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pmid: "34562873"
title: "Apigenina aumenta a indução de apoptose pelo 5-fluorouracil através da regulação da timidilato sintase em células de câncer colorretal."
authors: "Yang C, Song J, Hwang S, Choi J, Song G, Lim W"
journal: "Redox biology"
pubdate: "2021 Nov"
doi: "10.1016/j.redox.2021.102144"
source: "PMC Full Text"

Apigenina aumenta a indução de apoptose pelo 5-fluorouracil através da regulação da timidilato sintase em células de câncer colorretal.

Autores

Yang C, Song J, Hwang S, Choi J, Song G, Lim W

Periodico

Redox biology (2021 Nov)

Conteudo

A apigenina potencializa a indução de apoptose pelo 5-fluorouracil por meio da regulação da timidilato sintase em células de câncer colorretal

Embora medicamentos eficazes tenham sido desenvolvidos, incluindo o 5-fluorouracil (5-FU), o câncer colorretal (CCR) avançado apresenta baixa sensibilidade terapêutica resultante do desenvolvimento de resistência ao 5-FU. A timidilato sintase (TS) é uma proteína alvo do 5-FU, e a elevação da TS reduz a sensibilidade das células de CCR ao 5-FU. Aqui, testamos a eficácia de vários fitocompostos candidatos em células HCT116 derivadas de CCR humano, que expressam a proteína supressora tumoral P53 do tipo selvagem, e em células HT29, que expressam P53 mutante. Entre eles, descobrimos que a apigenina potencializou o efeito inibitório do 5-FU na viabilidade celular. Além disso, a apigenina inibiu a regulação positiva da TS induzida pelo 5-FU. A apigenina também potencializou a apoptose induzida por 5-FU nas células HCT116 e intensificou a perturbação do ciclo celular. Ademais, a apigenina aumentou a produção de espécies reativas de oxigênio, as concentrações intracelulares e intramitocondriais de Ca2+ e o potencial da membrana mitocondrial quando em cotratamento com 5-FU. O silenciamento da proteína forkhead box M, um fator de transcrição que modula a sensibilidade ao 5-FU, potencializou o aumento da apoptose pela apigenina nas células HCT116. Além disso, a apigenina suprimiu a expressão de TS e inibiu a viabilidade de células HCT116 resistentes ao 5-FU. Portanto, a apigenina pode melhorar a eficácia terapêutica do 5-FU contra o CCR ao suprimir a TS, mas a indução de apoptose depende principalmente do P53 funcional.

Destaques

• A apigenina inibe a regulação positiva da TS induzida pelo 5-FU para apoptose do CCR.
• O silenciamento do FOXM1 potencializa o aumento da apoptose pela apigenina.
• A supressão da TS e a promoção da atividade do P53 pela apigenina reduzem a resistência adquirida ao 5-FU.

Introdução

O câncer colorretal (CCR) é a segunda causa mais comum de morte relacionada ao câncer nos Estados Unidos. Atualmente, o 5-fluorouracil (5-FU) é um dos agentes quimioterápicos mais eficazes para o CCR em estágio inicial. Essa eficácia antitumoral resulta da inibição da timidilato sintase (TS), uma enzima essencial para a replicação do DNA ao catalisar a conversão de monofosfato de desoxiuridina (dUMPs) em monofosfato de desoxitimina para a biossíntese de desoxinucleotídeos, o que, por sua vez, leva a danos no DNA, parada na fase S e apoptose. Além disso, a maior expressão de TS no CCR está associada a uma menor sensibilidade ao 5-FU; portanto, direcionar a TS é uma estratégia terapêutica racional baseada em evidências para melhorar a citotoxicidade e a eficácia antitumoral do 5-FU. Adicionalmente, algumas proteínas ribossômicas desempenham papéis importantes no mecanismo terapêutico do 5-FU em células cancerígenas. O estresse nucleolar induzido pelo 5-FU resulta na liberação de proteínas ribossômicas dos ribossomos, que ativam a via P53. No entanto, o uso clínico do 5-FU é limitado pela resistência aos medicamentos, sendo necessário descobrir suplementos para superar a resistência a múltiplos fármacos, incluindo 5-FU, CPT-11 e oxaliplatina, e identificar mecanismos para melhorar a sensibilidade aos medicamentos no CCR.

A apigenina (4′,5,7-triidroxiflavona) é uma flavona vegetal encontrada em uma ampla variedade de frutas e vegetais com múltiplas atividades biológicas documentadas, incluindo propriedades anticancerígenas. Em comparação com outros flavonoides, a apigenina pode induzir seletivamente a parada do ciclo celular e a apoptose de células cancerígenas, com baixa mutagenicidade e toxicidade contra células normais, e, portanto, está ganhando atenção como um promissor adjuvante anticancerígeno. Além disso, a estrutura e as propriedades químicas de seu sítio de ligação proteica sugerem que a apigenina pode inibir a reação catalítica da TS por meio de ligações de hidrogênio com os grupos carbonila da pirimidina e hidroxila da desoxirribose do dUMP. Ademais, vários estudos sugeriram potencial eficácia terapêutica em células de CCR, mas ainda não está claro se a apigenina pode melhorar a sensibilidade ao 5-FU e regular a expressão de TS em células de CCR.
A sensibilidade a medicamentos do CCR varia dependendo do estado de mutação da proteína supressora tumoral P53. Como a P53 pode ser especificamente inibida no nível traducional pela TS, essas proteínas são fatores importantes para prever a eficácia terapêutica contra o CCR. Além disso, a proteína forkhead box M1 (FOXM1), um membro da família de fatores de transcrição forkhead box, desempenha um papel importante na tumorigênese, organogênese e envelhecimento através da regulação transcricional relacionada à proliferação, e estudos recentes relataram que o eixo FOXM1–TS está envolvido no desenvolvimento de resistência ao 5-FU pelas células cancerígenas. Portanto, neste estudo, vários fitoquímicos, incluindo apigenina, foram selecionados como adjuvantes candidatos para o 5-FU, e as eficácias individuais para melhorar a inibição mediada por 5-FU da viabilidade celular e para regular a expressão de P53 e TS foram analisadas em células de CCR. Além disso, as contribuições da P53 foram avaliadas comparando os efeitos da combinação de 5-FU e apigenina em células HCT116 que expressam P53 do tipo selvagem e células HT29 que expressam P53 mutante. Além disso, investigamos os efeitos do silenciamento de FOXM1 na indução de apoptose e modulação do ciclo celular pela apigenina.

Materiais e métodos

Produtos químicos
Apigenina, 5-FU, carvacrol, crisina, coumestrol, formononetina, naringenina, ostol, quercetina, silibinina, estigmasterol, CPT-11 e oxaliplatina foram adquiridos da Sigma-Aldrich, Inc (St. Louis, MO, EUA), curcumina da HWI Analytik Gmbh (Rülzheim, Alemanha) e delfinidina da Indofine Chemical Company (Somerville, NJ, EUA). Anticorpos contra P53, TS, poli-(ADP-ribose) polimerase (PARP), BAX, BCL-2 e CCND1 foram adquiridos da Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EUA) e anticorpos contra α-tubulina (TUBA) e P21 da Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA, EUA).
Cultura de células
As linhagens celulares derivadas de CCR humano HCT116 e HT29 foram obtidas do Korean Cell Line Bank (Seul, República da Coreia). Para estabelecer células de câncer de cólon resistentes ao 5-FU (5-FUR), as células HCT116 foram cultivadas por pelo menos 6 meses com concentrações progressivamente crescentes de 5-FU começando em 0,5 μM.
Teste de viabilidade e proliferação celular
A viabilidade celular foi medida usando o Cell Proliferation Kit I (MTT) (Roche, Basileia, Suíça). Células cultivadas em placas de 96 poços foram incubadas com 10 μL de reagente de marcação MTT a 37°C no escuro. Após 4 h, uma solução de solubilização foi dispensada e incubada a 37°C durante a noite. A densidade óptica foi determinada a 560 e 650 nm usando o espectrofotômetro de microplacas Epoch™ (BioTek Instruments, Winooski, VT, EUA). A proliferação celular foi examinada usando o BrdU ELISA Kit (Roche). As células tratadas foram cultivadas em solução de BrdU por 2 h para permitir a incorporação no DNA genômico e, em seguida, em solução de anti-BrdU-peroxidase por 90 min. Os produtos da reação foram quantificados medindo a absorbância a 370 e 492 nm usando o espectrofotômetro de microplacas Epoch™.
Análise de Western blot
O western blotting foi realizado para estimar os níveis de expressão de proteínas extraídas de células de CCR. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para membranas de nitrocelulose e expostas aos anticorpos indicados durante a noite. As membranas foram então expostas ao anticorpo secundário conjugado com peroxidase por 1 h, e as imagens das bandas foram adquiridas usando o equipamento ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).

Coloração com anexina V e iodeto de propídio

A apoptose foi analisada usando o kit de detecção de apoptose com anexina V conjugada com isotiocianato de fluoresceína I (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA). Para medir a apoptose, as células tratadas foram coletadas, coradas com anexina V e iodeto de propídio (PI) por 15 min e, em seguida, analisadas por citometria
As concentrações intracelulares e intramitocondriais de cálcio foram medidas utilizando os corantes fluorescentes Fluo-4 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e Rhod-2 (Invitrogen), respectivamente. Após a incubação com Fluo-4 a 37°C por 20 min ou Rhod-2 a 4°C por 30 min, as células foram tratadas conforme indicado e a intensidade de emissão de fluorescência foi medida usando um citômetro de fluxo.
RT-PCR quantitativo
Para quantificar a expressão gênica, o RNA total foi extraído das células usando o reagente Trizol (Invitrogen), e os DNAs complementares (cDNAs) foram sintetizados usando RT premix. A expressão gênica foi então quantificada usando o corante SYBR e pares de iniciadores para TP53 (F: 5’-CCTCACCATCATCACACTGG-3’, R: 5’-TCTTGCGGAGATTCTCTTCC-3’) e FOXM1 (F: 5’-GGGTTTTCTCCTTTGCTTCC-3’, R: 5’-ATGGGTCTCGCTAAGTGTGG-3’). Os níveis relativos de mRNA foram calculados usando o método 2−ΔΔCT com base nos valores de CT. A expressão do gene GAPDH foi medida para normalização.
Imunofluorescência para P53
A imunofluorescência foi utilizada para analisar os padrões de expressão de P53 nas células. Resumidamente, as células tratadas foram permeabilizadas por incubação com metanol 100% a 4°C por 10 min. Em seguida, as células foram lavadas com PBS, bloqueadas com soro de cabra por 2 h, incubadas com anticorpo primário anti-P53 durante a noite a 4°C e, em seguida, incubadas com anticorpo secundário conjugado com Alexa488 (Invitrogen) por 1 h. Os núcleos foram contracorados com DAPI por 5 min, e as imagens de fluorescência foram adquiridas usando um microscópio confocal. No mínimo três imagens foram utilizadas para a quantificação da intensidade de fluorescência pelo software Metamorph Offline (Molecular Devices).
Transfecção
O knockdown da expressão de FOXM1 foi realizado por transfecção de siFOXM1 usando Lipofectamine 2000 (Sigma-Aldrich) de acordo com as instruções do fabricante (Bioneer, Daejeon, República da Coreia). A sequência de FOXM1 alvo do siFOXM1 é 5’-AGTTTCCAGCTGGGATCAA-3’. A sequência do siFOXM1 é 5’-AGUUUCCAGCUGGGAUCAATT-3’ para a fita sense e 5’-TTUCAAAGGUCGACCCUAGUU-3’ para a fita antissense. Um siRNA não específico foi usado como controle (siControl). Todos os siRNAs foram adquiridos da Bioneer com base em uma biblioteca de siRNA pré-desenhada em todo o genoma. O siFOXM1 usado para transfecção tinha três IDs de siRNA diferentes (2305–1, 2305–2 e 2305–3) e foi especificado como sendo desenhado com base nas sequências de referência do National Center for Biotechnology Information (NM_001243088.1, NM_001243089.1, NM_021953.3, NM_202002.2, NM_202003.2).

Estatística

Todos os cálculos estatísticos foram realizados usando análise de variância de acordo com o modelo linear geral (PROC-GLM) do software estatístico SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, EUA). Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes. Um valor de p <0,05 (bilateral) foi considerado estatisticamente significativo para todos os testes.

Resultados

Os fitoquímicos potencializaram a inibição da viabilidade das células de CCR por 5-FU.
Múltiplos fitoquímicos, incluindo apigenina, potencializaram o efeito supressor do 5-FU na viabilidade de células de câncer colorretal (CRC). [A] Viabilidade das linhagens humanas de CRC HCT116 e HT29 após tratamento com 5-FU (20 μM) isoladamente ou 5-FU mais o fitoquímico indicado (20 μM) por 48 h, medida pelo ensaio de MTT. [B] Expressão de P53 por células HCT116 e HT29 após tratamento com fitoquímico (20 μM) por 24 h, medida por western blot. [C] Expressão da timidilato sintase (TS) por células HCT116 e HT29 após tratamento com 5-FU isoladamente ou 5-FU mais o fitoquímico indicado (20 μM) por 24 h, medida por western blot. As bandas superiores representam TS ligada, e as bandas inferiores representam TS não ligada. Os dados são apresentados como representativos dos resultados de três experimentos independentes. O asterisco indica diferença estatisticamente significativa em comparação com as células controle não tratadas (***p < 0,001). O símbolo 'a' indica um efeito significativo do tratamento combinado em comparação com 5-FU isoladamente (p < 0,05).
Fig. 1

Quando aplicado isoladamente por 48 h, o 5-FU (1, 2, 4, 8, 16, 32 e 64 μM) inibiu de forma dose-dependente a viabilidade e proliferação das células HCT116 e HT29 (Fig. S1), consistente com seu conhecido efeito anticancerígeno. Em seguida, examinamos se algum dos seguintes compostos naturais, apigenina, carvacrol, crisina, coumestrol, curcumina, delfinidina, formononetina, naringenina, osthol, quercetina, silibinina e estigmasterol, a 20 μM, potencializava o efeito anticancerígeno do 5-FU (20 μM) por 48 h (Fig. 1A). Selecionamos uma concentração de 20 μM de fitoquímicos com base na concentração média encontrada em nossos estudos anteriores para induzir a morte de células cancerígenas. Para comparar os efeitos de cada fitoquímico na viabilidade celular em células de CRC, todos os fitoquímicos foram tratados na mesma concentração e pelo mesmo período. Em cada ensaio, o fármaco anticancerígeno convencional CPT-11 (20 μM) foi usado como controle positivo. Apigenina, crisina, formononetina, osthol e estigmasterol demonstraram os maiores efeitos potencializadores do 5-FU na viabilidade das células HCT116, enquanto apigenina, crisina, coumestrol, formononetina e estigmasterol mostraram os maiores efeitos potencializadores do 5-FU na viabilidade das células HT29.

Em seguida, examinamos as alterações na expressão de P53 do tipo selvagem em células HCT116 após tratamento com fitoquímicos e fármacos anticancerígenos convencionais a 20 μM por 24 h (Fig. 1B) e descobrimos que, entre os fitoquímicos, apenas a apigenina aumentou a expressão de P53 em 2,3 vezes (p < 0,001), de forma semelhante ao 5-FU (2,3 vezes, p < 0,001) e ao CPT-11 (2,9 vezes, p < 0,001). Também observamos que o tratamento com 5-FU (20 μM) por 24 h intensificou a expressão da banda superior de TS em células HCT116 e HT29, sugerindo a formação de complexos clássicos de TS; portanto, investigamos em seguida se os fitoquímicos que potencializaram a atividade do 5-FU, a saber, apigenina, crisina, coumestrol, formononetina, ostol e estigmasterol, também suprimiam a TS (Fig. 1C). Todos os fitoquímicos testados, exceto o estigmasterol, inibiram a expressão de TS em células HCT116. Em células HT29, todos os fitoquímicos testados e o CPT-11 (controle positivo) também inibiram a expressão de TS. Esses resultados sugerem que os fitoquímicos potencializam os efeitos do 5-FU, possivelmente revertendo o aumento de TS induzido pelo 5-FU. Entre os fitoquímicos, a apigenina aumentou a expressão de P53, sugerindo que a aplicação de apigenina é uma nova estratégia para o tratamento de CCR. Portanto, concentramo-nos nos efeitos da apigenina em todos os experimentos subsequentes.

A apigenina potencializou a supressão do crescimento celular e a indução de apoptose em células de CCR mediadas pelo 5-FU.

A apigenina potencializou a inibição do crescimento de células de CRC e a indução de apoptose pelo 5-FU em cultura 2D e 3D. [A] A viabilidade das células HCT116 e HT29 após tratamento com apigenina (20 μM) mais 5-FU (20 μM) por 48 h, analisada pelo ensaio de MTT. [B] Morte apoptótica das células HCT116 e HT29 após tratamento com apigenina (20 μM) ou 5-FU (20 μM) mais apigenina por 48 h, estimada por dupla marcação com anexina V/iodeto de propídio (IP) e citometria de fluxo. O quadrante superior direito indica células em apoptose tardia usadas para a quantificação da morte celular. [C] Expressão de PARP, BAX e BCL-2 em células HCT116 e HT29 após tratamento com 5-FU (20 μM) isolado, apigenina (20 μM) isolada ou apigenina mais 5-FU (20 μM) por 24 h, estimada por western blot. [D] Estrutura 3D de esferoides de células HCT116 e HT29 após tratamento com 5-FU (20 μM) mais apigenina (20 μM) por 3 dias, quantificada pelo ImageJ. A barra de escala representa 300 μm. [E] Diagrama esquemático do nosso método para observar a morfologia das células/colônias em Matrigel após tratamento com 5-FU mais apigenina em poços satélites. Comparação da morfologia das células/colônias antes do tratamento e após 48 h de tratamento com apigenina (20 μM) isolada ou apigenina mais 5-FU (20 μM), quantificada pelo ImageJ. A barra de escala representa 200 μm. Os dados são apresentados como representativos dos resultados de três experimentos independentes. O asterisco indica uma diferença estatisticamente significativa em relação aos controles não tratados (***p < 0,001). O símbolo 'a' indica uma diferença significativa entre o tratamento combinado e o tratamento com 5-FU isolado (p < 0,05). O símbolo 'b' indica uma diferença significativa entre o tratamento combinado e o tratamento com apigenina isolada (p < 0,05).
Fig. 2

Apigenina inibiu de forma dose-dependente a viabilidade de ambas as células CRC por 48 h e foi particularmente eficaz contra as células HCT116 (Fig. S2A). Além disso, a apigenina induziu de forma dose-dependente a apoptose das células HCT116 por 48 h (Fig. S2B). Com base nesses resultados de dose-resposta, definimos 20 μM como a concentração ideal de apigenina para experimentos subsequentes. Primeiro, confirmamos que a adição de apigenina (20 μM) ao 5-FU (20 μM) por 48 h induziu reduções maiores (69,3% de redução nas células HCT116 e 66,4% de redução nas células HT29, p < 0,001) na viabilidade das células HCT116 e HT29 do que o 5-FU isolado (55% de redução nas células HCT116 e 31,1% de redução nas células HT29, p < 0,001) (Fig. 2A). Além disso, a coloração com anexina V e PI revelou que o 5-FU induziu de forma dose-dependente a apoptose tardia das células HCT116 (Fig. S3). Além disso, a adição de apigenina (20 μM) ao 5-FU (20 μM) por 48 h aumentou a taxa de apoptose (70,92%, p < 0,001) das células HCT116 em comparação com o tratamento apenas com 5-FU (20,20%, p < 0,001) (Fig. 2B). Por outro lado, a apoptose das células HT29 foi induzida pelo 5-FU apenas em concentrações ≥32 μM, enquanto a adição de apigenina não teve um efeito potencializador demonstrável, sugerindo que esse efeito potencializador depende da função da P53 (tipo selvagem). A clivagem da PARP é uma medida importante do dano ao DNA em células cancerígenas. A apigenina (20 μM) por 24 h aumentou significativamente a expressão da PARP clivada nas células HCT116, e a adição de 5-FU (20 μM) potencializou ainda mais o efeito crescente (Fig. 2C). Curiosamente, o 5-FU isolado, a apigenina isolada ou o tratamento combinado de 5-FU e apigenina não afetaram significativamente a expressão da PARP clivada em comparação com o grupo controle nas células HT29. Esses resultados são consistentes com o resultado de que o 5-FU e a apigenina não mostraram efeito indutor de apoptose nas células HT29. A proporção da proteína pró-apoptótica BAX para a proteína antiapoptótica BCL-2 é um indicador previsível da apoptose mediada por mitocôndrias em células cancerígenas. O tratamento com 5-FU isolado, apigenina isolada ou 5-FU mais apigenina aumentou significativamente a proporção de BAX/BCL-2 nas células HCT116. Nas células HT29, o tratamento com 5-FU isolado, apigenina isolada ou 5-FU mais apigenina diminuiu a expressão de BCL-2, resultando em um aumento na proporção de BAX/BCL-2, embora não tenha tido efeito na expressão de BAX.

Para a eficácia antitumoral, os candidatos devem suprimir a viabilidade celular no ambiente tecidual 3D. Portanto, analisamos em seguida os efeitos de 5-FU (20 μM) e apigenina (20 μM) por 3 dias em esferoides de células CRC (Fig. 2D). A apigenina aumentou o número de colônias (de 17 colônias no grupo controle para 120 colônias em células HCT116 e de 2 colônias no grupo controle para 15 colônias em células HT29, p < 0,001), diminuiu a área média das colônias (92,1% em células HCT116 e 78,5% em células HT29) e potencializou os efeitos de 5-FU em ambos os tipos celulares. O tratamento combinado com 5-FU e apigenina diminuiu significativamente a formação de esferoides em comparação com o tratamento apenas com 5-FU. Para confirmar ainda mais a potencialização da eficácia de 5-FU no ambiente 3D, analisamos o efeito em células imobilizadas em Matrigel (Fig. 2E). Consistente com os resultados em cultura 2D e em esferoides, a combinação de 5-FU (20 μM) e apigenina (20 μM) administrada a partir de poços satélites por 48 h impediu a formação de colônias grandes em células HCT116. A área média das colônias reduziu em 36,8% (p < 0,001) com 5-FU isolado, 30,5% (p < 0,001) com apigenina isolada e 69,9% (p < 0,001) com 5-FU mais apigenina em comparação com o grupo controle em células HCT116. Em células HT29, o tratamento combinado de 5-FU e apigenina reduziu significativamente a área média das colônias em 41,5% (p < 0,01), embora o tratamento com cada um deles isoladamente não o tenha feito. Coletivamente, esses resultados sugerem que a apigenina potencializa os efeitos de 5-FU no crescimento e sobrevivência das células CRC.

A apigenina isoladamente e em combinação com 5-FU deslocou a distribuição das fases do ciclo celular das células CRC em direção à SubG1

A apigenina potencializou a disrupção do ciclo celular induzida por 5-FU, potencialmente influenciando a expressão de CCND1. [A] A distribuição do ciclo celular foi determinada por coloração com iodeto de propídio (PI) e citometria de fluxo e expressa como as proporções de células nas fases SubG1, G1, S e G2/M após tratamento com 5-FU e/ou apigenina por 48 h. [B] Expressão de CCND1 em células HCT116 e HT29 após tratamento com 5-FU (20 μM) isolado, apigenina (20 μM) isolada ou apigenina mais 5-FU (20 μM) por 24 h, conforme estimado por western blot. Os dados são apresentados como representantes dos resultados de três experimentos independentes. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas em comparação com controles não tratados (***p < 0,001; **p < 0,01). O símbolo 'a' indica uma diferença significativa entre o tratamento combinado e o tratamento apenas com 5-FU (p < 0,05). O símbolo 'b' indica uma diferença significativa entre o tratamento combinado e o tratamento apenas com apigenina (p < 0,05).
Fig. 3

É bem conhecido que o tratamento com 5-FU causa a parada na fase S das células CRC; portanto, investigamos se a apigenina facilita ainda mais a mudança na distribuição das fases do ciclo celular (Fig. 3A). A apigenina (20 μM) não alterou a distribuição do ciclo celular das células HT29, isoladamente ou em combinação com 5-FU (20 μM), enquanto a apigenina isoladamente (11,6%, p < 0,001), 5-FU isoladamente (7,2%, p < 0,001) e a combinação (32,8%, p < 0,001) por 48 h aumentaram a proporção de células HCT116 na fase SubG1, implicando entrada na via apoptótica.

Em seguida, analisamos as alterações na expressão do regulador-chave do ciclo celular, ciclina D1 (CCND1), por western blotting (Fig. 3B). Em ambos os tipos de células CRC, 5-FU (20 μM) isoladamente (redução de 34,8% em células HCT116, p < 0,001, e redução de 28,0% em células HT29, p < 0,01), apigenina (20 μM) isoladamente (redução de 63,4% em células HCT116, p < 0,001, e redução de 68,0% em células HT29, p < 0,001) e a combinação (redução de 82,3% em células HCT116, p < 0,001, e redução de 79,6% em células HT29, p < 0,001) por 48 h reduziram a expressão de CCND1. Assim, a apigenina pode regular o ciclo celular das células CRC tanto isoladamente quanto em combinação com 5-FU, possivelmente suprimindo a CCND1. Além disso, esses efeitos são dependentes de P53 selvagem.

Apigenina isoladamente e em combinação com 5-FU induziu a produção de ROS e disfunção mitocondrial em células CRC
Apigenina aumenta a produção de ROS, a desregulação de Ca2+ e a despolarização do potencial de membrana mitocondrial (MMP) em células CRC tratadas com 5-FU. [A] Geração de ROS após tratamento com 5-FU (20 μM), apigenina (20 μM) e 5-FU mais apigenina por 1 ou 24 h, medida pela fluorescência de DCF. [B] Aumento da concentração intracelular de Ca2+ após tratamento com 5-FU (20 μM), apigenina (20 μM) e 5-FU mais apigenina por 1 ou 24 h, medido pela coloração com Fluo-4. [C] Aumento da concentração mitocondrial de Ca2+ após tratamento com 5-FU (20 μM), apigenina (20 μM) e 5-FU mais apigenina por 1 ou 24 h, medido pela coloração com Rhod-2. [D] Perda de MMP após tratamento com 5-FU (20 μM), apigenina (20 μM) e 5-FU mais apigenina por 24 h, medida pela coloração com JC-1 e citometria de fluxo. O grau de despolarização da membrana mitocondrial foi determinado pela proporção de células na área inferior do gráfico. Os dados são apresentados como representativos dos resultados de três experimentos independentes. Os gráficos de histograma no painel esquerdo de [A] a [C] são imagens representativas para o grupo de tratamento de 1 h. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas em comparação com os controles não tratados (***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05). O símbolo 'a' indica uma diferença significativa entre o tratamento combinado e o tratamento apenas com 5-FU (p < 0,05). O símbolo 'b' indica uma diferença significativa entre o tratamento combinado e o tratamento apenas com apigenina (p < 0,05).
Fig. 4

O estresse oxidativo é um mecanismo importante de morte celular de alguns agentes anticancerígenos convencionais e adjuvantes terapêuticos; portanto, investigamos os efeitos do 5-FU (20 μM) isolado, da apigenina (20 μM) isolada e do 5-FU mais apigenina por 1 e 24 h na produção de EROs, medida pela conversão de 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) em 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF) fluorescente (Fig. 4A). Imagens representativas de gráficos da população celular tratada por 1 h são apresentadas no painel esquerdo. O tratamento com 5-FU isolado por 1 h não causou acúmulo significativo de EROs em células HT29. Por outro lado, a apigenina isolada (4,0 vezes em células HCT116 e 11,4 vezes em células HT29, p < 0,001) e em combinação com 5-FU (5,8 vezes em células HCT116, p < 0,001 e 18,6 vezes em células HT29) promoveu a produção de EROs em ambas as linhagens de CCR dentro de 1 h.

O estresse oxidativo decorrente do acúmulo de EROs está associado tanto à desregulação do cálcio, ao acúmulo de cálcio mitocondrial e à indução da via de apoptose mitocondrial. Portanto, medimos os efeitos do 5-FU (20 μM) e da apigenina (20 μM) nas concentrações intracelulares e intramitocondriais de Ca2+ usando os corantes fluorescentes sensíveis ao cálcio Fluo-4 e Rhod-2, respectivamente (Fig. 4B–C). Enquanto o tratamento com 5-FU aumentou a concentração intracelular de Ca2+ após 24 h (1,5 vez em células HCT116 e 1,6 vez em células HT29, p < 0,01), a apigenina aumentou a concentração de Ca2+ após apenas 1 h (1,5 vez em células HCT116 e 1,6 vez em células HT29, p < 0,01) (Fig. 4B). Por outro lado, o nível de Ca2+ mitocondrial não foi afetado pelo tratamento de 1 h com 5-FU isolado, apigenina isolada ou a combinação em células HCT116 (Fig. 4C). Enquanto isso, o tratamento com 5-FU isolado, apigenina isolada ou a combinação reduziu os níveis de Ca2+ mitocondrial em células HT29. No entanto, todos os três tratamentos por 24 h aumentaram a concentração de Ca2+ mitocondrial. O tratamento combinado de 5-FU com apigenina por 24 h aumentou os níveis de Ca2+ mitocondrial em 1,8 vez (p < 0,001) em células HCT116 e 1,7 vez (p < 0,001) em células HT29 em comparação com os controles. Imagens representativas de gráficos para populações celulares tratadas por 1 h são apresentadas no painel esquerdo da Fig. 4B e C. Esses resultados sugerem que um aumento precoce no Ca2+ citoplasmático induzido pela apigenina aumenta a taxa de captação de cálcio mitocondrial, resultando, em última análise, em maior disfunção mitocondrial e alta taxa de apoptose.
A produção de energia pelas mitocôndrias depende da manutenção de um potencial transmembrana entre a membrana interna e a matriz. Assim, para examinar diretamente uma possível disfunção mitocondrial, medimos esse potencial de membrana mitocondrial (PMM) em células de CCR usando o indicador fluorescente de PMM JC-1 (Fig. 4D). Consistente com a redução da viabilidade celular e o aumento da taxa de apoptose, o tratamento com 5-FU (20 μM), apigenina (20 μM) e a combinação de 5-FU mais apigenina por 24 h induziu a despolarização mitocondrial, com efeitos maiores nas células HCT116 do que nas HT29. Além disso, o tratamento combinado induziu uma maior perda de PMM do que qualquer um dos agentes isoladamente. O tratamento combinado de 5-FU e apigenina por 24 h aumentou a perda relativa de PMM em 14,5 vezes (p < 0,001) nas células HCT116 e 2,1 vezes (p < 0,001) nas células HT29 em comparação com os controles. Esses resultados sugerem que a apigenina co-tratada com 5-FU aumenta o estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial nas células de CCR, aumentando assim a taxa de morte celular.

Apigenina regulou positivamente P53 e regulou negativamente TS em células de CCR

A apigenina regula positivamente a expressão de P53 e reverte a regulação positiva induzida por 5-FU da timidilato sintase (TS) em células de CCR. [A] A expressão de TP53 em células HCT116 e HT29 após tratamento com apigenina (20 μM) por 24 h foi analisada usando RT-PCR quantitativo. [B] A regulação da expressão de P53 pela apigenina (20 μM) por 24 h foi analisada por imunofluorescência (verde). Os núcleos foram contracorados com DAPI (azul). As barras de escala representam 40 μm, [C] Expressão de P53 em células HCT116 e HT29 após tratamento com apigenina (20 μM) por 24 h, conforme estimado por western blot. [D] A expressão de P53 em células HCT116 e HT29 após tratamento com apigenina (20 μM) mais 5-FU (20 μM) por 24 h foi analisada por western blot. [E] A expressão de P21 em células HCT116 e HT29 após tratamento com apigenina (20 μM) mais 5-FU (20 μM) por 24 h foi analisada por western blot. [F] A expressão de TS em células HCT116 e HT29 após tratamento com apigenina (20 μM) mais 5-FU (20 μM) por 24 h foi analisada por western blot. As bandas superiores representam TS ligada, e as bandas inferiores representam TS não ligada. Os dados são apresentados como representativos dos resultados de três experimentos independentes. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas em comparação com os controles não tratados (***p < 0,001; **p < 0,01). O símbolo 'a' indica uma diferença significativa entre o tratamento combinado e o tratamento apenas com 5-FU (p < 0,05). O símbolo 'b' indica uma diferença significativa entre o tratamento combinado e o tratamento apenas com apigenina (p < 0,05). (Para interpretação das referências às cores nesta legenda da figura, o leitor deve consultar a versão on-line deste artigo.)
Fig. 5

Em seguida, examinamos os efeitos da apigenina na expressão dos alvos putativos P53 e TS. O tratamento com apigenina (20 μM) por 24 h aumentou a expressão de TP53 em 2,4 vezes (p < 0,001) em células HCT116, mas não afetou a expressão em células HT29 com base na análise de RT-PCR quantitativa (Fig. 5A). A apigenina (20 μM) por 24 h também aumentou significativamente a expressão de P53 nos núcleos das células HCT116, mas novamente não teve efeito na expressão de P53 em células HT29 por análise de imunofluorescência (Fig. 5B). O aumento na expressão de P53 em células HCT116 foi dose-dependente (Fig. 5C); mas, ao contrário de outros, o tratamento com apigenina (20 μM) por 24 h não potencializou o aumento induzido por 5-FU (20 μM) (Fig. 5D). Analisamos a expressão de P21 como uma proteína alvo de P53, envolvida na parada do ciclo celular e apoptose (Fig. 5E). Curiosamente, o tratamento com 5-FU (20 μM), apigenina (20 μM) e a combinação de 5-FU mais apigenina por 24 h aumentou significativamente a expressão de P21 apenas em células HCT116, não em células HT29. Em ambas as linhagens celulares de CCR, no entanto, o tratamento com apigenina (20 μM) por 24 h reverteu a elevação induzida por 5-FU na expressão de TS (Fig. 5F). O tratamento combinado com 5-FU e apigenina reduziu a expressão superior de TS em 58,2% (p < 0,001) em células HCT116 e 41,6% (p < 0,001) em células HT29 em comparação com o tratamento apenas com 5-FU. Além disso, a intensidade da banda inferior representando TS não ligada também foi reduzida pelo tratamento adicional com apigenina. Esses resultados sugerem que a apigenina potencializa o efeito anticancerígeno do 5-FU ao mitigar o aumento associado de TS, mesmo em células mutantes para P53, mas não ativa diretamente a via de apoptose regulada por P53.

Potencialização da eficácia do 5-FU pela apigenina envolve o silenciamento de FOXM1

O silenciamento de FOXM1 contribui para a apoptose induzida por apigenina e modulação do ciclo celular. [A] O knockdown de FOXM1 após transfecção com siFOXM1 (10 nM) por 5 h em células HCT116 e HT29 foi analisado por RT-PCR quantitativa. [B] Taxas de morte de células HCT116 e HT29 após transfecção com siFOXM1 (10 nM) por 5 h e tratamento com apigenina (20 μM) por 48 h, medidas por dupla marcação com anexina V/iodeto de propídio (IP) e citometria de fluxo. As células no quadrante superior direito estão em apoptose tardia. [C] Distribuição do ciclo celular após transfecção com siFOXM1 (10 nM) por 5 h e tratamento com apigenina (20 μM) por 48 h determinada por marcação com IP e citometria de fluxo e expressa como proporções de células nas fases SubG1, G1, S e G2/M. Os dados são apresentados como representativos dos resultados de três experimentos independentes. O asterisco indica diferença estatisticamente significativa em comparação com controles não tratados (***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05). O símbolo 'a' indica uma diferença significativa entre o tratamento combinado e a apigenina isoladamente (p < 0,05).
Fig. 6

Estudos anteriores demonstraram que o fator de transcrição FOXM1 modulado por P53 regula a sensibilidade das células cancerígenas ao 5-FU. Para examinar as contribuições do FOXM1 para os efeitos da apigenina isoladamente e para a potencialização das respostas ao 5-FU, examinamos a resposta ao fármaco em células com knockdown de FOXM1 estabelecidas por transfecção com um RNA pequeno interferente (siRNA) direcionado (siFOXM1) (Fig. 6A). A transfecção com siFOXM1 a 10 nM reduziu a expressão do gene FOXM1 em 54,7% (p < 0,001) em células HCT116 e em 66,7% (p < 0,001) em células HT29. O knockdown de FOXM1 em células HCT116 aumentou a taxa de apoptose tardia em comparação com o siRNA controle (de 6,82% para 9,26%) e potencializou os efeitos da apigenina (20 μM) isoladamente de 32,75% para 38,58% (Fig. 6B). Em células HT29, a transfecção com siFOXM1 (10 nM) por 5 h não causou uma alteração significativa na taxa de apoptose, embora tenha aumentado ligeiramente a taxa de apoptose tardia. A transfecção com siFOXM1 (10 nM) também aumentou a proporção de células HCT116 tratadas com apigenina na fase SubG1 de 3,52% para 7,05% (Fig. 6C), consistente com o aumento da ativação da via apoptótica. No entanto, o knockdown de FOXM1 não afetou a distribuição do ciclo celular das células HT29, sugerindo que a ação do FOXM1 está sob a influência da P53 (tipo selvagem). Esses resultados sugerem ainda que a regulação negativa do FOXM1 em células de CCR potencializa o efeito anticancerígeno da apigenina ao facilitar os efeitos sobre o ciclo celular e a apoptose, e que essa facilitação depende da expressão e da função da P53.

A apigenina aliviou a resistência induzida ao 5-FU em células de CCR

Apigenina restaura a sensibilidade ao 5-FU em células de CCR. [A] Representação esquemática do método para estabelecer células de CCR resistentes ao 5-FU (células HCT116-5-FUR). [B] A viabilidade das células HCT116-5-FUR após tratamento com 5-FU por 48 h foi analisada pelo ensaio de MTT. [C] A proliferação das células HCT116-5-FUR após tratamento com 5-FU por 48 h foi analisada usando ELISA de BrdU. [D] A viabilidade das células HCT116-5-FUR e HCT116 após tratamento com CPT-11 por 48 h foi analisada pelo ensaio de MTT. [E] A viabilidade das células HCT116-5-FUR e HCT116 após tratamento com oxaliplatina por 48 h foi analisada pelo ensaio de MTT. [F] A viabilidade das células HCT116-5-FUR após tratamento com 5-FU (20 μM) mais apigenina (20 μM) por 48 h foi analisada usando o ensaio de MTT. [G] Taxa de morte apoptótica das células HCT116-5-FUR após tratamento com 5-FU (20 μM) mais apigenina (20 μM) por 48 h, conforme estimado por coloração dupla com anexina V/IP e citometria de fluxo. Células no quadrante superior direito estão em apoptose tardia. [H] Efeito do tratamento com 5-FU (20 μM) mais apigenina (20 μM) por 48 h na distribuição do ciclo celular das células HCT116-5-FUR, medido por coloração com IP e citometria de fluxo, e expresso pelas proporções nas fases SubG1, G1, S e G2/M. [I] Expressão de TS em células HCT116-5-FUR após tratamento com 5-FU (20 μM) mais apigenina (20 μM) por 24 h foi analisada usando western blotting. As bandas superiores representam TS ligada e as bandas inferiores representam TS não ligada. Os dados são apresentados como representantes dos resultados de três experimentos independentes. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas em comparação com os controles não tratados (***p < 0,001; **p < 0,01; *p < 0,05). O símbolo 'a' indica uma diferença significativa entre o tratamento combinado e o tratamento apenas com 5-FU (p < 0,05). O símbolo 'b' indica uma diferença significativa entre o tratamento combinado e o tratamento apenas com apigenina (p < 0,05).
Fig. 7

O desenvolvimento de resistência das células tumorais aos agentes quimioterápicos primários resulta em recrescimento tumoral, metástase e mau prognóstico; portanto, agentes que possam prevenir a resistência têm alto valor clínico. Testamos a capacidade da apigenina de reverter a resistência ao 5-FU usando uma linhagem celular de CCR estabelecida pelo tratamento de células HCT116 com concentrações gradualmente crescentes de 5-FU por aproximadamente 6 meses (Fig. 7A). Essas células HCT116-5-FUR exibiram um aumento acentuado na resistência ao 5-FU, conforme indicado pelo aumento da IC50 para 126,91 μM a partir de 32,30 μM em células HCT116, como mostrado na Fig. S1 (Fig. 7B). Além disso, essas células mostraram resistência aumentada à inibição da proliferação pelo 5-FU por 48 h (Fig. 7C). Em seguida, examinamos se as células HCT116-5-FUR apresentavam resistência a múltiplos fármacos ao CPT-11 e à oxaliplatina, os medicamentos anticancerígenos convencionais administrados juntamente com o 5-FU para o tratamento do CCR. Em comparação com as células HCT116, as células HCT116-5-FUR não mostraram diferença no efeito inibitório da viabilidade celular, exceto por uma baixa concentração de 1 μM para o tratamento com CPT11 por 48 h (Fig. 7D). Por outro lado, os resultados das alterações na viabilidade celular após o tratamento dose-dependente com oxaliplatina por 48 h sugerem que a sensibilidade à oxaliplatina é reduzida nas células HCT116-5-FUR em comparação com as células HCT116 (Fig. 7E). Esses resultados sugerem que a resistência ao 5-FU também pode estar envolvida na eficácia terapêutica de outros medicamentos anticancerígenos. Enquanto isso, o tratamento com apigenina (20 μM) por 48 h reduziu a viabilidade celular das células HCT116-5-FUR em 52,6% (p < 0,001) para um nível semelhante ao das células HCT116 parentais (Fig. 7F) e aumentou a taxa de apoptose das células HCT116-5-FUR quando combinada com 5-FU (53,91%) em comparação com 5-FU isolado (17,32%) por 48 h (Fig. 7G). A adição de apigenina (20 μM) por 48 h também aumentou a proporção de células HCT116-5-FUR em parada na fase S em comparação com o tratamento apenas com 5-FU (20 μM) (Fig. 7H) e aumentou a proporção de células HCT116-5-FUR tratadas com 5-FU que entram na fase SubG1 de 7,40% para 35,46%.
Em seguida, examinamos se esses efeitos estão associados à regulação de TS e P53, como nas células HCT-116 parentais, por western blotting (Fig. 7I). A quantidade de complexos clássicos de TS foi maior nas células HCT116-5-FUR não tratadas do que nas células HCT116 não tratadas. Inversamente, o 5-FU (20 μM) por 24 h aumentou a expressão de TS ligada (superior) e não ligada (inferior) em maior grau nas células HCT116. Esses achados sugerem que a alta expressão do complexo TS nas células HCT116 aumenta a resistência ao 5-FU. Além disso, o tratamento com apigenina (20 μM) atenuou o aumento da expressão de TS ligada e não ligada nas células HCT116-5-FUR. No entanto, a apigenina influenciou a P53 apenas nas células HCT116 controle, mas não nas células HCT116-5-FUR. Em outras palavras, a apigenina também pode aumentar a eficácia terapêutica do 5-FU em células de CCR resistentes ao 5-FU através da regulação da expressão de TS, mas independentemente da P53.

Discussão

Representação esquemática dos efeitos da apigenina em células de CCR quando adicionada com 5-FU. A expressão da timidilato sintase (TS) é aumentada pelo 5-FU, enquanto a apigenina reverte esse aumento. A inibição da expressão de TS induz danos ao DNA nas células de CCR, levando à apoptose. A apigenina regula positivamente a expressão da proteína antitumoral P53, que pode induzir ainda mais a parada do ciclo celular e a apoptose sob cotratamento com 5-FU. A apigenina também induz a produção de ROS, desregulação do Ca2+ intracelular e perda de MMP em células de CCR. O silenciamento de FOXM1 potencializa ainda mais a morte celular induzida por apigenina. As barras pontilhadas indicam mecanismos que foram relatados em estudos anteriores, mas não foram validados no presente estudo.
Fig. 8

A taxa de sobrevida em 5 anos de pacientes com CCR avançado é <10%, principalmente devido ao desenvolvimento de resistência a medicamentos e à consequente recorrência tumoral. O 5-FU é o principal fármaco de primeira linha utilizado para o tratamento de diversos tipos de câncer, incluindo o CCR. No entanto, em pacientes com CCR avançado, a taxa de resposta ao tratamento com 5-FU é de apenas 10%–15%; portanto, ele é aplicado em combinação com outros fármacos citotóxicos, como CPT-11 e oxaliplatina. Além disso, fitoquímicos com baixa citotoxicidade em células normais são adjuvantes valiosos para as terapias convencionais. Neste estudo, descobrimos que, entre os diversos fitoquímicos com efeitos anticancerígenos documentados em nossos estudos anteriores, vários, incluindo a apigenina, aumentaram a capacidade do 5-FU de reduzir a viabilidade das células de CCR (Fig. 8).

Apigenina é uma das flavonas mais amplamente encontradas em plantas. A apigenina é encontrada principalmente em Asteraceae; salsa, camomila, aipo e orégano também são fontes importantes de apigenina. O potencial terapêutico da apigenina tem sido amplamente relatado em diversas doenças, incluindo o câncer. A apigenina inibe a sobrevivência e o crescimento de células de coriocarcinoma e endometriose. Numerosos estudos também mostraram que vários flavonoides vegetais, incluindo a apigenina, podem aumentar a eficácia terapêutica do 5-FU. Por exemplo, a curcumina melhorou a sensibilidade das células de câncer de mama ao 5-FU ao inibir a regulação positiva da expressão de TS após a exposição ao 5-FU. A quercetina, um flavonoide presente em frutas e vegetais, potencializa a fragmentação do DNA induzida pelo 5-FU e os efeitos pró-apoptóticos de maneira dependente de P53 em células de CCR. Outro flavonoide, a luteolina, inibe o crescimento de células de CCR ao regular a expressão de proteínas relacionadas à apoptose, incluindo P53, BAX e BCL-2, quando combinada com 5-FU. Além disso, a S-adenosil-l-metionina, um nucleosídeo contendo enxofre natural, induz parada do ciclo celular e acúmulo de ROS em células de CCR deficientes em P53, reduzindo a viabilidade celular juntamente com o 5-FU. Ademais, a apigenina potencializou o efeito indutor de apoptose do 5-FU em células de câncer de mama. A apigenina também sinergizou com o 5-FU para promover parada em G2/M e aumentar a produção de ROS por células de carcinoma espinocelular de pescoço, levando à apoptose. Da mesma forma, a apigenina potencializou o efeito anticancerígeno do 5-FU contra células de carcinoma hepatocelular in vivo e in vitro ao promover a produção de ROS, ruptura da membrana mitocondrial e apoptose. Vários estudos anteriores sugeriram que a apigenina possui propriedades polifarmacológicas na indução de apoptose em células de CCR. Lee e colegas descobriram que a apigenina induziu autofagia em células HCT116 e que a inibição da autofagia potencializou a apoptose induzida pela apigenina. Além disso, a apigenina induz um fenótipo de senescência em células de CCR, mitigando a formação de tumores. Ademais, um estudo recente revelou que a apigenina inibe o crescimento de células de CCR mediado pelo miRNA-215-5p. Esses estudos sugerem que o mecanismo indutor de apoptose da apigenina revelado neste estudo é parte do amplo mecanismo de regulação fisiológica intracelular da apigenina em células de CCR. No entanto, ainda não é certo se a apigenina pode aumentar o efeito anticancerígeno do 5-FU em células de CCR.

Até onde sabemos, este estudo revelou pela primeira vez que a apigenina pode induzir estresse oxidativo, desregulação de Ca2+ e disfunção mitocondrial, potencializando assim a citotoxicidade do 5-FU. Vários fármacos quimioterápicos induzem a apoptose de células cancerígenas por meio da produção excessiva de EROs, que por sua vez induz disfunção mitocondrial e ativa sinais de apoptose mitocondrial. Portanto, a apigenina pode aumentar a sensibilidade dos tumores ao 5-FU ao ativar a via de apoptose mediada pelas mitocôndrias. Neste estudo, há uma limitação de que não foi realizado um tratamento combinado dependente da dose para calcular um valor, como um índice de combinação, que possa quantificar se a apigenina pode causar um efeito sinérgico com o 5-FU. Um estudo publicado recentemente revelou que a apigenina causou efeitos sinérgicos com o 5-FU na inibição da viabilidade celular. No estudo, a análise do índice de combinação sobre a viabilidade celular após tratamento concomitante com 20, 40 e 80 μM de apigenina e 10, 20 e 50 μM de 5-FU em células HCT116 mostra claramente que o 5-FU e a apigenina têm um forte efeito sinérgico. Além disso, nosso estudo nos leva a especular que o 5-FU e a apigenina podem ter um efeito sinérgico na apoptose de células de CCR, embora tenhamos confirmado os efeitos tanto do 5-FU quanto da apigenina em uma única concentração de 20 μM. Nossos resultados também sugerem que tanto o 5-FU quanto a apigenina compartilham um mecanismo funcional dependente de P53 para induzir apoptose em células de CCR.

Similar ao medicamento anticâncer convencional CPT-11, a apigenina também aumentou a expressão da proteína antitumoral P53. A proteína P53 atua como um iniciador do reparo do DNA em resposta a danos e desencadeia a apoptose de células com danos extensos ao DNA para evitar a propagação de mutações. A P53 mutante está associada a uma sobrevida global mais curta no CCR, e as células cancerosas com P53 mutante são menos sensíveis ao 5-FU. Além disso, a perda da função da P53 em células cancerosas pode reduzir a sensibilidade terapêutica ao 5-FU. Em células escamosas esofágicas, a apigenina induziu parada em G2/M e apoptose mediada por mitocôndrias independente de P53. O presente estudo também sugere que a apigenina pode atuar tanto de maneira dependente quanto independente de P53 em células de CCR. O mecanismo dependente de P53 pela apigenina em células de CCR parece estar intimamente relacionado à apoptose, representado principalmente pelo aumento da expressão de PARP clivado e P21. Por outro lado, especula-se que o mecanismo de ação da apigenina independente de P53 esteja principalmente relacionado ao desequilíbrio redox, representado pela geração de ERO e desequilíbrio de Ca2+. O presente estudo revelou uma clara diferença nos efeitos da apigenina e do 5-FU em células de CCR com P53 do tipo selvagem (HCT116) em comparação com células com P53 mutante (HT29), sugerindo que o efeito indutor de apoptose da apigenina depende da função normal da P53. Portanto, são necessárias mais pesquisas para identificar formas de aumentar a eficiência do tratamento em células de CCR, que são mutadas ou deficientes em P53. Como exemplo de um estudo nesse contexto, o 5-FU e a proteína ribossômica livre encapsulados em nanopartículas poliméricas podem aumentar a apoptose por meio da indução de estresse nucleolar em células cancerosas deficientes em P53. Evidências sugerem que o estresse nucleolar induzido por 5-FU em células cancerosas medeia proteínas ribossômicas para ativar P53 e seu alvo, P21. Também foi descoberto que o 5-FU induz apoptose mediada por mitocôndrias ao alvejar proteínas ribossômicas em células de CCR deficientes em P53, sugerindo que a apoptose independente de P53 pode ser induzida. Em células cancerosas sem P53, a superexpressão de proteínas ribossômicas leva à parada do ciclo celular e à ativação de P21, resultando em apoptose. Portanto, a superexpressão de proteínas ribossômicas é considerada uma abordagem que pode aumentar a citotoxicidade do 5-FU. Além disso, em células cancerosas, as proteínas ribossômicas influenciam a atividade de P21 independentemente de P53 e podem estar envolvidas na resistência a múltiplos medicamentos.

Em nosso estudo, o tratamento isolado com 5-FU ou apigenina, e a combinação de 5-FU e apigenina aumentaram a expressão de P21 apenas em células HCT116, mas não em células HT29, da mesma forma que a expressão de P53. Embora análises adicionais sejam necessárias, pode-se especular que P53 e suas proteínas downstream estão intimamente relacionadas ao mecanismo pelo qual a apigenina induz apoptose em células de CCR. A presença de P53 funcional em células de CCR pode desempenhar um papel decisivo na extensão do efeito indutor de apoptose da apigenina. A clivagem da PARP é um marcador útil de morte celular programada no CCR. Além disso, a razão BAX/BCL-2 é uma medida importante para avaliar a gravidade da apoptose mediada por mitocôndrias após o tratamento com fármacos em células cancerígenas. A expressão de PARP clivada, BAX e BCL-2 regulada pela apigenina em combinação com 5-FU em células de CCR complementa o efeito indutor de apoptose da apigenina em resposta à presença de P53 funcional. Além disso. estudos adicionais precisam verificar se a apigenina pode estar envolvida na regulação de proteínas ribossomais para melhorar a resistência a fármacos em células de CCR. Estudos anteriores sugeriram que a resistência a um fármaco em células cancerígenas pode ser acompanhada por resistência a outros fármacos anticancerígenos. Células de câncer de pulmão resistentes ao 5-FU também demonstraram ser resistentes a outros fármacos anticancerígenos, incluindo 5'-desoxi-5-fluorouridina, oxaliplatina e cisplatina. No presente estudo, células de CCR resistentes ao 5-FU foram resistentes apenas em baixa concentração após o tratamento com CPT-11, mas foram resistentes ao tratamento com oxaliplatina em todas as concentrações analisadas. Esses resultados sugerem que estudos adicionais são necessários para determinar se a apigenina pode estar envolvida na superação da resistência a múltiplos fármacos no CCR.

Nós também encontramos efeitos anticancerígenos modestos da apigenina isolada, consistentes com vários estudos anteriores. Por exemplo, foi relatado que a apigenina inibe a proliferação de células de CRC com um IC50 de 1,8 μM. Turktekin e colaboradores (2011) também relataram que a apigenina aumentou a expressão dos efetores pró-apoptóticos CASP3 e CASP8 e diminuiu a expressão de mTOR e CCND1 em células HT29. Além disso, a apigenina promoveu defeitos induzidos por quimiorrepelente circular em células de CRC, inibindo assim a formação de esferoides e sugerindo eficácia contra a tumorigênese precoce. Além disso, Sen e colaboradores (2019) relataram que a entrega simultânea de apigenina e 5-FU nos mesmos lipossomas inibiu a proliferação e aumentou a taxa de apoptose em um modelo de xenoenxerto de CRC em camundongos. Embora a eficácia terapêutica potencial da apigenina contra células de CRC tenha sido demonstrada em vários modelos pré-clínicos, este é o primeiro estudo a mostrar que a apigenina pode potencializar o efeito anticancerígeno do 5-FU, inclusive contra células com resistência induzida ao 5-FU, pelo menos em parte através da modulação da expressão de P53 e TS.

A TS é uma enzima folato-dependente responsável pela produção de timidilato, um intermediário essencial para a biossíntese de DNA. O metabólito ativo do 5-FU se liga ao sítio ativo do dUMP para formar um complexo TS inativo, impedindo assim a conversão de dUMP em dTMP. Estudos in vitro e in vivo demonstraram que a alta expressão de TS está intimamente relacionada ao desenvolvimento de quimiorresistência ao 5-FU. Além disso, os níveis de expressão gênica e proteica da TS, bem como sua atividade enzimática, são inversamente correlacionados com a sensibilidade ao 5-FU em células de CCR. Devido à sua estrutura química, a apigenina é um inibidor eficaz da TS, e especulamos que a apigenina induz a morte celular e a interrupção do ciclo celular em células de CCR por meio da regulação negativa da atividade da TS e da concomitante regulação positiva da P53. No CCR, a expressão de P53 é regulada negativamente pela TS. Portanto, células que superexpressam TS serão menos sensíveis à parada do ciclo celular por agentes danificadores do DNA. Li e colaboradores (2020) relataram o desenvolvimento de um novo inibidor de TS que pode inibir o crescimento do câncer de pulmão de células não pequenas ao regular positivamente a expressão de P53. Além disso, a inibição da TS facilita o dano ao DNA, induz a despolarização da MMP e, por fim, ativa as vias de sinalização apoptótica. A exposição contínua a agentes quimioterápicos convencionais regula positivamente as vias de sinalização pró-sobrevivência e os genes de resistência a múltiplos fármacos, estabelecendo assim a resistência. Essa resistência pode ser modelada in vitro por exposição prolongada a concentrações crescentes de fármacos quimioterápicos, e tais células se mostraram úteis para a triagem de potenciais adjuvantes que podem reduzir a resistência a fármacos no CCR. Em comparação com linhagens celulares sensíveis ao 5-FU, as células de CCR resistentes expressaram níveis mais elevados de TS, e demonstramos que a apigenina adjuvante pode induzir apoptose mesmo em células de CCR resistentes ao 5-FU (5-FUR) ao regular negativamente a TS independentemente da P53. Em análises de imunotransferência, a banda superior da TS indica a formação de um complexo ternário do fármaco e da TS, e a banda inferior indica TS não modificada. Descobrimos que o tratamento adicional com apigenina suprimiu a expressão de ambas as formas de TS, ligada e não ligada, em células de CCR. Esses resultados sugerem que a apigenina inibe a tradução proteica da TS, em vez da modificação pós-traducional, em células de CCR.

FOXM1 é um fator de transcrição envolvido na progressão e quimiorresistência de numerosos carcinomas. É altamente expresso em células resistentes a medicamentos, enquanto a deficiência de FOXM1 aumenta a sensibilidade das células cancerígenas a agentes genotóxicos. Muitas evidências sugerem que o FOXM1 contribui para a sobrevivência e crescimento do CCR. Além disso, o 5
Apigenina induz apoptose através da degradação proteassomal de HER2/neu em células de câncer de mama superexpressando HER2/neu via via dependente de fosfatidilinositol 3-quinase/Akt
Resposta seletiva de inibição do crescimento, desregulação do ciclo celular e apoptótica da apigenina em células normais versus células de carcinoma prostático humano
Isolamento e estudos da atividade mutagênica no teste de Ames de flavonoides naturalmente presentes em ervas medicinais
Comparando imagens de fármacos e reposicionamento de fármacos com BioGPS e FLAPdock: o caso da timidilato sintase
Diferenças no status de p53 influenciam significativamente a resposta celular e a sobrevivência celular ao cotratamento com 1,25-diidroxivitamina D3-metformina em células de câncer colorretal
Regulação da expressão de p53 pela timidilato sintase
FOXM1 modula a sensibilidade ao 5-fluorouracil no colangiocarcinoma através da timidilato sintase (TYMS): implicações do desacoplamento do eixo FOXM1-TYMS na resistência ao 5-FU
FOXM1 modula a resistência ao 5-FU no câncer colorretal através da regulação da expressão de TYMS
Crisofanol induz apoptose em coriocarcinoma através da regulação de ROS e das vias AKT e ERK1/2
Um protocolo simples de cultura celular em gota pendente para geração de esferoides 3D
Apigenina reduz a sobrevivência de células de coriocarcinoma induzindo apoptose pelas vias PI3K/AKT e ERK1/2 MAPK
Carvacrol induz apoptose mediada por mitocôndrias através da interrupção da homeostase de cálcio em células de coriocarcinoma humano
Crisina atenua a progressão de células de câncer de ovário regulando cascatas de sinalização e disfunção mitocondrial
Coumestrol inibe a proliferação e migração de células de câncer de próstata regulando as cascatas de sinalização celular AKT, ERK1/2 e JNK MAPK
Curcumina suprime a proliferação e migração e induz apoptose em células de coriocarcinoma placentário humano pelas vias de sinalização ERK1/2 e SAPK/JNK MAPK
Delfinidina suprime a proliferação e migração de células de carcinoma de células claras de ovário humano bloqueando as vias de sinalização AKT e ERK1/2 MAPK
A isoflavona O-metilada, formononetina, inibe a proliferação de células de câncer de ovário humano por parada na fase sub G0/G1 do ciclo celular através da inativação de PI3K/AKT e ERK1/2
Naringenina suprime o crescimento de coriocarcinoma placentário humano através das vias P38 e JNK MAPK mediadas por espécies reativas de oxigênio
Osthol interage com um eixo RE-mitocôndria e facilita a supressão tumoral no câncer de ovário
Os efeitos inibitórios da quercetina na progressão de células de coriocarcinoma humano são mediados pelas cascatas de transdução de sinal PI3K/AKT e MAPK
Silibinina estimula apoptose induzindo geração de ROS e estresse de RE em células de coriocarcinoma humano
Estigmasterol causa apoptose em células de câncer de ovário induzindo disfunção do retículo endoplasmático e mitocondrial
Detecção da clivagem da poli(ADP-ribose) polimerase em resposta ao tratamento com inibidores da topoisomerase I: um potencial desfecho substituto para avaliar a eficácia do tratamento
rpL3 promove a apoptose de células de câncer de pulmão com mutação em p53 ao reduzir a expressão de CBS e NFkappaB durante o tratamento com 5-FU
A regulação negativa do fator de transcrição FoxM1 por p53 potencializa a senescência induzida por oxaliplatina no carcinoma hepatocelular
A modulação do estado redox celular está subjacente ao antagonismo entre oxaliplatina e cetuximabe em linhagens celulares de câncer colorretal humano
Irinotecano combinado com fluorouracil comparado com fluorouracil isolado como tratamento de primeira linha para câncer colorretal metastático: um ensaio clínico randomizado multicêntrico
Ensaio randomizado multicêntrico de fase III de oxaliplatina adicionada a fluorouracil-leucovorina cronomodulada como tratamento de primeira linha do câncer colorretal metastático
O potencial terapêutico da apigenina
Flavona vegetal apigenina: um agente anticâncer emergente
Apigenina induz apoptose dependente de ROS e estresse de RE em células de endometriose humana
Avaliação mecanicista dos eventos de sinalização que regulam a quimiossensibilização mediada por curcumina de células de câncer de mama ao 5-fluorouracil
5-Fluorouracil combinado com apigenina potencializa a atividade anticancerígena através da indução de apoptose em células de câncer de mama humano MDA-MB-453
Produtos naturais para terapia direcionada ao câncer: flavonoides cítricos como potentes agentes quimiopreventivos
Quercetina aumenta a apoptose induzida por 5-fluorouracil em células de câncer colorretal MSI através da modulação de p53
Quercetina e luteolina melhoram os efeitos anticancerígenos do 5-fluorouracil em modelo in vitro de adenocarcinoma colorretal humano: uma visão mecanicista
S-Adenosil-L-Metionina supera a resistência a medicamentos mediada por uL3 em células de câncer de cólon com deleção de p53
Apigenina induz apoptose via via mediada pelo receptor do fator de necrose tumoral e Bcl-2 e aumenta a suscetibilidade do carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço ao 5-fluorouracil e cisplatina
5-Fluorouracil combinado com apigenina potencializa a atividade anticâncer através de apoptose mediada pelo potencial de membrana mitocondrial (Delta Psi m) no carcinoma hepatocelular
A apoptose induzida por apigenina é potencializada pela inibição da formação de autofagia em células de câncer de cólon humano HCT116
O estresse oxidativo desencadeado pela flavona natural apigenina resulta em senescência e efeito quimioterápico em células de câncer colorretal humano
Apigenina inibe o crescimento do câncer colorretal através da redução da expressão de E2F1/3 mediada por miRNA-215-5p
Papel crítico do estresse oxidativo e da ativação sustentada de JNK na morte celular apoptótica mediada por aloe-emodina em células de hepatoma humano
Apoptose aguda e tardia induzida pela privação de timidina correlaciona-se com a expressão de p53 e genes regulados por p53 em células de carcinoma de cólon
Alteração de p53 e instabilidade de microssatélites têm valor preditivo para benefício de sobrevida da quimioterapia no carcinoma colorretal estágio III
A disrupção de p53 em células cancerígenas humanas altera as respostas aos agentes terapêuticos
A interação da expressão da timidilato sintase com as vias de sinalização reguladas por p53 em células tumorais
Citotoxicidade de flavonas e flavonóis em uma linhagem celular de carcinoma espinocelular de esôfago humano (KYSE-510) por indução de parada em G2/M e apoptose
Aumento da sensibilidade ao 5-FU pelo gene pró-apoptótico rpL3 em células de câncer de cólon p53 nulo através de nanopartículas poliméricas combinadas
O 5-FU tem como alvo o rpL3 para induzir apoptose mitocondrial via cistationina-beta-sintase em células de câncer de cólon sem p53
O rpL3 humano induz parada em G1/S ou apoptose modulando os níveis de p21 (waf1/cip1) de maneira independente de p53
Papel do uL3 na resistência a múltiplos fármacos em células de câncer de pulmão com p53 mutado
Quimioterapia, quimiorresistência e o cenário em mudança do tratamento para NSCLC
Características antiproliferativas in vitro de flavonoides e diazepam em células de adenocarcinoma colorretal SNU-C4
Avaliação dos efeitos do flavonoide apigenina na expressão gênica da via apoptótica na linhagem celular de câncer de cólon (HT29)
A intravasão de esferoides de células de câncer de cólon SW620 através da barreira endotelial sanguínea é inibida por fármacos clínicos e flavonoides in vitro
Lipossoma carregado com dupla droga contendo apigenina e 5-Fluorouracila para eficácia terapêutica sinérgica no câncer colorretal
O mecanismo catalítico e a estrutura da timidilato sintase
Regulação da timidilato sintase em células de câncer de cólon humano tratadas com 5-fluorouracila e interferon-gama
Fluorouracila e leucovorina em altas doses em pacientes previamente tratados com câncer de mama metastático
Indução da timidilato sintase como um mecanismo de resistência ao 5-fluorouracila
Desenvolvimento de um novo inibidor da timidilato sintase (TS) capaz de regular positivamente a expressão de P53 e inibir a angiogênese em NSCLC
Caracterização de linhagens celulares de câncer colorretal isogênicas p53 selvagem e nulo resistentes a 5-fluorouracila, oxaliplatina e irinotecano
Superexpressão da timidilato sintase medeia a dessensibilização ao 5-fluorouracila de células tumorais
Um teste clínico proposto para monitoramento da terapia com fluoropirimidinas: detecção e estabilidade dos complexos ternários da timidilato sintase
A inibição da timidina fosforilase pode reverter a resistência adquirida ao 5FU em células de câncer gástrico
Os papéis emergentes das proteínas forkhead box (Fox) no câncer
FOXM1 tem como alvo NBS1 para regular a senescência induzida por danos ao DNA e a resistência à epirrubicina
ATM e p53 regulam a expressão de FOXM1 via E2F no tratamento e resistência à epirrubicina em câncer de mama
O fator de transcrição forkhead box M1 contribui para o desenvolvimento e crescimento do câncer colorretal de camundongo

Dados suplementares

Os seguintes são os Dados suplementares deste artigo:
Os dados suplementares deste artigo podem ser encontrados online em https://doi.org/10.1016/j.redox.2021.102144.