com CA não causou nenhum impacto notável na viabilidade celular (Figura S3I, Informações de Suporte). A expressão de mRNA dos reguladores mestres da adipogênese, incluindo Pparγ, Cebpα e Fabp4, também foi atenuada por CA de maneira dependente da dose (Figura 3D). Exceto pelo CA, o ácido alfa‐linolênico e outros 18 metabólitos também podem possuir propriedades anti‐obesidade. Outros metabólitos potenciais ou vias biológicas podem ser uma direção importante para exploração futura.
A. muciniphila‐driven CA confers protection against obesity via FXR signaling. A) Volcano plot showing differentially expressed serum metabolites induced by A. muciniphila colonization. The indicate plot was CA (n = 6). B) Schematic of cellular experiments in vitro. The primary stromal vascular fraction (SVF) cells were isolated from iWAT of male C57BL/6J mice, induced to differentiate, and treated with 0, 25, or 50 µm of CA throughout the differentiation process. C) Bodipy and ORO staining of SVF cells. Differentiation was induced with CA up to day 6. D) mRNA expression levels of adipogenesis‐related marker genes in SVF cells (n = 4). E,F) mRNA expression levels of major BAs receptors (Fxr and Tgr5) in iWAT (E) and SVF cells (F) (n = 4). G) Bodipy and ORO staining of SVF cells in Fxr‐silenced or CA‐treated groups. H,I) mRNA expression levels of Tnfα, Ifnγ, and Il10 in iWAT (H) and SVF cells (I) (n = 4). J) Schematic illustration of the experimental design for administering CA to C57BL/6J mice. K) Relative body weight gain of mice at termination of study (n = 6). L) mRNA expression levels of Fxr, Tgr5, Tnfα, Ifnγ, and Il10 in iWAT (n = 3).
Como o CA confere respostas anti-obesidade? Numerosos estudos revelaram que os BAs regulam redes metabólicas simbióticas ao se ligar e ativar diferentes receptores, particularmente o receptor farnesoide X (FXR) e o receptor 5 acoplado à proteína G Takeda (TGR5).[ ] O CA tem sido confirmado como tendo potencial de ativação de FXR/TGR5. Em nosso estudo atual, observamos uma ativação substancial do FXR no iWAT após suplementação com A. muciniphila ou quercetina, em comparação com camundongos submetidos apenas à dieta HFD (Figura 3E). Similarmente, apenas o FXR foi marcadamente ativado quando células SVF foram tratadas com várias concentrações de CA in vitro (Figura 3F). Para verificar ainda mais o papel do FXR, realizamos experimentos de resgate mediados por siRNA e descobrimos que a depleção do FXR poderia reverter parcialmente a inibição da deposição lipídica induzida por CA, implicando que o CA realmente requer o FXR para exercer sua função (Figura 3G; Figura S3H, Informações de Suporte). Como o FXR é um fator de transcrição para genes relacionados à inflamação e a inflamação é um componente chave da obesidade, em seguida detectamos a expressão de genes marcadores. Os dados mostraram que a gavagem com A. muciniphila ou quercetina levou à regulação positiva de fatores anti-inflamatórios (Il10) e regulação negativa de fatores pró-inflamatórios (Tnfα e Ifnγ) no iWAT (Figura 3H). Alterações análogas foram observadas em células SVF tratadas com CA (Figura 3I). Além disso, administramos oralmente PBS ou CA a camundongos sob dieta HFD para investigar os efeitos anti-obesidade in vivo do CA (Figura 3J). Não surpreendentemente, o CA exibiu uma capacidade considerável de mitigar a obesidade (Figura 3K; Figura S3J–M, Informações de Suporte), ativar o FXR e modular a expressão de genes relacionados à inflamação (Figura 3L). Em conjunto, nossos dados revelam que A. muciniphila poderia modular o metabolismo dos BAs. O aumento dos níveis circulantes de CA suprimiu o acúmulo lipídico de uma maneira dependente do receptor de BAs FXR.
Metabólitos de A. Muciniphila Aumentam a Expressão de CYP8B1 de Maneira Dependente de m6A, Elevando Assim os Níveis de CA
Os BAs são sintetizados principalmente na via clássica pelos hepatócitos.[ ] Para identificar ainda mais se A. muciniphila também influencia os níveis de CA in vitro, adicionamos sobrenadantes de cultura de A. muciniphila (A. m-Sup) ao meio de células AML12, com sobrenadantes de meio de infusão cérebro-coração (BHI) em branco (BHI-Sup) como controle (Figura 4A). Em linha com as observações in vivo, o conteúdo de CA no meio de cultura de hepatócitos foi notavelmente elevado devido ao tratamento com A. m-Sup (Figura 4B). Como os metabólitos de A. muciniphila induzem um aumento na biossíntese de CA é a próxima questão que pretendemos decifrar.
A. muciniphila metabólitos aumentam a expressão de CYP8B1 de forma dependente de m6A para gerar mais CA. A) Esquema experimental para coleta de sobrenadantes de cultura de A. muciniphila para tratar células AML12, com sobrenadantes BHI em branco como controle. B) Concentrações de CA no meio de cultura de células AML12 (n = 3). C) Esquema da via de metabolismo dos BAs. D) Teor de colesterol total (TC) em fígados de camundongos (n = 8). E) Teor de TC em células AML12 tratadas com BHI-Sup ou A. m-Sup (n = 4). F,G) Níveis de expressão de mRNA de Cyp7a1 em fígados (F) (n = 6) e células AML12 (G) (n = 6). H,I) Níveis de expressão proteica de CYP8B1 em fígados (H) (n = 4) e células AML12 (I) (n = 3). J,K) Níveis de expressão de mRNA de Cyp8b1 em fígados (J) (n = 8) e células AML12 (K) (n = 6). L) Níveis de modificação m6A de mRNA em fígados de camundongos. Coloração com azul de metileno foi usada como controle de carregamento (n = 3). M) Níveis de modificação m6A do mRNA de Cyp8b1 em fígados de camundongos (n = 3). N) Níveis de expressão proteica de reguladores de m6A em fígados de camundongos (n = 3). O) Níveis de modificação m6A de mRNA em células AML12 tratadas com BHI-Sup ou A. m-Sup. Coloração com azul de metileno foi usada como controle de carregamento (BHI-Sup n = 3, A. m-Sup n = 4). P) Níveis de modificação m6A do mRNA de Cyp8b1 em células AML12 tratadas com BHI-Sup ou A. m-Sup (n = 3). Q) Níveis de expressão proteica de FTO em células AML12 tratadas com BHI-Sup ou A. m-Sup (n = 3). R) Níveis de expressão de mRNA de Cyp8b1 em células AML12 foram medidos sob diferentes condições: BHI-Sup, A. m-Sup, BHI-Sup+siFto ou A. m-Sup+siFto (n = 5). S) Níveis de expressão de mRNA de Cyp8b1 em células AML12 transfectadas com siRNA Ythdf2 ou siRNA negativo (n = 7). T) Tempo de vida do mRNA de Cyp8b1 em células AML-12 tratadas com BHI-Sup ou A. m-Sup (n = 4).
De acordo com a literatura anterior, o colesterol é metabolizado a 7α-hidroxicolesterol pela enzima limitante da taxa colesterol 7α-hidroxilase (CYP7A1), e então convertido em CA ou ácido quenodesoxicólico (CDCA) pela esterol 12α-hidroxilase (CYP8B1) ou esterol 27-hidroxilase (CYP27A1), respectivamente (Figura 4C).[ ] Aqui, primeiro excluímos a possibilidade de que a colonização por A. muciniphila produzisse mais colesterol para gerar mais CA. Isso foi demonstrado por concentrações hepáticas mais baixas de colesterol total (CT) em camundongos HFD+ A. m (Figura 4D), bem como níveis inalterados de CT em hepatócitos após o tratamento com A. m‐Sup (Figura 4E). A expressão de Cyp7a1 poderia ser efetivamente regulada positivamente por A. m‐Sup in vitro (Figura 4G); no entanto, não foi significativamente alterada pela intervenção com quercetina ou A. muciniphila in vivo (Figura 4F). Em relação à expressão de CYP8B1, fígados de camundongos HFD+ A. m (Figura 4H,J; Figura S4A, Informações de Apoio), fígados de camundongos HFD+Que (Figura S4C,D, Informações de Apoio) e hepatócitos tratados com A. m‐Sup (Figura 4I,K; Figura S4B, Informações de Apoio) mostraram um aumento significativo em comparação com o grupo controle. Todos esses resultados sugerem que os metabólitos de A. muciniphila aumentam os níveis séricos de CA através do aumento da expressão de CYP8B1. No entanto, o mecanismo regulatório que rege a regulação positiva da expressão de CYP8B1 requer maiores esclarecimentos.

Jabs et al. propuseram que camundongos livres de germes (GF) monocolonizados com A. muciniphila exibiram uma alteração notável nas modificações m6A nos fígados.[ ] A modificação de RNA m6A desempenha um papel crucial na saúde metabólica do hospedeiro.[ ] Além disso, 24 sítios m6A do mRNA de Cyp8b1 foram registrados no RMBase v3.0 (http://bioinformaticsscience.cn/rmbase/).[ ] Esses fatores nos levaram a verificar se o aumento da expressão de CYP8B1 depende de modificações m6A. Coincidindo com nossa hipótese, os níveis hepáticos totais de m6A são mais baixos em camundongos HFD+ A. m do que em camundongos HFD (Figura 4L). Os níveis de mRNA de Cyp8b1 modificado por m6A também diminuíram devido à suplementação com A. muciniphila (Figura 4M). Como a abundância de m6A no mRNA é determinada pela interação dinâmica entre as principais metiltransferases (METTL3 e METTL14) e desmetilases (FTO e ALKBH5), em seguida examinamos e descobrimos que níveis atenuados de m6A são atribuídos à expressão aumentada de FTO (Figura 4N; Figura S4F, Informações de Apoio). Fígados de camundongos HFD+Que exibiram níveis diminuídos de m6A (Figura S4E, Informações de Apoio) e expressão aumentada da proteína FTO (Figura S4C,D, Informações de Apoio) também. Da mesma forma, o tratamento de células AML12 com A. m‐Sup produziu os mesmos resultados, incluindo níveis totais de m6A mais baixos (Figura 4O), níveis reduzidos de m6A no mRNA de Cyp8b1 (Figura 4P) e expressão acelerada da proteína FTO (Figura 4Q; Figura S4G, Informações de Apoio). Além disso, os estudos adicionais de perda de função confirmaram o papel mediador de FTO, manifestado como a perturbação de FTO de fato anulou o impacto de A. m‐Sup nos níveis de mRNA de Cyp8b1 (Figura 4R).
As modificações m6A exercem um efeito sobre o mRNA principalmente recrutando proteínas de ligação ao RNA (proteínas contendo o domínio de homologia T521‐B (YTH)), também conhecidas como “leitoras de m6A”.[ ] A YTHDF2, uma das leitoras de m6A, tem sido documentada por reconhecer seletivamente sítios m6A e mediar a degradação de mRNA contendo m6A. O knockdown de Ythdf2 causou uma expressão maior de mRNA de Cyp8b1 (Figura 4S), implicando que a YTHDF2 está envolvida na transcrição de Cyp8b1. O mRNA de Cyp8b1 contendo m6A pode ser reconhecido e ligado pela YTHDF2 e então degradado. Para testar isso, detectamos o conteúdo relativo de mRNA de Cyp8b1 em 0, 3 e 6 h após a adição de actinomicina D para bloquear a transcrição. Os dados mostraram que A. m‐Sup prolongou distintamente a meia-vida do mRNA de Cyp8b1 (Figura 4T). Coletivamente, descobrimos pela primeira vez que A. muciniphila modula o metabolismo de BA sob uma perspectiva epigenética, aliviando assim a obesidade do hospedeiro.
O Metabolito ILA é Responsável pelo Aumento da Expressão de CYP8B1 Mediada por m6A
Posteriormente, examinamos os sobrenadantes de cultura de A. muciniphila por meio de análises metabolômicas não direcionadas e identificamos 77 metabólitos produzidos por A. muciniphila (Figura 5A).
A possibilidade de A. muciniphila gerar diretamente mais CA foi descartada (Figura S5A, Informações de Suporte).
A análise KEGG mostrou enriquecimento acentuado no metabolismo da tirosina, metabolismo da fenilalanina, ciclo do citrato (ciclo TCA), pool de um carbono por folato e outras vias (Figura 5B).
Ácido indol-3-láctico (ILA), ácido fólico (Folic), ácido alfa-cetoglutárico (αKG), ácido fumárico (Fum) e ácido cis-aconítico (cis-A) foram especulados como potenciais candidatos para investigação adicional com base em suas funções previamente relatadas (Figura 5C).
Ao utilizar esses metabólitos mencionados em células AML12, dois deles, ILA e αKG, pareceram exibir níveis proteicos mais elevados de FTO e CYP8B1 (Figura 5D; Figura S5B,C, Informações de Suporte), níveis celulares mais baixos de m6A (Figura 5E), bem como concentrações mais altas de CA (Figura 5F) em comparação ao grupo controle, com os efeitos mais significativos observados em hepatócitos tratados com ILA.
Além disso, os níveis séricos de ILA foram predominantemente elevados após a suplementação com A. muciniphila e quercetina (Figura 5G).
Para validar o papel do ILA in vivo, camundongos receberam administração oral de PBS ou ILA (Figura 5H).
Como esperado, o ILA foi capaz de melhorar drasticamente a obesidade induzida por HFD (Figura 5I; Figura S5D–G, Informações de Suporte) sem afetar a ingestão alimentar (Figura S5E, Informações de Suporte).
Os níveis circulantes de CA (Figura 5J), a expressão de FTO e CYP8B1 (Figura 5K; Figura S5H,I, Informações de Suporte), os níveis totais de m6A no mRNA (Figura 5L), o efeito de resgate do FTO silenciado (Figura 5M) e a vida útil do mRNA de Cyp8b1 (Figura 5N) também apoiaram a ideia de que o ILA contribuiu para a regulação positiva de CYP8B1 mediada por modificações de m6A.
O ILA foi mencionado por afetar a interação epitélio-macrófago por meio de modificações histonas.[ ]
Nosso trabalho lança luz sobre novos insights na regulação epigenética do ILA.
O metabólito ILA é responsável pelos níveis elevados de CYP8B1 mediados por m6A. A) Gráfico de vulcão mostrando metabólitos diferencialmente expressos entre sobrenadantes de BHI em branco e sobrenadantes de cultura de A. muciniphila (n  = 3). B) Análise de enriquecimento KEGG dos metabólitos diferencialmente expressos descritos em (A) (n = 3). C) Lista de potenciais metabólitos derivados de A. muciniphila selecionados. D) Níveis de expressão proteica de FTO e CYP8B1 em células AML12 tratadas com os metabólitos listados em (C) (n = 3). E) Níveis de modificação m6A do mRNA em células AML12 tratadas com DMSO, αKG ou ILA (n = 3). F) Concentrações de CA no meio de cultura de células AML12 (n = 3). G) Níveis séricos de ILA em camundongos entre os grupos HFD, HFD+A.m e HFD+Que (n = 6). H) Ilustração esquemática do desenho experimental para administração de ILA a camundongos C57BL/6J. I) Ganho de peso corporal relativo dos camundongos ao final do estudo (n = 6). J) Níveis séricos de CA em camundongos entre os grupos HFD e HFD+ILA (n = 4). K) Níveis de expressão proteica de FTO e CYP8B1 nos fígados de camundongos dos grupos HFD e HFD+ILA (n = 3). L) Níveis de modificação m6A do mRNA nos fígados de camundongos dos grupos HFD e HFD+ILA (n = 3). M) Níveis de expressão do mRNA de Cyp8b1 em células AML12 medidos sob diferentes condições: DMSO, ILA, DMSO+siFto ou ILA+siFto (DMSO n = 4, ILA n = 4, DMSO+siFto n = 4, ILA+siFto n = 3). N) Vida útil do mRNA de Cyp8b1 em células AML‐12 tratadas com DMSO ou ILA (n = 4). O) Modelo de trabalho da quercetina/A. muciniphila na regulação do acúmulo de gordura.
Discussão
A microbiota intestinal é um dos fatores fundamentais intimamente correlacionados com aspectos da saúde do hospedeiro, e sua composição pode ser alterada de forma rápida e substancial por meio da nutrição.[ ] Com o crescente conhecimento da complexa interação entre microrganismo e hospedeiro, atualmente, estudos acumulados focam nas funções precisas de bactérias específicas, em vez de apenas análises de correlação grosseiras.[ ] Pesquisas em nível de espécies ou cepas bacterianas são urgentemente necessárias. Aqui, demonstramos que a intervenção dietética com quercetina pode melhorar a obesidade e a síndrome metabólica associada, remodelando a estrutura geral da microbiota, especialmente o aumento notável da abundância de A. muciniphila. A. muciniphila, descoberta e caracterizada há duas décadas,[ ] é o paradigma dos microrganismos benéficos de próxima geração. Perturbações dessa bactéria comensal foram implicadas no desenvolvimento da obesidade e de várias outras doenças,[ ] enquanto a compreensão do mecanismo subjacente é amplamente limitada. Nossos estudos atuais descrevem um novo eixo A. muciniphila‑m6A‑BAs que suprime a adipogênese do hospedeiro ao ativar o FXR no iWAT. Este trabalho pode servir como uma estratégia de intervenção para combater a síndrome metabólica.
De fato, estudos anteriores baseados em humanos e modelos animais confirmaram o potencial antiobesidade da quercetina, conforme demonstrado neste estudo. A administração de 100 mg dia⁻¹ de quercetina ou extrato de cebola com alto teor de quercetina em indivíduos obesos reduziu o peso corporal e o índice de massa corporal (IMC) após 12 semanas.[ ] Camundongos alimentados com dieta rica em gordura (HFD) suplementados com 100 mg kg⁻¹ dia⁻¹ de quercetina apresentaram inibição da sinalização MAPK no tecido adiposo branco epididimal (eWAT) e uma redução de 40% no peso corporal final.[ ] Mas, notavelmente, a quercetina geralmente exibe disponibilidade sistêmica devido à sua estrutura química complexa e formas poliméricas.[ ] Quase toda a quercetina dietética não pode ser absorvida, mas interage com a microbiota intestinal para manifestar indiretamente funções probióticas.[ ] Para descrever melhor o mecanismo da quercetina, exploramos inovadoramente a partir da perspectiva dos microrganismos e avaliamos A. muciniphila como um mediador crucial nas melhorias metabólicas induzidas pela quercetina. No entanto, nossos achados disponíveis ainda não são capazes de explicar claramente a razão precisa para a alta abundância de A. muciniphila em camundongos HFD+Que. A. muciniphila foi identificada como uma especialista exclusiva na degradação de mucina presente no intestino desde o início da vida.[ ] Foi demonstrado que a quercetina promove efetivamente a secreção de mais mucina pelas células caliciformes.[ ] Com base nas evidências disponíveis, levantamos a hipótese de que a intervenção com quercetina impulsiona o enriquecimento de A. muciniphila ao promover a secreção de mucina. Além disso, um estudo recente propôs um ponto interessante de que a seleção natural molda a evolução bacteriana em todos os ambientes.[ ] Pesquisadores realizaram amostragem metagenômica quase diária e confirmaram a evolução intra-hospedeiro e a adaptação de Bacteroides fragilis, levando-nos a especular que a "evolução adaptativa" de A. muciniphila pode ser outra explicação para a quercetina resistir à redução na abundância de A. muciniphila causada por condições de alta gordura.
Definir e caracterizar diversos metabólitos da microbiota poderia ajudar a compreender mecanicamente a interação cruzada hospedeiro‐microbiota e a identificar possíveis biomarcadores ou assinaturas de doenças. Sob condições de obesidade induzida por dieta, notamos um aumento dramático nas concentrações séricas de CA devido à colonização por A. muciniphila (Figura 3A). Uma modulação semelhante do metabolismo de BA impulsionada por A. muciniphila foi mencionada recentemente pela primeira vez em modelo de infecção viral sistêmica em camundongos, com estudo relatando que A. muciniphila regulava a conjugação de BAs primários ao aumentar especificamente a expressão da N‐acetiltransferase de aminoácidos (BAAT).[ ] Diferentemente disso, nossas investigações mecanísticas revelaram que A. muciniphila aumentou indireta e especificamente a expressão de CYP8B1 por meio de seu ILA derivado, promovendo assim a conversão de colesterol em CA. Até o momento, descobriu‐se que o ILA pode regular negativamente as vias de sinalização da glicólise, NF‐κB e HIF por meio do receptor de hidrocarboneto arílico,[ ] e também pode aumentar transcricionalmente a função das células T CD8 infiltrantes do tumor ao alterar a acessibilidade da cromatina.[ ] O presente estudo é a primeira demonstração que representa o impacto regulatório do ILA no metabolismo de BA, o que melhora a compreensão do papel de A. muciniphila e do ILA. No entanto, não conseguimos identificar quaisquer genes contrapartes que possam ser responsáveis pela síntese de ILA. O(s) gene(s) específico(s) envolvido(s) na síntese de ILA dentro do genoma de A. muciniphila merecem investigação em estudos subsequentes, e esta deve ser uma direção importante para atenção futura.
Outra característica importante do nosso trabalho é a descoberta de que o ILA de A. muciniphila modula o metabolismo de BA do hospedeiro de maneira dependente de m6A. A microbiota intestinal, juntamente com seus metabólitos, demonstrou regular vias epigenéticas do hospedeiro, como metilação do DNA,[ ] metilação do RNA[ ] ou modificação de histonas,[ ] embora pouco se saiba sobre o mecanismo e o papel exatos. Múltiplos estudos existentes, incluindo esforços de pesquisa anteriores conduzidos por nossa equipe, indicaram que a modificação m6A do mRNA desempenha um papel vital em inúmeros eventos biológicos, particularmente na saúde metabólica.[ ] Mais importante, o transcrito de mRNA Cyp8b1 contém sítios de modificação m6A. Todos esses fatores nos permitiram hipotetizar se o metabolismo de BA mediado por CYP8B1 pode ser modificado pela metilação m6A do mRNA. Com certeza, de fato observamos que A. muciniphila e ILA ambos atenuaram os níveis de m6A ao elevar a expressão de FTO. O mRNA Cyp8b1 contendo m6A foi reconhecido e ligado por YTHDF2 e subsequentemente degradado (Figura 4S). Este mecanismo regulatório recém-descoberto envolvendo m6A-BAs nunca foi documentado antes.
Em conclusão, mostramos que a A. muciniphila impulsionada pela quercetina modula o metabolismo de BA do hospedeiro de maneira coordenada ILA/FTO/m6A/CYP8B1/CA para amenizar a obesidade induzida pela dieta (Figura 5O). Nosso trabalho aqui apresentado propõe que a quercetina pode servir como candidata para uso em suplementos alimentares para prevenir a obesidade. Mais importante, ele expande o conhecimento limitado existente sobre a função mediadora das modificações m6A no metabolismo de BA influenciado por microrganismos.

Seção Experimental

Declaração de Ética Animal

Todos os procedimentos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais e pelo Comitê de Ética em Experimentos Animais da Universidade de Zhejiang (ZJU20240254) e foram rigorosamente realizados de acordo com os regulamentos aplicáveis para experimentos com animais durante todo o período experimental.

Estudo com Animais

Todos os camundongos experimentais foram adquiridos do Shanghai Model Organisms Center, Inc. (Xangai, China) e aclimatados por 1 semana. Eles foram alojados (no máximo quatro por gaiola) em uma instalação de animais livre de patógenos sob ciclo claro/escuro de 12 h, temperatura ambiente de 22 ± 2 °C e umidade de 50 ± 5% com acesso irrestrito a comida e água da torneira. O peso corporal e a ingestão de alimentos foram monitorados semanalmente durante todo o período experimental. Após o sacrifício dos animais ao final do experimento, os tecidos foram dissecados, pesados e embebidos em formalina para posterior análise morfológica ou imediatamente congelados em nitrogênio líquido para análise posterior. As amostras de sangue foram mantidas a 4 °C durante a noite e as amostras de soro foram obtidas por centrifugação (4 °C, 3000 rpm e 15 min).

No experimento suplementar com quercetina. Um total de 40 camundongos machos C57BL/6J selvagens, com 7 semanas de idade, foram alocados aleatoriamente em 4 grupos da seguinte forma: dieta normal (NCD, 10% kcal de gordura, Research Diets, D12450J), NCD com gavagem de 100 mg kg−1 dia−1 de quercetina (NCD+Que, Sigma–Aldrich, Q4951),[ ] dieta rica em gordura (HFD, 60% kcal de gordura, Research Diets, D12492) e HFD com gavagem de 100 mg kg−1 dia−1 de quercetina (HFD+Que, Sigma–Aldrich, Q4951).

No experimento suplementar com A. muciniphila. Um total de 40 camundongos machos C57BL/6J selvagens, com 7 semanas de idade, foram alocados aleatoriamente em 4 grupos da seguinte forma: NCD, HFD, HFD com gavagem de 10⁹ UFC dia−1 de A. muciniphila viável (HFD+A. m) e HFD com gavagem de 10⁹ UFC dia−1 de A. muciniphila pasteurizada (HFD+P‑A. m).[ ] Para pasteurização, a A. muciniphila foi inativada por pasteurização por 30 min a 70 °C.[ ]

No experimento suplementar com CA. Um total de 12 camundongos machos C57BL/6J selvagens, com 8 semanas de idade, foram alocados aleatoriamente em 2 grupos da seguinte forma: HFD e HFD com gavagem de 100 mg kg−1 de CA (Aladdin, C103690).[ ]

No experimento suplementar com ILA. Um total de 12 camundongos machos C57BL/6J selvagens, com 8 semanas de idade, foram alocados aleatoriamente em 2 grupos da seguinte forma: HFD e HFD com gavagem de 20 mg kg−1 de ILA (Aladdin, I157602).[ ]
O teste de tolerância à glicose (TTG) e o teste de tolerância à insulina (TTI) foram realizados após jejum noturno. Os camundongos receberam administração intraperitoneal de uma dosagem de 1,75 g kg−1 de glicose (Sigma–Aldrich, G7021) ou 0,75 U kg−1 de insulina (Sigma–Aldrich, I2643). Os níveis de glicose no sangue foram medidos em amostras de sangue coletadas da veia da cauda antes de 0, 15, 30, 60, 90 e 120 min após a injeção por glicosímetros AlphaTRAK (Nanjing Yuyue Electronics, China).
Medição da Composição Corporal
Antes do experimento, os camundongos foram submetidos a jejum por 6 h. Os parâmetros de composição corporal dos tecidos magro e adiposo dos camundongos foram medidos usando o Sistema de Análise de Composição Corporal para Pequenos Animais MesoQMR e o Sistema de Imagem por RM de Bancada (NIUMAG, QMR06‐090H‐PRO).
Análise de Morfologia
Para a coloração com hematoxilina-eosina (H&E), os tecidos fixados com paraformaldeído a 4% (Servicebio, G1101) foram desidratados, embebidos em blocos de parafina, seguidos de corte e coloração com H&E. As imagens foram observadas e fotografadas usando um microscópio Leica DM 3000 (LEICA).
Cepas Bacterianas
A. muciniphila foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC, número de catálogo BAA835) e cultivada em meio de infusão de cérebro e coração (BHI, Oxoid, CM1135) a 37 °C em condições anaeróbicas. A concentração foi quantificada com base na densidade óptica a 600 nm (DO600).
Isolamento de Pré-adipócitos Primários de Camundongos
O isolamento das células da fração vascular estromal (FVE) do tecido adiposo branco inguinal (TABi) foi realizado seguindo o método descrito anteriormente com pequenos ajustes.[ ] Brevemente, o TABi foi dissecado de camundongos C57BL/6J machos de 8 semanas de idade, picado com tesoura e depois digerido com colagenase tipo II a 1 mg mL−1 (Gibco, 17101015) a 37 °C por 45 min. O tecido digerido foi filtrado através de um filtro celular (200 µm) para remover fragmentos grandes e depois centrifugado a 1000 g por 4 min. Após ser lavado duas vezes com PBS, os pellets celulares foram incubados com tampão de lise de glóbulos vermelhos (Beyotime Biotechnology, C3702) por 1 min, seguido de centrifugação a 1000 g por 4 min. As células FVE isoladas foram plaqueadas em placas de 10 cm. As células flutuantes foram removidas no dia seguinte e meio de cultura fresco foi adicionado.
Cultura e Diferenciação Celular
A linhagem celular de hepatócitos de camundongo AML12 foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC). As células AML12 foram cultivadas em Meio Eagle Modificado por Dulbecco/Mistura de Nutrientes F-12 (DMEM/F12, Gibco, 11320033) contendo 10% de soro fetal bovino (SFB, Gibco, 10099141), 1% de insulina-transferrina-selênio (ITS, Gibco, 41400045) e 1% de penicilina-estreptomicina (NEST Biotechnology, 211092) em atmosfera umidificada a 37 °C com 5% de CO2. Para induzir a diferenciação, as células AML12 foram tratadas com um meio de indução contendo 0,5 mmol l−1 de ácido oleico (AO, Kunchuang Biotechnology, KC005) por 24 h quando a densidade celular atingiu 90%–95%.
Células SVF isoladas foram cultivadas em DMEM/F12 (Gibco, 11320033) contendo 15% de SBF (Gibco, 10099141) e 1% de penicilina‐estreptomicina (Gibco, 15140122) em atmosfera umidificada a 37 °C com 5% de CO2. Para induzir a diferenciação, após 2 dias pós‐confluência, a diferenciação das células SVF foi induzida usando um meio de indução contendo 1 µmol l−1 de dexametasona (Sigma–Aldrich, D4902), 500 µmol l−1 de IBMX (Sigma–Aldrich, I5879), 5 µg mL−1 de insulina (Solarbio, I8040) e 0,5 µmol l−1 de rosiglitazona (Sigma–Aldrich, PHR2932) por 2 dias, seguido por um meio de diferenciação contendo 5 µg mL−1 de insulina. Meio de diferenciação fresco foi substituído a cada 2 dias até que as células SVF estivessem prontas para a colheita, geralmente por volta do dia 8.
Transfecção Celular
A transfecção do RNA pequeno interferente (siRNA) e dos plasmídeos foi realizada utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, 13‐778030) e Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668030), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante. Os siRNAs foram encomendados da GenePharma e as sequências foram as seguintes (5′‐3′).
siRNA controle negativo: UUCUCCGAACGUGUCACGUTT.
siRNA de Fto de camundongo: TTAAGGTCCACTTCATCATCGCAGG.
Coloração com Bodipy
As células foram lavadas 3 vezes com PBS (Biosharp, BL302A) e então coradas com 1 µg mL−1 de Bodipy 493/503 (Invitrogen, D3922) a 37 °C no escuro por 30 min. Em seguida, as células foram lavadas 3 vezes com PBS, contracoradas com Hoechst 33342 (Yeasen, 40732ES03) a 37 °C no escuro por 10 min e, finalmente, lavadas 3 vezes novamente com PBS. As imagens foram observadas e fotografadas em uma sala de microscopia escurecida usando um microscópio de fluorescência.
Coloração com Oil Red O (ORO)
As células foram lavadas 3 vezes com PBS (Biosharp, BL302A), fixadas com paraformaldeído a 4% (Servicebio, G1101) à temperatura ambiente por 2 h, lavadas 3 vezes com isopropanol a 60% e então coradas com uma solução de trabalho de Oil Red O (Sigma–Aldrich, O9755) filtrada por 10 min. Após enxágue com água destilada, as gotículas lipídicas coradas de vermelho foram observadas e fotografadas usando um microscópio. Para quantificar o acúmulo relativo de lipídios, as gotículas lipídicas coradas com Oil Red O foram eluídas em isopropanol a 100% e a absorbância do extrato foi medida a 500 nm (OD500).
Detecção de Índices Bioquímicos
Os níveis de colesterol total (CT) e triglicerídeos (TG) foram determinados com kits disponíveis comercialmente (Instituto de Engenharia Biológica Nanjing Jiancheng, Nanjing, China), de acordo com o protocolo do fabricante.
Conteúdo de Ácido Cólico (CA)
Os níveis de CA em amostras de soro e sobrenadantes de cultura celular foram medidos usando o Kit ELISA de Ácido Cólico para Camundongo (Cell Biolabs, MET5007), de acordo com o protocolo do fabricante.
Conteúdo de Ácido Indol‐3‐Láctico (ILA)
A concentração de ILA em amostras de soro foi medida usando o Kit ELISA de ILA para Camundongo (SINOBESTBIO, YX‐23042 M), de acordo com o protocolo do fabricante.
Western Blot
As proteínas em tecidos ou células foram extraídas usando o kit de extração de proteína total celular (Solarbio, BC3710) e determinadas usando o kit de ensaio de proteína BCA (Novoprotein, PA002). Os lisados de proteína foram coletados e imediatamente centrifugados a 12 000 rpm por 15 min, separados por géis de SDS‐poliacrilamida e, em seguida, transferidos para membrana de PVDF (Millipore, IPVH00010). Após bloqueio com leite desnatado 5% à temperatura ambiente por 1 h, a membrana foi incubada com anticorpos primários a 4 °C durante a noite e, subsequentemente, incubada com anticorpos secundários conjugados com HRP (Biosharp, BL001A ou BL003A) à temperatura ambiente por 1 h. A membrana foi visualizada usando Super ECL Plus (US EVERBRIGHT, S6009L). Os anticorpos primários estão listados na Tabela S1 (Informações de Suporte).

PCR em Tempo Real Quantitativa (qPCR)

O RNA total foi extraído separadamente de tecidos ou células usando o Reagente FreeZol (Vazyme, R71102) e transcrito reversamente em DNA complementar (cDNA) pelo Kit SPARKscript II One Step RT‐PCR (Shandong Sparkjade Biotechnology Co., Ltd., AG0402). A análise de qPCR foi realizada usando SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Q71102) com o Sistema ABI Step‐One Plus Real‐Time PCR (Applied Biosystems). A expressão relativa da abundância de mRNA foi calculada usando o método 2−ΔΔCt, com β‐actina usada como controle interno. Todas as reações de qPCR foram realizadas em triplicata. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S2 (Informações de Suporte).

Ensaios de Dot Blot para m6A

A análise de Dot blot foi realizada para detectar os níveis de modificação m6A no mRNA de tecidos ou células. Resumidamente, o mRNA foi purificado do RNA total usando duas rodadas de purificação de cauda poliA com o kit Dynabeads mRNA DIRECT (Thermo Fisher Scientific, 61012) e quantificado com um Fluorômetro Qubit (Thermo Fisher Scientific, Q33216). 400 ng de mRNA foram desnaturados por aquecimento a 65 °C por 5 min para romper estruturas secundárias, aplicados em membrana Amersham Hybond‐N+ (GE Healthcare, RPN203B) e, em seguida, reticulados com luz UV (duas vezes, 1200 J cm−2). Após bloqueio com leite desnatado 5% à temperatura ambiente por 1 h, a membrana foi incubada com anticorpos anti‐m6A (Synaptic Systems, 202003) a 4 °C durante a noite e, subsequentemente, incubada com anticorpos secundários conjugados com HRP (Biosharp, BL003A) à temperatura ambiente por 1 h. A membrana foi visualizada usando Super ECL Plus (US EVERBRIGHT, S6009L). Após a exposição, a membrana foi corada com uma solução de azul de metileno para verificar a consistência do mRNA carregado entre os diferentes grupos.

Análise de Imunoprecipitação de RNA Metilado‐qPCR (MeRIP‐qPCR)
Ensaio MeRIP refere-se ao método anterior com pequenas modificações.[ ] Resumidamente, 50 µg de RNA foram ajustados para 100 µl e fragmentados usando um BioRuptor (Diagenode) com ciclo de 30 s ligado/desligado por 30 ciclos. Um décimo do mRNA fragmentado foi salvo como controle de entrada. O outro mRNA fragmentado foi imunoprecipitado com anticorpo N6-metiladenosina (NEB, E1610S) acoplado a Pérolas Magnéticas de Proteína G (NEB, S1430) em tampão de imunoprecipitação a 4 °C por 4 h, seguido de eluição, precipitação e salvo como amostras IP. O enriquecimento de m6A foi determinado por análise de qPCR. Os primers específicos utilizados foram desenhados de acordo com um preditor de sítios m6A, SRAMP, e as sequências são as seguintes (5′‒3′).
Cyp8b1-MeRIP-qPCR-Forward: CCATAAGACGCCATCCCTCC.
Cyp8b1-MeRIP-qPCR-Reverse: GGCTCGATTCCATTGAGCAAC.
Análise de Estabilidade do mRNA
Culturas celulares foram suplementadas com actinomicina D (Sigma-Aldrich, A9415) a 5 µg mL⁻¹ para inibir a produção de mRNA. Amostras totais de RNA foram coletadas após incubação por 0, 3, 6 e 9 h e os níveis de expressão de mRNA foram detectados por análise de qPCR.[ ]
Sequenciamento de rDNA 16S
Amostras de fezes frescas foram coletadas, imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a −80 °C. O DNA bacteriano foi extraído usando o QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, 51-504) seguindo as instruções do fabricante. Primers específicos (338F, 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′; 806R, 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) foram utilizados para amplificar a região V3-V4 do gene rRNA 16S, e os produtos de amplificação foram sequenciados na plataforma Illumina MiSeq na Majorbio Bio-Pharm Technology Co. Ltd. As leituras de sequenciamento foram agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com 97% de similaridade de sequência. A análise bioinformática da microbiota intestinal foi realizada usando a plataforma Majorbio Cloud (https://cloud.majorbio.com). A análise de tamanho de efeito por análise discriminante linear (LEfSe) foi realizada para identificar os táxons de bactérias significativamente abundantes entre os diferentes grupos.
Análise de Metabolômica Não Direcionada
Os metabólitos de amostras de soro e sobrenadantes de cultura bacteriana foram extraídos com tampão (metanol: água, 4:1). A análise LC-MS/MS dos metabólitos foi realizada pelo sistema Thermo UHPLC-Q Exactive HF-X (Thermo) na Novogene Technology Co. Ltd. A análise bioinformática dos metabólitos foi realizada usando a plataforma NovoMagic Cloud (https://magic.novogene.com).
Análise Estatística
A análise estatística foi realizada usando o software SPSS (versão 22), enquanto o GraphPad Prism (versão 8.0.2) foi utilizado para visualizar os dados para gráficos. A significância entre os grupos foi analisada usando teste t não pareado ou ANOVA de uma via após teste de homogeneidade de variâncias com o teste de Levene. A ANOVA de duas vias com comparações múltiplas de Bonferroni foi usada para comparações de múltiplos fatores. Todos os dados foram apresentados como média ± DP e considerados p < 0,05 como estatisticamente significativo. * ou # p < 0,05, ** ou ## p < 0,01 e *** ou ### p < 0,001.
Conflito de Interesses
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Contribuições dos Autores
X.W. e J.L. conceberam o projeto. J.L., Y.L., C.H., T.Y., R.T. e Z.X. realizaram o trabalho experimental sob a supervisão de X.W., J.L. e Y.L. foram os principais contribuidores na condução do estudo, coleta e análise de dados, interpretação de dados. J.L. escreveu e C.H. revisou o manuscrito. X.W. projetou o projeto e forneceu a aprovação final do manuscrito.
Informações de Suporte
Declaração de Disponibilidade de Dados
Todos os conjuntos de dados gerados no presente estudo estão disponíveis mediante solicitação razoável ao autor correspondente (xinxiawang@zju.edu.cn).