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pmid: "32041991"
title: "Proantocianidinas de mirtilo selvagem moldam um perfil distinto da microbiota intestinal e influenciam a homeostase da glicose e fenótipos intestinais em camundongos alimentados com alto teor de gordura e alta sacarose."
authors: "Rodríguez-Daza MC, Daoust L, Boutkrabt L, Pilon G, Varin T, Dudonné S, Levy É, Marette A, Roy D, Desjardins Y"
journal: "Scientific reports"
pubdate: "2020 Feb 10"
doi: "10.1038/s41598-020-58863-1"
source: "PMC Full Text"

Proantocianidinas de mirtilo selvagem moldam um perfil distinto da microbiota intestinal e influenciam a homeostase da glicose e fenótipos intestinais em camundongos alimentados com alto teor de gordura e alta sacarose.

Autores

Rodríguez-Daza MC, Daoust L, Boutkrabt L, Pilon G, Varin T, Dudonné S, Levy É, Marette A, Roy D, Desjardins Y

Periodico

Scientific reports (2020 Feb 10)

Conteudo

Proantocianidinas de mirtilo silvestre moldam um perfil distinto da microbiota intestinal e influenciam a homeostase da glicose e fenótipos intestinais em camundongos alimentados com dieta rica em gordura e sacarose

Os mirtilos são uma fonte rica em polifenóis, amplamente estudados para a prevenção ou atenuação de doenças metabólicas. No entanto, a contribuição para a saúde e os mecanismos de ação dos polifenóis dependem do seu tipo e estrutura. Aqui, avaliamos os efeitos de um extrato polifenólico de mirtilo silvestre (WBE) (Vaccinium angustifolium Aiton) sobre parâmetros cardiometabólicos, composição da microbiota intestinal e histologia do epitélio intestinal em camundongos obesos induzidos por dieta rica em gordura e sacarose (HFHS) e determinamos qual fração polifenólica constitutiva (BPF) foi responsável pelos efeitos observados. Para isso, o extrato total foi separado em três frações: F1) Antocianinas e ácidos fenólicos, F2) proantocianidinas oligoméricas (PACs), ácidos fenólicos e flavonóis (grau de polimerização das PACs DP < 4) e F3) polímeros de PACs (PACs DP > 4), e fornecidas em suas respectivas concentrações no extrato total. Após 8 semanas, o WBE reduziu a AUC do OGTT em 18,3% em comparação com os roedores tratados com HFHS, e a fração F3 foi a que mais contribuiu para esse efeito. A fração F1, rica em antocianinas, não reproduziu essa resposta. O WBE e as BPF restauraram a camada de muco colônico. Particularmente, a fração F3, rica em PACs poliméricas, aumentou o número de células caliciformes secretoras de mucina. O WBE causou uma proporção significativamente 2 vezes maior de Adlercreutzia equolifaciens, enquanto a fração F2, rica em PACs oligoméricas, aumentou em 2,5 vezes a proporção de Akkermansia muciniphila. Este estudo revela o papel fundamental das PACs do WBE na modulação da microbiota intestinal e na restauração da camada de muco epitelial colônico, fornecendo um nicho ecológico adequado para bactérias simbióticas associadas à mucosa, o que pode ser crucial para desencadear os efeitos benéficos dos polifenóis do mirtilo para a saúde.

Introdução
Mirtilos silvestres (Vaccinium angustifolium Aiton) são reconhecidos como uma rica fonte de compostos fenólicos bioativos, cujo consumo tem sido associado à atenuação de distúrbios metabólicos por meio de sua ação benéfica na homeostase da glicose e na redução do estresse oxidativo e da inflamação intestinal. Até agora, esses efeitos positivos foram predominantemente atribuídos aos flavonoides e, em particular, às antocianinas. No entanto, o mirtilo silvestre apresenta um perfil complexo de polifenóis bioativos; além das antocianinas, contém ácido clorogênico, e oligômeros e polímeros de flavan-3-óis, como as proantocianidinas (PACs). Curiosamente, há evidências crescentes mostrando que as PACs podem atenuar a progressão da síndrome metabólica, incluindo diabetes tipo 2 e obesidade. Estudos pré-clínicos sugeriram diferentes mecanismos pelos quais as PACs regulam a saúde metabólica, variando desde sinalização imunomoduladora, estimulação do metabolismo da glicose e dos lipídios, redução da endotoxemia metabólica, bem como por meio da inibição de enzimas digestivas. No entanto, como as PACs de alto peso molecular são mal absorvidas no intestino delgado, elas atingem o intestino grosso, onde interagem com a microbiota intestinal e exercem efeitos semelhantes aos prebióticos.
Uma homeostase intestinal perturbada e alterações na diversidade e composição taxonômica da microbiota intestinal (ou seja, disbiose) foram encontradas para afetar a resposta imune intestinal e contribuir para a patogênese da obesidade e diabetes tipo 2; pode, portanto, representar novos fatores de risco para esses distúrbios metabólicos. Da mesma forma, a inflamação epitelial intestinal e a camada de muco alterada levam ao aumento da permeabilidade epitelial e estão especificamente associadas a uma microbiota intestinal alterada. Entre os fatores do estilo de vida que afetam a diversidade microbiana intestinal, a qualidade da dieta é de suma importância e contribui significativamente para a determinação da composição da microbiota intestinal. Nesse contexto, os polifenóis de frutas vermelhas, incluindo o mirtilo selvagem, demonstraram recentemente promover significativamente a abundância de bactérias benéficas envolvidas na atenuação de distúrbios associados à obesidade e disbiose. De fato, em ratos alimentados com dieta rica em gordura, a suplementação com pó de mirtilo por 8 semanas melhorou a sensibilidade à insulina e a inflamação sistêmica em associação com grandes mudanças na composição da microbiota intestinal. Em humanos, um estudo de intervenção dietética cruzada revelou efeitos prebióticos do mirtilo selvagem na abundância relativa de Bifidobacterium spp. Além disso, uma fração polifenólica de mirtilo highbush e uma fração enriquecida com antocianinas atenuaram a disfunção da barreira intestinal induzida por E. coli em um modelo de cultura de células epiteliais Caco-2. Embora essas descobertas tenham sido obtidas usando diferentes metodologias e sistemas modelo, juntas elas fornecem evidências fortes para sugerir que os polifenóis do mirtilo selvagem podem modular seletivamente a composição da microbiota intestinal e prevenir distúrbios intestinais e metabólicos associados à obesidade. No entanto, ainda não sabemos qual tipo de polifenol está fornecendo esses efeitos benéficos e os mecanismos subjacentes.

Uma melhor compreensão da influência de polifenóis específicos do mirtilo na microbiota intestinal e no epitélio intestinal é crucial para entender seu papel nos distúrbios metabólicos associados à obesidade. Nossa hipótese é que a microbiota intestinal, o epitélio colônico do hospedeiro e o perfil de muco são características-chave pelas quais os PACs oligoméricos e poliméricos não absorvíveis podem melhorar a homeostase intestinal e metabólica perturbada associada a uma dieta obesogênica. Além disso, a identificação de comunidades bacterianas com capacidade única de degradação fenólica pode revelar consórcios bacterianos específicos que desencadeiam bioatividades benéficas no hospedeiro.
No presente estudo, avaliamos a contribuição de frações polifenólicas específicas encontradas em mirtilos silvestres inteiros para seu impacto benéfico sobre desfechos intestinais e metabólicos em um modelo de obesidade induzida por dieta em camundongos. Investigamos o impacto da administração oral do extrato de mirtilo silvestre (extrato hidroetanólico, WBE) ou de três frações polifenólicas (antocianinas e ácidos fenólicos, PACs oligoméricos com flavonóis e ácidos fenólicos, e PACs poliméricos nas respectivas quantidades encontradas no extrato de mirtilo inteiro) sobre a intolerância à glicose induzida pela dieta, sensibilidade à insulina e na composição da microbiota intestinal, bem como na histologia do epitélio intestinal.
Resultados
Caracterização fenólica do WBE e das frações polifenólicas
Conteúdo fenólico na dosagem do extrato de mirtilo e frações polifenólicas em camundongos. Camundongos C57BL/6J foram alimentados com uma dieta HFHS e tratados com veículo (água); 200 mg/kg de peso corporal (PC) de extrato de mirtilo silvestre (WBE) contendo 17 mg de polifenóis; 37 mg/kg PC da fração F1 rica em antocianinas e ácidos fenólicos; 53 mg/kg PC da fração F2 rica em PACs oligoméricos, ácidos fenólicos e flavonóis; e 37 mg/kg PC da fração F3 rica em PACs poliméricos por 8 semanas. A dose de cada fração administrada aos camundongos foi calculada para fornecer a mesma concentração de antocianinas, oligômeros de PACs e polímeros de PACs encontrada no extrato de mirtilo inteiro (frações F1, F2 e F3, respectivamente).
A caracterização polifenólica dos extratos e frações é apresentada na Tabela S1 das Informações Complementares. A justificativa para o fracionamento do extrato polifenólico de mirtilo silvestre (WBE) foi determinar qual classe e tipo de polifenol, ou seja, antocianinas, oligômeros de PACs ou polímeros de PACs, era responsável pelos efeitos observados no WBE total. Para isso, o WBE total foi fracionado em três partes: F1) antocianinas e ácidos fenólicos, F2) proantocianidinas oligoméricas (PACs), ácidos fenólicos e flavonóis (grau de polimerização de PACs DP < 4), e F3) polímeros de PACs (PACs DP > 4) (Fig. 1) e fornecidos em suas respectivas concentrações no extrato total. Ou seja, duzentos mg de WBE por kg de peso corporal (PC) de camundongo forneceram uma dose diária de 17,03 mg de polifenóis totais, incluindo ácidos fenólicos, flavonóis, antocianinas, oligômeros e polímeros de PACs. 32,01 mg/kg PC da fração F1 administrada aos camundongos representou a proporção de antocianinas contidas no WBE total de 200 mg/kg PC (ou seja, 1,68 mg), enquanto 53 mg/kg PC da fração F2 forneceu a dose diária equivalente de PACs oligoméricos (ou seja, 4,43 mg) e 37,21 mg/kg PC da fração F3 forneceu uma dose equivalente de PACs poliméricos fornecida pelo WBE (ou seja, 1,95 mg). A caracterização detalhada da dosagem dos extratos por camundongo é apresentada na Fig. 1. Vale ressaltar que a dose utilizada neste estudo em camundongos representa uma dose viável em humanos. Aplicando as diretrizes da Food and Drug Administration dos EUA para estabelecer a dose equivalente humana com base na área de superfície corporal, descobrimos que uma dose de 17 mg/kg seria o equivalente humano de uma dose de 200 mg/kg em camundongos.

O ganho de peso e a adiposidade não foram afetados pelo WBE e BPF

Como esperado, o consumo de uma dieta HFHS por 8 semanas aumentou significativamente o peso corporal e o ganho de peso corporal dos camundongos em comparação com os camundongos alimentados com ração (Informações Complementares Fig. S1A,B). Isso foi explicado pelo aumento da ingestão energética (Informações Complementares Fig. S1C). A ingestão energética foi ligeiramente, mas significativamente, reduzida na semana 2 nos animais tratados com WBE e com a fração F2 em comparação com o grupo controle HFHS (p < 0,05) (Informações Complementares Fig. S1C). Esse efeito foi transitório e nenhuma diferença na ingestão energética total foi observada durante toda a duração do experimento (HFHS, 600,7 ± 15,88 kcal; WBE, 583,2 ± 9,69 kcal; F1, 589,0 ± 12,17 kcal; F2, 577,6 ± 11,49 kcal; F3, 574,7 ± 9,06 kcal). Os tecidos adiposos viscerais aumentaram significativamente no grupo controle HFHS em comparação com os camundongos alimentados com ração (p < 0,05). No entanto, camundongos gavados com WBE e BPF apresentaram massa visceral semelhante, sem diferenças significativas em comparação com os camundongos tratados com veículo HFHS (Informações Complementares Fig. S1D).

O WBE total e a F3 rica em PACs poliméricos melhoraram a tolerância à glicose em camundongos alimentados com HFHS
Camundongos alimentados com WBE total e fração rica em PACs poliméricos apresentaram melhora na tolerância à glicose. Camundongos C57BL/6J foram alimentados com dieta rica em gordura e sacarose (HFHS) e tratados com veículo (água), WBE ou uma fração de BPF: antocianinas e ácidos fenólicos (F1), PACs oligoméricos, ácidos fenólicos e flavonóis (F2) e PACs poliméricos (F3) por 8 semanas. (A) Teste oral de tolerância à glicose (OGTT) foi realizado com jejum de 12 horas na 8ª semana de tratamento; (B) Área sob a curva (AUC) do OGTT calculada entre o basal e 120 min; (C) Níveis de insulina foram medidos durante o OGTT; (D) AUC do nível de insulina durante o OGTT foi calculada; (E) Medidas de glicose sanguínea durante o teste de tolerância à insulina (ITT) foi realizado em camundongos em jejum por 6 horas na 6ª semana de tratamento; (F) Modelo de avaliação homeostática da resistência à insulina (HOMA-IR). O teste t de Student foi aplicado para calcular a significância da diferença entre o grupo controle (ração padrão) e o grupo HFHS. ANOVA de uma via com teste post hoc de Dunnett foi aplicada para calcular diferenças significativas entre os grupos. ANOVA de medidas repetidas de duas vias com teste post hoc de Dunnett foi aplicada para calcular a significância entre grupos em diferentes pontos de tempo. Os valores são expressos como média ± EPM (n = 12/grupos). p < 0,05 comparado ao HFHS; Controle vs HFHS #p < 0,05, ###p < 0,001.
A avaliação adicional da homeostase da glicose foi determinada pelo teste oral de tolerância à glicose (OGTT) (Fig. 2A). A tolerância à glicose estava marcadamente deteriorada nos camundongos HFHS tratados com veículo, conforme revelado pelo aumento significativo da área sob a curva (AUC) do OGTT em comparação com os camundongos alimentados com ração padrão (p < 0,05). Embora a glicemia de jejum não tenha sido diferente entre os camundongos tratados com WBE e BPF e o grupo HFHS tratado com veículo, observamos uma melhora significativa na tolerância à glicose em camundongos tratados com WBE e F3 (PACs poliméricos), indicada por uma redução significativa da AUC de 18,25 e 18,52%, respectivamente (p < 0,05), enquanto uma tendência de diminuição da AUC (17,68%, p = 0,0566) também foi observada em camundongos alimentados com a fração F2 em comparação com HFHS (Fig. 2B). Os camundongos alimentados com HFHS eram resistentes à insulina em comparação com os camundongos alimentados com ração padrão, conforme indicado pela secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) elevada (Fig. 2C,D), pela tolerância à insulina prejudicada (Fig. 2E) e pelo índice HOMA-IR (Fig. 2F). No entanto, nenhum efeito significativo nos parâmetros acima foi observado em camundongos alimentados com WBE e BPF em comparação com o grupo alimentado com HFHS.
A fração de PACs poliméricos (F3) aumentou o número total de GC em camundongos alimentados com HFHS
Frações polifenólicas de mirtilo selvagem restauram a espessura do muco e a fração rica em PACs poliméricos estimulou significativamente o número de células caliciformes secretoras de mucina no cólon de camundongos alimentados com dieta HFHS. O efeito da dieta HFHS e da suplementação com WBE e BPF: antocianinas e ácidos fenólicos (F1), PACs oligoméricos, ácidos fenólicos e flavonóis (F2) e PACs poliméricos (F3) foram estudados na morfologia do cólon de camundongos. Uma combinação de coloração Azul Alciano e ácido periódico-Schiff (AB/PAS) foi usada para distinguir mucinas ácidas (azul escuro) e neutras (vermelho). A cor roxa indica a presença de mucinas ácidas e neutras. As imagens mostradas são representativas dos camundongos examinados (n = 12) em cada grupo: (A-1) Chow; (A-2) HFHS; (A-3) WBE; (A-4) F1; (A-5) F2; (A-6) F3. As imagens foram obtidas usando objetiva UPLSAPO 20×/0,75, ampliação 12,6×, escala 50 μm. As setas indicam a espessura do muco (MT) medida usando o software Image J. O círculo envolve uma cripta colônica. Dentro de cada cripta, as células caliciformes preenchidas com mucina (GC) foram contadas. Os parâmetros histológicos foram avaliados em cortes transversais de tecidos do cólon corados com AB/PAS: (b) Espessura do muco, (c) Profundidade da cripta, (d) Número total de GC por µm de cripta e (e) Tipos de GC preenchidas com mucina. Os dados são apresentados como Média ± EPM (n = 12/grupo). Diferenças significativas foram determinadas por ANOVA de uma via comum. Os valores são expressos como média +/− EPM. p < 0,01## em comparação com Chow, p < 0,01* e p < 0,05* em comparação com HFHS, respectivamente.
A camada de muco intestinal possui importantes propriedades protetoras e lubrificantes no cólon e pode ser afetada por uma disbiose induzida por dieta rica em gordura e açúcar (HFHS), aumentando assim o risco de exposição da mucosa colônica à microbiota comensal. Isso nos motivou a investigar os efeitos dos polifenóis do mirtilo silvestre na histomorfologia da mucosa do cólon de camundongos, incluindo o comprimento das criptas, o número de células caliciformes (CC) secretoras de mucina e a espessura da camada de muco. Imagens representativas de tecidos colônicos corados com AB-PAS são apresentadas na Fig. 3A1–6. Em camundongos alimentados com ração padrão, uma espessa camada de muco corada em roxo foi consistentemente observada, com a camada interna de muco intimamente associada ao epitélio colônico e um muco secretado disperso no espaço luminal. A camada de muco era mais fina e esparsa no grupo HFHS tratado com veículo (Fig. 3A-2) em comparação com os animais alimentados com ração padrão. No entanto, os camundongos tratados com WBE e BPF apresentaram uma espessura de muco restaurada em comparação com o grupo controle HFHS (Fig. 3A3–6). Camundongos alimentados com HFHS apresentaram uma camada de muco mais fina em comparação com os camundongos alimentados com ração padrão (p < 0,01, Fig. 3B). No entanto, todos os camundongos suplementados por via oral com WBE (p < 0,01), F1 (p < 0,01), F2 (p < 0,05) ou F3 apresentaram uma camada de muco significativamente mais espessa em comparação com os camundongos alimentados com HFHS tratados com veículo (p < 0,05). Nenhuma diferença na profundidade das criptas foi observada entre os camundongos tratados com WBE e todos os BPF e os camundongos controle HFHS tratados com veículo (Fig. 3C). Embora tenhamos observado que a camada de muco nos camundongos alimentados com HFHS tratados com veículo era mais fina em comparação com o grupo da ração padrão, não houve diferenças significativas no número total de CC secretoras de mucina. Uma vez normalizado pelo comprimento da cripta (número de CC por μm de criptas colônicas), apenas os camundongos alimentados com a fração F3 rica em PACs poliméricos apresentaram um número aumentado de CC total em comparação com os camundongos alimentados com HFHS tratados com veículo (p < 0,05) (Fig. 3D).
Consistente com as múltiplas funções do muco, está bem estabelecido que as GC produzem uma gama heterogênea de subtipos de mucinas secretoras e podem ser identificadas como mucinas ácidas, neutras e como uma mistura de ambas. As mucinas ácidas são ainda diferenciadas em grupos de sialomucinas ou sulfomucinas, com base na presença de ácido siálico terminal ou grupo sulfato nas cadeias de oligossacarídeos O-ligados. Portanto, classificamos o número total de GC considerando o tipo de mucina policromática AB/PAS separadamente, resultando na determinação específica de GC preenchidas com mucina ácida, GC preenchidas com mucina mista e GC preenchidas com mucina neutra, bem como aquelas GC sem mucina que foram consideradas como GC vazias de mucina. Uma mistura de mucinas neutras e ácidas (mucina corada em púrpura, GC de mucina mista) foi predominantemente encontrada nas GC do cólon nos grupos tratados com BPF (F1, 84,2%; F2, 85,3%; e F3, 83,4%; em comparação com camundongos alimentados com HFHS tratados com veículo, 80,2%) (Fig. 3E). No entanto, em camundongos alimentados com WBE, as GC preenchidas com mucina neutra mostraram uma proporção aumentada (20,2%) em comparação com camundongos alimentados com HFHS (8,6%, p < 0,05) (Fig. 3E). Em contraste, as GC restantes em camundongos alimentados com HFHS tiveram uma proporção maior de GC não preenchidas com mucina (11%) em comparação com o WBE (2,2%) (p = 0,0358, q = 0,093 após correções de comparações múltiplas), e camundongos tratados com BPF (F1, 3,3%; F2. 2,7%; e F3, 6,4%) (F1, p = 0,0536 q = 0,0938; F2, p = 0,0338 q = 0,093).
Para investigar a influência dos polifenóis do mirtilo selvagem na permeabilidade intestinal, a expressão gênica de Tjp1 (proteína de junção tight, também conhecida como Zonula occludin, ZO-1) e Ocln (Ocludina) foi medida usando RT-qPCR e não foram encontradas alterações significativas entre camundongos alimentados com HFHS tratados com veículo e camundongos alimentados com ração padrão em comparação com camundongos tratados com WBE e BPF (Fig. S2A,B).
WBE e BPF não afetaram a riqueza microbiana da microbiota intestinal de camundongos obesos induzidos por dieta HFHS
Para determinar se a dieta HFHS afetou a diversidade microbiana fecal e se os tratamentos com polifenóis de mirtilo poderiam modificar esse parâmetro, analisamos em seguida os índices de diversidade alfa e beta. As curvas de rarefação das sequências normalizadas mostraram que nosso sequenciamento foi suficientemente profundo para incluir todas as OTUs nos grupos de dieta (Fig. S3). Todos os tratamentos, incluindo os camundongos alimentados com ração padrão tratados com veículo e os alimentados com HFHS, exibiram quase o mesmo índice de diversidade α usando o índice Chao1, uma estimativa da riqueza de OTUs para comunidades microbianas (Fig. S3A). Não houve diferenças significativas no número de espécies observadas nos camundongos tratados com polifenóis em comparação com os camundongos alimentados com HFHS, conforme determinado pelo teste de Kruskal-Wallis com correção de comparação múltipla de Benjamini. Uma resposta semelhante foi observada entre os camundongos tratados com BPF e os camundongos alimentados com HFHS quanto à abundância de espécies e ao índice de diversidade de Shannon (P > 0,05) (Fig. S3B).
Análise de dissimilaridade da composição da microbiota intestinal entre grupos e abundância relativa média de táxons bacterianos nos níveis de filo, família e gênero após 8 semanas de suplementação dietética. Os gráficos de coordenadas principais (PCoA) exibiram uma dispersão diferente das comunidades fecais microbianas da WBE. Medidas quantitativas não filogenéticas foram aplicadas como métricas de β-diversidade para calcular as distâncias entre todas as amostras fecais de camundongos. (a) A matriz de Bray-Curtis das amostras rareficadas para 6.957 sequências revelou diferenças significativas entre os grupos (PERMANOVA, R-quadrado: 0,37968; valor de p < 0,001). Cada ponto amostral (n = 12/grupo) é codificado por cor com base na dieta administrada por 8 semanas (S8), conforme mostrado em cada legenda da figura. (b) Diferentes razões Firmicutes/Bacteroides são mostradas para camundongos controle alimentados com ração padrão (chow) e HFHS na semana 8. Camundongos alimentados com dieta HFHS e suplementados com WBE e BPF: antocianinas e ácidos fenólicos (F1), PACs oligoméricos, ácidos fenólicos e flavonóis (F2) e PACs poliméricos (F3) apresentaram variações nas proporções de sequências distribuídas em (c) Quatro filos bacterianos, (d) Onze famílias e (e) vinte gêneros atribuídos. A significância estatística na β-diversidade entre os grupos de amostras foi avaliada com o teste não paramétrico de Análise de Variância Multivariada Permutacional (PERMANOVA, 999 permutações de Monte Carlo). O teste de Kruskal-Wallis com correção post-hoc de múltiplas comparações de Benjamini em comparação com HFHS foi usado para identificar alterações significativas nas proporções taxonômicas, p < 0,01##. Os valores são expressos como média +/− EPM.

Como esperado, a dieta HFHS alterou drasticamente a composição da microbiota intestinal em comparação com a dieta padrão (chow). A PERMANOVA para a matriz de Bray-Curtis revelou diferenças significativas entre o grupo chow tratado com veículo e os grupos HFHS e tratados com BPF (PERMANOVA, R-quadrado: 0,37968; valor de p < 0,001). O índice de β-diversidade de Bray-Curtis mostrou ainda que as comunidades associadas ao grupo chow e aos camundongos alimentados com HFHS tratados com veículo divergiram dentro de uma região confinada no PCoA (Fig. 4A). Especificamente, a distribuição dos camundongos ao longo do eixo PC1 refletiu a diferença do perfil microbiano entre camundongos alimentados com chow versus dieta HFHS, explicando 39% da variância. Embora tenha havido diferenças na proporção relativa de algumas OTUs bacterianas identificadas, a β-diversidade da microbiota intestinal permaneceu semelhante entre os camundongos alimentados com as dietas contendo polifenóis. Os camundongos alimentados com a WBE, a BPF e a dieta controle HFHS agruparam-se de forma semelhante; este não foi o caso dos camundongos alimentados com a WBE, que tenderam a se dispersar para fora do grupo HFHS tratado com veículo.
Os táxons bacterianos dentro das famílias Coriobacteriaceae e Verrucomicrobiaceae foram influenciados pela WBE e pela fração F2 rica em PACs oligoméricos em camundongos obesos induzidos por dieta HFHS.
Proporções médias de táxons bacterianos por sequenciamento do gene 16S rRNA e diferenças significativas na proporção média relativa de A. muciniphila e A. equolifaciens por qPCR em camundongos tratados com polifenóis de mirtilo e grupo controle HFHS. Amostras fecais de camundongos alimentados com HFHS foram analisadas por sequenciamento do gene 16S rRNA e análise de qPCR da cópia do gene 16S rRNA para Adlercreutzia equolifaciens e Akkermansia muciniphila foram realizadas para validar os dados obtidos pelo método de sequenciamento de alto rendimento do 16S rRNA após 8 semanas de tratamento dietético com WBE e BPF: antocianinas e ácidos fenólicos (F1), PACs oligoméricos, ácidos fenólicos e flavonóis (F2) e PACs poliméricos (F3). Proporção relativa de sequências de (a) Adlercreutzia equolifaciens, (b) Um gênero não atribuído da família S24-7 e (c) Akkermansia muciniphila; a proporção relativa da cópia do gene 16S rRNA determinada por qPCR de (d) Um gênero não atribuído da família Ruminococcaceae; (e) Um gênero não atribuído da família Peptostreptococcaceae; (f) A proporção relativa de Akkermansia muciniphila em relação ao total de bactérias; (g) Variação dobra (fold-change) da proporção de Akkermansia muciniphila em relação ao HFHS (h) Variação dobra (fold-change) da proporção de Adlercreutzia equolifaciens em relação ao HFHS; (i) A análise de correlação de Spearman foi realizada para comparar os dados obtidos do sequenciamento do 16S rRNA versus a proporção relativa do 16S rRNA obtida por qPCR, Estatística: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 para qPCR vs dados de sequenciamento do gene 16S rRNA. Os valores são expressos como média +/− EPM. Teste de Kruskal-Wallis com correção de comparação múltipla post-hoc de Benjamini em comparação com HFHS *p < 0,05 e **p < 0,01. Teste U de Mann-Whitney PACs < 4 vs HFHS #p < 0,05.
Análise da abundância relativa bacteriana confirmou relatos anteriores de que o consumo de uma dieta rica em gordura e açúcar (HFHS) afeta consistentemente a proporção de Bacteroidetes (19%) e Firmicutes (59%), em comparação com uma dieta padrão (53% e 35%, respectivamente) (p < 0,001), resultando em uma maior razão Firmicutes/Bacteroidetes (F/B) nos grupos tratados com HFHS (Fig. 4B,C). A análise em nível de filo mostrou que a maioria das diferenças composicionais entre camundongos alimentados com HFHS tratados com veículo, WBE e BPF foram refletidas na abundância relativa de Firmicutes, Bacteroidetes e, em menor grau, Verrucomicrobia e Actinobacteria (Fig. 4C). Nos camundongos tratados com WBE e BPF, as famílias Coriobacteriaceae, S24-7, Verrucomicrobia e a ordem Clostridiales foram favorecidas em comparação com HFHS (Fig. 4D). Dentro das famílias, 20 gêneros diferentes foram identificados (Fig. 4E). Foram observadas mudanças importantes na proporção relativa dos gêneros Adlercreutzia, Akkermansia, um gênero desconhecido da ordem Clostridiales, família S24-7, bem como um gênero de Ruminococcaceae e Peptostreptococcaceae (Fig. 5A–E). Testes de Kruskal-Wallis com correções múltiplas de Benjamini mostraram uma redução significativa de um gênero não atribuído da família S24-7 pelo WBE em comparação com o grupo HFHS tratado com veículo (p < 0,05). Embora não tenha sido suportado estatisticamente, observamos que o BPF tendeu a aumentar a abundância de Akkermansia (família Verrucomicrobiaceae), apresentando a maior proporção nos camundongos tratados pela fração F2 rica em PACs oligoméricos (24,8%) e pela F3 rica em PACs poliméricos (21,2%) em comparação com HFHS (17,9%). O WBE não estimulou A. muciniphila. Além disso, gêneros não atribuídos pertencentes às famílias Ruminococcaceae e Peptostreptococcaceae foram aumentados em WBE e reduzidos em camundongos tratados com F2 (Fig. 5D,E). Da mesma forma, uma proporção aumentada de Adlercreutzia (família Coriobacteriaceae) foi observada nos camundongos alimentados com WBE (7,8%) e F2 (6,8%) em comparação com camundongos alimentados com HFHS (4,5%).
Análises de qPCR de amostras fecais de camundongos confirmaram os efeitos estimuladores do WBE e da fração F2 rica em PACs oligoméricos sobre a proporção relativa de A. muciniphila e A. equolifaciens.
A abundância relativa do gênero bacteriano distinto encontrado nos dados de sequenciamento de rRNA 16S pelo BPF foi posteriormente analisada por qPCR. Concentramos nossa atenção em duas espécies bacterianas consideradas importantes para a degradação de polifenóis e a atenuação de problemas metabólicos; Adlercreutzia equolifaciens e Akkemansia muciniphila. Curiosamente, a proporção de A. muciniphila foi significativamente estimulada pela fração F2 rica em PACs oligoméricos, mostrando uma proporção relativa 2,5 vezes maior da bactéria nas fezes desses camundongos em comparação com a do grupo HFHS (p < 0,05). Ao mesmo tempo, o WBE, que continha quantidade similar de PAC oligomérico, não estimulou A. muciniphila (Fig. 5F,G). De maneira similar, a proporção relativa de A. equolifaciens foi 2,0 vezes maior em ambos os grupos de camundongos tratados com o WBE e a fração F2 (p < 0,01 e p < 0,05 respectivamente) (Fig. 5H). Ambos os conjuntos de dados de qPCR e sequenciamento do gene rRNA 16S foram correlacionados para validar a abundância observada. Coeficientes de Spearman significativos foram obtidos para os grupos (p < 0,01) e mostraram perfil comparável desses táxons bacterianos pelos dois métodos de quantificação (Fig. 5I).
Análise funcional das comunidades microbianas em camundongos alimentados com polifenóis de mirtilo selvagem revelou vias relacionadas ao metabolismo de xenobióticos
A análise LEfSe das previsões do PICRUSt em camundongos alimentados com dieta HFHS tratados com veículo demonstrou flutuações nas vias funcionais atribuídas ao metabolismo de carboidratos, lipídios e energia e ao transporte de membrana em comparação com camundongos alimentados com ração padrão. No total, 21 vias foram significativamente afetadas pela dieta HFHS, em comparação com a suplementação com WBE, que mostrou afetar apenas
O objetivo deste estudo foi identificar frações polifenólicas de mirtilo que possam contribuir para os efeitos benéficos relatados do WBE na saúde metabólica, na composição da microbiota intestinal e na histologia intestinal de camundongos obesos induzidos por dieta HFHS. Observamos que as melhorias do WBE na tolerância à glicose coincidiram com uma modulação da abundância de famílias bacterianas como Coriobacteriaceae e Verrucomicrobiaceae e a manutenção da camada de muco colônico em um modelo murino de obesidade induzida por dieta e resistência à insulina. Também fornecemos novas evidências de que esse efeito é amplamente atribuível à fração enriquecida em polímeros de proantocianidina do mirtilo.
De fato, dentro do BPF, a fração F3 rica em PACs poliméricos parece contribuir mais para o efeito benéfico geral do extrato de mirtilo silvestre na histologia intestinal e na tolerância à glicose de camundongos alimentados com HFHS, enquanto a fração F2, rica em oligômeros de PACs, também tendeu a melhorar este último parâmetro (p = 0,0566). Apesar do fato de que os polímeros de PACs representavam apenas uma pequena fração dos polifenóis totais encontrados no WBE total, eles exerceram efeitos significativos na tolerância à glicose. Durante o OGTT, apesar de não haver alterações significativas na secreção de insulina nos animais tratados com PACs em comparação com o grupo controle, foi observada uma melhora na tolerância à glicose. Esses resultados podem sugerir uma melhora na ação da insulina, um efeito independente de insulina ou uma redução na absorção intestinal de glicose no grupo tratado com PACs. De fato, estudos anteriores relataram que os polifenóis podem interferir com SGLT1 e GLUT2 no intestino delgado. Nesse sentido, as proantocianidinas demonstraram imitar os efeitos da insulina ao afetar os transportadores de glicose intestinais e estimular os hormônios intestinais envolvidos na modulação da digestão e do metabolismo. Por exemplo, Casanova-Martí et al. demonstraram, tanto in vivo quanto ex vivo, o papel das proantocianidinas de semente de uva (GSPE) na indução da secreção de enterohormônios em diferentes partes do intestino, levando à regulação da homeostase da glicose. Os autores mostraram que o tratamento com GSPE aumentou os níveis de GLP-1 no íleo, enquanto as GSPEs não absorvidas e os metabólitos fenólicos microbianos fizeram o mesmo no cólon. Esses achados sugerem que polifenóis não absorvidos com alto grau de polimerização e compostos fenólicos metabolizados pela microbiota atuam nas células L enteroendócrinas para promover a secreção de GLP-1. Estudos adicionais serão necessários para determinar se a proteção contra a intolerância à glicose associada aos PACs poliméricos não absorvidos do mirtilo pode estar ligada a outros alvos intestinais relacionados à secreção de insulina pelas células beta pancreáticas ou à depuração hepática de insulina.
Neste estudo, constatou-se que a melhora na tolerância à glicose foi independente de alterações no peso corporal, consistente com estudos anteriores. Por exemplo, Seymour et al. não observaram qualquer alteração no ganho de peso corporal, massa magra e gordurosa, apesar da melhora na tolerância à glicose em ratos Zucker obesos alimentados com dieta rica em gordura (HFD) suplementada com 2% de pó de mirtilo. Além disso, Elks et al. descobriram que a suplementação com pó de mirtilo (4%) não afetou o ganho de peso corporal, mas atenuou significativamente a intolerância à glicose e a esteatose hepática em camundongos fêmeas obesas na pós-menopausa alimentadas com HFD.

Uma meta-análise recente de micróbios intestinais humanos associados à obesidade mostra associações fracas ou não significativas de táxons específicos ou diversidade geral com o índice de massa corporal, mas está se tornando evidente que os compostos polifenólicos podem remodelar distintamente as bactérias intestinais e exercer efeitos protetores locais e sistêmicos contra disfunções metabólicas induzidas por HFD. Observamos que os polifenóis do mirtilo não tiveram efeito na razão F/B, como marcador de disbiose intestinal induzida pela dieta; no entanto, observamos uma estimulação de espécies bacterianas-chave como A. muciniphila e A. equolifaciens pertencentes aos filos Verrucomicrobia e Actinobacteria, respectivamente, em camundongos alimentados com o WBE e a fração F2. Em camundongos alimentados com o WBE, uma diminuição na abundância relativa de S24-7 (classificada taxonomicamente como Muribaculaceae) foi coerente com a abundância reduzida do filo Bacteroidetes. A S24-7 é uma família bacteriana que se acredita estar envolvida na degradação de glicanos vegetais, glicanos do hospedeiro e carboidratos α-glucanos, mas dentro da composição da microbiota intestinal de camundongos C57-BL6, mostrou-se sensível à administração de antibióticos. Assim, supomos que as abundâncias reduzidas do táxon S24-7 são o resultado da ação antibacteriana do WBE total.
Alterações na microbiota intestinal têm sido propostas como um importante mecanismo de ação de polifenóis de alto peso molecular pouco absorvidos contra distúrbios metabólicos associados à obesidade.

O florescimento de A. muciniphila pela fração F2 rica em PACs oligoméricos é particularmente interessante, pois demonstrou-se que impulsiona a resposta imunomoduladora epitelial colônica e protege contra distúrbios metabólicos. Efeitos semelhantes na abundância de A. muciniphila também foram desencadeados por um extrato rico em elagitaninos de romã e camu-camu, por um extrato de uva rico em proantocianinas do tipo B, por um extrato de cranberry rico em proantocianinas do tipo A, bem como por lingonberries.

No presente experimento, não houve associação dessa bactéria com o ganho de peso corporal. Da mesma forma, Shin et al. demonstraram que o florescimento de A. muciniphila após o tratamento com metformina não afetou o ganho de peso corporal ou o acúmulo de massa gorda, mas melhorou a tolerância à glicose em camundongos alimentados com dieta rica em gordura (HFD).

Um estudo recente demonstrou que a administração de A. muciniphila neutralizou a endotoxemia metabólica induzida pela dieta, restaurou a disfunção da barreira mucosa do cólon e a homeostase da glicose em camundongos obesos diabéticos tipo 2.

Em nosso estudo, as alterações induzidas pela fração F2 na microbiota intestinal, e particularmente em A. muciniphila, embora convincentes, são um tanto surpreendentes, pois não foram reproduzidas no tratamento com WBE contendo os mesmos polifenóis que a F2 (oligômeros de PAC, ácidos fenólicos como ácido protocatecuico e ácido 5-cafeoilquínico, bem como flavonóis como quercetina). Supomos que os polifenóis não presentes na F2, nomeadamente antocianinas e polímeros de PAC, tenham atenuado a proliferação de Akkermansia nos camundongos tratados com WBE, provavelmente estimulando o crescimento de bactérias que competem com A. muciniphila. Observamos de fato que as famílias bacterianas associadas ao muco, Ruminococcaceae e Peptostreptococcaceae, foram estimuladas nos camundongos tratados com WBE e reduzidas nos tratados com F2 (Fig. 5D, E). Essas espécies podem ser mutuamente co-exclusivas com Akkermansia, conforme demonstrado por Lavelle et al. em um modelo humano de colite ulcerativa humana.
Notavelmente, a fração F2 também favoreceu A. equolifaciens pertencente à família Coriobacteriaceae, envolvida na degradação de compostos fenólicos incluindo flavan-3-ols, uma característica que explica sua proporção relativa aumentada nos tratamentos com WBE e PACs em comparação com camundongos tratados com veículo HFHS. Recentemente, Jiao et al. descobriram que Adlercreutzia era prevalente em camundongos alimentados com dieta de baixo teor de gordura em comparação com a obesidade induzida por dieta rica em gordura em camundongos C57BL/6J, e que a suplementação com extrato polifenólico de mirtilo aumentou sua abundância relativa. Interessantemente, estudos recentes não apenas demonstraram a capacidade de Adlercreutzia de converter – epigalocatequina (−EGC), -epicatequina (−EC), -catequina (−C), e +catequina (+C) em seus metabólitos correspondentes, mas também que ela pode catalisar os metabólitos acima por reações de hidroxilação e produzir uma gama de metabólitos fenil-valerolactonas presumidos de ter bioatividades metabólicas. Além disso, A. equolifaciens também foi observado como diminuído em indivíduos que sofrem de doença inflamatória intestinal (DII). Nesse estudo, A. equolifaciens foi considerada um biomarcador microbiano do restabelecimento da função mucosal naqueles pacientes que responderam positivamente a uma monoterapia com imunomoduladores.
Diretamente envolvida na homeostase intestinal, a camada de muco que cobre o epitélio colônico atua como uma barreira protetora contra os micróbios comensais luminais. Observamos que a suplementação com o WBE total e todos os BPF preveniu a perda de espessura do muco induzida pela dieta rica em HFHS.

Curiosamente, apenas os camundongos alimentados com a fração F3 rica em polímeros de PACs apresentaram um maior número de GC secretores de mucina colônica no epitélio em comparação com os camundongos alimentados com HFHS. Nossos resultados são comparáveis aos de outro estudo que examinou como a administração de PACs de cranberry neutralizou a morfologia e função intestinal alteradas, induzidas pela nutrição enteral elementar em camundongos.

Embora no presente estudo a expressão do gene Muc2 não tenha sido analisada, é bem conhecido que a exocitose de mucina e a função do muco são amplamente reguladas em nível pós-traducional e, portanto, a análise do conteúdo da proteína Muc2 por meio de técnica ex vivo, histológica ou por preparações de imuno-histoquímica em estudos futuros será útil para fornecer evidências complementares da melhora da função do muco e dos potenciais mecanismos envolvidos em nível molecular.

A avaliação histológica dos tecidos colônicos de camundongos mostrou uma clara melhora da barreira de muco pelo BPF, no entanto, as vias imunes inatas envolvidas na regulação e exocitose de mucina ainda precisam ser exploradas para compreender melhor os mecanismos subjacentes ao aumento da espessura do muco colônico.

Por exemplo, a via do inflamassoma NLRP6 foi demonstrada como um fator essencial para a auto-renovação da mucosa, proliferação celular e regulação da flora intestinal através da secreção de muco pelas GC e pelo epitélio. Curiosamente, um estudo recente demonstrou que um pó liofilizado de suco de amora rico em polifenóis promove a formação de inflamassomas NLRP6 e fornece proteção da mucosa ao modificar o conteúdo bacteriano e preservar o número de GC em camundongos com colite aguda induzida por DSS.
O tipo de mucinas secretadas é um parâmetro importante que pode ser afetado em distúrbios metabólicos intestinais. As proporções entre mucinas neutras e ácidas são normalmente constantes e são modificadas na obesidade e na DII. Em nosso experimento, diferenças significativas foram observadas na proporção de GC preenchidas com mucina neutra entre camundongos tratados com WBE (20,2%) e alimentados com HFHS (8,6%). As mucinas neutras geralmente têm sido associadas à mucina monossulfatada em GC localizadas na base da cripta colônica, um local onde as divisões celulares e a maturação da mucina parecem estar ativas. As GC localizadas no topo da cripta colônica abrigam principalmente sialomucinas ácidas. No caso dos camundongos tratados com BPF, foi observada uma tendência ao aumento da mucina mista ácida, sugerindo que o BPF pode induzir a secreção de sialomucinas, que são mais resistentes à degradação microbiológica do que as mucinas neutras e são impermeáveis às glicosidases bacterianas e proteases do hospedeiro. Perfil semelhante de mucina foi relatado em tecidos colônicos humanos normais, com predominância de mucina mista ácida (~80%) e mucina neutra esparsa (20%). Esses resultados destacam a modulação da maturação e do perfil do tipo de mucina como um mecanismo emergente pelo qual o polifenol do mirtilo silvestre pode manter a homeostase intestinal.

Uma limitação do presente estudo é que nossa abordagem metodológica para a preparação das frações polifenólicas não permitiu a obtenção de classes fenólicas puras, como foi o caso da fração rica em antocianinas (F1) e da fração rica em PACs oligoméricos (F2). Para confirmar os efeitos do WBE e do BPF, em particular, será necessário um fracionamento melhorado dos polifenóis do mirtilo silvestre, a fim de testar os efeitos seletivos dos oligômeros e polímeros de PAC na composição da microbiota intestinal (Akkermansia e Adlercreutzia) e na histologia, bem como nos fenótipos metabólicos relacionados em estudos futuros.
Em resumo, demonstramos que a administração oral de todos os BPF restabeleceu a espessura do muco colônico em camundongos obesos e, assim, criou um nicho ecológico para as bactérias simbióticas associadas à mucosa. Especificamente, a fração F2 exerceu uma ação prebiótica seletiva sobre a bactéria degradadora de mucina A. muciniphila, mas isso não ocorreu com o WBE. Curiosamente, também observamos um crescimento da família Coriobacteriaceae degradadora de polifenóis, em particular de A. equolifaciens, o que sugere seu envolvimento no metabolismo de polifenóis, o que é particularmente relevante, pois pode gerar moléculas bioativas envolvidas na melhora das alterações metabólicas na obesidade e no diabetes. Nosso estudo também revelou o importante papel que os PACs poliméricos desempenham na função da barreira epitelial intestinal, especialmente promovendo uma camada de muco mais espessa, possivelmente através do aumento do número de GC secretoras de mucina, bem como mediando a resposta glicêmica intestinal não dependente de insulina em camundongos obesos. Enquanto a administração de WBE atenuou a tolerância à glicose induzida por HFHS, apenas a fração F3 replicou esse efeito, embora essa fração estivesse em menor proporção no WBE total.
Métodos
Fracionamento de polifenóis
Um extrato hidroetanólico (70%) de mirtilo selvagem rico em polifenóis (Vaccinium angustifolium Aiton) (WBE) fornecido pela Diana Food Canada foi fracionado por cromatografia de filtração em gel, conforme descrito por Gu et al., para produzir três frações diferentes: a primeira, rica em antocianinas e ácidos fenólicos (F1); a segunda, rica em oligômeros de PACs, ácidos fenólicos e flavonóis (F2); e a última, rica em polímeros de PACs (F3). A purificação dos compostos de antocianina foi realizada utilizando 30 g de resina de troca catiônica (siliaPrepX SCX, silicycle, Canadá). Resumidamente, 75 g/l de WBE bruto solubilizado em água acidificada (1% de ácido acético) foi depositado na resina, e o WBE foi eluído com etanol 50% (Fração contendo flavonoides e PACs) e, em seguida, com metanol acidificado com 5% de HCl (F1 contendo antocianinas). A fração contendo antocianinas foi então passada através de resina XAD 7 para eliminar o HCl, que pode ser tóxico para camundongos, e posteriormente evaporada e liofilizada. A fração contendo flavonoides e PACs também foi evaporada e recuperada em solução de etanol/água (50/50: v/v). A purificação da fração rica em PACs foi realizada adicionalmente em uma coluna Sephadex LH-20, utilizando uma adaptação do protocolo de Feliciano et al. Uma coluna Redisep (Teledyne, Isco) contendo 65 g de Sephadex LH-20 (volume de leito = 100 ml) foi colocada em um sistema Spot Prep (Armen Instrument, França). O sistema está acoplado a um detector UV ajustado para 254 nm e a um detector de fluorescência (comprimento de onda de emissão: 230 nm – comprimento de onda de recepção: 321 nm). A vazão utilizada foi de 5 ml/min. Oligômeros de PACs e flavonoides foram isolados por eluição com metanol/etanol 50/50 (F2); e os polímeros de PACs foram eluídos com acetona 70% (F3). Para produzir a quantidade necessária para o estudo pré-clínico, várias separações consecutivas foram realizadas. As frações foram então homogeneizadas e caracterizadas.

Caracterização fenólica do extrato de mirtilo e das frações polifenólicas
A análise da composição de polifenóis foi realizada conforme descrito anteriormente. Flavonóis, flavan-3-óis e ácidos fenólicos foram analisados como publicado anteriormente, utilizando UHPLC-MS/MS de fase reversa, onde os dados foram adquiridos em modo de varredura (m/z 100–1000). As antocianinas foram analisadas por HPLC de fase reversa com detecção DAD utilizando um sistema Agilent 1100 series (Santa Clara, CA). A separação foi realizada com uma vazão de 1 mL/min utilizando uma coluna de fase reversa Develosil C18 (250 mm × 4 mm, tamanho de partícula 5 μm), protegida com uma coluna de guarda Ultrasep C18 (Phenomenex, CA). O gradiente binário de ácido fórmico a 5% em água ultrapura (solvente A) e metanol (solvente B) foi o seguinte para a separação das antocianinas: 0–2 min, 5% B; 2–10 min, 5–20% B; 10–15 min, 20% B; 15–30 min, 20–25% B; 30–35 min, 25% B; 35–50 min, 25–33% B; 50–55 min, 33% B; 55–65 min, 33–36% B; 65–70 min, 36–45% B; 70–75 min, 45–53% B; 75–80 min, 53–55% B; 80–84 min, 55–70% B; 84–88 min, 70–5% B; 88–90 min, 5% B. Os dados cromatográficos foram adquiridos a 520 nm e a quantificação foi realizada utilizando um padrão de cianidina 3-glicosídeo. A identificação das antocianinas foi alcançada por comparação dos tempos de retenção cromatográficos e informações espectrais de massa obtidas com dados publicados anteriormente. Os PACs foram analisados por HPLC de fase normal com detecção por fluorescência utilizando um sistema Agilent 1260/1290 infinity (Santa Clara, CA). A fluorescência foi monitorada nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 230 nm e 321 nm, respectivamente, e a quantificação do grau de polimerização (DP) de 1 a >10 foi realizada utilizando uma curva de calibração externa de epicatequina, aplicando um fator de correção de acordo com suas respectivas respostas na fluorescência.

Desenho experimental do estudo animal
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes do comitê de cuidados com animais da Universidade Laval (CPAUL). Os protocolos foram submetidos e aprovados pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCA). Camundongos machos C57BL/6J de seis semanas de idade (n = 72; Jackson Laboratories, Sacramento, CA, EUA) foram alojados individualmente em ambiente controlado (1 camundongo por gaiola; ciclo claro-escuro de 12/12 horas) com livre acesso a comida e água potável. Após duas semanas de aclimatação com dieta padrão de ração (dieta de roedores Teklad global 2018 com 18% de proteína, Harlan Laboratories), os camundongos foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n = 12/grupo) e alimentados com uma dieta Chow ou uma dieta HFHS (65% lipídios, 15% proteínas e 20% carboidratos). Os animais nas dietas controle (HFHS e Chow) foram tratados diariamente por gavagem com o veículo (água). Os grupos tratados com polifenóis foram alimentados com dieta HFHS e suplementados diariamente por gavagem com o extrato de polifenóis de mirtilo selvagem (WBE, 200 mg/kg, fornecendo 17 mg de polifenóis por dia) ou suas frações polifenólicas (BPF), que eram ricas em antocianinas e ácidos fenólicos (F1), em PACs oligoméricos, ácidos fenólicos e flavonóis (F2), ou em PACs poliméricos (F3). Para determinar a contribuição das diferentes classes de polifenóis do mirtilo na modulação da composição da microbiota intestinal e do perfil intestinal e metabólico do hospedeiro, a quantidade de BPF administrada aos camundongos representou a proporção respectiva de polifenóis de antocianinas (F1), PACs oligoméricos (F2) e PACs poliméricos (F3) contidos no WBE total. De acordo com o grupo, os animais receberam 32 mg/kg da fração F1, 53 mg/kg da fração F2 e 37 mg/kg da fração F3 (Fig. 1). O ganho de peso corporal foi medido em condição de não jejum, duas vezes por semana. O consumo alimentar foi avaliado monitorando o consumo de comida (g) três vezes por semana. Após 5 semanas e 7 semanas de tratamento, o teste de tolerância à insulina (ITT) e o teste oral de tolerância à glicose (OGTT) foram realizados, respectivamente. Fezes foram coletadas antes do início dos tratamentos (semana 0) e ao final (semana 8), imediatamente imersas em gelo seco e armazenadas a −80 °C para análises metagenômicas subsequentes. Após 8 semanas de alimentação, os camundongos foram anestesiados com isoflurano (2–3%; 0,5–1,5 L/min) e eutanasiados por punção cardíaca. Tecidos adiposos, órgãos e intestinos foram cuidadosamente dissecados; seu peso foi registrado e imediatamente imersos em nitrogênio líquido, RNA later (Invitrogen) ou em soluções de fixação (solução de Carnoy, formalina tamponada a 10%) de acordo com as análises subsequentes. Tecidos congelados foram então armazenados a −80 °C.
Homeostase da glicose
Após 5 semanas de tratamentos, os camundongos foram submetidos a jejum de 6 horas. Sangue foi coletado no basal e imediatamente centrifugado (3.500 rpm, 10 min a 4 °C). Solução de insulina foi administrada (10 μl/g de 0,65 U/kg) por injeção intraperitoneal, seguida por medições de glicemia usando um glicosímetro Accu-Check (Bayer) antes e aos 5, 10, 15, 20, 30 e 60 minutos após a injeção. Um teste oral de tolerância à glicose (TOTG) foi realizado após 7 semanas de tratamento dietético. Os camundongos foram submetidos a jejum de 12 horas durante a noite, uma amostra de sangue basal foi coletada e imediatamente centrifugada (3.500 rpm, 10 min a 4 °C). Solução de dextrose (2 μl/g de dextrose a 50%) foi administrada por gavagem e amostras de sangue (60 μl) foram obtidas da veia safena lateral do camundongo. A glicemia foi determinada usando um glicosímetro Accu-Check (Bayer) nos tempos 15, 30, 60, 90 e 120 minutos em relação à carga de glicose. A área sob a curva (AUC-TOTG) foi determinada considerando os níveis de glicose medidos entre o basal e 120 minutos após a sobrecarga de glicose (GraphPad Prism 7.0, EUA). O índice de resistência à insulina (HOMA-IR) foi calculado usando a fórmula: HOMA-IR = [glicemia de jejum (nmol/L) * insulinemia de jejum (µU/mL)/22,5]. As amostras de sangue em jejum de 12 horas foram coletadas para determinações de insulina plasmática. As amostras foram armazenadas a −80 °C até o ensaio. A insulina de camundongo foi determinada usando um kit ELISA ultrasensível (Alpco, Salem, EUA).
Os tecidos do cólon foram preparados conforme descrito anteriormente. Os tecidos do cólon lavados com PBS foram cortados em duas seções de tamanho igual (incisão transversal). Cada seção (aproximadamente 0,5 cm) do cólon foi colocada lado a lado em um pedaço de fita adesiva (fita cirúrgica 3M Micropore, largura de 2,5 cm) e, em seguida, apertada com pinça. Os feixes que envolviam os fragmentos do cólon foram transferidos para um tubo contendo um grande excesso de solução gelada de Methanol-Carnoy (60% metanol, 30% clorofórmio e 10% ácido acético glacial), com volume de fixador pelo menos 10 vezes o volume do tecido. As amostras foram armazenadas por 3 horas a 4 °C para permitir a fixação. Após a fixação, os tecidos foram lavados uma vez com etanol gelado a 70% e armazenados na mesma solução a 4 °C até serem processados. O processamento dos tecidos foi realizado no laboratório IBIS de Imagem Molecular e Microscopia, Universidade Laval (Québec, QC, Canadá). As amostras foram colocadas em cassete histológico identificado de forma indelével com um identificador único do animal e o nome do segmento intestinal. Os cassetes foram submetidos a um processador de tecidos para processamento padrão, a fim de permitir a inclusão em parafina (Tissue-Tek VIP, Processador de Infiltração a Vácuo, marca Sakura). O protocolo aplicado foi: Álcool 95% 45 min, Álcool 100% 3 × 45 min, Tolueno 2 × 45 min, Parafina 1h30, 2h00 e 4h00. Cortes de tecidos do cólon incluídos em parafina foram cortados e corados com ácido periódico de Schiff e azul alciano (AB-PAS). A coloração AB-PAS permite a diferenciação entre mucinas ácidas e mucinas neutras, com a cor azul indicando mucinas ácidas, a cor roxa indicando uma mistura de mucinas neutras e ácidas, e a cor vermelha/magenta indicando apenas mucinas neutras.
Quantificação de células caliciformes, espessura do muco e medidas de profundidade das criptas
As proporções relativas e a distribuição de GC secretoras de muco foram quantificadas seguindo os protocolos de Johnson et al. com algumas modificações. Todas as imagens foram capturadas usando um microscópio BX51 (Olympus America, Inc, EUA) equipado com um Sistema de Câmera Digital CCD e o software Image-Pro. O número de GC foi contado para uma distância definida (usando objetiva de 20X, escala de 50 μm). Um total de 12 criptas (3 criptas por secção) foram analisadas para cada camundongo. Inicialmente, as imagens foram obtidas com a objetiva de 4X (barras de escala de 200 μm) para examinar toda a secção do tecido. Isso foi usado para garantir que a área total das imagens capturadas em maior ampliação cobriria pelo menos 50% da secção do tecido. Posteriormente, sob objetiva de 20X, cada secção foi dividida em quatro quadrantes iguais e imagens representativas foram capturadas. Em cada quadrante, dentro de uma área delimitada (do epitélio em direção às criptas do cólon), o número total de GC foi contado, e os dados foram expressos como o número relativo de células por cripta (12 criptas de 12 camundongos por grupo). Para determinar os tipos específicos de células de mucina para o cólon de cada animal, as contagens totais de GC foram totalizadas separadamente (GC preenchidas com mucina neutra e mista, incluindo GC não preenchidas com mucina) e os dados foram normalizados para refletir a proporção de cada tipo de célula de mucina por cripta. Os comprimentos das criptas (µm) foram calculados a partir de uma média de 12 criptas por secção de tecido, para 12 camundongos. A média da espessura do muco foi calculada de maneira semelhante, medindo os comprimentos da camada de muco interno firmemente aderida ao epitélio, para 12 camundongos. O software Image J do National Institute of Health foi utilizado para auxiliar nas quantificações celulares e nas medições do comprimento das criptas.
Expressão de mRNA do cólon por RT-PCR quantitativo
Tecidos de cólon armazenados em RNAlater (Invitrogen) a −80 °C foram descongelados em gelo, e o RNA total foi extraído usando o kit RNeasy mini (Qiagen, #74104), de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram tratadas com DNase usando o kit DNase livre de RNase (Qiagen; #79254) e a concentração e qualidade do RNA foram avaliadas usando RNA NanoChips no Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Alemanha). As sínteses de cDNA de primeira fita foram preparadas a partir de 700 ng de RNA usando o Kit RT2 First Strand (Qiagen/SABiosciences). A reação incluiu uma etapa adicional para eliminar vestígios de DNA genômico. O produto de cDNA resultante foi imediatamente amplificado por qPCR usando o Master Mix RT2 SYBR Green qPCR (Qiagen/SABiosciences) em uma plataforma de ciclagem em tempo real Applied Biosystems ABI 7500 Fast. A RT-PCR quantitativa foi realizada em uma reação de 25 μl contendo 1 μl de cDNA, 1 μl de 10 μM de primers reverso e direto e 12,5 μl de Master Mix RT2-SYBR Green. O protocolo de termociclagem foi o seguinte: 95 °C por 10 min para ativação da polimerase hot-start, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15S, anelamento a 60 °C por 1 min e um estágio de curva de melting conforme configuração padrão de 60 °C a 95 °C. Cada amostra foi analisada em duplicata e 10–12 réplicas biológicas foram utilizadas para cada tratamento. Para a análise da permeabilidade intestinal, foram utilizados primers individuais prontos codificando genes reguladores da diferenciação (RT2 qPCR Primer Assay, Qiagen). Os genes alvo murinos foram Ocludina (Ocln, Qiagen #PPM05314A) e Proteína de junção apertada 1 (Tjp1, Qiagen #PPM25091A); Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH, Qiagen #PPM02946E), Hipoxantina guanina fosforribosil transferase (Hprt, Qiagen #PPM03559F) e Peptidilprolil isomerase B (Ppib, Qiagen #PPM03728A) foram amplificados como genes de controle housekeeping (HKGs). A estabilidade dos HKGs foi avaliada posteriormente pelos aplicativos geNorm e NormFinder. O mRNA total universal Mouse XpressRef (Qiagen #338114) também foi usado como modelo de referência para verificar e comparar a qualidade das expressões gênicas em nosso mRNA experimental murino. Os dados foram analisados usando o método ΔΔCT para determinar o nível de expressão de cada gene normalizado ao nível de expressão do gene housekeeping Gapdh.
Extração de DNA fecal e preparação da biblioteca de amplicons do gene 16S rRNA e sequenciamento
O DNA total foi extraído de aproximadamente 100 mg de fezes usando um kit de DNA fecal ZR (D6010; Zymo Research Corp., Orange, CA) que incluía uma etapa de agitação com esferas para a lise mecânica das células microbianas e purificação em coluna de sílica. A extração de DNA foi realizada conforme recomendado nos respectivos manuais do kit, com algumas modificações, incluindo uma etapa dupla de pré-lavagem e lavagens durante a filtração subsequente para remover ácidos húmicos/polifenóis que poderiam inibir a PCR. A concentração e a qualidade do DNA foram determinadas espectrofotometricamente medindo a A260/280 usando um ND-1000 Nanodrop (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, EUA). O sequenciamento das amostras de DNA fecal (12 amostras por grupo de dieta) foi processado no laboratório IBIS, Universidade Laval, Québec, QC, Canadá.

Amplicons da região V3-V4 do 16S rRNA foram gerados usando os primers degenerados 341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) e 805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) adaptados para incorporar os adaptadores Illumina Nextera baseados em transposons (Illumina, EUA) e uma sequência de código de barras da amostra permitindo sequenciamento pareado multiplexado. As bibliotecas metagenômicas 16S construídas foram purificadas usando 35 µL de esferas magnéticas (kit AxyPrep Mag PCR Clean up; Axygen Biosciences, EUA) por 50 µL de reação de PCR. O controle de qualidade da biblioteca foi realizado com um Bioanalyzer 2100 usando chips de DNA 7500 (Agilent Technologies, EUA). Um pool equimolar foi obtido e verificado quanto à qualidade antes do processamento adicional. O pool foi quantificado usando picogreen (Life Technologies, EUA) e carregado em uma plataforma MiSeq usando sequenciamento pareado 2 × 300 pb (Illumina, EUA). O sequenciamento de alto rendimento foi realizado no IBIS (Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes - Université Laval).

Processamento das sequências do 16S rRNA

As leituras demultiplexadas foram analisadas usando o pacote de software QIIME (versão 1.9.1) e scripts personalizados. O Paired-End read mergeR (PEAR) v.0.9.5 foi usado para parear as leituras forward e reverse das sequências em cada amostra com pelo menos uma sobreposição de 50 pb. As sequências foram descartadas se apresentassem base ambígua (N) ou escore Phred ≤25 ou fossem mais curtas que 450 pb de comprimento. Quimeras foram filtradas com uma abordagem baseada em referência usando UCHIME versão 4.2 e um conjunto representativo de sequências verificadas quanto a quimeras. As sequências resultantes foram agrupadas em OTUs (Unidades Taxonômicas Operacionais) com 97% de identidade usando uma metodologia de referência aberta realizada com USEARCH 61 versão 6.1.544. A taxonomia das OTUs foi atribuída a um conjunto representativo de sequências de 16S rRNA no banco de dados Greengenes usando o classificador RDP. Todas as OTUs observadas menos de 2 vezes (ou seja, singleton) ou com um número de sequências <0,1% do total de leituras foram descartadas. O classificador RDP contra o banco de dados RDP versão 11 foi usado para classificar ainda mais as OTUs que não foram atribuídas contra o Greengenes em nível de gênero.

Análise da diversidade e composição da microbiota intestinal
OTUs que apresentavam prevalência em pelo menos 20% dos camundongos em um grupo de tratamento e tinham um valor de variância superior a 10% em um grupo de tratamento foram incluídos na análise. A análise de α-rarefação do QIIME a uma profundidade de 6957 sequências por amostra foi realizada. Amostras individuais foram rarefeitas com base nas estimativas de α-diversidade, para garantir profundidade de sequenciamento uniforme para medições de diversidade e abundância relativa. A α-diversidade de cada amostra foi analisada usando o índice de diversidade de Shannon-Weaver para composição da comunidade microbiana, combinando riqueza de espécies e abundância por amostra. O índice Chao1 foi determinado para riqueza e estimativa de Espécies observadas (número de OTUs únicas). Testes U não paramétricos de Mann-Whitney, bem como o teste de Kruskal-Wallis com correção de comparação múltipla de Benjamini, foram realizados para comparar a diversidade entre os tipos de dieta usando o Prism 8.0 (GraphPad software, Califórnia).

As métricas de β-diversidade foram calculadas usando a medida de distância de Bray-Curtis, considerando a tabela de OTUs rarefeita a 6957 sequências por amostra para todas as amostras, a fim de levar em conta variações na profundidade de sequenciamento. Gráficos de Análises de Coordenadas Principais (PCoA) foram realizados nas matrizes de distância calculadas. A significância estatística na β-diversidade entre os grupos de amostras foi avaliada com o teste não paramétrico de Análise de Variância Multivariada Permutacional (PERMANOVA, 999 permutações de Monte Carlo). As análises PERMANOVA retornam um valor p para significância e também o valor de R², que é indicativo da quantidade de variação atribuída a um tratamento específico dentro de um modelo. O ponto de corte de significância para valores P (PERMANOVA) e valores P corrigidos (Kruskal-Wallis) foi estabelecido em 0,05. As frequências relativas das diferentes categorias taxonômicas obtidas foram calculadas usando o programa Statistical Analysis of Metagenomic Profiles (STAMP v.2.1.3).

Análise de PCR quantitativa em tempo real
A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) foi utilizada para confirmar a proporção de táxons bacterianos específicos encontrados distintamente estimulados nos dados metagenômicos. As abundâncias relativas de Akkermansia muciniphila e Adlercreutzia equolifaciens foram analisadas em amostras fecais de todos os grupos. Sequências de iniciadores de rRNA 16S desenhadas internamente (software Geneious, versão 9.0) foram usadas para A. muciniphila (forward 5′-CACACCGCCCGTCACAT-3′ e reverse 5′-TGCGGTTGGCTTCAGATACTT-3′) e A. equolifaciens (forward 5′-TTAGGTAGACGGCGGGGTAA-3′ e reverse 5′-TAGGAGTCTGGGCCGTATCT-3′). As bactérias totais foram quantificadas usando os iniciadores universais Uni334F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′) e Uni514R (5′-ATTACCGCGGCTGCTGGC-3′). As eficiências de amplificação dos iniciadores e as curvas padrão foram determinadas por meio de séries de diluição do DNA total puro de cada bactéria (cepas ATCC BAA-835 e DSM 19450), calculando uma regressão linear com base nos pontos de dados de CT e inferindo a eficiência a partir da inclinação da reta. Cada qPCR foi realizada em uma reação de 20 μl contendo 10 μL de 2X PowerUP SYBR Green Master Mix (Applied Biosystem), 6,4 μL de água, 0,8 μL de uma solução 5 μM de iniciadores forward e reverse e 2 μL de DNA extraído em água livre de DNase/RNase. As amplificações por qPCR foram realizadas em uma plataforma de ciclagem em tempo real Applied Biosystems ABI 7500 Fast. O protocolo de termociclagem consistiu em 50 °C por 2 min, 95 °C por 10 min para ativação da polimerase hot-start, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15 s, anelamento a 60 °C por 1 min e um estágio de curva de melting conforme configuração padrão de 60 °C a 95 °C. Doze amostras foram analisadas para cada grupo, e foram realizadas reações de qPCR em duplicata. O valor médio de CT obtido para cada par de iniciadores foi usado para calcular a proporção de táxons bacterianos em relação ao total de bactérias nas fezes de camundongos. Os dados foram transformados em porcentagem utilizando a fórmula baseada em ∆∆CT, conforme descrito em outro local: onde Eff.Univ é a eficiência calculada dos iniciadores universais e Eff.Spec se refere à eficiência dos iniciadores específicos para o táxon. CT univ e CT spec são os valores médios de CT registrados pela plataforma de ciclagem em tempo real Fast. “X” representa a porcentagem do número de cópias específicas do rRNA 16S presente em cada amostra fecal. Por fim, foram realizadas análises de correlação de Spearman para comparar os dados do sequenciamento do rRNA 16S versus a proporção relativa do rRNA 16S obtida por qPCR; valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Funções metagenômicas inferidas pelo PICRUSt
As previsões da funcionalidade do metagenoma, agrupadas por dieta, foram previstas usando o software PICRUSt 1.0.0 (http://picrust.github.io). A tabela BIOM resultante (uma coleção de OTUs de referência fechada) obtida a partir das leituras filtradas do QIIME e os dados correspondentes a uma coleção de referência (banco de dados GreenGenes, versão de maio de 2013; http://greengenes.lbl.gov) com 97% de identidade, foi então categorizada por vias KEGG (ou seja, grupos de Ortólogos KEGG [KOs] foram colocados em categorias funcionais). Os dados foram analisados estatisticamente usando o STAMP v 2.1.3. A análise LEfSe foi realizada para identificar as vias funcionais microbianas que foram diferencialmente expressas nos diferentes grupos de dietas.

Análise estatística
Para calcular comparações pareadas individuais de médias de dados paramétricos, testes t de Student e ANOVA de uma via com pós-teste de Dunnett (Graph Pad Prism 8) foram realizados entre os grupos WBE e BPF em comparação com o grupo HFHS. A significância entre grupos em diferentes pontos de tempo foi calculada usando ANOVA de medidas repetidas de duas vias com pós-teste de Dunnett (Sigma-plot, EUA). Testes de Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney U de medianas foram usados para analisar dados não paramétricos conforme apropriado, considerando o tamanho da amostra e a distribuição dos dados. Os efeitos dos tratamentos dietéticos na abundância de táxons bacterianos foram analisados pelo teste t não paramétrico de White com correção de Benjamini para comparações múltiplas (STAMP; versão 2.1.3). Para examinar diferenças na abundância de táxons individuais entre dois grupos, foi aplicado um teste não paramétrico de Mann-Whitney U. Valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos, enquanto valores de p entre 0,05 e 0,1 foram considerados como mostrando uma tendência. Os resultados foram expressos como médias ± erro padrão da média (SEM).

Informações suplementares
Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Estes autores contribuíram igualmente: Maria-Carolina Rodríguez-Daza e Laurence Daoust.
Informações suplementares estão disponíveis para este artigo em 10.1038/s41598-020-58863-1.

Contribuições dos autores
Y.D., A.M., D.R., E.L. e G.P. desenharam o estudo. M.C.R. e L.D. realizaram os experimentos. L.B. e S.D. estiveram envolvidos na preparação e análise técnica dos extratos etanólicos de mirtilo. M.C.R. e T.V. realizaram o pré-processamento das sequências de rRNA 16S. M.C.R. realizou a análise metataxonômica, ensaios de PCR, histologia intestinal e análise de expressão gênica. M.C.R. e L.D. trabalharam na análise e discussão dos dados. M.C.R., L.D., Y.D. e A.M. escreveram o manuscrito. Todos os autores revisaram e aprovaram o manuscrito final.

Disponibilidade de dados
Os conjuntos de dados gerados durante e/ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis junto ao autor correspondente mediante solicitação razoável.

Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Referências
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Extrato de polifenóis de mirtilo como prebiótico potencial com efeitos anti-obesidade em camundongos C57BL/6J através da modulação da microbiota intestinal
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Comparação de Proantocianidinas Isoladas de Cranberry (Vaccinium macrocarpon Ait.) com Catequina e Procianidinas A2 e B2 para Uso como Padrões no Ensaio com 4-(Dimetilamino)cinamaldeído
Análise abrangente de compostos fenólicos e perfis de ácido abscísico de doze bagas nativas canadenses
Modulação da Glicuronidação de Compostos Fenólicos de Morango/Cranberry pela Co-suplementação com Cebola: Caracterização de Metabólitos Fenólicos no Plasma de Ratos Usando um Método Otimizado de μSPE-UHPLC-MS/MS
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