pmid: "39887668"
title: "O Ácido α-Lipoico Melhora os Distúrbios Lipídicos Induzidos por Arsênio ao Promover a β-Oxidação Peroxissomal e Reduzir a Lipofagia em Hepatócitos de Frango."
authors: "Zhao Y, Guo M, Pei T, Shang C, Chen Y, Zhao L, Lu Y, Liang C, Wang J, Zhang J"
journal: "Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany)"
pubdate: "2025 Mar"
doi: "10.1002/advs.202413255"
source: "PMC Full Text"

O Ácido α-Lipoico Melhora os Distúrbios Lipídicos Induzidos por Arsênio ao Promover a β-Oxidação Peroxissomal e Reduzir a Lipofagia em Hepatócitos de Frango.

Autores

Zhao Y, Guo M, Pei T, Shang C, Chen Y, Zhao L, Lu Y, Liang C, Wang J, Zhang J

Periodico

Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) (2025 Mar)

Conteudo

α‐Ácido Lipóico Ameliora os Distúrbios Lipídicos Induzidos por Arsênio ao Promover a β‐Oxidação Peroxissomal e Reduzir a Lipofagia em Hepatócitos de Frango

Resumo
A doença hepática representa uma ameaça significativa para a saúde pública global, sendo o arsênio (As) reconhecido como um importante tóxico ambiental que contribui para a lesão hepática. No entanto, os mecanismos específicos e os efeitos protetores do ácido α‐lipóico (LA) ainda não estão claros. Portanto, este estudo emprega toxicologia de rede e farmacologia de rede para analisar de forma abrangente o mecanismo hepatotóxico do As e o mecanismo hepatoprotetor do LA, e verifica ainda mais os mecanismos da β‐oxidação peroxissomal e da lipofagia no processo. Os resultados da análise de rede mostram que o As induz danos ao fígado principalmente através de autofagia, apoptose, metabolismo lipídico e estresse oxidativo, enquanto o LA exerce suas propriedades hepatoprotetoras principalmente regulando o metabolismo lipídico. Verificações adicionais constatam que o As inibe a expressão de SIRT1, ativa as vias P53 e Notch, danifica as mitocôndrias, inibe a β‐oxidação peroxissomal, aumenta o acúmulo de lipídios e intensifica a lipofagia no fígado, enquanto a intervenção com LA alivia o acúmulo de lipídios induzido por As e intensifica a lipofagia ao visar SIRT1, melhorando o dano mitocondrial, aumentando a β‐oxidação peroxissomal, aliviando assim o dano hepático induzido por As. Este estudo esclarece ainda mais o mecanismo da hepatotoxicidade do As e fornece uma base teórica para o LA como um potencial agente hepatoprotetor.

A lesão hepática induzida por arsênio representa uma séria ameaça à saúde humana e à indústria avícola. Este estudo descobre que o ácido α‐lipóico alivia o acúmulo de lipídios induzido por arsênio e intensifica a lipofagia ao visar SIRT1, melhorando o dano mitocondrial, aumentando a β‐oxidação peroxissomal. Este estudo esclarece ainda mais o mecanismo da hepatotoxicidade do arsênio e fornece uma base teórica para o ácido α‐lipóico como um potencial agente hepatoprotetor.

Introdução
Devido a mudanças no estilo de vida e ao aumento da poluição ambiental, as doenças hepáticas representam uma ameaça significativa à saúde pública global. De acordo com os Institutos Nacionais de Saúde, as doenças hepáticas afetam aproximadamente 1,69 bilhão de pessoas em todo o mundo.[ ] Além disso, na indústria avícola, uma fonte crítica de carne e ovos, a incidência de doenças hepáticas varia de 1% a 15%, com uma taxa de mortalidade entre 0,5% e 10%, levando a perdas econômicas significativas.[ ] O arsênio (As) é um poluente metálico ambiental perigoso bem conhecido, utilizado em pesticidas, herbicidas, semicondutores, germicidas, fundição de metais e mineração.[ ] O As entra amplamente no corpo através da água e dos alimentos, acumulando-se ao longo da cadeia alimentar. Como órgão chave de desintoxicação, o fígado é um alvo primário para a toxicidade do As, recebendo escrutínio contínuo.[ ] A exposição prolongada ao As danifica a estrutura e função hepáticas, interrompe o metabolismo e leva ao acúmulo de substâncias nocivas, ameaçando a saúde humana e a segurança alimentar animal.[ ] Portanto, investigar os mecanismos do dano hepático induzido por As e identificar estratégias eficazes de prevenção e tratamento são cruciais para a saúde humana, o desenvolvimento da indústria avícola e a segurança alimentar animal.
O fígado é responsável pela síntese de novo, oxidação, captação e exportação de lipídios, fornecendo nutrientes essenciais às células e ajudando-as a se adaptar às mudanças ambientais.[ ] Os peroxissomos são organelas essenciais nos hepatócitos que desempenham um papel crucial nos processos de metabolismo e desintoxicação do fígado, especialmente na decomposição de ácidos graxos de cadeia muito longa pela β-oxidação peroxissomal.[ ] A β-oxidação peroxissomal pode quebrar especificamente ácidos graxos de cadeia longa em uma série de acil-coenzima A (CoA) encurtados, gerando acetil-CoA, propionil-CoA e vários acil-CoA de cadeia média, que são posteriormente oxidados nas mitocôndrias para produzir CO2 e H2O2.[ ] Além disso, esse processo é regulado pela enzima limitante da taxa ACOX1, que catalisa a dessaturação de acil-CoA para 2-trans-enoil-CoA, gerando assim H2O2.[ ] Além disso, a β-oxidação peroxissomal foi identificada como um fator chave na patogênese de várias doenças hepáticas.[ ] Por exemplo, a expressão de ACOX1 é marcadamente reduzida nos fígados de pacientes com doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) e carcinoma hepatocelular, resultando no acúmulo de ácidos graxos no fígado, o que exacerba a esteatose hepática e a transformação maligna.[ ] Além disso, na cirrose hepática, a função diminuída da β-oxidação peroxissomal está intimamente associada à apoptose de hepatócitos, fibrose e insuficiência hepática, e mutações ou deficiências em ACOX1 podem exacerbar o processo patológico da cirrose.[ ] No entanto, o papel da β-oxidação peroxissomal no dano hepático induzido por As permanece incerto.
O metabolismo lipídico anormal no fígado pode levar ao acúmulo de gotículas lipídicas, o que, por sua vez, induz várias doenças hepáticas. Foi descoberto que a autofagia regula tanto a biogênese quanto a degradação de gotículas lipídicas no metabolismo lipídico, um processo denominado lipofagia.[ ] A lipofagia é um subtipo de autofagia que utiliza a lipase ácida lisossomal para atuar sobre gotículas lipídicas, formando autofagossomos que sequestram e subsequentemente se fundem com lisossomos, proporcionando ao fígado a capacidade de converter triglicerídeos (TGs) e realizar a β‐oxidação de ácidos graxos, prevenindo assim maior deposição lipídica e doenças hepáticas metabólicas.[ ] Por exemplo, estudos mostraram que a ativação da lipofagia reduz a esteatose hepática e inibe o acúmulo excessivo de TGs, atenuando assim o desenvolvimento da DHGNA.[ ] Atualmente, a relação regulatória entre a lipofagia e a β‐oxidação peroxissomal no metabolismo lipídico tem recebido ampla atenção. Por exemplo, estudos indicaram que os peroxissomos interagem com o sistema autofagia-lisossomal.[ ] Além disso, o modelo de camundongos knockout para ACOX1 específico do fígado revelou que a deficiência de ACOX1 levou à diminuição dos níveis de acetil-CoA e da acetilação da subunidade chave do mTORC1, Raptor, o que induziu a autofagia através do ULK1.[ ] No entanto, a lipofagia é um processo de autofagia seletiva que remove especificamente gotículas lipídicas em excesso, e não há evidências diretas que esclareçam a relação regulatória entre a β‐oxidação peroxissomal e a lipofagia. Portanto, elucidar os mecanismos da lipofagia e da β‐oxidação peroxissomal na interrupção do metabolismo lipídico hepático induzida por As é crucial para compreender a hepatotoxicidade do As.
α‐ácido lipoico (AL), comumente referido como ácido tióctico e ácido 1,2‐ditiolano‐3‐pentanoico, é um antioxidante natural encontrado em quase todos os tipos de células procarióticas e eucarióticas.[ ] Apresenta uma série de funções bioquímicas, incluindo propriedades antioxidantes e quelantes de metais, e pode aumentar a atividade de outros antioxidantes, como a glutationa.[ ] Clinicamente, o AL é utilizado no tratamento da polineuropatia relacionada ao diabetes, onde ajuda a melhorar a dor e as anormalidades sensoriais.[ ] No contexto da prevenção e terapia do câncer, o AL apresenta atividade antitumoral direta, induzindo apoptose e inibindo a proliferação celular.[ ] Além disso, estudos demonstraram que o AL promove o crescimento, potencializa os efeitos antioxidantes, regula o metabolismo lipídico, mitiga os efeitos de toxinas, melhora a imunidade, inibe a apoptose celular, reduz o estresse do retículo endoplasmático e inibe a deposição lipídica tanto in vitro quanto in vivo.[ ] Por exemplo, Park et al. demonstraram que o AL reduziu os níveis de TG no plasma e no fígado de ratos alimentados com uma dieta rica em gordura.[ ] Além disso, a suplementação com AL pode reduzir a deposição lipídica hepática, aumentar a expressão de ATGL e diminuir a expressão de FASN e ACC fosforilada, indicando seus efeitos redutores de lipídios.[ ] No entanto, o efeito da intervenção do AL sobre danos hepáticos causados pela exposição ao As em frangos ainda não está claro, e seus mecanismos específicos ainda não são totalmente compreendidos.
Estudos demonstraram que os níveis de arsênio na ração de frangos podem atingir até 18 mg kg−1 e até mesmo mais em algumas granjas avícolas ou áreas contaminadas com arsênio, e a exposição a concentrações de arsênio de 0,95, 20,78, 40,67 e 60,25 mg kg−1 afeta os fígados e rins de frangos através da ração.[ ] Além disso, doses mais baixas de AL, como 50 e 200 mg kg−1, demonstraram melhorar o consumo de ração e o ganho de peso em frangos, enquanto doses mais altas, como 400 mg kg−1, aumentam a capacidade antioxidante do fígado e a qualidade da carne dos frangos.[ ] No entanto, doses excessivamente altas, como 900 mg kg−1, podem suprimir o desempenho do crescimento e reduzir a eficiência econômica. Portanto, de acordo com a produção real de frangos e a literatura existente, escolhemos 27,27 mg kg−1 de As e 200 e 400 mg kg−1 de AL para estabelecer o modelo experimental.
Neste estudo, a toxicologia de redes e a farmacologia de redes foram empregadas em uma abordagem combinada para elucidar de forma abrangente os mecanismos subjacentes à lesão hepática induzida por As e aos efeitos protetores do LA nesse processo. Além disso, coloração com hematoxilina e eosina (HE) e Oil Red O, imunofluorescência dupla, citometria de fluxo, RT-PCR, western blotting e outras tecnologias foram utilizadas para observar os efeitos do LA sobre o conteúdo de As no fígado, a morfologia tecidual, o metabolismo lipídico, a β-oxidação peroxissomal e a lipofagia na lesão hepática induzida por As. Nosso objetivo foi investigar os efeitos atenuantes do LA na lesão hepática induzida por As em galinhas e elucidar os mecanismos envolvendo a β-oxidação peroxissomal e a lipofagia nesse processo. Este estudo esclarecerá ainda mais os mecanismos subjacentes da lesão hepática induzida por As e os efeitos hepatoprotetores do LA, fornecendo uma base teórica para o desenvolvimento do LA como um fármaco hepatoprotetor para mitigar os danos hepáticos induzidos por As.
Resultados
Análise de Toxicologia de Redes dos Mecanismos Potenciais da Lesão Hepática Induzida por As
Utilizando o banco de dados de toxicogenômica comparativa (CTD) e os bancos de dados GeneCards e identificando interseções, 754 genes-alvo relacionados ao As e 1410 genes-alvo relacionados à lesão hepática foram selecionados, e uma nova interseção desses dois conjuntos de dados revelou 331 genes-alvo sobrepostos (Figura 1A). A análise de enriquecimento de ontologia genética (GO) revelou que, em termos de processo biológico (BP), os genes estavam associados principalmente à regulação positiva da expressão gênica, à regulação da apoptose, à resposta ao estresse oxidativo e à estimulação xenobiótica, e à regulação transcricional. Para componente celular (CC), os genes estavam localizados em regiões subcelulares-chave, incluindo o citoplasma, núcleo, mitocôndrias, espaço extracelular e nucleoplasma. Em relação à função molecular (MF), os genes foram enriquecidos em categorias como ligação a proteínas, ligação a enzimas, ligação a fatores de transcrição e atividade de transferase (Figura 1C,D e Tabela S2, Informações de Suporte). A análise de enriquecimento da enciclopédia de genes e genomas de Kyoto (KEGG) indicou envolvimento em vias-chave, incluindo a via de sinalização PI3K-Akt, processo de apoptose, via de sinalização AGE-RAGE, via de sinalização FoxO, tensão de cisalhamento por fluido e aterosclerose, via de sinalização p53, vias de câncer relacionadas a microRNA, diferenciação de células Th17, via de sinalização HIF-1 e via de sinalização MAPK (Figura 1B e Tabela S3, Informações de Suporte). Esses achados sugeriram que o As afetou principalmente os processos biológicos dos hepatócitos, como estresse oxidativo, proliferação, diferenciação, apoptose, autofagia, metabolismo lipídico e inflamação, regulando as vias relacionadas à autofagia, apoptose, metabolismo lipídico e estresse oxidativo, induzindo assim danos hepáticos.
Resultados da análise de toxicologia de rede. A) Diagrama de Venn para triagem de genes relacionados a danos hepáticos induzidos por As. B) Resultados de enriquecimento KEGG de genes relacionados a danos hepáticos induzidos por As. C) Diagrama de rede PPI de genes relacionados a danos hepáticos induzidos por arsênio. D) Diagrama de círculo de enriquecimento GO de genes relacionados a danos hepáticos induzidos por As.
LA Melhorou o Dano Estrutural e Funcional Hepático Induzido por As
Com base na análise de toxicologia de rede e na revisão da literatura, as funções biológicas do LA foram consideradas sobrepostas significativamente aos mecanismos hepatotóxicos do As. Os resultados mostraram que, após 20 semanas de tratamento, o As causou uma diminuição no peso corporal dos frangos e um aumento no conteúdo de aspartato aminotransferase (AST) no fígado, enquanto a intervenção de 400 mg kg−1 de LA aumentou o peso corporal dos frangos e diminuiu o conteúdo de AST no fígado em comparação com o grupo As (P < 0,05, P < 0,01, Figura 2A,C). Em contraste com os resultados de 20 semanas, o As e o LA não mostraram impacto significativo no peso corporal e nos coeficientes de órgãos após 32 semanas de tratamento. No entanto, o As elevou obviamente os níveis de AST e alanina aminotransferase (ALT) no fígado, e esses aumentos foram acentuadamente aliviados pela intervenção com LA (P < 0,05, P < 0,01, Figura 2A–D). Além disso, observações patológicas e morfológicas revelaram que, após 20 e 32 semanas de exposição ao As, o fígado exibiu coloração mais clara, disposição desordenada dos cordões hepáticos, aumento de gotículas lipídicas e elevação da dissolução nuclear e picnose dos hepatócitos (Figura 2E,F). No entanto, a intervenção com LA melhorou efetivamente as alterações patológicas e morfológicas mencionadas induzidas pelo As, com 400 mg kg−1 de LA demonstrando um efeito protetor mais pronunciado (Figura 2E,F).
Efeitos da exposição ao As e da intervenção com LA no status de crescimento, estrutura e função hepática de frangos. A) Peso corporal, n = 10. B) Coeficiente do órgão hepático, n = 10. C,D) Resultados da detecção do índice de função hepática (AST e ALT), n = 6. E) Observação da aparência do fígado. F) Resultados da coloração HE (400×, estrela vermelha: cordões hepáticos desordenados; setas pretas: gotículas lipídicas; setas verdes: espaços intercelulares aumentados). *
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Para investigar melhor os potenciais efeitos hepatoprotetores do LA, a farmacologia de redes foi empregada para identificar e analisar genes-alvo chave e características biológicas associadas ao LA. Conforme mostrado na Figura 3A, 125 genes-alvo potenciais com probabilidade > 0 do LA foram selecionados nos bancos de dados Swiss Target Prediction e TargetNet. Além disso, os resultados da análise de enriquecimento GO mostraram que o LA atuou principalmente em termos relacionados ao metabolismo lipídico, entre os quais está mais intimamente associado ao processo metabólico de ácidos graxos insaturados e à regulação negativa do armazenamento de lipídios, representando 20,23% e 19,21%, respectivamente (Figura 3B–D e Tabela S4, Informações de Suporte). Adicionalmente, a análise de enriquecimento KEGG dos genes-alvo relacionados ao metabolismo lipídico revelou que estava principalmente relacionada a vias como a via de sinalização PPAR, via de sinalização P53, via de sinalização Notch, regulação da lipólise e via de sinalização de esfingolipídeos (Figura 3E e Tabela S5, Informações de Suporte). Além disso, a análise revelou que o SIRT1 é um alvo chave do LA, e os resultados da docking molecular indicaram que a proteína SIRT1 possui múltiplos sítios de ligação que podem se ligar de forma estável ao LA com baixa energia de ligação (Figura 3F,G, aptidão total: -1775,5651 kcal mol⁻¹, energia: -42,6646 kcal mol⁻¹). A validação proteica mostrou que o nível de expressão da proteína SIRT1 diminuiu significativamente após a exposição ao As, mas essa alteração foi revertida pela intervenção com LA. Esses resultados indicaram que o LA melhora principalmente o dano hepático modulando o metabolismo lipídico e que o SIRT1 desempenha um papel vital nesse processo.

Resultados da análise de farmacologia de redes do LA. A) Diagrama de rede de genes-alvo potenciais do LA. B) Mapa da rede de enriquecimento GO dos genes-alvo. C) Análise da proporção de cada processo biológico (enriquecimento GO). D) Mapa da rede de enriquecimento GO de termos relacionados ao metabolismo lipídico. E) Mapa da rede de enriquecimento KEGG dos genes-alvo. F) Resultados da docking molecular do LA e SIRT1. G) Resultados da detecção do nível de expressão da proteína SIRT1, n = 3. *
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O LA Melhorou o Distúrbio do Metabolismo Lipídico Hepático Induzido por As
Para validar ainda mais o mecanismo hepatotóxico do As e o mecanismo hepatoprotetor do LA, este estudo utilizou coloração com Oil Red O, detecção de indicadores relacionados ao metabolismo lipídico, RT-PCR e western blotting para avaliar os efeitos do As e/ou LA no metabolismo lipídico hepático. Os resultados mostraram que a exposição ao As promoveu significativamente o acúmulo de TG, colesterol total (T-CHO) e lipoproteína de baixa densidade (LDL) no fígado e diminuiu o nível de lipoproteína de alta densidade (HDL) após 20 e 32 semanas de tratamento. No entanto, a adição de LA reverteu efetivamente essa tendência, reduzindo significativamente os níveis de TG, T-CHO e LDL e aumentando os níveis de HDL, entre os quais o efeito do grupo de intervenção com 400 mg Kg−1 de LA foi particularmente significativo (P < 0,05, P < 0,01, Figura 4A–D). Consistente com os resultados da detecção lipídica, os resultados da coloração com Oil Red O mostraram que o conteúdo lipídico (área positiva vermelha) e o número de gotículas lipídicas aumentaram no fígado após 20 e 32 semanas de tratamento, enquanto a intervenção com LA reduziu significativamente o conteúdo lipídico hepático (Figura 4F). Essas descobertas sugeriram que o LA poderia aliviar o dano hepático induzido por As ao diminuir o conteúdo lipídico hepático, com efeitos se tornando mais pronunciados em 32 semanas.
Efeitos da exposição ao As e da intervenção com LA no metabolismo lipídico no fígado de frango. A–D) Resultados da detecção do índice de metabolismo lipídico hepático (T-CHO, TG, LDL-C e HDL-C), n = 6. E) Resultados da detecção do conteúdo de As no fígado, n = 6. F) Resultados da coloração com Oil Red O (400×, setas verdes: gotículas lipídicas). G) Resultados estatísticos da coloração com Oil Red O, n = 6. H,I) Resultados da detecção dos níveis de expressão das proteínas P53 e Notch1, n = 3. *
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Considerando que o dano hepático induzido por As foi mais grave e que o LA tem um efeito melhor em aliviar o dano à função hepática, o dano morfológico do tecido e os distúrbios do metabolismo lipídico induzidos por As às 32 semanas. Portanto, os estudos subsequentes focaram no mecanismo específico do LA na melhora do dano hepático induzido por As às 32 semanas. As análises estatísticas da coloração com Oil Red O e do conteúdo de As no fígado mostraram que tanto a área positiva vermelha quanto o conteúdo de As no fígado estavam significativamente elevados após a exposição ao As, enquanto a intervenção com LA atenuou efetivamente essas alterações (P < 0,05, P < 0,01, Figura 4E,G). Com base nos resultados da toxicologia de rede e farmacologia de rede, bem como na literatura de apoio, foi identificado que as vias de sinalização P53 e Notch desempenham um papel fundamental na melhora da desregulação lipídica hepática induzida por As pelo LA. Detecções adicionais dos genes-chave revelaram que a exposição ao As elevou significativamente os níveis de expressão proteica de P53 e Notch1 no fígado, enquanto a intervenção com LA reduziu efetivamente a expressão de ambas as proteínas (P < 0,05, Figura 4H,I). Esses resultados indicaram que o LA, especialmente na dose de 400 mg kg−1, teve um efeito benéfico no alívio dos distúrbios do metabolismo lipídico hepático induzidos pela exposição ao As, que foi regulado pela via P53 e Notch.
O LA Atenuou o Efeito Inibitório do As na β-Oxidação Peroxissomal no Fígado
Para investigar melhor os efeitos do As e do LA na síntese, degradação e oxidação de lipídios hepáticos, os níveis de expressão de mRNA e proteína de genes-chave envolvidos na síntese lipídica (CHREBP, ADGAT2, ACACA e FASN), decomposição lipídica (ATGL, LIPA, HSL) e oxidação lipídica (ACOX1, CPT2) foram analisados. Os resultados indicaram que o As aumentou a expressão de mRNA dos genes-chave da síntese lipídica de novo (ACACA e FASN) e diminuiu a expressão de mRNA dos genes-chave da decomposição lipídica (ATGL, LIPA) e oxidação lipídica (ACOX1, CPT2) (P < 0,05, P < 0,01, Figura 4H). No entanto, após a intervenção com LA, os níveis de expressão de mRNA de ATGL, LIPA e ACOX1 aumentaram significativamente, e os níveis de expressão de mRNA de ACACA, FASN e CPT2 foram consideravelmente menores do que os do grupo As (P < 0,05, P < 0,01, Figura 5A). Consistente com os resultados da detecção de mRNA, os níveis de expressão proteica de ATGL e ACOX1 foram notavelmente diminuídos no grupo As, mas aumentaram significativamente após a intervenção com LA (P < 0,05, Figura 5B,C).
Efeitos da exposição ao As e da intervenção com LA na β-oxidação peroxissomal no fígado de frango. A–C) Níveis de expressão de mRNA (n = 6) e proteína (n = 3) dos resultados de detecção dos genes-chave do metabolismo lipídico. D) Resultados da detecção de Acetil CoA, n = 6. E) Resultados da detecção de mtDNA, n = 6. F) Níveis de expressão de mRNA dos resultados de detecção dos genes-chave da β-oxidação de ácidos graxos, n = 6. G) Níveis de expressão proteica dos resultados de detecção dos genes-chave da β-oxidação peroxissomal, n = 3. H) Resultados da marcação por imunofluorescência de peroxissomos (400×). *
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A β-oxidação mitocondrial e peroxissômica são os processos biológicos centrais na decomposição lipídica. Os resultados da detecção mostraram que o tratamento com As reduziu significativamente o conteúdo de acetil-CoA e mtDNA, enquanto a adição de LA reverteu efetivamente essa diminuição (P < 0,05, P < 0,01, Figura 5D,E). Além disso, o As diminuiu claramente os níveis de expressão de mRNA dos genes-chave da síntese de acetil-CoA (ACSS2 e ACLY) no fígado, enquanto a intervenção com LA aumentou notavelmente a expressão de mRNA de ACSS2 e ACLY (P < 0,05, P < 0,01, Figura 5F), sugerindo que o LA exerceu um efeito hepatoprotetor ao regular a via metabólica do acetil-CoA e resistir ao dano mitocondrial. Adicionalmente, conforme mostrado na Figura 5G, a intervenção com LA reduziu significativamente o aumento induzido por As nos níveis de expressão proteica (P < 0,05) de PMP70 (receptor de superfície peroxissômica) e PLIN2 (receptor de superfície de gotícula lipídica). A coloração de imunofluorescência adicional usando PMP70 para marcar peroxissomos revelou que o tratamento com As aumentou os peroxissomos no fígado, enquanto a intervenção com LA foi eficaz em reverter essa alteração (Figura 5H), indicando que a β-oxidação peroxissômica estava envolvida no processo pelo qual o LA aliviou a deposição lipídica induzida por As.
O LA Reduziu a Lipofagia Hepatocitária Induzida por As
Imunofluorescência, RT-PCR e western blotting foram empregados para explorar ainda mais o papel da lipofagia na melhora mediada pelo LA da deposição lipídica hepática induzida por As. Nos experimentos de imunofluorescência, ATGL e LC3 foram usados para localizar gotículas lipídicas e autofagossomos, respectivamente, co-localizando assim a lipofagia. Conforme mostrado na Figura 6A, a intensidade de fluorescência da lipofagia no grupo As foi aumentada em comparação com o grupo Ctrl, indicando um aumento na lipofagia. Em contraste, a intensidade de fluorescência do grupo de intervenção com LA foi diminuída em comparação com o grupo As. Os níveis de expressão de genes-chave da autofagia em gotículas lipídicas revelaram que, em comparação com o grupo Ctrl, a expressão de mRNA de LC3 no grupo As foi significativamente aumentada (P < 0,05), e a expressão de mRNA de P62 foi significativamente diminuída (P < 0,05, P < 0,01, Figura 6B). No entanto, em comparação com o grupo As, as alterações nos níveis de expressão de mRNA de LC3 e P62 foram atenuadas no grupo de intervenção com LA (P < 0,05, Figura 6B), sem diferenças significativas em comparação com o grupo Ctrl. Semelhante aos resultados genéticos, os resultados de western blotting mostraram que, em comparação com o grupo Ctrl, a expressão proteica de LC3 e P62 foi significativamente aumentada no grupo As, enquanto os níveis de expressão proteica de LC3 e P62 no grupo de intervenção com LA foram menores do que aqueles no grupo As, e não houve diferença significativa entre eles e o grupo Ctrl (P < 0,05, Figura 6C,D). Os resultados acima indicaram que a exposição ao As induziu dano hepatocitário ao aumentar a lipofagia, enquanto o LA reduziu a lipofagia e aliviou esse dano nos hepatócitos.
Efeitos da exposição ao As e da intervenção com LA na lipofagia no fígado de frango. A) Resultados da detecção de colocalização por imunofluorescência da lipofagia (400×, ATGL: gotículas lipídicas; LC3: lisossomos, setas amarelas: lipolisossomo). B) Resultados da detecção dos níveis de expressão de mRNA dos genes-chave da lipofagia, n = 6. C,D) Resultados da detecção dos níveis de expressão proteica dos genes-chave da lipofagia nas gotículas lipídicas, n = 3. *
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LA melhorou a Lesão Hepatocelular Induzida por As e os Distúrbios do Metabolismo Lipídico, e TRCDA Inibiu a β‐Oxidação Peroxissomal In Vitro
Para verificar ainda mais o mecanismo protetor da LA contra a lesão hepática induzida por As em um modelo celular, este estudo inicialmente utilizou experimentos com CCK-8 para avaliar os efeitos do As em diferentes concentrações e tempos de exposição e o impacto da LA em diferentes concentrações na taxa de proliferação das células LMH. Conforme mostrado na Figura 7A,B, com o aumento das concentrações de As e o prolongamento dos tempos de tratamento, a taxa de proliferação dos hepatócitos diminuiu significativamente. Além disso, à medida que a concentração de LA aumentou, a taxa de proliferação das células apresentou uma diminuição correspondente (P < 0,05, P < 0,01). No entanto, a intervenção com 25, 50, 75 e 100 µm de LA aliviou significativamente o declínio na taxa de proliferação dos hepatócitos causado pelo tratamento com As (69,89%), com taxas de proliferação correspondentes de 84,92%, 89,29%, 89,58% e 86,97%, respectivamente (P < 0,05, P < 0,01, Figura 7C). Com base nos resultados acima, este estudo determinou que a concentração de tratamento de As foi de 10 µmol L−1, a concentração de tratamento de LA foi de 25 µmol L−1, e o tempo de tratamento foi de 24 h na pesquisa subsequente do modelo celular.
Estabelecimento do modelo de pesquisa do mecanismo da linhagem celular de fígado de frango (linhagem celular LMH). A) Resultados estatísticos das taxas de proliferação celular sob tratamento com As em diferentes concentrações e por diferentes tempos, n = 6. B) Resultados estatísticos da taxa de proliferação celular sob tratamento com diferentes concentrações de LA, n = 6. C) Resultados estatísticos da taxa de proliferação celular sob tratamento combinado com As e diferentes concentrações de LA, n = 6. D) Resultados da detecção dos níveis de expressão proteica de SIRT1, n = 3. E) Resultados estatísticos dos níveis de expressão de mRNA dos genes-chave do metabolismo lipídico sob tratamento com As e/ou LA, n = 6. F) Resultados estatísticos do nível de expressão proteica de LIPA sob tratamento com As e/ou LA, n = 3. G–I) Resultados estatísticos dos níveis de expressão proteica de ACOX1 nos diferentes grupos de tratamento, n = 3. *
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P < 0,05, ##
P < 0,01, versus As.
SIRT1, uma proteína alvo chave do LA, foi encontrada como regulada negativamente pelo As, enquanto o LA regulou positivamente a expressão de SIRT1, o que foi consistente com os achados in vivo (P < 0,05, Figura 7D). Além disso, este estudo mediu os níveis de expressão de mRNA e proteína de genes-chave da lipólise para verificar o efeito atenuante do LA sobre os distúrbios do metabolismo lipídico hepático induzidos pelo As no modelo celular. Os resultados mostraram que o tratamento com As aumentou a expressão de mRNA de ACACA, FAS e CPT2, enquanto diminuiu a expressão de mRNA de ATGL, LIPA, ADGAT2 e ACOX1 nos hepatócitos. No entanto, o tratamento combinado de As e LA atenuou essas alterações induzidas pelo As (P < 0,05, P < 0,01, Figura 7E). Além disso, de forma consistente com os resultados da detecção de mRNA, o As reduziu a expressão proteica de LIPA e ACOX1, enquanto a intervenção com LA aumentou o nível de expressão dessa proteína nos hepatócitos (P < 0,05, Figura 7F,G), sugerindo que o LA exerceu um efeito semelhante na melhora dos distúrbios do metabolismo lipídico em nível celular, conforme observado in vivo.
Para investigar melhor o papel da β-oxidação peroxissomal na melhora do LA sobre os distúrbios do metabolismo lipídico hepático induzidos pelo As, este estudo utilizou TRCDA, um inibidor de ACOX1, que é uma proteína-chave na via de β-oxidação de ácidos graxos peroxissomais, para estabelecer um modelo mecânico de β-oxidação peroxissomal. Os resultados da detecção da proteína ACOX1 demonstraram que a intervenção com LA aumentou a expressão da proteína ACOX1, que foi diminuída pelo tratamento com As, enquanto o tratamento com TRCDA reduziu ainda mais a expressão da proteína ACOX1 nos hepatócitos (P < 0,05, P < 0,01, Figura 7H,I). Esses achados indicaram que o TRCDA inibiu a β-oxidação peroxissomal, que estava implicada na regulação da toxicidade hepática induzida pelo As e no efeito protetor do LA no fígado.
O TRCDA Promoveu Distúrbios do Metabolismo Lipídico e Lipofagia Induzidos pelo As, ao Mesmo Tempo que Reduziu a Eficácia do LA na Melhora de Ambas as Condições
Função dos hepatócitos e detecção do índice de conteúdo lipídico, coloração fluorescente e citometria de fluxo foram empregadas para detectar o efeito da inibição da β-oxidação peroxissomal na capacidade do LA de melhorar os danos aos hepatócitos e os distúrbios do metabolismo lipídico induzidos por As. Conforme mostrado na Figura 8, o tratamento com As aumentou significativamente os indicadores de função hepática (AST e ALT, Figura 8A), indicadores de metabolismo lipídico (TG e T-CHO, Figura 8B), taxa de morte celular (Figura 8C–E), conteúdo de ROS (Figura 8D,E), taxa de acidificação extracelular (ECAR, Figura 8F), taxa de despolarização da membrana mitocondrial (Figura 8G), mas aumentou a taxa de consumo de oxigênio (OCR, Figura 8F) nos hepatócitos (P < 0,05, P < 0,01). Por outro lado, os conteúdos de AST, ALT, TG, T-CHO, ROS e a taxa de morte celular e despolarização da membrana mitocondrial foram significativamente diminuídos no grupo As+LA (P < 0,05, P < 0,01), e o OCR e ECAR do grupo As+LA não foram significativamente diferentes do grupo Ctrl. Além disso, o tratamento com TRCDA inibiu os efeitos atenuantes do LA sobre os indicadores mencionados alterados por As e tendeu a exacerbar os aumentos induzidos por As nos níveis de AST e TG (P < 0,05). Esses resultados validaram ainda mais o efeito protetor do LA nos distúrbios do metabolismo lipídico hepático e danos mitocondriais induzidos por As, e confirmaram o papel regulador da β-oxidação peroxissomal nesse processo.
Efeitos do tratamento com TRCDA na função dos hepatócitos, metabolismo lipídico, conteúdo de ROS e morte celular sob exposição a As e/ou LA. A) Resultados da detecção dos índices de função dos hepatócitos, n = 6. B) Resultados da detecção dos índices de metabolismo lipídico, n = 6. C) Resultados da coloração fluorescente com PI (400×). D,E) Resultados da citometria de fluxo com coloração fluorescente PI e H2DCFDA, n = 6. F) Resultados da detecção de OCR e ECAR, n = 4. G) Resultados da detecção do potencial de membrana mitocondrial, n = 6. H) Resultados da coloração fluorescente com JC-1.*
P < 0,05, **
P < 0,01, versus Ctrl; #
P < 0,05, ##
P < 0,01, versus As.
Este estudo também investigou o papel regulador da β-oxidação peroxissomal na lipofagia no contexto da melhora do dano hepático induzido por As pelo LA. Os resultados mostraram que o tratamento com As aumentou significativamente a intensidade e o número de pontos fluorescentes de lipofagia nos hepatócitos, elevou os níveis de expressão proteica de LC3, ULK e P62, e reduziu o nível de expressão proteica de mTOR nas gotículas lipídicas dos hepatócitos, mas a intervenção com LA atenuou as alterações acima induzidas por As (P < 0,05, Figura 9A–E). Além disso, o tratamento com TRCDA promoveu ainda mais as alterações nos indicadores relacionados à lipofagia induzidos por As, enquanto inibiu o efeito melhorador do LA na lipofagia induzida por As (P < 0,05, Figura 9A–E). Esses resultados sugeriram que a β-oxidação peroxissomal regulou a lipofagia e desempenhou um papel essencial na melhora da lesão hepática induzida por As pelo LA.
Efeitos do tratamento com TRCDA na lipofagia de hepatócitos sob exposição a As e/ou LA. A) Resultados da detecção de colocalização por fluorescência da lipofagia (400×, Nile red: gotículas lipídicas; Lyso‐Tracker: Lisossomo, caixa amarela: lipolisossomo). B–E) Resultados da detecção dos níveis de expressão proteica de genes-chave da lipofagia nas gotículas lipídicas sob diferentes grupos de tratamento, n = 3. *
P < 0.05, versus Ctrl; #
P < 0.05, versus As.
Discussão
A poluição por As, impulsionada por atividades humanas como mineração de minério, fundição de metais, combustão de combustíveis e uso de pesticidas, tornou-se cada vez mais grave e atraiu atenção significativa de pesquisadores em toxicologia.[ ] Os mecanismos da toxicidade do As são complexos, afetando muitos tecidos e órgãos, o que ameaça seriamente a saúde humana e o desenvolvimento da pecuária.[ ] O As tem como alvo o fígado, e a exposição a longo prazo prejudica a função metabólica normal, induz estresse oxidativo e inflamação, e causa danos estruturais e funcionais.[ ] Para analisar de forma abrangente a hepatotoxicidade induzida por As e desenvolver estratégias de prevenção eficazes, este estudo utilizou a análise de toxicologia de redes. A análise revelou que o As afeta principalmente os processos biológicos do fígado, como estresse oxidativo, proliferação, diferenciação, apoptose, autofagia, metabolismo lipídico e inflamação, regulando vias relacionadas. Análises adicionais descobriram que o estresse oxidativo e os distúrbios do metabolismo lipídico são centrais para a lesão hepática induzida por arsênio, que não apenas danifica diretamente os hepatócitos, mas também contribui para o desenvolvimento da lesão hepática ao afetar a proliferação celular, diferenciação, apoptose, autofagia e outros processos.[ ] O LA, um antioxidante natural cujos mecanismos de proteção se sobrepõem às vias hepatotóxicas do As, demonstrou proteger contra doenças hepáticas graves.[ ] Portanto, este estudo estabeleceu um modelo de galinha de intervenção com LA na exposição ao As para verificar e explorar ainda mais o efeito hepatoprotetor e o mecanismo do LA na lesão hepática induzida por As. Embora as galinhas sirvam como modelo animal agrícola, as vias metabólicas e os mecanismos celulares envolvidos na toxicidade do As e nos efeitos hepatoprotetores do LA mostram similaridades significativas com aqueles em humanos e outros mamíferos. Portanto, os achados obtidos do modelo de galinha podem fornecer uma referência valiosa para a compreensão do mecanismo da lesão hepática induzida por arsênio e da aplicação hepatoprotetora do ácido α-lipoico em humanos e outros organismos. Além disso,
O fígado é o principal órgão-alvo para o armazenamento e metabolismo do As.[ ] Evidências existentes mostraram que traços de As estimularam o crescimento e a síntese proteica, mas o excesso de As levou a retardo no crescimento, atrofia hepática, perda de peso, infiltração inflamatória, degeneração gordurosa, desorganização tecidual, necrose, apoptose e elevação das enzimas hepáticas AST e ALT.[ ] Neste estudo, o As afetou significativamente o peso corporal e a função hepática em frangos, mas a tolerância hepática atenuou os efeitos do As sobre o peso corporal,[ ] especialmente após exposição de longo prazo. Além disso, o LA isoladamente não teve efeito sobre o peso corporal ou a função hepática, mas a co-exposição com o As mostrou potencial para mitigar a toxicidade do As em frangos. Esses achados são semelhantes aos de estudos que utilizaram camundongos e humanos como modelos de pesquisa. Para explorar melhor os mecanismos hepatoprotetores do LA, a farmacologia de redes foi utilizada para analisar suas características biológicas, revelando que o LA melhora principalmente o dano hepático ao regular o metabolismo lipídico. Portanto, este estudo verificou ainda mais os efeitos do As e do LA sobre o metabolismo lipídico hepático.
O metabolismo lipídico no fígado é essencial para manter o equilíbrio lipídico do corpo e as funções fisiológicas normais.[ ] Envolve a síntese e o catabolismo de fosfolipídios, COL, TG e AGNE, e o metabolismo lipoproteico para o transporte e utilização eficientes de lipídios. Estudos demonstraram que o As pode causar distúrbios do metabolismo lipídico no fígado.[ ] Por exemplo, Ditzel et al. descobriram que a exposição ao As pré-natal e pós-natal precoce induziu degeneração gordurosa do fígado de camundongos, aumentando significativamente os níveis de TG, T‐COL e AGNE.[ ] Da mesma forma, no presente estudo, a exposição ao As causou acúmulo de lipídios, degeneração vacuolar e aumento de gotículas lipídicas no fígado. TG e T‐COL são indicadores importantes do metabolismo lipídico hepático.[ ] A exposição ao As aumentou os níveis de TG e T‐COL, promoveu a lipogênese de novo e diminuiu a expressão gênica de lipólise e oxidação de ácidos graxos, confirmando ainda mais o efeito indutor do As sobre os distúrbios do metabolismo lipídico hepático. No entanto, a intervenção com LA atenuou essas alterações induzidas pelo As. Em estudos de DHGNA humana, o LA melhorou a lesão hepática modulando o metabolismo lipídico, o que corrobora os resultados do presente estudo. Combinado com a farmacologia de redes, toxicologia de redes e literatura relacionada, descobriu-se que o SIRT1 atuou como um alvo crucial do LA, e as vias de sinalização P53 e Notch desempenharam papéis significativos nos efeitos do LA e do As no metabolismo lipídico hepático. Investigações adicionais confirmaram que a exposição ao As inibiu a expressão de SIRT1 e ativou as vias P53 e Notch no fígado, enquanto o LA poderia se ligar ao SIRT1, aumentou a expressão e atividade do SIRT1 e suprimiu as vias P53 e Notch. Estudos anteriores mostraram que o SIRT1, por meio de sua atividade de desacetilação, modulou fatores de transcrição associados à diferenciação de adipócitos, inibindo assim a diferenciação de adipócitos.[ ] Além disso, o SIRT1 ativou o PGC‐1α para promover a oxidação de ácidos graxos, reduzindo o acúmulo intracelular de ácidos graxos.[ ] Enquanto isso, as vias P53 e Notch são reguladores cruciais da desregulação do metabolismo lipídico hepático.
A via P53 modula a expressão de genes envolvidos na síntese de lipídios e participa da regulação da oxidação de ácidos graxos, e a via Notch1 promove a diferenciação de adipócitos e leva à desregulação dos genes do metabolismo lipídico por meio de interações com diversos fatores de transcrição.[ ] Com base nessas descobertas, pode-se inferir que o As inibiu a expressão de SIRT1 e ativou as vias P53 e Notch, resultando em distúrbios do metabolismo lipídico hepático. Em contraste, o LA teve como alvo a SIRT1, aumentando sua expressão e atividade, exibindo assim propriedades antioxidantes, modulando as vias do metabolismo lipídico, reduzindo a síntese e o acúmulo de gordura hepática, promovendo a lipólise e aliviando efetivamente o acúmulo de gordura hepática e a peroxidação lipídica.[ ] A β-oxidação peroxissomal e a lipofagia são processos essenciais no metabolismo lipídico.[ ] Portanto, este estudo investigou ainda seus papéis na hepatotoxicidade induzida por As e nos efeitos hepatoprotetores do LA.
Os peroxissomos, organelas únicas nas células eucarióticas, são importantes reguladores da homeostase do metabolismo lipídico hepático.[ ] Eles são responsáveis por remover o peróxido de hidrogênio prejudicial para manter o equilíbrio redox celular, bem como pela β‐oxidação de ácidos graxos de cadeia muito longa, convertendo-os em acetil‐CoA por meio de uma série de reações enzimáticas.[ ]

Neste estudo, a exposição ao As resultou na diminuição da expressão da enzima de β‐oxidação peroxissomal ACOX1, interrompendo a β‐oxidação peroxissomal. Por outro lado, o As promoveu a β‐oxidação mitocondrial de ácidos graxos, provavelmente como um mecanismo compensatório para mitigar a β‐oxidação peroxissomal prejudicada, com a suplementação de LA aliviando esse efeito.[ ]

O acetil‐CoA é um produto chave da β‐oxidação peroxissomal, e o LA poderia reverter a diminuição nos níveis de acetil‐CoA causada pela exposição ao As. O acetil‐CoA citosólico deriva principalmente de duas fontes: ACLY e ACSS2.[ ]

Neste estudo, a administração de LA melhorou a expressão de mRNA de ACLY e ACSS2, confirmando que tanto o As quanto o LA influenciam os níveis de acetil‐CoA por meio da β‐oxidação peroxissomal. Além disso, a exposição ao As elevou a expressão de PMP70, uma proteína receptora nos peroxissomos, indicando um aumento na quantidade de peroxissomos no fígado. Isso sugeriu uma resposta adaptativa dos hepatócitos à exposição ao As, visando melhorar a função ou estabilidade peroxissomal. No entanto, esse aumento foi insuficiente para neutralizar completamente o efeito inibitório do As sobre a β‐oxidação peroxissomal, resultando em expressão elevada de PLIN2 e subsequente acúmulo de gotículas lipídicas.[ ]

A intervenção com LA poderia regular esses processos, melhorando a β‐oxidação peroxissomal induzida pelo As e aliviando os distúrbios do metabolismo lipídico. Além disso, o acúmulo de gotículas lipídicas pode desencadear um aumento da lipofagia, com a lipofagia excessiva potencialmente exacerbando os danos celulares.
Lipofagia, um processo de autofagia seletiva, reconhece e degrada especificamente gotículas lipídicas no fígado, regulando assim a homeostase lipídica e reduzindo o acúmulo de lipídios.[ ] No entanto, o aumento anormal da lipofagia pode resultar em danos às organelas, desequilíbrio do metabolismo lipídico, estresse oxidativo e resposta inflamatória, prejudicando, por fim, as células.[ ] Por exemplo, Yu et al. demonstraram que uma dieta rica em gordura poderia induzir doença hepática gordurosa não alcoólica e envelhecimento hepático via lipofagia em ratos e células HepG2.[ ] Além disso, Yoshito et al. descobriram que o aumento da lipofagia aliviou efetivamente a esteatose e a esteato-hepatite não alcoólica em camundongos.[ ] Esses achados sugeriram que o acúmulo de gotículas lipídicas desencadeia o aumento da lipofagia. Neste estudo, o As levou ao acúmulo de gotículas lipídicas e ao aumento dos níveis de LC3 e P62 nas gotículas lipídicas, indicando lipofagia aumentada. Notavelmente, a intervenção com LA reduziu a lipofagia em hepatócitos, conforme validado adicionalmente por colocalização por imunofluorescência. O aumento da lipofagia pode representar uma resposta adaptativa das células à toxicidade do As, visando mitigar os danos do excesso de lipídios. No entanto, a intervenção com LA parece aliviar a deposição de gotículas lipídicas e a lipofagia por meio de seus efeitos antioxidantes, aumentando a β-oxidação peroxissomal e regulando as vias do metabolismo lipídico, reduzindo assim os danos celulares induzidos pelo As.[ ] Para investigar melhor o mecanismo da β-oxidação peroxissomal e da lipofagia na hepatotoxicidade do As e no efeito hepatoprotetor do LA, este estudo estabeleceu um modelo de pesquisa celular.

A β-oxidação peroxissomal e a lipofagia são processos-chave no catabolismo lipídico hepático.[ ] Embora a relação regulatória entre esses dois processos permaneça incerta, estudos indicaram que a acetil-CoA produzida pela β-oxidação peroxissomal pode inibir a autofagia e promover a degeneração gordurosa.[ ] Neste estudo, o tratamento com o inibidor da β-oxidação peroxissomal TRCDA exacerbou os efeitos inibitórios do As na β-oxidação, diminuiu os efeitos promotores do LA na β-oxidação e atenuou os efeitos protetores do LA contra danos à função hepática e deposição lipídica induzidos pelo As. Esses achados corroboraram ainda mais que o LA mitigou os distúrbios do metabolismo lipídico hepático induzidos pelo As ao aumentar a β-oxidação oxidase. Além disso, este estudo observou que o tratamento com TRCDA intensificou o efeito promotor do As na lipofagia, ao mesmo tempo em que reduziu os efeitos inibitórios do LA na lipofagia, o que confirmou o efeito regulador da β-oxidação peroxissomal na lipofagia na melhora dos distúrbios do metabolismo lipídico hepático induzidos pelo As pelo LA.
Interessantemente, ROS, um subproduto da β‐oxidação peroxissomal, estava elevado apesar do As inibir a β‐oxidação peroxissomal. As mitocôndrias, o principal local de produção de ROS, exibem potencial de membrana diminuído e fosforilação oxidativa prejudicada quando danificadas, resultando em consumo reduzido de oxigênio, refletido por uma diminuição da OCR.[ ] Além disso, a disfunção mitocondrial leva à diminuição da síntese de ATP, o que por sua vez ativa a glicólise, aumentando a produção de lactato, o que acelera a acidificação extracelular, refletido por um aumento da ECAR.[ ] Neste estudo, a exposição ao As mostrou reduzir o mtDNA, o potencial de membrana mitocondrial e a OCR, enquanto aumentava a ECAR, indicando dano mitocondrial e comprometimento da fosforilação oxidativa e da glicólise celular. O dano mitocondrial aumenta diretamente o conteúdo de ROS, o que ajuda a explicar os níveis elevados de ROS após exposição ao As. No entanto, a intervenção com LA reverteu o dano mitocondrial induzido pela exposição ao As. O mecanismo subjacente pode envolver os efeitos tóxicos do As, que inibiram a expressão de SIRT1, ativaram as vias P53 e Notch, danificaram as mitocôndrias e inibiram a atividade da β‐oxidase peroxissomal, prejudicando assim a degradação de ácidos graxos e levando ao acúmulo de lipídios nos hepatócitos.[ ] Em resposta a essa sobrecarga lipídica, as células iniciaram o mecanismo de lipofagia para eliminar o excesso de gotículas lipídicas, e o aumento excessivo da lipofagia afetou, por fim, a proliferação e a morte das células hepáticas.[ ] Por outro lado, como antioxidante que promove a atividade metabólica, o LA direcionado à SIRT1 melhorou efetivamente a função mitocondrial, potencializou a função de β‐oxidação dos peroxissomos e reduziu o acúmulo excessivo de lipídios no fígado.[ ] Esse mecanismo não apenas alivia diretamente a carga lipídica no fígado, mas também inibe a ativação excessiva da lipofagia ao restaurar o equilíbrio do metabolismo lipídico, mitigando assim de forma eficaz os distúrbios dos metabólitos lipídicos hepáticos e a morte celular induzidos pelo As.[ ] As principais vias e mecanismos intrínsecos pelos quais a β‐oxidação peroxissomal regula a lipofagia serão explorados mais a fundo em estudos futuros.
Conclusão
Este estudo indicou que o As inibiu a expressão de SIRT1, ativou as vias P53 e Notch, induziu danos mitocondriais e inibiu a β-oxidação peroxissomal, resultando em deposição lipídica que potencializou a lipofagia e levou a danos estruturais e funcionais no fígado. No entanto, a intervenção com LA atenuou os danos hepáticos induzidos pelo As ao direcionar a SIRT1, melhorar os danos mitocondriais, aumentar a β-oxidação, regular o metabolismo lipídico e inibir a lipofagia, especialmente na dose de 400 mg kg⁻¹. Este estudo esclareceu ainda mais o efeito regulador da β-oxidação peroxissomal sobre a lipofagia em hepatócitos e seus mecanismos subjacentes na hepatotoxicidade induzida pelo As e no efeito hepatoprotetor do LA. Esses achados fornecem uma base teórica para o LA como um potencial agente terapêutico para danos hepáticos induzidos pelo As e oferecem novos insights e direções para pesquisas em doenças hepáticas.
Seção Experimental
Animais e Tratamento
Cento e vinte pintinhos Hailan Brown (um dia de idade, especificamente livres de patógenos) foram comprados de um incubatório comercial (Jinzhong, China). Após uma semana de adaptação, os pintinhos foram divididos aleatoriamente em 6 grupos: grupo controle (Ctrl: ração comum para frangos), grupo de tratamento com As (As: As₂O₃), grupos de tratamento com LA (LAI: 200 mg kg⁻¹ LA, LAII: 400 mg kg⁻¹ LA), grupos de tratamento com As e LA (As+LAI: As₂O₃+200 mg kg⁻¹ LA, As+LAII: As₂O₃+400 mg kg⁻¹ LA), 20 pintinhos por grupo. As doses de As₂O₃ foram de 36 mg kg⁻¹ (As: 27,27 mg kg⁻¹), e o As₂O₃ e o LA foram adicionados à ração. O ácido (R)-(+)-α-lipoico foi utilizado neste estudo e foi adquirido da Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (D118666, CAS: 1200-22-2, Xangai, China). Todas as galinhas foram alimentadas com uma dieta padrão sob condições padrão. Na 23ª e 35ª semanas de criação, 10 galinhas de cada grupo foram eutanasiadas, e os fígados foram coletados para a detecção de indicadores relevantes. Este experimento foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Agrícola de Shanxi (SXAU-EAW-2023C.QR.001011208).
Cultura, Passagem e Tratamento de Células LMH
A célula LMH utilizada neste estudo foi uma linhagem celular congelada no laboratório, comumente usada para estudar doenças hepáticas em galinhas. Após remover as células congeladas do nitrogênio líquido, as células foram rapidamente transferidas para um banho-maria a 37 °C para descongelamento. Em seguida, as células foram centrifugadas, o sobrenadante foi descartado e o meio de cultura completo foi adicionado. A mistura foi suavemente ressuspendida e transferida para um frasco de cultura colocado em uma incubadora. Quando as células cresceram até 80% de densidade, elas foram passadas, e quando as células atingiram um número suficiente, foram agrupadas e tratadas de acordo com os requisitos experimentais. O As₂O₃ e o LA foram diluídos com um meio de cultura completo.
Detecção por CCK-8
Ensaios de CCK‐8 foram utilizados para avaliar os efeitos de diferentes concentrações de As/LA na taxa de proliferação de células LMH e para determinar as concentrações ideais de tratamento de As e LA in vitro. Resumidamente, 100 µL de suspensão celular foram semeados em uma placa de 96 poços, e As e/ou LA foram adicionados após 24 h (a concentração final de As foi 0, 4, 6, 8, 10 e 12 µmol L−1, e a concentração final de LA foi 0, 25, 50, 75, 100, 125 e 150 µmol L−1). Após 12, 24 e 48 h de cultura celular, 10 µL de CCK‐8 (C0037, Beyotime, Xangai) foram adicionados a cada poço e incubados por 2 h. A absorbância foi registrada a 450 nm, e a taxa de proliferação dos diferentes grupos de tratamento foi calculada.

Toxicologia de Rede e Farmacologia de Rede

A toxicologia de rede foi utilizada para analisar os mecanismos potenciais da lesão hepática induzida por As, e a farmacologia de rede foi utilizada para analisar os efeitos protetores potenciais do LA contra a lesão hepática induzida por As. Toxicologia de rede: As palavras-chave “Arsênio” e “lesão hepática” foram pesquisadas no CTD (https://ctdbase.org/) e no banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/), respectivamente.[ ] Os genes relevantes pesquisados nos dois bancos de dados foram interseccionados para obter genes-alvo potenciais para danos hepáticos induzidos por As, e a análise de enriquecimento GO e KEGG foi realizada no Matescape (http://metascape.org/gp/index.html). Farmacologia de rede: Alvos potenciais do LA foram triados nos bancos de dados Swiss Target Prediction (http://swisstargetprediction.ch/) e TargetNet (http://targetnet.scbdd.com/), e os genes-alvo pesquisados nos dois bancos de dados foram combinados.[ ] Em seguida, o banco de dados Matescape e o Cytoscape/Cluego (versão 3.7.2, EUA) foram utilizados para triar genes-alvo chave e realizar análise de enriquecimento GO e KEGG. Além disso, docking molecular e visualização foram realizados usando o SwissDock (https://www.swissdock.ch/) e o software UCSF Chimera (versão 1.13.1, EUA) para triagem adicional.

Detecção do Conteúdo de As no Fígado e na Ração

A espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP‐MS) foi utilizada para determinar o conteúdo de íons As no fígado e na ração.[ ] Resumidamente, 1 g de tecido hepático ou ração foi pesado e seco até peso constante. Posteriormente, foi finamente moído em pó, e 100 mg do pó foram colocados em um tubo de digestão contendo 8 mL de ácido nítrico concentrado. O tubo de digestão foi colocado em um aparelho de digestão para digestão de acordo com as etapas convencionais. Após volume constante, a solução foi filtrada usando uma membrana filtrante e detectada usando um ICP‐MS (NexION 350, PerkinElmer, Waltham). Finalmente, o teor real de As na amostra foi calculado com base na curva padrão.

Coloração HE
Avaliação do dano morfológico hepático foi realizada por coloração HE. Após a fixação do fígado, este foi lavado, desidratado, clarificado, embebido em parafina, incluído, e foram feitos cortes de parafina de 5 µm. Os cortes de parafina foram rotineiramente desparafinizados e corados com eosina e hematoxilina, e a estrutura morfológica do fígado foi observada sob microscópio óptico comum (BX51, Olympus, Tóquio).
Coloração Oil Red O
A coloração Oil Red O foi utilizada para observar o conteúdo lipídico no fígado. O tecido hepático fresco foi incluído em meio de inclusão OCT, e cortes congelados de 8 µm foram preparados. Em seguida, os cortes foram lavados com isopropanol 60% por 2 min e corados com Oil Red O por 15 min no escuro. Finalmente, após lavagem com etanol anidro 75%, os cortes foram contracorados com hematoxilina e montados com glicerina‐gelatina. Sob o microscópio óptico comum, as gotículas lipídicas apareceram em vermelho‐alaranjado e os núcleos celulares em azul.
Detecção de indicadores relacionados à função hepática e ao metabolismo lipídico
A função hepática e o metabolismo lipídico foram observados através da detecção dos níveis de indicadores relacionados à função hepática (ALT (C009‐2‐1), AST (C010‐2‐1)) e indicadores relacionados ao metabolismo lipídico (T‐CHO (A111‐1‐1), TG (A110‐1‐1), LDL‐C (A113‐1‐1), HDL‐C (A112‐1‐1)) no fígado e nas células. Esses kits foram adquiridos do Instituto de Engenharia Bioquímica de Nanjing (Nanjing). Para amostras de fígado, foi preparado um homogeneizado 10×. Para amostras celulares, as células foram coletadas, rompidas por ondas ultrassônicas e centrifugadas para obter o sobrenadante, obtendo a solução de teste celular. Subsequentemente, o procedimento foi realizado de acordo com as instruções dos kits. Finalmente, os valores de DO foram medidos usando um leitor de microplacas (Varioskan Flas, Thermo Fisher, Waltham), e os resultados foram analisados.
Detecção de mtDNA
O DNA total foi extraído usando um kit de extração de DNA (D1700, Solarbio, Pequim) e quantificado com NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Massachusetts). O DNA foi então diluído para uma concentração de 150 ng µL−1. Primers foram desenhados com base nas sequências do D‐loop de galinha (gene mitocondrial) e GCG (gene nuclear) e sintetizados. As sequências dos primers foram fornecidas na Tabela S1 (Informações de Suporte). A RT‐PCR foi realizada usando um kit de RT‐PCR (RR420A, Takara Biomedical Technology) seguindo as instruções do fabricante. O nível relativo de mtDNA foi calculado por 2ΔCT.
Detecção do Potencial de Membrana Mitocondrial
As células foram semeadas em placas de 96 poços/12 poços e cultivadas por 24 h. Em seguida, as células foram tratadas de acordo com o agrupamento experimental. Após 24 h, o meio de cultura foi substituído e o corante JC-1 (C2006, Beyotime, Xangai) foi adicionado a uma concentração final de 10 µg mL⁻¹. As células foram incubadas a 37 °C por 20 min, após o que o meio de cultura foi substituído. As alterações do potencial da membrana mitocondrial foram detectadas usando um leitor de microplacas multifuncional ou microscópio de fluorescência. Em potencial de membrana mitocondrial mais elevado, aparecia como agregados J (525 nm/590 nm, fluorescência vermelha), enquanto em potencial de membrana mitocondrial mais baixo, aparecia como monômero (490 nm/530 nm, fluorescência verde). A razão entre a fluorescência verde/vermelha foi usada para quantificar a mudança no potencial da membrana mitocondrial.

Detecção de OCR e ECAR
Após o tratamento de acordo com o agrupamento experimental, as células foram cultivadas por 24 h, em seguida o meio de cultura foi descartado. OCR (E-BC-F068) e ECAR (E-BC-F069) foram medidos usando kits de ensaio correspondentes (Elabscience, Wuhan) de acordo com as instruções do fabricante. A microplaca foi colocada em um leitor de microplacas multifuncional ajustado a 37 °C com modo de leitura dinâmica. Para a detecção de OCR, o comprimento de onda de excitação foi ajustado para 405 nm, o comprimento de onda de emissão foi ajustado para 675 nm, e a detecção foi realizada a cada 2 min por 90 min. Para a detecção de ECAR, o comprimento de onda de excitação foi ajustado para 490 nm e o comprimento de onda de emissão para 535 nm, e a detecção foi realizada a cada 2,5 min por 120 min. Finalmente, os valores de fluorescência foram plotados em função do tempo, e OCR e ECAR foram representados pelas inclinações das curvas.

Detecção de Lipofagia
Amostras de fígado foram duplamente coradas por imunofluorescência com a proteína marcadora de autofagossomo (LC3) e a proteína marcadora de gotículas lipídicas (ATGL) para co-localizar a lipofagia nos hepatócitos. Secções de fígado embebidas em parafina foram desparafinizadas e reidratadas usando um protocolo padrão, e a recuperação antigênica foi realizada com tampão citrato por 10 min. Em seguida, as secções foram bloqueadas com 5% de BSA por 2 h e incubadas durante a noite a 4 °C com os anticorpos primários LC3 (1:200, derivado de camundongo, A17424, ABclonal Technology, Wuhan) e ATGL (1:200, derivado de coelho, A6245, ABclonal Technology). Após lavagem, as secções foram incubadas à temperatura ambiente com dois anticorpos secundários fluorescentes por 2 h. Finalmente, as secções foram montadas com meio de montagem antidesbotecimento contendo DAPI e observadas sob microscópio de fluorescência para imagem e análise de co-localização.
Amostras de células foram duplamente coradas com uma sonda fluorescente lisossomal (Lyso‐Tracker Green, C1047S, Beyotime) e uma sonda fluorescente lipídica (Nile Red, C2051S, Beyotime) para co‐localizar a lipofagia nos hepatócitos. Após tratar e cultivar as células de acordo com os requisitos experimentais, o meio foi substituído por meio de cultura fresco, e Lyso‐Tracker Green (concentração final 75 nmol L−1) e Nile Red (concentração final 1 µmol L−1) foram adicionados. Em seguida, as células foram incubadas a 37 °C por 30 min no escuro. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e observadas sob um microscópio de fluorescência invertido para imageamento e análise de colocalização.

Detecção por Citometria de Fluxo
A citometria de fluxo foi utilizada para detectar apoptose celular (PI, HY‐D0815, MedChemExpress, Xangai) e espécies reativas de oxigênio (ROS, H2DCFDA, HY‐D0940, MedChemExpress). As células foram tratadas de acordo com os requisitos experimentais. Após 24 h de cultura, as células foram coletadas, lavadas com PBS e coradas com 200 µL de PI (concentração 50 µg mL−1) ou H2DCFDA (concentração 5 mm) por 30 min. Posteriormente, as células foram fixadas com etanol 70% pré‐resfriado por 30 min, filtradas através de tecido de nylon de 200 mesh e carregadas na máquina. Finalmente, a apoptose e os níveis de ROS das células foram analisados com base nos resultados experimentais.

Western Blotting
100 mg de tecido hepático foram homogeneizados em 1000 µL de tampão de lise RIPA contendo 10 µL de PMSF, três amostras por grupo. E as amostras foram centrifugadas a 10 000 g por 15 min a 4 °C. Para a detecção dos níveis de expressão proteica de genes relacionados à lipofagia, as gotículas lipídicas foram extraídas usando um kit de extração de gotículas lipídicas (CBL‐MET‐5011, Cell Biolabs, San Diego) e, em seguida, as proteínas das gotículas lipídicas foram extraídas. A concentração de proteína no sobrenadante foi determinada usando um kit de ensaio BCA (AR1189, Boster Biological Technology, Wuhan). Em seguida, 60 µg de proteínas foram separados por eletroforese em géis de SDS‐PAGE a 8% e 12% (80 V por 30 min, seguido de 100 V por 90 min). As proteínas separadas foram transferidas para membranas de NC (350 mA por 1 h) e bloqueadas com 5% de leite seco desnatado por 2 h. As membranas foram então incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários GAPDH (1:10000), P53 (1:2000), Notch1 (1:1000), SIRT1 (1:1000), PMP70 (1:1000), ATGL (1:1000), PLIN2 (1:1000), ACOX1 (1:3000), LC3B (1:1000), P62 (1:1000), mTOR (1:1000) e ULK1 (1:1000). GAPDH (bsm‐33033M), mTOR (bs‐1992R), ULK1 (bs‐3602R) e P62 (bs‐55207R) adquiridos da Bioss (Pequim), e PMP70 (A4172), PLIN2 (D161460), P53 (10442‐1‐AP), Notch1 (10062‐2‐AP), SIRT1 (SIRT1) e ACOX1 (10957‐1‐AP) adquiridos da ABclonal Technology, Sangon (Xangai) e Proteintech (Wuhan), respectivamente. Após lavar três vezes com TBST, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário (1:5000, RS0002, RS0001, ImmunoWay, Pequim) a 37 °C por 2 h. Os sinais foram então revelados usando quimioluminescência ECL e analisados com o sistema de imageamento multifuncional FluorChem Q (Cell Biosciences, CA).
Extração de RNA e Detecção por RT‐PCR
A RT‐PCR foi utilizada para avaliar os níveis de expressão relativa de mRNA de genes relacionados ao metabolismo de ácidos graxos no fígado. O mRNA total foi extraído de 40 mg de tecido hepático usando um Extrator de RNA Total (B511311, Sangon, Xangai), seis amostras por grupo. A concentração de mRNA foi medida usando um NanoDrop 2000 e ajustada para 250 ng µL−1. O mRNA foi então transcrito reversamente em cDNA usando o kit PrimeScript RT (RR037A, Takara Biomedical Technology, Pequim). Os níveis de expressão relativa de mRNA foram subsequentemente medidos de acordo com o protocolo do kit qRT‐PCR. As sequências de primers para GAPDH, ACOX1, ACACA, FASN, ATGL, LIPA, HSL, CHREBP, ADGAT2, LC3B, P62 e MTOR foram fornecidas na Tabela S1 (Informações de Apoio). Os níveis de expressão relativa dos genes alvo foram calculados usando o método 2−△△CT.

Análise Estatística
Os dados são apresentados como média ± EPM e foram analisados usando o software GraphPad Prism 8.0. As comparações estatísticas foram realizadas usando ANOVA de uma via e comparações múltiplas. As diferenças significativas em comparação com o grupo controle foram marcadas com “*”, e as diferenças significativas entre os grupos de intervenção com LA e o grupo As foram indicadas por “#”, o grupo de tratamento apenas com LA não foi comparado com o grupo As. Um valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Declaração de Aprovação Ética
Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade Agrícola de Shanxi (SXAU‐EAW‐2023C.QR.001011208)

Conflito de Interesses
Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Contribuições dos Autores
Y.Z.: análise formal, supervisão, metodologia, redação do rascunho original e aquisição de financiamento. M.G.: análise formal, validação, metodologia e redação – revisão e edição. T.P., C.S. e Y.C.: validação, redação – revisão e edição. L.Z. e Y.L.: metodologia. C.L. e J.W.: redação – revisão e edição e supervisão. J.Z.: administração do projeto, supervisão, aquisição de financiamento e redação – revisão e edição.

Informações de Apoio

Declaração de Disponibilidade de Dados
Todos os dados necessários para avaliar as conclusões do artigo estão presentes no artigo e/ou nas Informações de Apoio. Não há restrições quanto ao uso dos materiais.