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pmid: "27099338"
title: "O ácido α-lipóico promove a hiperacetilação da α-tubulina e bloqueia a renovação das mitocôndrias através da mitofagia."
authors: "Stoner MW, Thapa D, Zhang M, Gibson GA, Calderon MJ, St Croix CM, Scott I"
journal: "The Biochemical journal"
pubdate: "2016 Jun 15"
doi: "10.1042/BCJ20160281"
source: "PMC Full Text"

O ácido α-lipóico promove a hiperacetilação da α-tubulina e bloqueia a renovação das mitocôndrias através da mitofagia.

Autores

Stoner MW, Thapa D, Zhang M, Gibson GA, Calderon MJ, St Croix CM, Scott I

Periodico

The Biochemical journal (2016 Jun 15)

Conteudo

Ácido α-Lipóico Promove a Hiperacetilação de α-Tubulina e Bloqueia a Renovação de Mitocôndrias através da Mitofagia

A acetilação de lisina está intimamente acoplada ao estado nutricional da célula, uma vez que a disponibilidade de seu cofator, acetil-CoA, flutua com as mudanças nas condições metabólicas. Estudos recentes demonstraram que os níveis de acetil-CoA atuam como um indicador de nutrição celular, e o aumento da abundância deste metabólito pode bloquear a indução de programas de reciclagem celular. Aqui investigamos a interação entre as vias metabólicas mitocondriais, acetilação e autofagia, utilizando indutores químicos da produção mitocondrial de acetil-CoA. O tratamento de células com Ácido α-Lipóico, um cofator do complexo piruvato desidrogenase, levou à inesperada hiperacetilação de α-Tubulina no citosol. Esta acetilação foi bloqueada pela inibição farmacológica da exportação de citrato mitocondrial (uma fonte de acetil-CoA derivada da mitocôndria no citosol), dependeu da α-Tubulina acetiltransferase αTAT, e foi acoplada a uma perda de função da histona desacetilase citosólica, HDAC6. Demonstramos ainda que o Ácido α-Lipóico retarda o fluxo de substratos através das vias relacionadas à autofagia, e limita severamente a capacidade das células de remover mitocôndrias despolarizadas através da mitofagia mediada por PINK1.

INTRODUÇÃO

Durante períodos de privação de nutrientes, os organismos podem aumentar a regulação de múltiplas vias catabólicas para manter o suprimento de metabólitos e a homeostase celular. A autofagia, um processo de reciclagem celular induzido pelo estresse nutricional, degrada múltiplos componentes subcelulares, permitindo que a célula reutilize as estruturas bioquímicas contidas neles. Para regular a indução da autofagia, as células empregam vários mecanismos para monitorar seu estado energético, sendo o mais bem caracterizado o eixo AMPK-mTOR-ULK1. Aqui, aumentos na relação AMP:ATP no citoplasma são detectados pela AMP quinase (AMPK), que fosforila e inativa o alvo mamífero da rapamicina (mTOR). A inativação do mTOR remove sua inibição da quinase ULK1 que, junto com outros efetores upstream, inicia a produção de estruturas necessárias para transportar substratos da autofagia até o lisossomo para processamento (revisado em).

Trabalhos recentes demonstraram que o acetil-CoA, assim como AMP/ATP, pode atuar como uma molécula sensora do estado nutricional celular. Utilizando várias abordagens para manipular os níveis celulares de acetil-CoA, foi mostrado que reduções na abundância citosólica de acetil-CoA ativam a maquinaria autofágica celular. Este processo pôde ser revertido usando agentes farmacológicos que aumentam a disponibilidade de acetil-CoA no citoplasma.
As etapas finais dessas vias de metabolismo de combustíveis ocorrem na mitocôndria e, como tal, essa organela é um dos principais reguladores da abundância de acetil-CoA na célula. Essa regulação ocorre tanto dentro das mitocôndrias (alterando os níveis de acetil-CoA disponíveis para as vias bioenergéticas ou biossintéticas) quanto no ambiente celular mais amplo (através da exportação retrógrada de moléculas transportadoras de acetil-CoA, como o citrato, para o citoplasma).

Demonstramos recentemente que uma redução nos níveis de acetilação de lisina em proteínas mitocondriais levou ao aumento do turnover de proteínas mitocondriais através da mitofagia, uma via de degradação específica de organelas relacionada à autofagia. Como a acetil-CoA é o cofator para a acetilação, existe uma forte ligação entre sua disponibilidade e o status de acetilação das proteínas mitocondriais, como evidenciado pelo aumento da observação dessa modificação em modelos de excesso de nutrientes. Portanto, levantamos a hipótese de que o aumento dos níveis mitocondriais de acetil-CoA, usando indutores farmacológicos do metabolismo do piruvato, levaria à proteção das mitocôndrias da degradação pela mitofagia.

Neste relatório, demonstramos que o tratamento de células com Ácido α-Lipóico, um cofator em várias vias metabólicas mitocondriais, incluindo o complexo da piruvato desidrogenase, leva à hiperacetilação rápida e específica de uma única proteína. Surpreendentemente, mostramos que essa modificação está localizada fora das mitocôndrias e ocorre no resíduo K40 da α-Tubulina. A acetilação desse resíduo depende da função da acetiltransferase de tubulina, αTAT, e é mediada por uma inibição da função da HDAC6. Finalmente, demonstramos que o tratamento com Ácido α-Lipóico retarda o fluxo de processamento de substrato pela maquinaria autofágica e limita a remoção de mitocôndrias despolarizadas através de vias de mitofagia relacionadas à PINK1.

MATERIAIS E MÉTODOS
Cultura de Células e Tratamentos
Células de fibroblasto de rim de macaco verde africano COS-7 ou células de hepatocarcinoma humano HepG2 foram cultivadas em DMEM com alta glicose, suplementado com 10 % de SBF e Anti-Anti (todos Gibco), a 37 °C/5 % de CO2. As células foram tratadas com os seguintes produtos químicos (ver legendas das figuras para tempo e concentração): (±)-Ácido α-Lipóico, piruvato de sódio (Pyr), dicloroacetato, N-acetilcisteína, 4-hidroxi-TEMPO, bafilomicina A1 e carbonil cianeto 3-clorofenil-hidrazona, 6-BHA e BTC (todos Sigma). RNAs pequenos interferentes para αTAT, juntamente com controles não direcionados, foram obtidos da IDTDNA e transfectados em células usando Lipofectamina 3000 (Life Technologies). GFP-Tubulina e GFP-K40R-Tubulina foram obtidos da Addgene e transfectados usando Lipofectamina 3000.

Colheita de Células, Fracionamento Subcelular e Co-Imunoprecipitação
Para western blots padrão, as células foram lavadas em PBS gelado e coletadas por raspagem. Os pellets celulares foram lisados no gelo por 30 min em tampão de detergente CHAPS, e os sobrenadantes foram recuperados a 13000 g. Para fracionamento subcelular, as células foram coletadas como antes e os pellets celulares foram lisados no gelo usando tampão de sacarose sem detergente e uma agulha 25-gauge. Após a remoção dos núcleos celulares e células não lisadas a 500 g, os sobrenadantes foram centrifugados a 6000 g. O pellet representou a fração de membrana pesada (HM) rica em mitocôndrias, enquanto o sobrenadante representou o citosol. Ambas as frações foram posteriormente lisadas em tampão CHAPS antes da análise por western blot. Para experimentos de co-imunoprecipitação, as células foram coletadas em tampão CHAPS, e quantidades iguais de proteína total foram incubadas a 4 °C durante a noite com o anticorpo relevante. As proteínas imunocapturadas foram isoladas usando beads de agarose Proteína-A (Cell Signaling Technology), lavadas em tampão CHAPS e eluídas a 95 °C em tampão de amostra LDS (Life Technologies). Os níveis de Acetil-CoA foram medidos usando um kit disponível comercialmente (Sigma).

Anticorpos e Western Blotting

Os lisados proteicos foram preparados em tampão de amostra LDS e separados usando o sistema Bolt SDS-PAGE em géis de Bis-Tris a 12%, antes da transferência para membranas de nitrocelulose (todos da Life Technologies). A expressão proteica foi analisada usando os seguintes anticorpos: acetil-Lisina monoclonal de camundongo, α-Tubulina de camundongo, GAPDH de coelho, Glutamato Desidrogenase (GDH) de coelho, acetil-Tubulina K40 de coelho, HDAC6 de coelho, LC3A/B de coelho, COX IV de coelho, Succinato Desidrogenase A (SDHA) de coelho, fosfo-ACC de coelho da Cell Signaling Technologies; PINK1 de coelho da Novus Biochemicals. Anticorpos secundários fluorescentes anti-camundongo ou anti-coelho (vermelho, 700 nm; verde, 800 nm) da LiCor foram usados para detectar os níveis de expressão.

Microscopia Confocal e Análise

Células HepG2 foram cultivadas em lamínulas de vidro, fixadas em paraformaldeído a 4% (v/v) e imunomarcadas usando anticorpos para Tom20 (mitocôndrias), LC3 (autofagossomos), juntamente com coloração DAPI (núcleo). A figura mostra imagens representativas dos três grupos experimentais, e foram comprimidas para reduzir o tamanho, mas manter a resolução. Todas as imagens foram obtidas usando uma óptica de 60X (1,43NA) em um Nikon A1 com detectores GASP e software NIS Elements (Nikon Inc., Melville NY). A renderização 3D das pilhas Z confocais foi realizada para obter medidas de fragmentação mitocondrial usando Imaris (Bitplane). As medidas foram obtidas de cada célula em 15 campos de visão escolhidos aleatoriamente para cada condição. A colocalização entre Tom20 e LC3 foi medida em voxels acima de limiares pré-definidos, e Coeficientes de Correlação de Pearson foram gerados para quantificar a colocalização de mitocôndrias e autofagossomos.

Preparação de Imagens e Reprodução Experimental
As imagens de western blot foram capturadas utilizando o Odyssey Fluorescent Imager (LiCor), que permite a análise simultânea de duas proteínas em uma única membrana. As imagens foram processadas e quantificadas utilizando o software Odyssey e montadas no Photoshop (Adobe). Alterações no brilho/contraste dos painéis das figuras foram feitas utilizando configurações automáticas do software quando necessário, e verificadas para garantir que nenhum resultado foi artificialmente manipulado ou deturpado. Todos os experimentos foram realizados pelo menos três vezes, e imagens representativas dessas repetições são apresentadas.
RESULTADOS
O Ácido α-Lipoico promove a hiperacetilação de uma única proteína citoplasmática
Pesquisas recentes demonstraram que a modulação química de vias mitocondriais relacionadas ao metabolismo da acetil-CoA regula vias globais de autofagia, e que alterações nos níveis de acetilação de lisina mitocondrial estão ligadas à captação e utilização de gordura. Primeiramente, investigamos se a modulação dos níveis mitocondriais de acetil-CoA através da via do piruvato produziria um efeito semelhante na acetilação de lisina. Células COS-7 foram tratadas com 3 mM de piruvato de sódio (Pyr; uma concentração três vezes maior que a do meio de cultura padrão), 5 mM de αLA (um cofator do complexo da piruvato desidrogenase) ou 20 mM de DCA (um inibidor das quinases da piruvato desidrogenase), e a acetilação total de lisina nas proteínas foi analisada por western blot. Após 4 h, houve um aumento impressionante nos níveis de acetilação de uma única banda de ~50 kDa nas células tratadas com αLA, que estava ausente em todas as outras canaletas (Fig. 1a).
Além de atuar como cofator enzimático mitocondrial, foi demonstrado que o αLA possui propriedades antioxidantes (ver, por exemplo). Portanto, examinamos se essa hiperacetilação estava ligada a alterações no estado redox celular. O tratamento das células com os antioxidantes de amplo espectro NAC ou TEMPO não teve efeito sobre a acetilação de lisina (Fig. 1b), indicando que as alterações observadas nas células tratadas com αLA não estão relacionadas ao estado de oxidação dessa proteína.
Em seguida, testamos se a hiperacetilação de lisina observada ocorria de forma dinâmica, ou se era causada por um processo não biológico. Células COS-7 foram tratadas por 4 h com uma variedade de concentrações de αLA (Fig. 1c), ou em diferentes pontos temporais ao longo de 24 h (Fig. 1d). A análise por western blot mostrou que o estado de acetilação dessa proteína de ~50 kDa mudou dinamicamente, de maneira dependente tanto da concentração quanto do tempo, começando dentro de uma hora do tratamento. Resultados semelhantes foram encontrados em células HepG2 derivadas de hepatocarcinoma humano, indicando que os efeitos do αLA não são específicos de linhagem celular (Fig. 1c, d). Em conjunto, esses dados sugerem que a hiperacetilação induzida pelo tratamento com αLA ocorre de forma controlada e não artificial.
Para demonstrar ainda mais os efeitos específicos do αLA, repetimos este curso temporal utilizando 6-BHA, um análogo inativo do ácido lipoico. Enquanto uma hiperacetilação robusta em ~50 kD foi observada após 1 h nas células tratadas com αLA, houve acetilação negligenciável nas células tratadas com 6-BHA de 1 a 24 h (Fig. 1e). Esses dados apoiam ainda que a hiperacetilação observada é específica ao αLA.

Finalmente, investigamos a localização subcelular desse evento de acetilação. Como os produtos químicos moduladores de acetil-CoA foram todos propostos para atuar através das vias mitocondriais de utilização de piruvato, hipotetizamos que a proteína hiperacetilada estaria localizada no compartimento mitocondrial. Para testar isso, tratamos células com Pyr, αLA e DCA, e então separamos as proteínas em diferentes frações celulares usando centrifugação diferencial. Surpreendentemente, a proteína hiperacetilada estava predominantemente localizada na fração citoplasmática solúvel, e não no pellet de membrana pesada contendo mitocôndrias (Fig. 1f). Isso indicou que ou o αLA estava atuando predominantemente no citoplasma, ou que os sinais pró-acetilação estavam sendo transmitidos das mitocôndrias para o citosol, como proposto anteriormente.

Identificação da α-Tubulina Lisina-40 como o substrato da hiperacetilação
A força e a rapidez da resposta de hiperacetilação induzida por αLA sugeriram que o substrato pode ser uma proteína citosólica abundante. Como o tamanho da proteína foi avaliado por SDS-PAGE em cerca de 50 kDa, levantamos a hipótese de que poderia ser um membro da família da tubulina. Para examinar isso mais de perto, tratamos células com Pyr, αLA e DCA por 4 h, e então analisamos os lisados por western blot. Usando o sistema de duas cores LiCor, medimos simultaneamente a expressão de α-Tubulina (vermelho) e acetil-lisina (verde), e descobrimos que a banda hiperacetilada induzida por αLA se sobrepôs à α-Tubulina com alta fidelidade (Fig. 2a). A acetilação da α-Tubulina é um fenômeno bem caracterizado, sendo o resíduo de lisina na posição 40 (K40) a modificação mais comum. Para estabelecer se αLA está promovendo a hiperacetilação desse resíduo, repetimos os tratamentos celulares e analisamos os lisados por western blot usando um anticorpo específico para essa modificação. Após 4 h de tratamento com αLA, houve um aumento acentuado na abundância de α-Tubulina acetilada em K40, que estava ausente nas células controle e tratadas com Pyr e DCA (Fig. 2b). Isso indica que K40 da α-Tubulina é o substrato para a hiperacetilação mediada por αLA. Para confirmar ainda mais que a α-Tubulina era o substrato de hiperacetilação, realizamos uma análise de imunoprecipitação do seu estado de acetilação. Células tratadas com ou sem αLA por 4 h foram imunoprecipitadas com um anticorpo global de acetil-lisina, seguido por imunotransferência para α-Tubulina. Enquanto fomos capazes de detectar uma quantidade significativa de α-Tubulina acetilada em células tratadas com αLA, isso estava ausente em células não tratadas (Fig. 2c). Em seguida, testamos se a hiperacetilação dinâmica observada usando o anticorpo global de acetil-lisina também era observada no sítio K40. Em consonância com os resultados anteriores, foi confirmado que a acetilação da α-Tubulina em K40 ocorre de maneira dependente da concentração e do tempo (Fig. 2d, e), indicando que é potencialmente catalisada por um processo enzimático. Finalmente, testamos se a expressão de um mutante não acetilável da α-Tubulina (K40R) bloquearia a acetilação observada em células tratadas com αLA. De fato, a expressão transiente de GFP-WT-α-Tubulina, seguida pelo tratamento com αLA, levou a uma robusta hiperacetilação da α-Tubulina em K40, que foi significativamente atenuada em células que expressavam o mutante GFP-K40R (Fig. 1f). No geral, esses dados sugerem que o resíduo K40 da α-Tubulina é o substrato para a hiperacetilação induzida por αLA.
A exportação mitocondrial de citrato é necessária para a acetilação da α-Tubulina mediada por ácido α-lipóico
Trabalhos anteriores mostraram que o citrato derivado da mitocôndria (uma molécula transportadora de acetil-CoA) é uma das principais fontes de acetil-CoA citoplasmática necessária para a acetilação de lisina. O citrato é exportado para o citosol através do transportador mitocondrial de citrato, onde é convertido novamente em acetil-CoA pela ATP citrato liase (revisado em ). Para fortalecer a ligação entre a produção de acetil-CoA mediada por αLA na mitocôndria e a acetilação citosólica de α-Tubulina, tratamos células COS-7 com αLA na presença ou ausência de BTC, um inibidor farmacológico da exportação mitocondrial de citrato. A perda da exportação mitocondrial de citrato (e, portanto, de acetil-CoA) em células co-tratadas com BTC/αLA levou a uma redução significativa na acetilação de α-Tubulina, em relação às células tratadas apenas com αLA (Fig. 3a,b).

Como hipotetizamos que o tratamento com αLA levaria a um aumento de acetil-CoA citoplasmática livre, medimos a concentração de acetil-CoA em células tratadas com ou sem αLA por 24 h. Surpreendentemente, descobrimos que houve uma redução significativa nas concentrações de acetil-CoA em células tratadas com αLA em relação ao controle (Fig. 3c). Ao investigar mais a fundo, descobrimos que o tratamento com αLA induziu significativamente a atividade da acetil-CoA carboxilase (ACC; medida como desfosforilação da ACC), que converte acetil-CoA citosólica livre em malonil-CoA (Fig. 3d). Para implicar ainda mais o citrato mitocondrial nesse processo, descobrimos que o BTC poderia bloquear a indução mediada por αLA da ACC (Fig. 3d). Dessa forma, hipotetizamos que o tratamento com αLA leva a um grande aumento no transporte de citrato mitocondrial, que fornece acetil-CoA suficiente para permitir a hiperacetilação de α-Tubulina. A atividade contínua nessa via leva a mecanismos homeostáticos celulares no citosol para reduzir os níveis de acetil-CoA livre, resultando na ativação da ACC.

A hiperacetilação mediada por Ácido α-Lipoico é regulada pela atividade de αTAT e HDAC6
A acetilação da lisina da α-Tubulina em K40 foi previamente demonstrada como sendo catalisada pela proteína acetiltransferase de α-Tubulina αTAT (também conhecida como MEC-17). Portanto, propusemo-nos a determinar se a αTAT era responsável pela hiperacetilação enzimática da α-Tubulina em resposta ao tratamento com αLA. Células COS-7 foram transfectadas por 48 h com siRNA controle não-alvo (Con), ou com dois siRNAs independentes direcionados à αTAT (TAT-1 e TAT-2), seguidas de tratamento por 4 h com αLA. Em concordância com resultados anteriores, houve uma robusta acetilação em K40 das células tratadas com αLA e transfectadas com siRNA controle. Notavelmente, a hiperacetilação da α-Tubulina foi amplamente abolida em células transfectadas com siRNA direcionado à αTAT (Fig. 4a), sugerindo que os efeitos do αLA são mediados por esta acetiltransferase. Repetimos então esta análise com um anticorpo pan-acetilação, para garantir que a αTAT era responsável pela acetilação observada em ~50 kDa nos experimentos anteriores. Assim como com o anticorpo específico para K40, a perda de αTAT reduziu grandemente a banda de hiperacetilação observada (Fig. 4b), indicando que as modificações observadas anteriormente eram de fato na α-Tubulina.

Como essa modificação pós-traducional ocorre através de um processo reversível, buscamos em seguida investigar se a desacetilação de lisina desempenhava um papel no status de acetilação da α-Tubulina. Em particular, esperávamos determinar se o aumento da acetilação evidente nas células tratadas com αLA era causado por uma redução na abundância ou atividade da desacetilase. Como antes, tratamos células COS-7 com diferentes concentrações de αLA por 4 h, ou com 5 mM de αLA em diferentes tempos ao longo de 24 h. Após a coleta dos lisados, analisamos o nível de expressão de HDAC6, uma proteína citosólica que foi previamente demonstrada como sendo a principal desacetilase de α-Tubulina. No entanto, não houve alteração dependente de tempo ou concentração nos níveis de HDAC6 após o tratamento com αLA (Fig. 4c, d), indicando que este químico não tem efeito sobre a estabilidade da HDAC6.

Em seguida, examinamos se o αLA poderia ter um efeito direto sobre a capacidade da HDAC6 de desacetilar a α-Tubulina. Tratamos células COS-7 por 4 h com αLA e utilizamos os lisados celulares em experimentos de co-imunoprecipitação. Após a imunocaptura da α-Tubulina em células não tratadas, fomos capazes de detectar uma forte interação entre esta proteína e a HDAC6. No entanto, após 4 h de tratamento com αLA, observamos uma diminuição significativa na interação física entre a α-Tubulina e a HDAC6 (Fig. 4e). Concluímos, portanto, que o αLA promove a hiperacetilação da α-Tubulina ao abolir sua interação com a HDAC6, permitindo assim a acetilação desimpedida em K40 pela αTAT.

O tratamento com Ácido α-Lipóico retarda o fluxo autofágico e bloqueia a via mediada por PINK1.
Por fim, buscamos estabelecer se a hiperacetilação da α-Tubulina pela αLA tinha impacto na função celular. Como o status de acetilação de proteínas citosólicas tem sido recentemente implicado na regulação da autofagia global, examinamos o papel da acetilação da α-Tubulina na indução deste programa de reciclagem celular. O tratamento de células COS-7 por 4 h com αLA levou a um aumento na lipidação de LC3-I para formar LC3-II (Fig. 5a), um marcador comumente utilizado para indução de autofagia. No entanto, a medição do estado estacionário dos níveis de LC3-II oferece uma imagem incompleta do programa de autofagia, pois é incapaz de distinguir entre o aumento da produção de vacúolos autofágicos (autofagossomos) e uma diminuição na taxa de fluxo autofágico (por um bloqueio na via de autofagia; (19)). Assim, realizamos experimentos de curso temporal para medir o fluxo autofágico em células controle e tratadas com αLA. Primeiramente, privamos de soro as células COS-7 em HBSS por até 4 h para induzir autofagia, na presença ou ausência de αLA. Nas células tratadas com αLA, houve um aumento marcante em LC3-II após privação prolongada de soro, o que não era evidente em células não tratadas (Fig. 5b), indicando uma potencial redução no processamento de autofagossomos. Em segundo lugar, o tratamento das células com o inibidor lisossomal bafilomicina A1, em vários pontos temporais ao longo de 24 h, levou a um aumento constante na expressão de ambas as formas de LC3. O co-tratamento das células com αLA diminuiu a taxa de acúmulo de LC3-II após a adição de bafilomicina A1 (Fig. 5c, d), indicando que a hiperacetilação da α-Tubulina pela αLA pode retardar a progressão de substratos (como o próprio LC3-II) através da via de autofagia.
Trabalhos recentes demonstraram que mitocôndrias disfuncionais são seletivamente removidas por meio de um processo relacionado à autofagia chamado mitofagia (revisado em). Portanto, procuramos testar se a hiperacetilação da α-Tubulina, e a consequente interrupção do fluxo autofágico, regularia a degradação seletiva de mitocôndrias danificadas. Primeiro, adotamos uma abordagem baseada em imagens para analisar o impacto da αLA na mitofagia. Células HepG2 foram cultivadas em lamínulas e tratadas com 10 μM de CCCP (um desacoplador do potencial transmembrana mitocondrial), na presença ou ausência de αLA por 4 h. As células foram fixadas e coradas para Tom20 (um marcador mitocondrial), LC3 (um marcador autofagossômico) e DAPI. Nas células tratadas apenas com CCCP, houve um grande aumento na colocalização mitocondrial:autofagossômica, que foi atenuada pelo co-tratamento com αLA (Fig. 6a). Isso indica que a αLA pode retardar a entrega de mitocôndrias danificadas aos autofagossomos, ou prevenir os danos mediados por CCCP a montante desse processo. Além disso, houve um aumento significativo na fragmentação mitocondrial nas células tratadas com CCCP, que foi grandemente atenuado nas células co-tratadas com αLA (Fig. 6a). Isso sugere que a αLA pode bloquear a fissão mitocondrial, que é frequentemente observada antes da degradação mitocondrial em células durante a mitofagia regulada positivamente.

Em seguida, analisamos se a diminuição na entrega mitocondrial aos autofagossomos nas células co-tratadas com αLA teria um efeito na abundância de proteínas mitocondriais. Em células COS-7 tratadas apenas com CCCP, houve uma redução acentuada no conteúdo de proteínas mitocondriais, medida por western blotting para as proteínas mitocondriais COX IV e SDHA. Essa redução parecia ser específica do compartimento mitocondrial, pois o tratamento com CCCP não teve efeito na abundância da GAPDH citoplasmática, da histona H3 nuclear ou da Grp78 localizada no RE (Fig. 6b). Notavelmente, o co-tratamento das células com αLA bloqueou completamente a remoção das mitocôndrias danificadas por CCCP, com os níveis de expressão de COX IV e SDHA permanecendo semelhantes aos das células controle não tratadas (Fig. 6b). Em seguida, testamos se esse bloqueio mediado por αLA na mitofagia ocorria antes ou depois da entrega de substratos ao lisossomo. Enquanto o tratamento das células com bafilomicina A1 limitou o fluxo autofágico e levou ao acúmulo de LC3-II, ele não conseguiu prevenir a degradação induzida por CCCP das proteínas mitocondriais de maneira semelhante à αLA (Fig. 6c). Isso indica que a lesão na via da mitofagia causada pelo tratamento com αLA ocorre a montante da entrega de substratos mitocondriais ao lisossomo.
Após esse resultado, testamos se a hiperacetilação da α-Tubulina era responsável pelo bloqueio na mitofagia, por exemplo, afetando o transporte de mitocôndrias ao longo do citoesqueleto. Células COS-7 foram transfectadas com siRNA controle ou αTAT por 48 h, e então tratadas com αLA e/ou CCCP por 24 h. Apesar de uma redução robusta na acetilação da tubulina K40, não houve diferença na degradação das proteínas mitocondriais entre células controle ou com knockdown de αTAT tratadas com CCCP, sugerindo que o efeito protetor do αLA é independente de suas propriedades pró-acetilação (Fig. 6d). Pesquisas anteriores demonstraram que a despolarização das mitocôndrias com CCCP estabilizou os níveis da quinase mitocondrial PINK1, que então recruta a ubiquitina ligase Parkin, levando à degradação mitocondrial (21, 22). Portanto, testamos se o αLA tinha algum efeito na estabilização da PINK1 e descobrimos que ele bloqueou completamente o aumento mediado por CCCP dessa proteína (Fig. 6e). Assim, concluímos que o αLA impede a remoção de mitocôndrias pelas vias de mitofagia ao bloquear a estabilização da PINK1 e o recrutamento de Parkin, em vez de seus efeitos na tubulina e no citoesqueleto.

DISCUSSÃO

Neste relatório, nosso objetivo foi investigar o papel da abundância de acetil-CoA e da acetilação na regulação dos programas de reciclagem celular. Fornecemos dados sugerindo que: (i) o Ácido α-Lipóico promove a hiperacetilação rápida da α-Tubulina; (ii) que essa acetilação foi dependente de αTAT e exigiu a inibição da função de HDAC6; e (iii) o tratamento com Ácido α-Lipóico bloqueou a remoção de mitocôndrias através da mitofagia mediada por PINK1.

Nosso interesse inicial em examinar esse sistema baseou-se em relatos de que alterações na abundância de acetil-CoA, derivadas de fontes mitocondriais, poderiam atuar como um regulador das vias de autofagia celular. Usando um conjunto elegante de intervenções nutricionais e farmacológicas, Mariño et al. demonstraram que o aumento dos níveis de acetil-CoA nas mitocôndrias, seguido pela subsequente exportação para o citosol de moléculas transportadoras de acetil-CoA, como o citrato, levava a um bloqueio na indução da autofagia. Em essência, a acetil-CoA derivada do metabolismo de fontes nutricionais atuava como um sinal direto de saciedade celular, complementando vias como o eixo AMPK-mTOR-ULK1 na regulação dos processos autofágicos. Crucialmente, a regulação da autofagia pela acetil-CoA exigia a função de uma acetiltransferase, EP300, indicando uma ligação entre o estado nutricional, a acetilação de resíduos de lisina citosólicos (como um potencial marcador de abundância de combustível) e a reciclagem de componentes celulares.
Para regular a renovação mitocondrial por meio da mitofagia, devem existir mecanismos de sinalização entre as mitocôndrias e a maquinaria autofágica citoplasmática, que permitam que organelas específicas sejam direcionadas para degradação. A via PINK1-Parkin demonstrou direcionar organelas disfuncionais para remoção por meio da ubiquitinação de proteínas mitocondriais, enquanto BNIP3, Nix e FUNDC1 foram implicados em processos de mitofagia relacionados ao desenvolvimento e à hipóxia, atuando como mediadores da ligação à estrutura autofágica. Recentemente, demonstramos que mitocôndrias com acetilação reduzida de lisina mitocondrial foram direcionadas para degradação por mitofagia, indicando que a acetilação de lisina – um indicador dos níveis de acetil-CoA – pode atuar como mecanismo de sinalização para a aptidão metabólica mitocondrial.

Neste relatório, demonstramos que a alteração dos níveis de acetil-CoA na célula tem um efeito profundo na acetilação da α-Tubulina. Em relação aos estudos sobre autofagia como um todo, o papel da acetilação da tubulina na regulação da mitofagia recebeu pouca atenção. A acetilação da α-Tubulina em K40 ocorre no lado luminal dos microtúbulos e é catalisada pela acetiltransferase αTAT/MEC-17. Esta reação é contra-regulada por enzimas desacetilases, em particular a HDAC6. Trabalhos anteriores, realizados principalmente em neurônios, mostraram que a inibição da HDAC6 leva a um aumento na velocidade do movimento mitocondrial. Isso indicaria que a hiperacetilação da tubulina observada após o tratamento com αLA não inibiria o transporte de mitocôndrias para permitir a incorporação em autofagossomos e, de fato, a acetilação da α-Tubulina não teve efeito na mitofagia (Fig. 6c). Nossa hipótese alternativa é que a inibição da função da HDAC6, causada pelo tratamento com αLA, pode levar ao comprometimento da maturação das membranas dos autofagossomos, conforme observado anteriormente. Será necessário um trabalho adicional para determinar como o tratamento com αLA impede a remoção mitocondrial a montante da incorporação em autofagossomos, levando à perda da estabilização de PINK1 e do recrutamento de Parkin (Fig. 6d).

O papel do αLA em sistemas biológicos foi amplamente estudado, com várias aplicações farmacêuticas sendo propostas. O αLA é um cofator em diversas vias enzimáticas mitocondriais, incluindo o complexo da piruvato desidrogenase, o complexo da α-cetoglutarato desidrogenase, o complexo da desidrogenase de oxoácidos de cadeia ramificada e o sistema de clivagem da glicina. Sua forma ligada à enzima, lipoamida, foi encontrada para direcionar o complexo da piruvato desidrogenase a alterar o uso de substratos e fornecer proteção contra danos em corações pós-isquêmicos. No entanto, a maioria das pesquisas publicadas focou no papel do αLA como antioxidante, mostrando que ele pode mitigar o estresse oxidativo em vários sistemas. Neste estudo, testamos se a alteração do ambiente redox levaria à acetilação da α-Tubulina, mas descobrimos que dois outros antioxidantes gerais (NAC e TEMPO) não foram capazes de induzir essa modificação.
Como alternativa, postulamos que o aumento de acetil-CoA derivado de mitocôndrias após o tratamento com αLA levou a um aumento nos níveis de acetil-CoA citosólico, estimulando a acetiltransferase EP300. A EP300 ativa pode então acetilar a HDAC6 e interromper sua atividade de desacetilase, fazendo com que ela se dissocie fisicamente da α-Tubulina (Fig. 4c). Isso resulta na hiperacetilação descontrolada da α-Tubulina em K40 através da αTAT. Trabalhos estão ativamente em andamento em nosso laboratório para elucidar melhor as vias pelas quais o αLA inibe potentemente a HDAC6 e investigar se este fármaco pode ser útil para restringir a indução de autofagia ou mitofagia em situações onde possa ser potencialmente mal-adaptativa.

CONFLITOS DE INTERESSE

Os autores não têm conflitos a declarar

CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES

M.W.S., D.T., M.Z., G.G. e I.S. realizaram os experimentos, M.W.S., G.G., M.C., C.St.C. e I.S. analisaram os dados, I.S. e C.St.C. desenharam os experimentos, e I.S. escreveu o manuscrito.

ABREVIAÇÕES

6-BHA
ácido 6-bromo-hexanoico
Ac-K
acetil-lisina
αLA
Ácido α-Lipóico
ACC
carboxilase de acetil-CoA
AMPK
AMP quinase
αTAT
acetiltransferase de α-Tubulina
BTC
benzenotricarboxilato
BAF A1
Bafilomicina A1
CCCP
cianeto de carbonila 3-clorofenil-hidrazona
DCA
dicloroacetato
GAPDH
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
GDH
glutamato desidrogenase
HDAC6
histona desacetilase 6
HM
membrana pesada
K40
lisina-40
LC3
proteína 3 de cadeia leve associada a microtúbulos
mTOR
Alvo da Rapamicina em Mamíferos
NAC
N-acetil cisteína
PINK1
quinase 1 associada a PTEN
Pyr
Piruvato de Sódio
TEMPO
4-hidroxi-TEMPO
ULK1
quinase 1 semelhante a UNC-51

Como controlar a autodigestão: regulação transcricional, pós-transcricional e pós-traducional da autofagia
Regulação da autofagia pela acetil-coenzima A citosólica
A acetilação restrita de proteínas mitocondriais inicia a autofagia mitocondrial
A proteína 1 semelhante a GCN5 (GCN5L1) controla o conteúdo mitocondrial através da regulação coordenada da biogênese mitocondrial e mitofagia
O fígado gorduroso está associado à redução da atividade de SIRT3 e hiperacetilação de proteínas mitocondriais
A deficiência de SIRT3 e a hiperacetilação de proteínas mitocondriais aceleram o desenvolvimento da síndrome metabólica
A acetilação de proteínas mitocondriais é impulsionada pelo acetil-CoA da oxidação de ácidos graxos
A farmacologia do dicloroacetato
Papel essencial do NRF2 no efeito protetor do ácido lipoico contra a lipoapoptose em hepatócitos
O tratamento com ácido alfa-lipoico aumenta a biogênese mitocondrial e promove características de tecido adiposo bege em adipócitos subcutâneos de indivíduos com sobrepeso/obesidade
A autoimunidade da cirrose biliar primária e a teoria da seleção clonal
O código da tubulina: componentes moleculares, mecanismos de leitura e funções
MEC-17 é uma acetiltransferase de alfa-tubulina
Caracterização estrutural e funcional da acetiltransferase de alfa-tubulina MEC-17
HDAC6 controla a maturação do autofagossomo essencial para a autofagia de controle de qualidade seletiva de ubiquitina
HDAC-6 interage com e desacetila tubulina e microtúbulos in vivo
Espermidina e resveratrol induzem autofagia por vias distintas que convergem no acetilproteoma
Diretrizes para o uso e interpretação de ensaios para monitoramento de autofagia
Como interpretar a imunotransferência de LC3
Mecanismos Moleculares da Autofagia Mitocondrial/Mitofagia no Coração
Parkin é recrutado seletivamente para mitocôndrias danificadas e promove sua autofagia
PINK1 é seletivamente estabilizado em mitocôndrias danificadas para ativar Parkin
Bnip3 prejudica a bioenergética mitocondrial e estimula a renovação mitocondrial
Nix é um receptor de autofagia seletivo para a eliminação mitocondrial
A proteína FUNDC1 da membrana externa mitocondrial medeia a mitofagia induzida por hipóxia em células de mamíferos
Dinâmica de acetilação e estequiometria em Saccharomyces cerevisiae
HDAC6 regula o transporte mitocondrial em neurônios hipocampais
HDAC6 controla a maturação do autofagossomo essencial para a autofagia de controle de qualidade seletiva por ubiquitina
Interações proteína-proteína na montagem do ácido lipoico nas 2-oxoácido desidrogenases do metabolismo aeróbico
A lipoamida influencia a seleção de substrato em corações de ratos perfundidos pós-isquêmicos
A acetilação da histona desacetilase 6 por p300 atenua sua atividade desacetilase
Demais ou insuficiente de algo bom - As faces de Janus da autofagia na homeostase de combustível e proteínas cardíacas
O tratamento com αLA promove hiperacetilação de lisina de uma única proteína citoplasmática
(A) Células COS-7 foram tratadas por 4 h com 3 mM de Pir (3x a concentração normal de cultura), 5 mM de αLA ou 20 mM de DCA para aumentar as concentrações de acetil-CoA mitocondrial derivado de piruvato, seguidas de análise da acetilação de lisina total de proteínas (Ac-K). (B) Células COS-7 foram tratadas por 4 h com 5 mM de αLA, 1 mM de NAC ou 1 mM de 4-hidroxi-TEMPO, seguidas de análise de Ac-K total de proteínas. (C, D) Células COS-7 ou HepG2 foram tratadas com concentrações variadas de αLA por 4 h (C), ou por diferentes períodos de tempo com 5 mM de αLA (D), seguidas de análise de Ac-K. (E) Células COS-7 foram tratadas por diferentes períodos de tempo com o análogo do ácido lipoico 6-BHA (5 mM) ou αLA (5 mM), seguidas de análise de Ac-K. (F) Células COS-7 foram tratadas por 4 h com 3 mM de Pir, 5 mM de αLA ou 20 mM de DCA, seguidas de colheita e separação em frações citosólica e de membrana pesada (MP) por centrifugação diferencial. As frações foram analisadas para Ac-K, com GDH (MP) e GAPDH (citosólica) usados como controles de carregamento e pureza das frações. Todas as imunotransferências foram realizadas em géis Bis-Tris a 12%.
α-Tubulina é dinamicamente hiperacetilada em K40 em células COS-7 tratadas com αLA
(A) As células foram tratadas por 4 h com 3 mM Pyr, 5 mM αLA ou 20 mM DCA, seguidas de análise por western blot. A marcação simultânea de duas cores indica que a hiperacetilação de lisina ocorre no mesmo peso molecular que a α-Tubulina. (B) Células tratadas com 5 mM αLA por 4 h nas mesmas condições mostram hiperacetilação robusta da α-Tubulina na Lisina-40 (K40). (C) As células foram tratadas com αLA por 4 h, seguidas de imunoprecipitação com anticorpos específicos pan-Ac-K. As frações de input e IP foram sondadas com um anticorpo de α-Tubulina. (D, E) A acetilação de α-Tubulina K40 induzida por αLA ocorre de forma dinâmica, e é dependente tanto da concentração quanto do tempo. (F) As células foram transfectadas com GFP-WT-α-Tubulina ou GFP-K40R-α-Tubulina por 24 h, depois tratadas com 5 mM αLA por 24 h. A acetilação da α-Tubulina foi analisada por imunoblot de Ac-K. Todos os imunoblots foram realizados em géis Bis-Tris a 12%. Os gráficos mostram média ± EP, com um teste t de Student de P < 0,05 definido como significativo.
A inibição da exportação de citrato mitocondrial inibe a hiperacetilação da α-tubulina
(A, B) As células COS-7 foram tratadas com 5 mM αLA e/ou 1,5 mM BTC por 24 h, seguidas de análise para acetilação de α-Tubulina K40. (C) Medição dos níveis de acetil-CoA citosólico em células COS-7 na presença ou ausência de 5 mM αLA por 24 h. (D) Análise do estado de ativação da acetil-CoA carboxilase em células COS-7 tratadas com 5 mM αLA e/ou 1,5 mM BTC por 24 h. Uma redução nos níveis de fosfo-ACC indica aumento da conversão de acetil-CoA em malato. Todos os imunoblots foram realizados em géis Bis-Tris a 12%. Os gráficos mostram média ± EP, com um teste t de Student de P < 0,05 definido como significativo.
A hiperacetilação da α-Tubulina é dependente da atividade de αTAT e da perda da interação HDAC6:α-tubulina
(A) As células COS-7 foram transfectadas com dois siRNAs independentes (TAT-1 ou TAT-2) direcionados à α-Tubulina acetiltransferase (αTAT), ou um controle não-alvo. Após 48 h, as células foram tratadas com ou sem 5 mM αLA por 4 h, seguidas de análise para acetilação de αTubulina K40. (B) A análise da acetilação total de lisina celular indica que o knockdown de αTAT abole toda a hiperacetilação em ~50 kDa. (C, D) Efeito do tratamento celular dependente da concentração e do tempo com αLA na expressão da proteína desacetilase de α-Tubulina, HDAC6. (E) Análise de co-imunoprecipitação da interação entre α-Tubulina e HDAC6, após tratamento com 5 mM αLA por 4 h. Todos os imunoblots foram realizados em géis Bis-Tris a 12%.
O tratamento com αLA reduz o fluxo da autofagia celular
(A) Estado de ativação do marcador autofágico LC3, após tratamento de células COS-7 com 5 mM de αLA por 4 h. Aumentos nos níveis de LC3-II indicam um aumento na atividade autofágica ou uma diminuição no fluxo autofágico.
(B) Células COS-7 foram privadas de soro em HBSS por 0–4 h, na presença ou ausência de 5 mM de αLA. O acúmulo de LC3-II após várias horas de privação indica uma taxa reduzida de renovação proteica pela autofagia.
(C) Em experimentos de cinética temporal, células COS-7 tratadas com 5 mM de αLA apresentam níveis diminuídos de acúmulo de LC3-II, em comparação com aquelas tratadas apenas com o inibidor lisossomal BAF A1 (100 nM), indicando que αLA retarda o fluxo de substratos através da via autofágica.
(D) Quantificação da expressão total de LC3 em células COS-7 após 24 h de tratamento com BAF A1 e/ou αLA.
Todos os imunoblots foram realizados em géis Bis-Tris a 12%. Gráficos mostram média ± EP, com teste t de Student de P < 0,05 definido como significativo.

O tratamento com αLA impede a remoção de mitocôndrias despolarizadas através da mitofagia mediada por PINK1
(A) Células HepG2 foram tratadas com 10 μM de CCCP na presença ou ausência de 5 mM de αLA por 4 h. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4%, em seguida imunomarcadas com o marcador mitocondrial Tom20 e o marcador autofágico LC3, juntamente com DAPI nuclear. Análise confocal e renderização de superfície 3D de mitocôndrias a partir de Z-stacks foi usada para medir a colocalização Tom20:LC3 e a fragmentação mitocondrial em resposta ao tratamento.
(B) O tratamento de células COS-7 por 24 h com 10 μM de CCCP levou à degradação específica das proteínas mitocondriais COX IV e SDHA, sem afetar os níveis de proteínas citosólicas, microssomais ou nucleares. Isso foi bloqueado pela adição simultânea de 5 mM de αLA.
(C) αLA, mas não bafilomicina A1, foi capaz de prevenir a degradação de proteínas mitocondriais iniciada pelo tratamento com CCCP. Isso sugere que a atividade de αLA ocorre antes da etapa lisossomal da via autofágica.
(D) Células COS-7 foram transfectadas por 48 h com siRNA controle ou αTAT, seguidas de tratamento com αLA (5 mM) ou CCCP (10 μM). A perda da hiperacetilação de K40 não teve efeito sobre a remoção mediada por CCCP de proteínas mitocondriais, indicando que a prevenção da mitofagia por αLA não está relacionada ao seu efeito sobre a α-Tubulina.
(E) Células COS-7 tratadas com 10 μM de CCCP mostraram estabilização de PINK1, um marcador para mitofagia na via PINK1-Parkin. Essa estabilização foi abolida pelo tratamento concomitante com 5 mM de αLA, indicando que αLA atua a montante desse evento.
Todos os imunoblots foram realizados em géis Bis-Tris a 12%. Gráficos mostram média ± EP, com teste t de Student de P < 0,05 definido como significativo. Barra de escala é 10 μm.