pmid: "32610574"
title: "Efeitos da Apigenina nas Células RBL-2H3, RAW264.7 e HaCaT: Atividades Antialérgica, Anti-inflamatória e Protetora da Pele."
authors: "Park CH, Min SY, Yu HW, Kim K, Kim S, Lee HJ, Kim JH, Park YJ"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2020 Jun 29"
doi: "10.3390/ijms21134620"
source: "PMC Full Text"
Efeitos da Apigenina nas Células RBL-2H3, RAW264.7 e HaCaT: Atividades Antialérgica, Anti-inflamatória e Protetora da Pele.
Autores
Park CH, Min SY, Yu HW, Kim K, Kim S, Lee HJ, Kim JH, Park YJ
Periodico
International journal of molecular sciences (2020 Jun 29)
Conteudo
Efeitos da Apigenina em Células RBL-2H3, RAW264.7 e HaCaT: Atividades Antialérgica, Anti-inflamatória e Protetora da Pele
A apigenina (4′,5,7-trihidroxiflavona, flavonoides) é um composto fenólico conhecido por reduzir o risco de doenças crônicas devido à sua baixa toxicidade. O primeiro estudo sobre a apigenina analisou seu efeito na liberação de histamina na década de 1950. Desde então, propriedades antimutação e antitumorais da apigenina têm sido amplamente relatadas. No presente estudo, avaliamos a melhora mediada pela apigenina em doenças de pele e investigamos sua aplicabilidade como ingrediente funcional, especialmente em cosméticos. Foram analisados os efeitos da apigenina em células RAW264.7 (macrófagos murinos), RBL-2H3 (leucemia basofílica de rato) e HaCaT (queratinócitos humanos imortalizados). A apigenina (100 μM) inibiu significativamente a produção de óxido nítrico (NO), a expressão de citocinas (interleucina (IL)-1β, IL-6, ciclooxigenase (COX)-2 e óxido nítrico sintase induzível [iNOS]) e a fosforilação de moléculas de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), incluindo a quinase regulada por sinal extracelular (ERK) e a proteína quinase c-Jun N-terminal (JNK) em células RAW264.7. A apigenina (30 μM) também inibiu a fosforilação de moléculas de sinalização (Lyn, Syk, fosfolipase Cγ1, ERK e JNK) e a expressão do receptor FcεRIα de alta afinidade para IgE e de citocinas (fator de necrose tumoral (TNF)-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 e COX-2) que são conhecidas por induzir inflamação e respostas alérgicas em células RBL-2H3. Além disso, a apigenina (20 μM) induziu significativamente a expressão de filagrina, loricrina, aquaporina-3, ácido hialurônico, ácido hialurônico sintase (HAS)-1, HAS-2 e HAS-3 em células HaCaT, que são os principais componentes da barreira física da pele. Ademais, promoveu a expressão de β-defensina humana (HBD)-1, HBD-2, HBD-3 e catelicidina (LL-37) em células HaCaT. Sabe-se que esses peptídeos antimicrobianos desempenham um papel importante na pele como barreiras químicas. A apigenina suprimiu significativamente as respostas inflamatória e alérgica das células RAW264.7 e RBL, respectivamente, e, portanto, serviria como um potencial agente profilático e terapêutico para doenças relacionadas ao sistema imunológico. A apigenina também poderia ser usada para melhorar as funções das barreiras física e química da pele e para aliviar psoríase, acne e dermatite atópica.
1. Introdução
Estudos têm sido direcionados para descobrir ingredientes bioativos com atividades fisiológicas, como os fitoquímicos, de vários recursos naturais. Substâncias naturais exercem menos efeitos colaterais do que materiais sintéticos convencionais, e podem inibir efetivamente a superprodução de espécies reativas de oxigênio (ROS), como radicais livres instáveis e altamente reativos, prevenindo assim mutação e citotoxicidade. O estresse oxidativo tem sido relatado como promotor de doenças ou envelhecimento ao induzir danos às células e tecidos. Portanto, atenção crescente tem sido direcionada ao desenvolvimento de produtos que reduzem o estresse oxidativo. Nessa direção, substâncias bioativas potentes foram descobertas em plantas e têm sido ativamente aplicadas em alimentos funcionais, produtos farmacêuticos e cosméticos.
Inflamação causada por infecções ou lesão tecidual está associada a diversas doenças humanas. Os neutrófilos produzem ERO, espécies reativas de nitrogênio (ERN) e óxido nítrico (NO), todos agentes indutores de inflamação. A incidência de dermatite atópica (DA), dentre todas as doenças de pele, está aumentando gradualmente. A DA é causada por fatores intrínsecos e extrínsecos relacionados à pele. Danos cutâneos agudos ou crônicos permitem o fácil acesso de diversos alérgenos à pele, resultando em um aumento das respostas inflamatórias alérgicas. Entre vários mediadores inflamatórios, a interleucina (IL)-4 e a IL-13 produzidas após a ativação das células T auxiliares do tipo 2 (Th2) são conhecidas por serem superexpressas e induzirem a produção de imunoglobulina E (IgE) em pacientes com dermatite alérgica e DA. As células que desempenham o papel mais importante na indução de reações alérgicas são os mastócitos e os basófilos, que medeiam reações alérgicas secretando β-hexosaminidase. A IgE se liga à subunidade de ligação à IgE do receptor de alta afinidade para IgE (FcεRI), um receptor heterotetramérico (uma subunidade α, uma β e duas γ), em mastócitos e basófilos e promove a degranulação e a secreção de citocinas, levando a uma reação alérgica. A ligação da IgE à subunidade α resulta na ativação das subunidades β e γ do FcεRI, consequentemente recrutando Lyn e Syk e induzindo a fosforilação de proteínas tirosina quinases (PTKs). A Syk ativada demonstra estar envolvida na fosforilação e ativação da fosfolipase C (PLC)-γ. As proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), como a quinase regulada por sinal extracelular (ERK), a proteína quinase c-Jun N-terminal (JNK) e a p38, também são ativadas pelo crosslinking FcεRI-IgE. A fosforilação e ativação dessas MAPKs medeiam a expressão do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e da IL-2. Os macrófagos desempenham um papel importante na resposta imune e regulam diversos mediadores inflamatórios, como NO, prostaglandina (PG) e citocinas pró-inflamatórias. Em mamíferos, existem três tipos de óxido nítrico sintases (NOS), das quais a NOS induzível do tipo III (iNOS) é expressa apenas em resposta a estímulos como lipopolissacarídeo (LPS), citocinas e toxinas bacterianas em algumas células. O NO é produzido principalmente pela iNOS e promove respostas inflamatórias induzindo a expressão de mediadores inflamatórios. Outro fator inflamatório, a ciclooxigenase (COX), é uma enzima que converte o ácido araquidônico em PG.
Existem dois tipos de COX, COX-1 e COX-2, que apresentam diferentes padrões de expressão em várias células. A COX-2 é expressa principalmente durante a resposta inflamatória e induz a produção de prostaglandina E2 (PGE2), um mediador inflamatório associado à dor e febre. Além disso, uma das citocinas, o TNF-α, desempenha um papel importante na indução de reações inflamatórias através da ativação de células T e macrófagos e do aumento de outras citocinas pró-inflamatórias, levando a uma resposta inflamatória. A IL-6 também é um importante fator inflamatório secretado por macrófagos após exposição ao LPS.
A pele compreende a epiderme, a derme e o tecido subcutâneo (hipoderme) e atua como uma barreira para manter a umidade. Ela impede a invasão de agentes infecciosos externos por meio da produção de peptídeos antimicrobianos. Em particular, os queratinócitos que constituem a epiderme produzem involucrina, loricrina e filagrina para agregar os filamentos de queratina e formar um envelope celular cornificado. Além disso, o ácido hialurônico (AH) sintetizado pela hialuronato sintase (HAS) nos queratinócitos e fibroblastos também funciona como uma barreira hidratante na pele. As aquaporinas (AQPs) são pequenas proteínas integrais de membrana hidrofóbicas que regulam a taxa de retenção de água da pele e de outros órgãos. Até o momento, 13 tipos de AQPs foram identificados em mamíferos, dos quais a AQP3 está envolvida no transporte de água e glicerol. Os queratinócitos epidérmicos humanos expressam AQP3 em suas membranas. Em camundongos sem expressão de AQP3, verificou-se que a capacidade de transporte de água do ducto coletor era reduzida em cerca de três vezes, consistente com a ocorrência de poliúria e retardo na cicatrização de feridas devido ao aumento do ressecamento da pele. Os queratinócitos também produzem peptídeos antimicrobianos como defensina (β-defensina humana (HBD)-1, HBD-2, HBD-3), catelicidina, inibidor de proteinase leucocitária secretora, dermcidina e adrenomedulina para defesa contra agentes infecciosos. A doença crônica da pele em resposta à alta taxa de infecção bacteriana tem sido relatada como associada à expressão diminuída desses peptídeos antimicrobianos. As anormalidades desses componentes celulares da pele e dos peptídeos antimicrobianos também são consideradas a causa da DA, juntamente com outros fatores, como fatores genéticos e ambientais e desequilíbrio na resposta imune.
Durante a triagem de vários recursos naturais, descobrimos que o broto de cevada apresenta excelentes atividades anti-inflamatória e antialérgica. A cevada (Hordeum vulgare L.) é uma cultura importante pertencente à família Poaceae (Gramineae). Em particular, as folhas de cevada são ricas em várias substâncias bioativas, como vitamina C, vitamina E, catequina, kaempferol, quercetina e β-caroteno. Estudos têm sido realizados para analisar o valor nutricional e várias atividades fisiológicas da cevada, mas nenhum estudo avaliou sistematicamente as diferentes propriedades benéficas da cevada. De acordo com o banco de dados de flavonoides 1.0, o broto de cevada contém um nível relativamente mais alto de apigenina (4′,5,7-trihidroxiflavona, flavonoide), um tipo de composto fenólico, do que outras culturas. A apigenina exerce efeitos promotores de saúde e é conhecida por reduzir o risco de doença crônica devido à sua baixa toxicidade. Além disso, foi relatado que a apigenina apresenta efeitos notáveis contra células cancerígenas.
Para confirmar a aplicabilidade dos recursos naturais, é imperativo comprovar a eficácia dos principais ingredientes contidos nesses recursos. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a apigenina, principal ingrediente do broto de cevada, quanto aos seus efeitos antialérgicos em basófilos (RBL-2H3) e anti-inflamatórios em macrófagos (RAW264.7). Além disso, investigamos os efeitos da apigenina em queratinócitos epidérmicos humanos (HaCaT) para determinar seu potencial como substância natural para a prevenção da DA.
2. Resultados e Discussão
2.1. Citotoxicidade da Apigenina em Células RAW264.7, RBL-2H3 e HaCaT
Os flavonoides compreendem glicosídeos ligados a açúcares e agliconas. Vários flavonoides são encontrados na natureza, formados por diferentes combinações de aglicona e da porção de açúcar ligada. A apigenina é um metabólito secundário de plantas com fórmula molecular C15H10O5 (Figura 1a). O broto de cevada é rico na família flavona da apigenina, incluindo apigenina 6-C-arabinosídeo-8-C-glucosídeo (isoschaftosídeo), apigenina 6-C-glucosídeo-8-C-arabinosídeo (schaftosídeo), apigenina 6-C-glucosídeo (isovitexina), isovitexina 7-O-(6″-O-feruloil) glucosídeo (6″-O-feruloilsaponarina), isovitexina 7-O-(6″-O-feruloil) glucosídeo-4′-O-glucosídeo, isovitexina 7-O-(6″-O-sinapoil) glucosídeo (6″-O-sinapoilsaponarina), isovitexina 7-O-glucosídeo (saponarina) e isovitexina 7-O-rutinosídeo.
Vários estudos relataram os efeitos mutagênicos dos flavonoides, que estão associados às suas atividades pró-oxidantes. Assim, avaliamos a citotoxicidade da apigenina em células RAW264.7, RBL-2H3 e HaCaT. Conforme mostrado na Figura 1b–d, 40 e 30 μM de apigenina induziram citotoxicidade significativa em células RBL-2H3 (67,5%, p < 0,001) e HaCaT (89,9%, p < 0,05), respectivamente. No entanto, a apigenina não teve efeito sobre as células RAW264.7, mesmo na concentração de 100 μM. Portanto, nos experimentos subsequentes, as células RAW274.7, RBL-2H3 e HaCaT foram tratadas com concentrações não tóxicas de apigenina.
2.2. Efeitos da Apigenina na Produção de NO e Liberação de β-Hexosaminidase
Os macrófagos produzem e secretam mediadores secundários como NO, PGE2, leucotrienos e citocinas pró-inflamatórias. Essas substâncias desempenham um papel importante na regulação da imunidade inata e epigenética. No entanto, sua superprodução pode levar a sepse bacteriana, artrite reumatoide, inflamação crônica e doenças autoimunes. Avaliamos a atividade inibitória da apigenina na produção de NO e descobrimos que a apigenina inibiu significativamente a produção de NO em células RAW264.7 em comparação com LPS (controle positivo). Além disso, 100 μM de apigenina conseguiu inibir a produção de NO em células RAW264 em nível semelhante ao observado com quercetina (15 μM), que apresenta excelente atividade inibitória na produção de NO (Figura 2a).
β-Hexosaminidase está presente nos grânulos de mastócitos e basófilos e é secretada em resposta a reações alérgicas como asma e rinite. Ela serve como um indicador de degranulação e é útil para medir a bioatividade de inibidores de alérgenos. Células RBL-2H3 foram tratadas com as concentrações indicadas (5, 10, 20 e 30 μM) de apigenina, e a inibição da degranulação foi medida. A apigenina inibiu a degranulação de β-hexosaminidase em células RBL-2H3 em um nível significativo em todas as concentrações, das quais as doses de 10, 20 e 30 μM exerceram efeitos inibitórios semelhantes aos da ciclosporina A (1 μg/mL) (Figura 2b). Assim, a apigenina inibiu significativamente a produção de NO e a degranulação de β-hexosaminidase em células RAW264.7 induzidas por LPS e células RBL-2H3 induzidas por IgE, respectivamente.
2.3. Efeitos da Apigenina nas Citocinas e nas Vias de Sinalização MAPK em Células RAW264.7
Em geral, mediadores inflamatórios como NO e PGE2 são inevitavelmente acompanhados por citocinas inflamatórias, incluindo TNF-α, IL-1β e IL-6. O TNF-α é produzido principalmente por macrófagos ativados, mas também pode ser produzido por células linfoides, mastócitos e células endoteliais. Em particular, a expressão de TNF-α é regulada positivamente em resposta à estimulação por LPS. A IL-1β é uma citocina pré-inflamatória representativa que está muito intimamente relacionada ao TNF-α. Em geral, a IL-1β é necessária para o crescimento celular ou manutenção da homeostase em baixas concentrações, mas pode exacerbar doenças humanas quando superproduzida durante reações inflamatórias, feridas ou estímulos imunológicos. A iNOS normalmente está ausente nas células, mas sua expressão é induzida por NF-κB. A iNOS produz altos níveis de NO por um período prolongado. Este é um mecanismo importante para a superprodução de mediadores inflamatórios por LPS ou citocinas em macrófagos. A COX-1 atua em funções biológicas normais, como formação de plaquetas, manutenção da integridade da mucosa no trato gastrointestinal e função renal. Muitos fármacos anti-inflamatórios agem inibindo a síntese de PG através da supressão da produção ou atividade da COX-2. Verificou-se que a apigenina (100 μM) inibiu significativamente a expressão de TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS e COX-2 em células RAW264.7 induzidas por LPS (Figura 2a). Além disso, a expressão de IL-6 e iNOS diminuiu após o tratamento com apigenina, que foi tão eficaz quanto, ou até mais eficaz que, a quercetina (5 μM). No entanto, tanto a apigenina quanto a quercetina não conseguiram diminuir a expressão de TNF-α (Figura 3a), consistente com um relato anterior que mostrou a ausência de qualquer efeito da quercetina na expressão de TNF-α.
A MAPK é uma serina-treonina quinase que desempenha um papel importante na regulação do crescimento e diferenciação celular, bem como nas respostas celulares a citocinas e estresse. A ERK é amplamente ativada por estimuladores e pode fosforilar diversos fatores de transcrição. A p38 e a JNK fazem parte das vias de resposta ao estresse e são ativadas por fatores como citocinas inflamatórias. A via de sinalização JNK é ativada em células em resposta a estímulos imuno-inflamatórios, como LPS e TNF-α, e está envolvida na morfologia celular e na transcrição de citocinas. Investigamos o efeito da apigenina (100 μM) na via de sinalização MAPK e descobrimos que a fosforilação de ERK e JNK foi inibida em células RAW264.7 induzidas por LPS (Figura 3b). Esses resultados sugerem que a apigenina inibe a expressão de mediadores inflamatórios como IL-1β, IL-6, iNOS e COX-2 em células RAW264.7 por meio da supressão da via de sinalização MAPK via fosforilação de ERK e JNK, consequentemente exibindo efeitos anti-inflamatórios.
2.4. Efeitos da Apigenina nas Vias de Sinalização de Citocinas, MAPK e Alérgica em Células RBL-2H3
Os mastócitos apresentam expressão superficial de FcεRI, que é ativado ao se ligar à IgE reticulada por antígeno e medeia a desgranulação. A ativação por reticulação com IgE resulta na produção e secreção de mediadores lipídicos que sustentam a resposta inflamatória por meio de reações subsequentes que envolvem a síntese e secreção de várias citocinas. Sabe-se que a ativação dos mastócitos aumenta a expressão da subunidade αβγ do FcεRI. A ativação dos mastócitos e a resposta inflamatória são reguladas pela produção e secreção de citocinas, incluindo IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, TNF-α e fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF).
O TNF-α é uma citocina importante secretada e armazenada pelos mastócitos que aumenta as moléculas de adesão das células endoteliais e epiteliais e intensifica a hipersensibilidade das vias aéreas. A IL-6 é expressa durante a fase aguda da inflamação e desempenha um papel no desenvolvimento e exacerbação de doenças mediadas por Th2, como inflamação alérgica das vias aéreas e asma. A IL-5 é uma citocina essencial para o desenvolvimento e sobrevivência dos eosinófilos, enquanto a IL-4 promove a diferenciação de células B, levando à síntese de IgE e reações de hipersensibilidade imediata, juntamente com a indução da expressão da molécula de adesão celular vascular (VCAM)-1 nas células endoteliais. Ela também induz a expressão de IL-5, que é essencial para a diferenciação de células Th2 e eosinófilos. A IL-13 é uma citocina Th2 que se liga à cadeia α do receptor de IL-4, compartilhando um receptor com a IL-4, e é um regulador importante que induz a produção de IgE juntamente com a IL-4.
Em geral, a expressão de IgE é regulada positivamente na DA. Os tipos extrínsecos respondem imediatamente a antígenos inaláveis ou alimentares, enquanto os tipos intrínsecos não estão relacionados à hipersensibilidade a antígenos quando o nível de IgE está na faixa normal. Em particular, a expressão de IL-4 e IL-13 é regulada positivamente no tipo extrínseco em comparação com o tipo intrínseco. Conforme mostrado na Figura 4, a expressão de TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, COX-2 e FcεRIα em células RBL-2H3 ativadas por albumina 2,4-dinitrofenilada de soro bovino (DNP-BSA) e DNP-IgE foi significativamente inibida pela apigenina (30 μM). Como o efeito da apigenina foi semelhante ao observado com a ciclosporina A (1 μg/mL), a apigenina seria potencialmente eficaz na mediação de respostas imunes anormais devido à expressão excessiva de citocinas.
A via de sinalização dos mastócitos é ativada após a ligação do complexo antígeno-IgE à subunidade α do FcεRI, resultando na ativação da Lyn (quinase da família Src) ligada à subunidade β do FcεRI e na subsequente fosforilação e ativação da subunidade γ. As subunidades β e γ do FcεRI possuem um motivo de ativação baseado em imunorreceptor (ITAM) que é fosforilado pela quinase Lyn. A fosforilação da tirosina no motivo ITAM fornece um sítio de ligação para a quinase Syk e induz a ativação da quinase Syk por modificação estrutural. A Syk ativada ativa sequencialmente várias sub-moléculas de sinalização, como a fosfolipase Cγ1 (PLCγ1) e as MAPKs, para secretar mediadores que induzem várias respostas alérgicas. A apigenina reduziu significativamente a expressão da proteína FcεRIα/γ e inibiu a fosforilação da Lyn, da quinase Syk e da PLCγ1, que são essenciais para a ativação das células RBL-2H3 (Figura 5).
As MAPKs desempenham um papel importante na produção de várias citocinas, incluindo TNF-α e IL-4, após estimulação antigênica dos mastócitos. Realizamos análise de immunoblot para avaliar o efeito da apigenina na fosforilação das moléculas de sinalização das MAPKs. Conforme mostrado na Figura 5, a fosforilação de ERK e JNK, mas não de p38, diminuiu significativamente após o tratamento com apigenina. Assim, a inibição mediada pela apigenina da fosforilação de moléculas de sinalização e da expressão de citocinas em células RBL-2H3 sugere sua aplicação como um agente eficaz para controlar a inflamação e as respostas alérgicas.
2.5. Efeitos da Apigenina em Células HaCaT
Dada a importância da função da barreira cutânea, estudos têm sido direcionados para desenvolver substâncias funcionais relacionadas à pele com base nos mecanismos antioxidantes conhecidos. A relação entre DA e mutações do gene da filagrina foi recentemente relatada. Doenças crônicas da pele, como a psoríase, são consideradas relacionadas à diminuição da expressão de peptídeos antimicrobianos. Danos à barreira cutânea podem facilitar a penetração de alérgenos e induzir doenças de pele como a DA. A filagrina e a involucrina são as principais proteínas constituintes que são reguladas negativamente em resposta aos danos à barreira cutânea. Mutações da filagrina foram relatadas como as principais causas de DA, asma e rinite alérgica. AQP é uma proteína transportadora de água e glicerol produzida pelos queratinócitos que está envolvida no movimento e diferenciação dos queratinócitos. Foi relatado que desempenha um papel importante na restauração das funções da barreira cutânea. Qualquer diminuição na biossíntese de AH, um dos principais componentes da matriz extracelular da pele que atua como barreira hidratante, pode produzir rugas e reduzir a elasticidade da pele, consequentemente levando ao envelhecimento prematuro da pele, psoríase e dermatite. Portanto, a manutenção do nível de AH é importante para prevenir o envelhecimento da pele e doenças. O AH é sintetizado pela HAS nos queratinócitos; três genes HAS são conhecidos até agora, a saber, HAS-1, HAS-2 e HAS-3. Sabe-se que a diminuição da expressão dos genes HAS induz o envelhecimento da pele, incluindo defeitos na barreira hidratante, atrofia da epiderme, formação de rugas, diminuição da umidade da pele e redução da elasticidade. Algumas enzimas desempenham um papel crucial na síntese de AH, e pesquisas têm sido realizadas para aumentar a síntese de AH promovendo a expressão de HAS. Examinamos o efeito da apigenina na expressão dos genes que codificam involucrina, loricrina, filagrina, HAS-1, HAS-2, HAS-3 e AQP3 em células HaCaT usando reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (PCR). Como mostrado na Figura 6, a apigenina aumentou significativamente a expressão dos genes que codificam loricrina, HAS-1 e HAS-2, mas não involucrina e HAS-2, em células HaCaT. Também avaliamos os efeitos da apigenina na biossíntese de filagrina, AQP3 e HAS por ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs) e descobrimos que esses três níveis de proteína estavam significativamente aumentados. Portanto, a apigenina poderia melhorar e fortalecer a função de barreira física da pele ao promover a expressão dos constituintes nas células HaCaT.
A pele atua como uma barreira química contra patógenos invasores ao produzir peptídeos antimicrobianos, como HBD e catelicidina (LL-37), que exercem atividades antimicrobianas nos queratinócitos da epiderme. A HBD é um peptídeo catiônico de 3-4 kDa; 11 tipos de HBD foram relatados em humanos. Os que são expressos principalmente na pele são HBD-1, HBD-2 e HBD-3. A HBD-1 é expressa constitutivamente em condições normais no epitélio e nas glândulas sudoríparas, mas a expressão de HBD-2 e HBD-3 é observada na pele ou nas células epiteliais após infecção bacteriana, estimulação por citocinas (IL-1β e TNF-α) e diferenciação de queratinócitos. A LL-37 está presente no corpo lamelar dos queratinócitos juntamente com a HBD-2 e exerce forte atividade antimicrobiana contra bactérias, fungos e vírus. Além disso, a LL-37 também está envolvida na manutenção da função normal da barreira cutânea. Esses peptídeos antimicrobianos são componentes importantes da imunidade inata que são rapidamente expressos após uma infecção bacteriana ou viral, bem como em condições normais para proteger contra infecções externas. Portanto, a diminuição na expressão de peptídeos antimicrobianos reduz a imunidade inata e enfraquece a resistência a patógenos, levando à psoríase, acne e doenças inflamatórias crônicas da pele. Avaliamos o efeito da apigenina na expressão de peptídeos antimicrobianos, incluindo HBD-1, HBD-2, HBD-3 e LL-37, em células HaCaT usando PCR quantitativo em tempo real. Conforme mostrado na Figura 6, a expressão dos genes que codificam essas quatro proteínas foi significativamente aumentada após o tratamento com apigenina. Assim, a apigenina pode ser usada como um agente para melhorar as funções de barreira física e química da pele e aliviar doenças inflamatórias crônicas da pele, incluindo psoríase, acne e DA.
3. Materiais e Métodos
3.1. Reagentes
Meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), antibióticos (penicilina e estreptomicina) e tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) foram adquiridos da Gibco BRL (Grand Island, NY, EUA). Soro fetal bovino (FBS) foi obtido da Biowest (Kansas City, MO, EUA), e brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), LPS, 4-nitrofenil n-acetil-b-d-glucosaminídeo (p-NAG) e anticorpo monoclonal anti-DNP-IgE foram fornecidos pela Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, EUA). DNP-BSA foi adquirido da Invitrogen (Gaithersburg, MD, EUA). Anticorpos primários contra p-p38, p38, p-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-Lyn, Lyn, p-Syk, Syk, p-PLCγ, PLCγ e β-actina foram obtidos da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA), e FcεRIγ, da LSBio (Seattle, WA, EUA). O mix do kit SensiFAST SYBR No-ROX foi adquirido da Biolines (Seul, Coreia), e os kits ELISA para filagrina humana, AQP3 e HA foram obtidos da CUSABIO (Seul, Coreia). Células de leucemia basofílica de rato (RBL-2H3, ATCC® CRL-2256) e macrófagos murinos (RAW264.7, ATCC® TIB-71) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC), enquanto células de queratinócitos humanos imortalizados (HaCaT) foram obtidas do Prof. Lee da Universidade de Chosun, na Coreia.
3.2. Cultura Celular
As células RBL-2H3, RAW264.7 e HaCaT foram mantidas em DMEM contendo 10% de FBS e 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina). As células foram incubadas a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
3.3. Ensaio de Viabilidade Celular
A viabilidade celular de RAW264.7, RBL-2H3 e HaCaT foi analisada usando o ensaio de MTT. As células RAW264.7 foram tratadas com quercetina (15 μM) e apigenina (20, 40, 60, 80 e 100 μM) na ausência ou presença de LPS (1 μg/mL). As células RBL-2H3 e HaCaT foram tratadas com várias concentrações de apigenina (RBL-2H3: 5, 10, 20, 30 e 40 μM; HaCaT: 10, 20, 30, 40 e 50 μM). Após incubação por 24 h, 0,5 mg/mL de solução de MTT foi adicionado a cada poço. Os sobrenadantes foram descartados, e os cristais de formazan resultantes foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO) e transferidos para uma placa de 96 poços. A absorbância (570 nm) foi medida usando um leitor de microplacas (TECAN, Männedorf, Suíça).
3.4. Ensaio de Liberação de NO e β-Hexosaminidase
As células RAW264.7 foram semeadas em placas de 24 poços a 5 × 10⁴ células/poço e incubadas por 24 h. As células foram tratadas com LPS (1 μg/mL) e apigenina (20, 40, 60, 80 e 100 μM) por 24 h. O sobrenadante foi misturado com reagente de Griess em uma placa de 96 poços por 10 min, e a absorbância foi medida a 530 nm usando um leitor de microplacas. A quantidade de NO produzida foi calculada usando uma curva padrão de nitrito de sódio (NaNO2).
Para o ensaio de liberação de β-hexosaminidase, células RBL-2H3 foram semeadas em placas de 24 poços a 2 × 10⁵ células/poço e tratadas com 0,5 μg/mL de DNP-IgE por 24 h. O meio foi removido e lavado com tampão Tyrode (119 mM de cloreto de sódio (NaCl), 5 mM de cloreto de potássio (KCl), 2,5 mM de cloreto de cálcio (CaCl₂), 1,19 mM de sulfato de magnésio (MgSO₄), 10 mM de HEPES, 5 mM de glicose e 1 mg/mL de BSA, pH 7,3). As células foram incubadas com apigenina (5, 10, 20 e 30 μM) por 20 min e, em seguida, com 100 ng/mL de DNP-BSA por 1 h. Os sobrenadantes (50 μL) foram incubados com um tampão substrato (3,3 mM de p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glicosaminida, pH 4,5) em placas de 96 poços a 37 °C por 1 h. A reação foi interrompida usando 100 μL de uma solução de parada (0,1 M de carbonato de sódio (Na₂CO₃)/bicarbonato de sódio (NaHCO₃), pH 10,2), e a absorbância foi medida a 407 nm usando um leitor de microplacas. A atividade de liberação de β-hexosaminidase foi medida de acordo com a seguinte equação: atividade de liberação de β-hexosaminidase (%) = (OD407 da amostra / OD407 do controle) × 100.
3.5. PCR Quantitativo em Tempo Real
O RNA total foi preparado a partir das células usando o Reagente Trizol (Thermo Scientific, Seul, Coreia) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total (1 μg/mL) e 50 μM de iniciador oligo-dT foram misturados em 15 μL de água DEPC e reagidos a 70 °C por 5 min. Após a reação, 2 μL de 100 mM de ditiotreitol, 2 μL de 10 mM de dNTP, 5 μL de tampão RT 5× e 1 μL de 200 unidades/μL de M-MLV RTase (Bioneer, Daejeon, Coreia) foram adicionados para sintetizar cDNA em uma reação a 25 °C por 5 min, seguida de 42 °C por 60 min e 70 °C por 15 min. O PCR quantitativo em tempo real foi realizado no Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Seul, Coreia) usando o kit SensiFast SYBR No-ROX, 10 pM de cada iniciador (Tabela Suplementar S1) e 100 ng de cDNA. Após a amplificação, a análise da curva de melting foi realizada para confirmar a especificidade da reação. O limiar do ciclo final (Ct) usado para a quantificação por PCR em tempo real foi definido como o número de ciclos limite do PCR. A quantificação relativa do nível de expressão do gene alvo foi avaliada usando o método ΔΔCt.
3.6. Análise de Western Blot
Os pellets celulares foram ressuspensos em 50 μL de tampão de lise de radioimunoprecipitação (RIPA) (Thermo Scientific, Seul, Coreia) contendo coquetel inibidor de protease 1× e coquetel inibidor de fosfatase (GenDEPOT, Seul, Coreia). A concentração total de proteína foi determinada usando o reagente corante Bradford 1× (Bio-Rad, Seul, Coreia) a 595 nm. Quantidades iguais de proteína (8 μg) foram eletroforetadas usando eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), e as bandas de proteína separadas foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Merck Millipore, Seul, Coreia). A membrana foi bloqueada com BSA 5% (GenDEPOT, Seul, Coreia) e incubada com anticorpos primários diluídos 1:1000 (p-p38, p38, p-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-Lyn, Lyn, p-Syk, Syk, p-PLCγ, PLCγ, FcεRIγ e β-actina) a 4 °C por 16 h. Os sinais de Western blot foram visualizados usando anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) (Santa Cruz Biotech, Dallas, TX, EUA) e revelados com o kit EZ-western Lumi FemtoTM (Dogen, Seul, Coreia). As amostras foram escaneadas usando o escaneador de blot C-Digit (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EUA) e quantificadas usando o software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA).
3.7. ELISA
A produção de FLG, AQP3 e HA foi medida usando um kit ELISA conforme as instruções do fabricante (CUSABIO, Seul, Coreia). Resumidamente, células HaCaT (6 × 10⁴ células/poço) foram semeadas e tratadas com apigenina (20 μM) por 24 h. Os níveis de FLG, AQP3 e HA foram medidos no comprimento de onda de 450 nm usando um leitor de microplacas (TECAN, Männedorf, Suíça).
3.8. Análise Estatística
Todos os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP) de três experimentos independentes. A significância estatística em relação ao grupo controle foi avaliada usando análise de variância de uma via (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey e teste t usando o software Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA).
4. Conclusões
Neste estudo, avaliamos o efeito da apigenina sobre os principais mediadores das respostas inflamatória e alérgica em células RAW264.7 e RBL-2H3. A apigenina (100 μM) inibiu efetivamente a produção de NO e a expressão de citocinas (IL-1β, IL-6, COX-2 e iNOS), bem como a fosforilação de ERK e JNK associada à via de sinalização MAPK em células RAW264.7. A apigenina (30 μM) também inibiu a expressão de citocinas (TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 e COX-2) e FcεRIα/γ, bem como a fosforilação de moléculas sinalizadoras (Lyn, Syk, PLCγ1, ERK e JNK) correspondentes à via de respostas alérgicas em células RBL-2H3. Além disso, a apigenina (20 μM) induziu significativamente a expressão gênica ou proteica (filagrina, loricrina, AQP3, HA, HAS-1, HAS-2 e HAS-3) em células HaCaT de moléculas que desempenham um papel importante na barreira física e nas propriedades de retenção de água da pele. Adicionalmente, aumentou a expressão de peptídeos antimicrobianos (HBD-1, HBD-2, HBD-3 e LL-37) que desempenham um papel importante atuando como barreiras químicas das células HaCaT. No entanto, a apigenina tem solubilidade muito baixa em água. Portanto, é necessário desenvolver sistemas de liberação como lipossomas, micelas poliméricas, nanossuspensão para melhorar a absorção e biodisponibilidade considerando absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME). Embora pesquisas adicionais sejam necessárias, os resultados do presente estudo destacam a apigenina como um potencial candidato para aliviar doenças relacionadas ao sistema imunológico e DA.
Materiais Suplementares
Materiais suplementares podem ser encontrados em . Tabela S1: Primers utilizados neste estudo.
Contribuições dos Autores
Conceptualização, Y.-J.P.; metodologia, Y.J. Park, C.-H.P. e S.-Y.M.; análise formal, C.-H.P. e S.-Y.M.; investigação e curadoria de dados, C.H. Park, S.-Y.M., H.-W.Y., K.K., S.K., H.-J.L. e J.-H.K.; redação—preparação do rascunho original, Y.-J.P., C.-H.P. e S.Y. Min; redação—revisão e edição, Y.-J.P.; supervisão, Y.-J.P.; administração do projeto, Y.-J.P.; aquisição de financiamento, Y.-J.P.. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento
Esta pesquisa foi apoiada pelo Ministério do Comércio, Indústria e Energia (MOTIE), Instituto Coreano para o Avanço da Tecnologia (KIAT) por meio do Programa de Incentivo para as Indústrias da Região de Cooperação Econômica, número de concessão P0002201.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Desenvolvimento de medicamentos: Lições da natureza
Estresse oxidativo: Um conceito em biologia redox e medicina
Papel do estresse oxidativo e antioxidantes na nutrição diária e saúde humana
Envelhecimento da pele e estresse oxidativo: Efeitos antienvelhecimento do equol por meio de mecanismos bioquímicos e moleculares
Estresse oxidativo—Um fator de impacto emergente chave na saúde, envelhecimento, estilo de vida e estética
Uma abordagem aos cosmecêuticos
Revisão de bancos de dados de produtos naturais
Origem e papéis fisiológicos da inflamação
Patogênese da dermatite atópica
Variantes comuns de perda de função da proteína de barreira epidérmica filagrina são um importante fator predisponente para dermatite atópica
Detecção simultânea de variações genéticas relacionadas à barreira e à imunidade em pacientes com dermatite atópica por ensaio de hibridização reversa por blot
O papel do mastócito na fisiopatologia da asma
Novos conceitos sobre o mastócito
O paradigma TH1/TH2 na alergia
Transdução de sinal por receptores Fc: O caso do Fc Epsilon RI
Receptores Fc
Transdução de sinal na ativação de mastócitos e basófilos
Múltiplas vias de sinalização para a ativação de JNK em mastócitos: Envolvimento da tirosina quinase de Bruton, proteína quinase C e quinases JNK, SEK1 e MKK7
A tirosina quinase de Bruton regula a apoptose e a atividade da quinase JNK/SAPK
A proteína quinase ativada por mitógeno (MAP) regula a produção do fator de necrose tumoral alfa e a liberação de ácido araquidônico em mastócitos: Indicações de comunicação entre as MAP quinases p38 e p42
A regulação da atividade de AP-1 por proteínas quinases ativadas por mitógenos
Papel da moesina na transdução de sinal estimulada por lipopolissacarídeo
Óxido nítrico como produto secretor de células de mamíferos
Neurobiologia do óxido nítrico
Inibição de reações modelo bioquímicas para processos inflamatórios por extratos vegetais: Uma revisão sobre desenvolvimentos recentes
Supressão da artrite por um inibidor da óxido nítrico sintase
Inibição seletiva da ciclooxigenase 2 induzível in vivo é anti-inflamatória e não ulcerogênica
A biologia da caquectina/TNF-α mediador primário da resposta do hospedeiro
Biologia molecular das citocinas
Um modelo de mosaico de domínios da barreira cutânea
Tijolo e argamassa da barreira epidérmica
As proteínas elafina, filagrina, filamentos intermediários de queratina, loricrina e proteínas ricas em prolina pequenas 1 e 2 são componentes reticulados por isodipéptido do envelope celular córneo da epiderme humana
Ácido hialurônico: Um benefício na terapia periodontal
Canais de água aquaporina: da estrutura atômica à medicina clínica
Expressão funcional de AQP3 na epiderme da pele humana e epiderme reconstituída
Diabetes insípido nefrogênico em camundongos sem canais de água aquaporina-3
Regulação da aquaporina-1 e das isoformas da óxido nítrico sintase em um modelo de peritonite aguda em ratos
Glicerol seletivamente reduzido na pele de camundongos deficientes em aquaporina-3 pode explicar a hidratação, elasticidade e recuperação da barreira cutânea comprometidas
Papéis da aquaporina-3 na epiderme
Os queratinócitos armazenam o peptídeo antimicrobiano catelicidina em corpos lamelares
Peptídeos antimicrobianos
Significado da disfunção da barreira cutânea na dermatite atópica
Catelicidina LL-37: Um peptídeo antimicrobiano com um papel na doença inflamatória da pele
Epidemiologia, características clínicas e imunologia do tipo intrínseco (não mediado por IgE) de dermatite atópica (dermatite constitucional)
Dermatite atópica: Dos genes às lesões cutâneas
Visão geral da dermatite atópica
Estudos sobre atividades antioxidante, anti-inflamatória e clareadora de extratos de Hordeum vulgare L. e suas frações
Atividades antioxidante e anti-inflamatória do extrato de broto de cevada
Atividades antioxidante e antimicrobiana de extratos de cevada e trigo selecionados, habitantes da Península Coreana
Uma revisão sobre extração e análise de bioativos em aveia e cevada e o escopo para uso de novas tecnologias de processamento de alimentos
Atividade fisiológica da folha de cevada utilizando diferentes métodos de secagem
Desenvolvimento de um banco de dados de flavonoides para alimentos comumente consumidos por coreanos
O Banco de Dados de Flavonoides 1.0
O potencial terapêutico da apigenina
Apigenina: Um flavonoide dietético com diversas propriedades anticancerígenas
Propriedades farmacocinéticas e interações medicamentosas da apigenina, uma flavona natural
Desenvolvimento de um banco de dados de dados de flavonoides avaliados criticamente: Aplicação do sistema de avaliação da qualidade de dados do USDA
Impactos potenciais do consumo excessivo de flavonoides na saúde
Caráter pró-oxidante da citotoxicidade dos flavonoides: Relações estrutura-atividade
Peroxidação lipídica e danos ao DNA induzidos por morina e naringenina em núcleos isolados de fígado de rato
Óxido nítrico como S-nitrosoproteínas na artrite reumatoide
Flavonóis e doença cardiovascular
A β-hexosaminidase funciona apenas como um indicador de desgranulação em mastócitos? O papel primário da β-hexosaminidase nos grânulos dos mastócitos
Ciclosporina A: Um potente imunossupressor
Mastócitos da derme humana contêm e liberam fator de necrose tumoral alfa, que induz a molécula de adesão leucocitária endotelial
Papel da interleucina-1beta durante a dor e inflamação
A óxido nítrico sintase induzível e a ciclooxigenase-2 participam dos efeitos anti-inflamatórios e analgésicos do composto marinho natural lemnalol do coral mole Formosano Lemnalia cervicorni
Inibidores seletivos de COX-2: Uma revisão de suas relações estrutura-atividade
Efeito anti-inflamatório da quercetina e galangina em macrófagos RAW264.7 estimulados por LPS e modelos animais de dermatite atópica induzida por DNCB
Vias das proteínas quinases ativadas por mitógenos mediadas por ERK, JNK e p38
Vias das proteínas quinases ativadas por mitógenos
As quinases c-Jun N-terminais na micróglia cerebral: Funções imunológicas no cérebro
As quinases c-Jun N-terminais (JNKs) medeiam ações pró-inflamatórias da micróglia
O papel dos mastócitos na inflamação alérgica
Receptor de IgE e transdução de sinal em mastócitos e basófilos
Mastócitos no desenvolvimento de respostas imunes adaptativas
Os efeitos da IL-6 nas respostas das células T CD4
Mastócitos e mastocitose
A IL-6 é necessária para a produção de muco nas vias aéreas induzida por alérgenos fúngicos inalados
Nucleotídeos polimórficos dentro do promotor da IL-4 humana que medeiam a superexpressão do gene
Geração de IgE e função efetora dos mastócitos em camundongos deficientes em IL-4 e IL-13
Interleucina-13: Mediadora central da asma alérgica
Linfopoietina estromal tímica humana: Uma nova citocina derivada de células epiteliais e um potencial ator-chave na indução da inflamação alérgica
Células epiteliais humanas desencadeiam inflamação alérgica mediada por células dendríticas ao produzir TSLP
Ciclosporina na dermatite atópica: Modulação na expressão de marcadores imunológicos na pele lesional
Mecanismos para modulação do TNF alfa em doenças imunológicas e inflamatórias
Papel do TNF-alfa e citocinas na fisiopatologia da artrite reumatoide. Perspectivas terapêuticas
O papel da interleucina 10 na patogênese e potencial tratamento de doenças cutâneas
Fosforilação e desfosforilação do receptor de alta afinidade para imunoglobulina E imediatamente após o engajamento e desengajamento do receptor
Vias de sinalização integradas para ativação de mastócitos
Regulação molecular da ativação de mastócitos
O papel crítico dos mastócitos na alergia e inflamação
Biologia e relevância clínica de peptídeos antimicrobianos de ocorrência natural
Mutações de perda de função no gene que codifica a filagrina causam ictiose vulgar
Peptídeos antimicrobianos, infecções e a barreira cutânea
Expressão eritroide e estado oligomérico da proteína AQP3
Estresse osmótico regula positivamente a expressão do gene da aquaporina-3 em queratinócitos humanos cultivados
Ácido hialurônico: Um veículo tópico único para a liberação localizada de fármacos na pele
Ácido hialurônico no envelhecimento intrínseco cutâneo
Evidências de mudanças estruturais no sulfato de dermatana e ácido hialurônico com o envelhecimento
O metabolismo do hialuronano em queratinócitos humanos e na pele com dermatite atópica é impulsionado por um equilíbrio das hialuronano sintases 1 e 3
O fator de crescimento epidérmico ativa a hialuronano sintase 2 em queratinócitos epidérmicos e aumenta o hialuronano pericelular e intracelular
Expressão dos peptídeos antibióticos beta-defensina-1 humana e beta-defensina-2 humana na pele humana normal
Defensinas e defesa do hospedeiro
Peptídeos antimicrobianos epiteliais na defesa do hospedeiro contra infecção
Mecanismos de defesa cutânea por peptídeos antimicrobianos
Peptídeos e proteínas antimicrobianos da pele
Ensaio colorimétrico rápido para crescimento e sobrevivência celular: Aplicação em ensaios de proliferação e citotoxicidade
Estrutura molecular (a) e efeitos citotóxicos da apigenina em células RAW264.7 (b), RBL-2H3 (c) e HaCaT (d). As células foram tratadas com várias concentrações de apigenina (5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80 e 100 μM) por 24 h. Os dados foram analisados usando análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey. * p < 0,05, *** p < 0,001 versus células expostas a LPS sem tratamento com apigenina. Api, apigenina; LPS, lipopolissacarídeo; Q, quercetina (15 μM).
Efeitos da apigenina na produção de óxido nítrico e liberação de β-hexosaminidase de células RAW264.7 (a) e RBL-2H3 (b), respectivamente. Células induzidas por LPS ou IgE foram tratadas com várias concentrações de apigenina (5, 10, 20, 30, 40, 60, 80 e 100 μM). Api, apigenina; A, ciclosporina A (1 μg/mL); LPS, lipopolissacarídeo; Q, quercetina (15 μM). Os dados foram analisados usando análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey. ** p < 0,01, *** p < 0,001 versus células estimuladas por LPS sem tratamento com apigenina.
Efeitos da apigenina na expressão de citocinas (a) e moléculas de sinalização da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) (b) em células RAW264.7. As células foram tratadas com apigenina (100 μM) por 24 h. Api, apigenina; LPS, lipopolissacarídeo; Q, quercetina (15 μM). Os dados foram analisados usando análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Tukey. ** p < 0,01, *** p < 0,001 versus células induzidas por LPS sem tratamento com apigenina.
Efeitos da apigenina na transcrição de mRNA de citocinas e FcεRIα em células RBL-2H3. As células foram tratadas com apigenina (30 μM), 0,5 μg/mL de DNP-IgE e 100 ng/mL de DNP-BSA. Api, apigenina; A, ciclosporina A (1 μg/mL). Os dados foram analisados usando análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Tukey. *** p < 0,001 versus células tratadas com DNP-IgE e DNP-BSA sem exposição à apigenina.
Efeitos da apigenina na proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e moléculas de sinalização ativadas por IgE em células RBL-2H3. As células foram tratadas com apigenina (30 μM), 0,5 μg/mL de DNP-IgE e 100 ng/mL de DNP-BSA. Api, apigenina; A, ciclosporina A (1 μg/mL). Os dados foram analisados usando análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Tukey. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 versus células tratadas com DNP-IgE e DNP-BSA sem exposição à apigenina.
Efeitos da apigenina na expressão dos genes relacionados às funções de barreira física (a,b) e barreira química (c) das células HaCaT. As células foram tratadas com apigenina (20 μM) por 24 h. Api, apigenina; IVL, involucrina; LOR, loricrina. Os dados foram analisados usando teste t. ** p < 0,01, *** p < 0,001 versus células sem tratamento com apigenina.