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pmid: "40265973"
title: "Alvejando a Senescência com Apigenina Melhora a Eficácia Quimioterápica e Atenua Condições Relacionadas à Idade em Camundongos."
authors: "Zhang H, Xu Q, Jiang Z, Sun R, Wang Q, Liu S, Luan X, Campisi J, Kirkland JL, Zhang W, Sun Y"
journal: "Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany)"
pubdate: "2025 May"
doi: "10.1002/advs.202412950"
source: "PMC Full Text"

Alvejando a Senescência com Apigenina Melhora a Eficácia Quimioterápica e Atenua Condições Relacionadas à Idade em Camundongos.

Autores

Zhang H, Xu Q, Jiang Z, Sun R, Wang Q, Liu S, Luan X, Campisi J, Kirkland JL, Zhang W, Sun Y

Periodico

Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) (2025 May)

Conteudo

Segmentos Senescentes com Apigenina Melhora a Eficácia Quimioterápica e Atenua Condições Relacionadas à Idade em Camundongos
Resumo
A senescência celular é um destino celular desencadeado por estímulos estressantes e apresenta uma característica hipersecretora, o fenótipo secretor associado à senescência (SASP). A carga de células senescentes aumenta com o envelhecimento e contribui para a disfunção orgânica relacionada à idade e múltiplos distúrbios crônicos. Neste estudo, é realizada uma triagem em larga escala de uma biblioteca de produtos naturais em busca de candidatos senoterapêuticos. A apigenina, um flavonoide dietético previamente relatado com atividades antioxidantes e anti-inflamatórias, exibe capacidade de atingir células senescentes como um agente senomórfico. Este composto bloqueia as interações entre ATM/p38MAPK e HSPA8, prevenindo a transição de um fenótipo associado ao estresse agudo (ASAP) para o SASP. Mecanisticamente, a apigenina tem como alvo a peroxirredoxina 6 (PRDX6), uma molécula redox-ativa intracelular, suprimindo a atividade iPLA2 da PRDX6 e interrompendo as reações a jusante subjacentes ao desenvolvimento do SASP. A apigenina reduz a gravidade da malignidade de células cancerígenas promovida por células estromais senescentes em cultura, ao mesmo tempo que restringe a quimiorresistência quando combinada com quimioterapia em regimes anticancerígenos. Em ensaios pré-clínicos, a apigenina melhora a função física de animais com um estado de envelhecimento prematuro, aliviando a fragilidade física e o comprometimento cognitivo. Em conjunto, o estudo demonstra a viabilidade de explorar um composto natural com capacidade senomórfica para alcançar efeitos geroprotetores ao modular o SASP, fornecendo assim uma base para futuras explorações de agentes naturais para aliviar condições relacionadas à idade.
Como um flavonoide derivado de plantas, a apigenina tem como alvo direto a PRDX6 para inibir sua atividade PLA2, bloqueando a ativação da HSPA8 e perturbando suas interações com ATM e p38MAPK em células senescentes. Ao atenuar a expressão de amplo espectro do SASP, a apigenina previne a perda da homeostase tecidual, melhora a função orgânica e alivia múltiplas patologias relacionadas à idade como um agente senomórfico emergente.
Introdução
Dados demográficos recentes demonstram uma população idosa crescente com doenças crônicas relacionadas à idade, representando um enorme ônus social e econômico e um desafio sem precedentes para a assistência médica.[ ] A senescência celular é uma das principais marcas do envelhecimento e é um alvo terapêutico emergente para intervir nos processos de envelhecimento em si e contra múltiplas doenças e distúrbios.[ ] Embora a senescência pareça benéfica em alguns contextos fisiológicos, como desenvolvimento embrionário, reparo tecidual e cicatrização de feridas, evidências crescentes sugerem que a maioria, senão a totalidade, das patologias humanas pode ser favorecida ou causada pelo acúmulo e persistência de células senescentes em tecidos e órgãos.[ ] Estudos pré-clínicos recentes exploraram intensamente o potencial terapêutico de direcionar vias relacionadas à senescência no envelhecimento e em doenças, enquanto mais investigações, particularmente aquelas envolvendo futuros ensaios clínicos, são essenciais para compreender a eficácia e segurança da senoterapia, uma nova modalidade terapêutica que minimiza, ou pelo menos atenua, os efeitos prejudiciais do acúmulo de células senescentes com o envelhecimento.[ ]
Senoterapêuticos, um grupo de agentes farmacológicos que visam especificamente a senescência, geralmente incluem aqueles que atenuam a atividade pró-inflamatória das células senescentes (senomórficos) e aqueles que induzem a lise preferencial das células senescentes (senolíticos).[ ] A eliminação de células senescentes aumenta marcadamente a mobilidade, melhora a condição física, aprimora a função cognitiva e prolonga a vida útil geral em animais envelhecidos ou doentes.[ ] Notavelmente, a administração de senolíticos também confere benefícios adicionais à saúde em pacientes humanos, como evidenciado pelo caso da combinação de dasatinibe e quercetina ('D + Q') em ensaios clínicos para doença renal diabética (DRD) e fibrose pulmonar idiopática (FPI).[ ] Resultados iniciais de um ensaio clínico de vanguarda conduzido em pacientes sintomáticos em estágio inicial com doença de Alzheimer (DA) com o objetivo de avaliar a penetração no sistema nervoso central (SNC) apoiaram ainda mais a segurança, viabilidade e eficácia desses agentes e forneceram insights mecanicistas dos efeitos senolíticos.[ ]

Em contraste com a senólise, atenuar a influência das células senescentes por meio de agentes senomórficos representa outra abordagem eficaz.[ ] Um candidato senomórfico ideal deve ser capaz de atingir as células senescentes bloqueando o desenvolvimento do fenótipo secretor associado à senescência (SASP), em vez de matar as células senescentes ou induzir sua reentrada no ciclo celular, uma vez que as células rejuvenescidas ainda podem carregar uma carga de mutação.[ ]

Fitoquímicos, incluindo alcaloides e polifenóis, demonstraram a capacidade de atingir células senescentes, seja reduzindo sua carga in vivo e/ou modulando seu SASP, aumentando juntos o potencial de rejuvenescimento de órgãos.[ ] Curiosamente, alguns agentes naturais exibem atividades tanto senomórficas quanto senolíticas, dependendo amplamente da dose a ser usada e/ou das condições patológicas contra as quais se intervém.[ ]
O pipeline de desenvolvimento de medicamentos tem sido ineficiente, já que apenas 15,3% dos agentes em ensaios clínicos de fase 1 conseguem avançar para aprovação da FDA nos EUA.[ ] O reaproveitamento de medicamentos previamente aprovados para uso clínico representa uma tática eficiente para contornar as armadilhas do desenvolvimento de fármacos e reduzir os custos totais. Painéis de moléculas pequenas para estudos de reaproveitamento de medicamentos podem ser obtidos e personalizados, oferecendo uma oportunidade de adaptar triagens de reaproveitamento para indicações alternativas. Como um flavonoide naturalmente disponível em frutas e vegetais, a apigenina tem sido relatada por possuir múltiplas atividades biológicas, incluindo propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, antivirais e anticancerígenas.[ ] Ao reduzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) enquanto aumenta os níveis de glutationa e ATP mitocondrial, a apigenina previne efetivamente a distribuição mitocondrial anormal e a apoptose precoce em oócitos, minimizando assim a deterioração da qualidade oocitária durante o envelhecimento.[ ] Ela pode reverter significativamente as tendências de redução da glutationa, ao mesmo tempo que diminui a atividade da malondialdeído e da catalase no cérebro, exibindo potenciais efeitos antidepressivos em modelos animais.[ ] A apigenina pode suprimir o SASP parcialmente ao inibir a sinalização de IL-1α via IRAK1, IRAK4, p38MAPK e NF-κB, resultando na diminuição da agressividade de células de câncer de mama humano.[ ] No entanto, os benefícios potenciais da apigenina em um espectro mais amplo de contextos relacionados à idade, particularmente aqueles que envolvem senescência celular em estágios avançados da vida, e seu valor potencial em antagonizar patologias e disfunções físicas, permanecem pouco explorados. Neste estudo, triamos uma biblioteca de agentes medicinais naturais (NMAs) em busca de potenciais efeitos na modulação da sobrevivência e atividade pró-inflamatória de células primárias humanas induzidas a se tornarem senescentes in vitro. Nossos resultados apoiam a capacidade da apigenina de alvejar células senescentes humanas como um novo agente senomórfico. Além disso, desvendamos seus mecanismos funcionais de ação e valor farmacológico em conter atividades associadas à senescência, exemplificados pelo caso de intervenções contra progressão tumoral e envelhecimento precoce. Este estudo demonstra os benefícios da apigenina, um composto natural, em reduzir a influência patológica de células senescentes, fornecendo assim uma base para seu futuro desenvolvimento e aplicação em condições clínicas, incluindo a medicina geriátrica.
Resultados
Triagem de Medicamentos Revela o Potencial da Apigenina como Agente Senomórfico
Na tentativa de descobrir novos agentes naturais que possam regular efetivamente células senescentes, realizamos uma triagem abrangente de medicamentos com uma biblioteca NMA composta por 66 produtos naturais (Tabela S1, Informações de Suporte), principalmente metabólitos secundários derivados de plantas, micróbios e certos animais. Para este fim, a linhagem celular PSC27, uma linhagem primária de células estromais normais da próstata humana, foi selecionada como modelo celular experimental para estudos extensos. A PSC27 desenvolve um SASP canônico após senescência induzida por estresse inerente e/ou estímulos externos, incluindo replicação exaustiva (senescência replicativa, RS), quimioterapia genotóxica e radiação ionizante (senescência induzida por terapia, TIS).[ ] Expusemos as células a uma dose subletal de bleomicina (BLEO, 50 µg mL−1), com um fenótipo típico de senescência celular sendo observado 8–10 d após o tratamento, evidenciado pela positividade elevada da coloração de β-galactosidase associada à senescência (SA-β-Gal), diminuição da incorporação de BrdU e aumento dos focos de reparo de danos ao DNA (DDR) (Figura S1A–C, Informações de Suporte). Para otimizar nossa abordagem, projetamos um procedimento de triagem para avaliar os efeitos que agentes naturais individuais exercem sobre a viabilidade in vitro de células senescentes e a expressão de seu SASP (Figura 1A).

Triagem in vitro de uma biblioteca NMA para potenciais senoterapêuticos. A) Uma representação esquemática do procedimento para triagem baseada em células humanas de uma biblioteca NMA composta por 66 agentes de origem natural. A triagem foi realizada primeiro para todos os compostos naturais para senomórficos, com a eficácia dos candidatos potenciais sendo posteriormente validada em múltiplas linhagens de células estromais humanas, incluindo PSC27, WI38 e IMR90.[

] B) Resultados experimentais da triagem de senolíticos após tratamentos farmacológicos in vitro. Os compostos naturais foram testados por incubação por 3 dias a uma concentração de 3 µg/mL/agente (ABT-263 a 1,25 µM) com 5,0x103 células. Cada acerto indicado por um ponto azul é mostrado com base no efeito de matar seletivamente células SEN, mas não CTRL, e representa a média de 3 réplicas biológicas. A região retangular de borda vermelha mostra os candidatos a senolíticos. Observe que apenas ABT-263 e procianidina C1 (PCC1), os controles positivos, caíram nesta região específica. C) Avaliação da eficácia de compostos naturais como senolíticos em células SEN e CTRL correspondentes. (D-E) Avaliação da eficácia de compostos naturais (D, grupo A, E, grupo B) através da análise da expressão de um fator solúvel canônico do SASP, CXCL8. Para todos os conjuntos de dados, as amostras foram examinadas após tratamento com agentes individuais em cultura por 3 dias. NMA, agente medicinal natural. CTRL, controle. SEN, senescente. TIS, senescência induzida por terapia. Os dados em C, D e E são apresentados como média ± DP e representativos de 3 réplicas biológicas independentes. Os valores de P foram calculados por testes t de Student. P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.
Indução de apoptose em células senescentes representa uma característica central e a capacidade mais valiosa dos senolíticos, conforme exemplificado por estudos envolvendo compostos senolíticos como ABT‐263 (navitoclax), ABT‐737 e procianidina C1 (PCC1).[ ] Alternativamente, uma grande vantagem dos senomórficos, por exemplo, rutina e resveratrol,[ ] é a capacidade de regular negativamente seletivamente a expressão do SASP. Para determinar os potenciais relevantes antienvelhecimento nesses componentes do NMA, analisamos o efeito desses agentes naturais em células PSC27 senescentes, primeiro confirmando sua viabilidade experimental como modelo baseado em células para fins de triagem de compostos geroprotetores. Resultados preliminares indicaram que alguns agentes ou matavam células senescentes (enquanto preservavam suas contrapartes proliferativas), ou suprimiam a expressão de CXCL8, um fator SASP canônico, validando ainda mais o potencial e a adequação da PSC27 para investigações estendidas (Figura 1B–E, Figura S1D,E, Informações de Suporte). Apesar de uma triagem minuciosa da biblioteca NMA, não conseguimos descobrir novos agentes senolíticos, que deveriam funcionalmente se assemelhar aos controles positivos ABT‐263 e PCC1 (Figura 1B,C; Figura S1D,E, Informações de Suporte). Os resultados também implicaram a raridade de agentes senolíticos naturais e o desafio em expandir o reservatório atual de agentes senoterapêuticos, particularmente aqueles com potencial senolítico. No entanto, notamos que vários compostos naturais geraram um efeito senomórfico significativo, o que merece estudos aprofundados (Figura 1D,E).

Entre os agentes medicinais, rutina, resveratrol e apigenina exibiram forte capacidade senomórfica (Figura 1D,E). O resveratrol é um produto natural com atividade inibidora do SASP e tem como alvo a via de sinalização PI3K/Akt.[ ] Como outra molécula fitoquímica recentemente descoberta com eficácia senomórfica, a rutina atenua o fenótipo associado ao estresse agudo (ASAP) e afeta o desenvolvimento do SASP posteriormente, principalmente através da interrupção das interações entre ATM e HIF‐1α, bem como entre ATM e TRAF6.[ ] Neste estudo, optamos por focar especificamente na apigenina, um flavonoide natural derivado de plantas, que pode regular negativamente a expressão de fatores SASP típicos após senescência induzida por bleomicina em fibroblastos BJ, inibindo a atividade de NF‐κB p65 através do direcionamento da sinalização IRAK1/IκBα e da expressão de IκBζ, com atividade in vivo de supressão do SASP identificada no rim de ratos idosos.[ ] A apigenina também pode restringir o SASP pelo bloqueio da sinalização de IL‐1α via IRAK1, p38MAPK e NF‐κB, aliviando assim os efeitos pró-tumorigênicos do SASP em tumores mamários.[ ] No entanto, apesar dessas atividades intracelulares, que são relativamente a jusante na rede de sinalização do SASP, uma influência mais ampla da apigenina na expressão em todo o transcriptoma de células senescentes, especialmente os alvos mais a montante ou mesmo diretos após a exposição dessas células à apigenina, permanece basicamente desconhecida.
A apigenina atenua proeminentemente o SASP, mas não a senescência celular

Dado que a apigenina inibe a expressão de CXCL8, um fator marcante do SASP, perguntamos ainda se ela regula negativamente a maioria dos fatores do SASP, ou até mesmo neutraliza a senescência celular. Portanto, realizamos ensaios de coloração SA‑β‑Gal e incorporação de BrdU in vitro para determinar os efeitos antissenescência da apigenina. Os dados indicaram que os perfis de coloração SA‑β‑Gal e a inatividade mitótica permaneceram amplamente inalterados, tanto em células proliferativas quanto em suas contrapartes senescentes (Figura 2A,B).

Caracterização do potencial senomórfico da apigenina. A) Exame de senescência pela coloração SA‑β‑Gal de células PSC27. Esquerda, imagens representativas. Barra de escala, 20 µm. Direita, estatísticas. B) Avaliação da síntese de DNA pela incorporação de BrdU. Esquerda, imagens representativas. Barras de escala, 5 µm. Direita, estatísticas. C) Análise quantitativa da expressão de fatores canônicos do SASP no nível transcricional após senescência induzida por BLEO e tratamento com apigenina em concentrações crescentes. D) Mapa de calor de agrupamento hierárquico representando os principais genes humanos (67) que foram significativamente regulados positivamente em células estromais senescentes, mas regulados negativamente pelo tratamento com apigenina (10 µM). Estrelas vermelhas, fatores representativos do SASP. E) Análise por immunoblot de fatores do SASP em níveis proteicos de células estromais expostas a BLEO e/ou apigenina. GAPDH, controle de carregamento. F) Perfil GSEA dos escores de enriquecimento de fatores solúveis em todo o espectro do SASP. G) Perfil GSEA dos escores de enriquecimento de fatores relacionados à via NF‑κB. H) Gráfico de barras mostrando a função molecular GO dos genes diferencialmente expressos (67) representados em (d). I) Análise de enriquecimento da via KEGG dos genes diferencialmente expressos (67) representados em (D). Salvo indicação contrária, os dados em A, B e C são apresentados como média ± DP e são representativos de 3 réplicas biológicas independentes, com valores de P calculados pelo teste t de Student. P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Um subconjunto de fatores marcantes do SASP, incluindo IL6, CXCL8, IL1α/1β, MMP1/3, GM‑CSF, TIMP1 e WNT16B, apresentou um declínio dependente da dose após a exposição de células senescentes à apigenina, com uma concentração de 10 µM parecendo mais eficaz (Figura 2C). Além disso, dados transcriptômicos de RNA‑seq mostraram que a expressão dos fatores canônicos do SASP estava marcadamente regulada positivamente após a senescência celular, mas significativamente regulada negativamente após o tratamento com apigenina (Figura 2D). Ensaios de immunoblot indicaram que a apigenina aboliu a expressão do SASP em células senescentes, evidenciada pela expressão diminuída de IL1α, IL1β, IL6, CXCL8 e SAA2 (Figura 2E). Dado o efeito impressionante da apigenina em conter a expressão do SASP, realizamos análise GSEA para assinaturas de SASP e NF‑κB, sendo que esta última desempenha um papel significativo na ativação do ASAP e na manutenção do SASP.[ ] Nossos resultados sugerem que ambas as assinaturas moleculares foram aparentemente suprimidas após o tratamento com apigenina (Figura 2F,G).
Análise de enriquecimento de ontologia gênica (GO) dos genes regulados negativamente pela apigenina indicou que a atividade de quimiocinas, atividade de 16-alfa-hidroxilase de estrogênio, ligação a RNA de fita dupla e atividades de ligação ao receptor de quimiocina CCR/CXCR estavam entre as funções moleculares (MF) mais significativamente suprimidas (Figura 2H). Em termos de processos biológicos (BP), a via de sinalização do interferon tipo I, resposta de defesa a vírus, resposta a vírus e resposta inflamatória foram as mais dramaticamente afetadas (Figura S2A, Informações de Suporte). Os componentes celulares (CC) representativos mais associados aos genes regulados negativamente foram aqueles residentes na região e espaço extracelular, embora algumas proteínas fossem transportadas para a membrana plasmática, lúmen de grânulos densos de plaquetas, bem como complexo proteína quinase dependente de cálcio e calmodulina (Figura S2B, Informações de Suporte). A análise da via KEGG sugeriu que a interação receptor-citocina, interação de proteína viral com receptor de citocina, sinalização de TNF e vias de sinalização de NF-κB foram mais significativamente inibidas após o tratamento de células senescentes com apigenina (Figura 2I). Em conjunto, todos esses dados confirmam a capacidade da apigenina de suprimir a expressão de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, um subconjunto de fatores centrais de SASP, a partir do nível transcriptômico.
Como a grande maioria dos componentes do SASP são fatores solúveis secretados no espaço extracelular, coletamos o meio condicionado (CM) de células estromais humanas e os analisamos por espectrometria de massas (MS). Os dados resultantes sugerem que, entre os fatores SASP regulados positivamente em células senescentes, um grande número exibiu um padrão de mudança reversa, ou seja, regulação negativa, após o tratamento com apigenina (Figura S2C,D, Informações de Suporte). Alguns componentes típicos do SASP, como IL6, CXCL1/3/8, CSF1, CCL2, MMP1/2/3, IGFBP7, GDF15, HGF, AREG e EREG, que são frequentemente relatados pela literatura como sendo secretados por células estromais senescentes humanas,[ ] apareceram na lista principal com significância estatística. Portanto, como agente senomórfico, a apigenina pode restringir a expressão de um grande subconjunto de fatores SASP, embora não o espectro completo do SASP, implicando a presença de outra(s) via(s) de transdução de sinal envolvida(s) na mediação de sinais que sustentam o desenvolvimento do SASP.
Para aprofundar, avaliamos ainda o efeito da apigenina em células senescentes induzidas por outros meios, incluindo estresse inerente ou estimulação ambiental, conforme ilustrado pela senescência replicativa (SR) e radiação ionizante (RI), respectivamente. Como esperado, a apigenina tem o potencial de diminuir a expressão da maioria dos fatores canônicos do SASP, independentemente dos tipos de modalidade indutora de senescência (Figura S2E,F, Informações de Suporte). Adicionalmente, realizamos experimentos adicionais com WI38 e IMR90, duas linhagens típicas de fibroblastos derivadas de tecidos pulmonares embrionários humanos. Os resultados se assemelharam amplamente aos da PSC27, uma linhagem estromal derivada de próstata humana, sugerindo que a supressão do SASP exercida pela apigenina é essencialmente independente do tipo de órgão (Figura S2G,H, Informações de Suporte). Em conjunto, nossos estudos demonstraram uma capacidade saliente da apigenina em restringir a expressão do SASP, que não depende nem do tipo de senescência nem do tipo de órgão.

A Apigenina Amortece a Expressão do SASP ao Interferir nas Interações de ATM e p38MAPK com HSPA8

Dado o papel crítico da apigenina na supressão do SASP, investigamos em seguida seu mecanismo funcional no direcionamento de células senescentes. Para examinar o efeito potencial da apigenina na sinalização DDR, que geralmente é a força motriz de um SASP persistente, primeiro investigamos a extensão da perturbação de vias moleculares em células senescentes após exposição à apigenina. A indução de senescência por BLEO causou ativação notável de ATM, um modulador central da cascata de sinalização DDR, conforme evidenciado por ensaios de imunotransferência (Figura 3A). Como resposta a desafios externos ou estímulos endógenos, células em proliferação primeiro desenvolvem um fenótipo associado ao estresse agudo (ASAP), caracterizado por fosforilação e translocação núcleo-citoplasma de ATM, auto-ubiquitinação de TRAF6 e ativação de TAK1, uma série de reações intracelulares rápidas ao dano antes que os marcadores de senescência se tornem evidentes[ ] (Figura 3A). Após o tratamento genotóxico das células, TAK1, uma quinase citoplasmática chave que modula o SASP, foi rapidamente fosforilada, uma alteração que permite seu envolvimento funcional na transição do ASAP para o SASP por meio de mecanismos duplos de feedforward.[ ] Observamos ainda a fosforilação/ativação de p38MAPK, uma molécula a jusante de TAK1, seguida pelo engajamento de PI3K/Akt/mTOR, uma via de sinalização que suporta a formação de um fenótipo secretor crônico, o SASP. No entanto, na presença de apigenina, esses eventos moleculares sequenciais foram geralmente abolidos, embora a fosforilação de ATM e TAK1 tenha permanecido amplamente inalterada. De acordo com esse padrão molecular, supomos que o(s) alvo(s) potencial(is) da apigenina pode(m) estar mecanicamente localizado(s) a jusante de ATM e/ou TAK1, mas a montante de p38MAPK, PI3K/Akt/mTOR e outros fatores que podem estar implicados na transição do ASAP para o SASP durante a senescência celular.
A apigenina restringe a expressão de SASP ao interferir na transdução do sinal de DDR em células senescentes. A) Análise por immunoblot de moléculas relacionadas à sinalização de DDR envolvidas na regulação da expressão de SASP em células de mamíferos. Após 7 dias de incubação com BLEO e/ou apigenina, as células PSC27 foram lisadas para exame. GAPDH, controle de carregamento. B) Diagrama de Venn representando 19 moléculas que interagem mutuamente, compartilhadas por ATM e p38MAPK, descobertas por mineração bioinformática. C) Ensaio de imunoprecipitação (IP) combinado com análise por immunoblot para detectar interações proteína-proteína. Células PSC27 foram tratadas com BLEO (50 µg/mL) por 12 h para induzir senescência, na ausência ou presença de apigenina em cultura por 7 dias. As células foram então lisadas para IP com IgG ou anti-p-ATM, com HSPA8, NPM1, p38MAPK e p-ATM examinados nos imunoprecipitados (IPs) e/ou inputs. GAPDH, controle de carregamento de proteína intracelular. D) IP combinado com immunoblot para sondar interações proteína-proteína. A preparação da amostra foi realizada conforme descrito em (C). Os lisados foram imunoprecipitados com IgG ou anti-p38MAPK, com HSPA8, NPM1, p-ATM e p-p38 examinados nos IPs e/ou inputs. E) Avaliação quantitativa da expressão de fatores canônicos de SASP em nível transcricional após senescência induzida por BLEO em concentrações crescentes de VER155008 (VER), um inibidor de HSPA8. F) Análise por immunoblot da translocação de ATM, p50/105, p65 e IKBα entre núcleo e citoplasma após tratamento com apigenina. Lamin A/C e GAPDH, controles de carregamento para núcleo e citoplasma, respectivamente. G) Análise por immunoblot da translocação de ATM, p50/105, p65 e IKBα entre núcleo e citoplasma. A preparação das amostras foi semelhante à descrita em (f), exceto que VER155008 foi aplicado em vez de apigenina. Lamin A/C e GAPDH, controles de carregamento para núcleos e citoplasma, respectivamente. H) Avaliação por immunoblot de moléculas relacionadas à sinalização de DDR envolvidas na regulação da expressão de SASP. Após 7 dias de incubação com BLEO com ou sem VER, as células PSC27 foram lisadas para análise. GAPDH, controle de carregamento. I) Medição do nível de ROS via 2′-7′-diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA), uma sonda sensível a ROS, em células proliferativas ou senescentes na presença ou ausência de apigenina em cultura 1 dia depois. Imagens representativas são mostradas. Barra de escala, 20 µm. J) Estatísticas comparativas dos sinais de ROS imageados pela sonda fluorescente DCFH-DA. DDR, resposta ao dano no DNA. BLEO, bleomicina. ROS, espécies reativas de oxigênio. Salvo indicação em contrário, os dados em E e J são apresentados como média ± DP e representativos de 3 réplicas biológicas independentes, com valores de P calculados por testes t de Student. P > 0,05, P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.
Para desvendar o mecanismo que regula a função da apigenina na segmentação de células senescentes, realizamos um perfilamento em escala proteômica de interatores com capacidade de interagir tanto com ATM quanto com p38MAPK, duas moléculas conhecidas por estarem envolvidas na transdução de sinais que permitem o desenvolvimento do SASP, mas que carecem de correlação direta em células senescentes. A bioinformática sugeriu 198 moléculas que interagem exclusivamente com ATM e 234 que interagem exclusivamente com p38MAPK em células humanas, com 19 desses interatores compartilhados por ambas ATM e p38MAPK (Figura 3B, Figura S3A,B, Informações de Suporte). Entre esses candidatos a interatores, notamos que HSPA8 e NPM1, moléculas intracelulares envolvidas em respostas ao estresse celular, particularmente senescência,[ ] e que possuem potencial para mediar a interação entre ATM e p38MAPK, merecendo, portanto, investigação adicional. A co-imunoprecipitação (Co-IP) mediada por p-ATM revelou que tanto HSPA8 quanto NPM1 podem interagir diretamente com p-ATM e p38MAPK. No entanto, a interação de HSPA8, mas não de NPM1, com p-ATM ou p38MAPK foi atenuada de forma notável pela apigenina, indicando que a apigenina dificulta especificamente a interação de HSPA8, em vez de outras moléculas como NPM1, com p-ATM e p38MAPK (Figura 3C,D).
HSPA8, um importante membro da família das proteínas de choque térmico 70, está funcionalmente envolvido na autofagia mediada por chaperonas, uma das principais vias do sistema proteolítico lisossomo-autofagia, enquanto a degradação deficiente de proteínas compromete a proteostase celular e ativa vias de sinalização que culminam na indução da senescência celular, uma característica importante do envelhecimento.[ ] HSPA8 ativa a sinalização de NF-κB desestabilizando a proteína IκBβ na ausência de lipopolissacarídeo (LPS) ou facilitando sua translocação nuclear na presença de LPS, uma atividade que pode ser sinergizada pela proteína 5 contendo domínio de tiorredoxina (TXNDC5) para exacerbar o fenótipo inflamatório dos fibroblastos sinoviais na artrite reumatoide via sinalização de NF-κB.[ ] HSPA8 também é essencial para a fosforilação de Akt induzida por VEGF, enquanto a regulação negativa de HSPA8 abole a fosforilação de Akt.[ ] Portanto, especulamos que a HSPA8 desempenha um papel fundamental na orquestração do envolvimento funcional de vários fatores responsáveis pela manutenção da senescência e pelo desenvolvimento de SASP. Para testar essa hipótese, avaliamos a expressão de uma série de fatores SASP ou marcadores associados à senescência. Nosso estudo indicou que, na presença de VER155008 (doravante VER), um inibidor seletivo de HSPA8, a expressão de fatores SASP canônicos foi atenuada de maneira dependente da concentração (Figura 3E). Dados adicionais indicaram que a senescência celular foi acompanhada pela degradação de IκBα no citoplasma, bem como pela translocação do citoplasma para o núcleo das subunidades de NF-κB (p65, p50), uma tendência que foi geralmente revertida após o tratamento com apigenina ou VER, sugerindo um mecanismo compartilhado por esses agentes na redução da ativação do complexo NF-κB (Figura 3F,G). Curiosamente, o tratamento com VER também suprimiu a ocorrência de uma cascata de eventos moleculares, incluindo a ativação de p38MAPK e o engajamento de PI3K/Akt/mTOR após estresse genotóxico (Figura 3H). Observamos ainda interações marcadamente reduzidas entre ATM/p38MAPK e HSPA8 após a inibição da atividade de HSPA8 com o inibidor de molécula pequena VER, conforme evidenciado pelos dados de ensaios de IP e imunoblot (Figura S3C,D, Informações de Suporte).
Assim, interferir na comunicação cruzada entre ATM e seus alvos críticos, como HSPA8 e p38MAPK, exemplificado pelo agente natural apigenina, é capaz de atenuar a expressão de SASP enquanto mantém a senescência celular ou a parada do crescimento, uma característica distinta que está basicamente alinhada com os efeitos dos senomórficos. Como a maioria dos polifenóis flavonoides naturais possui atividades antioxidantes, incluindo a redução da superprodução de ROS e o alívio do estresse oxidativo, perguntamos a seguir se a apigenina tem um efeito semelhante em células senescentes. Quando expostas a um agente genotóxico (BLEO) por 8 a 10 dias, as células estromais apresentaram níveis de ROS acentuadamente elevados em comparação com suas contrapartes proliferativas. No entanto, na presença de apigenina (ou VER como controle experimental), a produção de ROS foi significativamente inibida, em grande parte consistente com a capacidade de neutralização de radicais oxidativos da apigenina, embora o nível de ROS tenha permanecido praticamente inalterado em células normais (Figura 3I,J).

Apigenina tem como alvo direto a PRDX6 para atenuar sua atividade iPLA2 e a expressão de SASP em células senescentes

Embora nossos dados tenham sugerido que a apigenina inibe a expressão de SASP ao interromper as interações de HSPA8 com outros fatores críticos que medeiam a transdução do sinal de SASP, resultando em um bloqueio da transição de ASAP para SASP (Figura 3C–E), o(s) potencial(is) alvo(s) direto(s) da apigenina em células senescentes que causam um efeito senomórfico permanece(m) obscuro(s). Portanto, aplicamos duas abordagens baseadas em afinidade, apigenina marcada com biotina (doravante Bio‑APIG) e estabilidade de alvo responsiva à afinidade de fármacos (DARTS),[ ] para revelar o(s) potencial(is) alvo(s) direto(s) da apigenina (Figuras 4A, S4A–C, Informações de Suporte). Na rota baseada em sonda, após incubação com lisados de células senescentes, a Bio‑APIG se ligou a proteínas antes que as esferas de estreptavidina‑agarose fossem aplicadas para puxar para baixo o complexo Bio‑APIG‑proteína para análise por EM. Observamos 61 proteínas alvo potenciais, que foram identificadas com enriquecimento distinto pela Bio‑APIG, mas inibidas competitivamente pela apigenina não marcada (peptídeos únicos ≥2, intensidade LFQ ≥1,5 para enriquecimento ou ≤0,67 para inibição competitiva), também evidenciado pela coloração de prata de proteínas (Figura 4B, Figura S4D, Informações de Suporte). Para descobrir mais proteínas alvo genuínas, seguimos outra abordagem, nomeadamente DARTS, para corroborar as descobertas por identificação de alvos. Os dados indicaram que 16 proteínas foram marcadamente reguladas positivamente após incubação com apigenina, em relação ao veículo (peptídeos únicos ≥2, intensidade LFQ ≥1,2) (Figura 4C). Entre as proteínas (PRDX6, SEPT11 e YWHAE) identificadas por ambas as abordagens, especulamos que a apigenina pode se ligar diretamente à PRDX6, uma hipótese que precisa ser comprovada experimentalmente (Figura 4D).
A apigenina se liga à PRDX6, inibe sua atividade iPLA2 e atenua o desenvolvimento do SASP. A) Uma ilustração esquemática do procedimento técnico de MS baseada em afinidade que aplicou uma sonda Bio‐APIG para enriquecimento de alvo, seguido de pulldown com estreptavidina‐agarose. Esta abordagem permite descobrir alvo(s) da apigenina com lisados proteicos de células senescentes. B) Mapa de calor exibindo as principais proteínas humanas (47) enriquecidas pela sonda Bio‐APIG, mas inibidas competitivamente por um excesso de 10 ou 20 vezes de apigenina não marcada. Estrelas vermelhas denotam proteínas identificadas alternativamente pela abordagem DARTS, que foi tecnicamente combinada com ensaio de MS. C) Gráfico de vulcão exibindo as proteínas significativa e diferencialmente reguladas (vermelho, reguladas positivamente; azul, reguladas negativamente) em lisados de células senescentes por DARTS na presença ou ausência de apigenina. Proteínas denotadas também foram identificadas pela sonda Bio‐APIG. D) Diagrama de Venn representando as 3 proteínas alvo potenciais identificadas por ambas as estratégias de sonda Bio‐APIG e DARTS. E) Avaliação do ensaio CETSA da estabilização térmica da PRDX6 após incubação com apigenina em uma faixa gradiente de temperaturas de 30 a 50 °C em lisados proteicos de células PSC27. F) Estatísticas comparativas da estabilização térmica da PRDX6 conforme representado em (E). G) Avaliação da estabilidade térmica da PRDX6 em uma faixa de concentrações de 0 a 400 µM de apigenina quando examinada a uma temperatura fixa de 50 °C. H) Estatísticas comparativas da estabilização da PRDX6 em uma faixa de concentrações de apigenina a 50 °C conforme representado em (g). I) Avaliação da estabilidade proteolítica (pronase) da PRDX6 em uma faixa de concentrações de 0 a 400 µM de apigenina quando a razão enzima:proteína foi fixada em 1:300. J) Estatísticas comparativas da estabilização enzimática da PRDX6 em uma faixa gradiente de concentrações de apigenina conforme representado em (I). K) Demonstração de que a PRDX6 se liga diretamente à apigenina. No ensaio SPR, a PRDX6 foi tratada com apigenina em uma faixa de concentrações de 0,78 a 12,5 µM. O valor de KD é mostrado ao lado dos traços. L) Modelagem molecular in silico da ligação potencial da apigenina à Cys91 e Glu210 da PRDX6. A estrutura relatada por microscopia de difração de raios X (ID do PDB, 5B6M) foi aplicada para realizar a docagem molecular, com Cys91 e Glu210 destacados na estrutura. M,N) A interação entre a apigenina e a PRDX6 ou seus mutantes funcionalmente disruptivos (m) superexpressos em células com tag GFP foi avaliada pela análise de termoforese em microescala celular (MST).
Alternativamente, a interação entre apigenina e um mutante de sítio duplo (Cys91/Ala‐Glu210/Ala) da PRDX6 foi analisada (n). O) Avaliação da atividade de iPLA2 após tratamento de lisados celulares contendo PRDX6 superexpressa com apigenina e medição da fluorescência em comprimento de onda de 515 nm. P) Ensaio quantitativo da expressão de fatores solúveis de SASP em nível transcricional após tratamento de células senescentes com concentrações crescentes de MJ33 (1–10 µM), um inibidor seletivo de PRDX6‐iPLA2. MS, espectrometria de massas. Bio‐APIG, biotina‐apigenina. DARTS, estabilidade alvo responsiva à afinidade de fármacos. SPR, ressonância plasmônica de superfície. iPLA2, fosfolipase A2 da PRDX6. Os dados em (F, H, J, O e P) são apresentados como média ± DP e representativos de 3 réplicas biológicas independentes, com valores de P calculados pelo teste t de Student. P > 0,05, P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.
Em seguida, investigamos as propriedades biofísicas que fundamentam a interação entre PRDX6 e apigenina. Como abordagem para analisar a estabilização térmica de proteínas após a ligação do ligante, o ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA) foi realizado em uma faixa de temperatura de 30 a 50 °C. Observamos um aumento da estabilidade da PRDX6 após incubação com apigenina em comparação com o veículo (Figura 4E,F). Examinamos ainda o efeito de ligação realizando CETSA em concentrações variando de 0 a 400 µM de apigenina, tanto na temperatura fixa de 50 °C quanto na proporção de enzima (pronase) para proteína fixada em 1:300. Como esperado, houve uma notável elevação da estabilidade da PRDX6, refletida por ambas as abordagens de maneira dependente da concentração (Figura 4G–J). Resultados do ensaio de ressonância plasmônica de superfície (SPR), uma abordagem de biossensor óptico direto sem marcação, mostraram uma ligação distinta da PRDX6 humana recombinante (rh) na presença de apigenina, resultando em uma constante de dissociação (KD) predita de 0,237 µM (Figura 4K). Para identificar o(s) resíduo(s) da PRDX6 responsável(is) pela ligação pela apigenina, realizamos modelagem molecular in silico, com os resultados ilustrando que a apigenina estabelece conexões diretas de ligação de hidrogênio com a PRDX6 através da Cys91 e Glu210 da PRDX6 (Figura 4L, Figura S4E, Informações de Apoio). Em seguida, realizamos termoforese em microescala (MST) com proteína PRDX6 exógena ligada a uma marca GFP. Similarmente ao ensaio de SPR, a análise de MST exibiu interação evidente entre PRDX6 e apigenina com um Kd estimado de 916 nM (Figura 4M,N). Como especulamos que Cys91 e Glu210 da PRDX6 podem ser críticas para a ligação entre alvo e ligante, geramos construções que permitem expressar mutantes nesses dois sítios individualmente ou simultaneamente. Em contraste com a PRDX6 do tipo selvagem, a mutação de Cys91 ou Glu210 para alanina aumentou seus Kds em aproximadamente dez vezes. No entanto, quando ambos os sítios foram mutados, a ligação entre PRDX6 e apigenina foi basicamente abolida (Figura 4M,N, Figura S4F, Informações de Apoio). Em conjunto, nossos dados indicam que a ligação de PRDX6 e apigenina pode gerar um efeito significativo durante a senescência celular.
Estudos anteriores relataram que a PRDX6 possui atividades enzimáticas de dupla função únicas dentro da família das peroxidases, com sua atividade de fosfolipase A2 (PLA2) fazendo com que as células gerem ácido araquidônico (AA), uma molécula que frequentemente induz inflamação.[ ] Como peroxidase, a PRDX6 facilita a conversão de H2O2 em água na presença de NADPH para minimizar danos oxidativos. Assim, projetamos um constructo para superexpressar PRDX6 e avaliamos a capacidade da apigenina de remover H2O2, especialmente quando comparada com NAC, um inibidor seletivo de peroxidase (Figura S4G,H, Informações de Apoio). Em contraste com NAC, que reduziu notavelmente a atividade de peroxidase de purgar H2O2 (IC50 = 15,5 µM), a eficácia de eliminação de H2O2 pela apigenina foi menos comprometida (IC50 = 49,5 µM) (Figura S4I, Informações de Apoio). As consequências diferenciais geradas por PRDX6 e NAC podem ser atribuíveis aos múltiplos efeitos biológicos causados por NAC, um antioxidante competente que também eleva o nível intracelular de Cys e permite a produção de enxofre sulfano, estimulando a bioenergética mitocondrial, ações que estão além de sua conhecida função de atenuar o estresse oxidativo e proteger as células contra danos oxidativos, principalmente como um eliminador de ROS.[ ]

No entanto, ao medir a atividade de PLA2, notamos uma redução distinta, sugerindo que a capacidade da apigenina de atenuar a expressão de fatores pró-inflamatórios pode ser atribuída à sua capacidade de bloquear a atividade de PLA2 da PRDX6 (Figura 4O). Além disso, aplicamos MJ33, um inibidor seletivo de PLA2 da PRDX6, para examinar sua eficácia em restringir a expressão de SASP, que está correlacionada com a atividade inflamatória de células senescentes. Descobrimos que o tratamento com MJ33 reduziu a expressão dos fatores SASP canônicos de maneira dependente da concentração (Figura 4P). A análise proteômica mostrou que, ao contrário do veículo, o tratamento com MJ33 inibiu significativamente a via de sinalização PI3K/Akt, corroborando ainda mais seu efeito senomórfico (Figura S4J, Informações de Apoio). Analisamos os níveis proteicos da família PRDX humana, que engloba seis homólogos (PRDX1‐6), em células senescentes na ausência ou presença de apigenina. Observamos nem aumento nem diminuição na expressão desses homólogos (Figura S4K, Informações de Apoio). Para dissecar melhor o mecanismo subjacente à regulação negativa de SASP pela supressão induzida por apigenina da atividade de PLA2 da PRDX6, realizamos co-imunoprecipitação (co-IP) mediada por PRDX6 seguida de análise por EM. Os resultados sugeriram que HSPA8 de fato interage com PRDX6, indicando que a interferência funcional com qualquer uma dessas moléculas pode explicar o efeito senomórfico da apigenina que observamos neste estudo (Figura S4L,M, Informações de Apoio). No geral, os dados sustentam a possibilidade de que a apigenina atenua a expressão de SASP através da ligação direta à PRDX6 e do bloqueio de sua atividade de PLA2.
Dado que PRDX6 é um alvo direto da apigenina, questionamos se PRDX6 desempenha um papel importante na mediação do desenvolvimento do SASP. Para abordar isso, optamos por depletar PRDX6 de células estromais humanas com pequenos RNAs em grampo (shRNAs) (Figura S5A,B, Informações de Suporte). Após o tratamento das células com BLEO, observamos uma regulação positiva notavelmente enfraquecida dos fatores SASP (Figura S5C, Informações de Suporte). Vale notar que a adição de apigenina à cultura celular não reduziu ainda mais o nível de expressão do SASP, como evidenciado pelo caso de fatores-chave do SASP, como IL6, CXCL8, IL1α e ILβ, sugerindo que o efeito inibitório causado pela apigenina no SASP foi principalmente através do direcionamento de PRDX6.

Apigenina Priva Células Cancerígenas da Malignidade Adquirida de Células Estromais Senescentes

Muitos fatores SASP solúveis secretados por células estromais senescentes favorecem alterações malignas em células cancerígenas, atuando como uma força significativa que alimenta a progressão tumoral, conforme demonstrado por estudos anteriores.[ ] Aqui, examinamos a capacidade do CM contendo fatores SASP em promover a proliferação de células cancerígenas, uma característica básica do estroma ativado no microambiente tumoral (TME). A linhagem celular estromal PSC27 foi induzida a se tornar senescente por BLEO, um agente quimioterápico frequentemente usado no tratamento do câncer, na presença ou ausência de apigenina, com CM coletado 8–10 dias depois e usado para incubar linhagens celulares de câncer de próstata (PCa) (PC3, DU145, M12, LNCaP) (Figura  5A). Não surpreendentemente, o potencial proliferativo foi substancialmente aumentado em todas as linhagens de PCa após o tratamento com CM de células estromais senescentes, uma tendência consistente com o aumento da migração e invasão dessas células (Figura 5A–C). Para excluir possíveis efeitos da proliferação na migração celular, realizamos ensaios de cicatrização de feridas durante um período mais curto, 18 h após o arranhão celular. A apigenina exibiu uma notável capacidade de inibir a migração celular, mesmo que nenhum aumento significativo na proliferação tenha sido observado dentro desse período de tempo. No entanto, o fenótipo maligno foi atenuado marcadamente pelo tratamento com apigenina (Figura  6A–C).
A apigenina reduz a malignidade de células de CP conferida por meio condicionado derivado de células estromais senescentes. A) Ensaio de proliferação de células de CP incubadas com diferentes tipos de MC por 3 dias. Esquerda, estatísticas. Direita, imagens representativas. Barra de escala, 50 µm. B) Avaliação de migração de células de CP incubadas com vários tipos de MC por 18 h. Direita, imagens representativas. Barra de escala, 200 µm. C) Medição da invasividade de células de CP através de membrana de transwell à base de colágeno incubadas com diferentes tipos de MC por 3 dias. Direita, imagens representativas. Barra de escala, 200 µm. D) Ensaio de quimiorresistência de células de CP tratadas com MIT enquanto cultivadas com diferentes tipos de MC. O MIT foi administrado em uma concentração inibitória média (IC50) pré-determinada para cada linhagem celular. E) Exame da viabilidade celular em cultura após exposição a concentrações de IC50 de MIT. Imagens representativas são mostradas. Barra de escala, 50 µm. F) Curvas de dose-resposta (regressão não linear/ajuste de curva) de células PC3 tratadas com diferentes tipos de MC e simultaneamente expostas a uma faixa de concentrações de MIT. Os dados foram plotados em escala exponencial, com a viabilidade celular avaliada em relação ao grupo não tratado e calculada como porcentagem. G) Leituras de sinal do ensaio de atividade de caspase-3/7 de células PC3 foram plotadas como unidades relativas de luminescência (RLUs). CP, câncer de próstata. MC, meio condicionado. MIT, mitoxantrona. SB, SB203580 (um inibidor de p38MAPK que suprime a expressão de SASP). Os dados em A, B, C, D, F e G são apresentados como média ± DP e representativos de 3 réplicas biológicas independentes, com valores de P calculados por testes t de Student. P > 0,05, P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. [Correção adicionada em 16 de maio de 2025, após a primeira publicação online: A Figura 5C foi substituída.]
Combinação de apigenina e quimioterapia melhora resultados pré-clínicos. A) Esquema ilustrando o fluxo de trabalho pré-clínico. Duas semanas após a inoculação subcutânea e captação in vivo de recombinantes PC3/PSC27, camundongos com imunodeficiência combinada grave (SCID) foram submetidos a tratamento com agente único ou combinado em um esquema metronômico composto por vários ciclos. B) Análise estatística dos volumes finais dos tumores. Células PC3 foram inoculadas sozinhas ou combinadas com PSC27 antes de serem implantadas subcutaneamente no flanco posterior de camundongos NOD/SCID, que receberam MIT e apigenina, isoladamente ou sequencialmente. Esquerda, estatísticas comparativas. Direita, imagens representativas dos tumores. C) Análise transcricional de vários fatores SASP em células estromais isoladas de focos tumorais PC3/PSC27, que foram submetidas à microdissecção a laser (LCM) para isolamento de células estromais e cancerosas, respectivamente. Os sinais foram normalizados para a amostra mais baixa no grupo placebo. D) Análise transcricional dos dois biomarcadores canônicos de senescência p16INK4a e p21CIP1. E) Avaliação da senescência celular em tecido de xenoenxerto por coloração SA‐β‐Gal. Esquerda, imagens representativas. Direita, estatísticas comparativas. Barra de escala, 100 µm. F) Quantificação dos sinais de DDR por imunofluorescência (IF) para γH2AX em tecidos de xenoenxerto (vermelho, γH2AX, azul, DAPI). Barra de escala, 20 µm. G) Avaliação da apoptose celular em tecidos de xenoenxerto por imuno-histoquímica (IHC) para caspase clivada 3 (CCL3) ao final dos regimes de tratamento. Amostras de biópsia de animais recebendo placebo serviram como controles negativos para camundongos recebendo tratamentos com MIT e/ou apigenina. Barra de escala, 20 µm. H) Avaliação estatística do dano ao DNA e apoptose celular em tecidos de xenoenxerto. Os valores são mostrados como a porcentagem de células coradas positivamente por IF ou IHC específica para γH2AX ou CCL3, respectivamente. I) Avaliação dos níveis circulantes de dois fatores SASP típicos (AREG, esquerda, EREG, direita) no soro de animais recebendo tratamentos com MIT e/ou apigenina. DDF, focos de dano ao DNA. Os dados em B, C, D, E, H e I são apresentados como média ± DP e representativos de 3 réplicas biológicas independentes, com valores de P calculados pelo teste t de Student. ^, P > 0,05, P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.
Nossos estudos anteriores revelaram que células estromais danificadas por genotoxicidade no TME possuem potencial notável para conferir resistência às células cancerosas remanescentes, conforme evidenciado pelos fatores SASP WNT16B, AREG e EREG.[ ] Se a capacidade dos fatores SASP de aumentar a quimiorresistência do câncer pode ser reduzida pela apigenina permanece desconhecido. Descobrimos que a viabilidade das células cancerosas foi acentuadamente elevada após co-cultura com CM derivado de células estromais senescentes, mas diminuiu quase ao nível basal em comparação com suas contrapartes de células estromais normais após tratamento com apigenina (Figura 5D). A capacidade da apigenina em neutralizar a quimiorresistência também estava alinhada com a mudança distinta das curvas de sobrevivência celular, baseada na porcentagem de viabilidade celular em concentrações de MIT na faixa de 0,1–10 µM, uma janela clinicamente relevante de concentrações circulantes em pacientes com câncer[ ] (Figura 5E, F). Essa diminuição na viabilidade das células cancerosas pode ser explicada pelo efeito pró-apoptótico elevado da apigenina nas células cancerosas através de seus efeitos de amortecimento do SASP, refletido pelo aumento da atividade da caspase 3/7 (Figura 5G). Utilizamos docetaxel (DTX), outro agente quimioterápico, para confirmar ainda mais a capacidade da apigenina em prevenir a quimiorresistência. A substituição de MIT por DTX recapitulou em grande parte os efeitos do MIT, diminuindo a apoptose e aumentando a quimiorresistência, enquanto ambos foram consideravelmente suprimidos pela apigenina (Figura S6B–D, Informações de Suporte). Esses resultados sugerem que o CM derivado de células estromais senescentes conferiu às células cancerosas uma notável resistência terapêutica, tendência que foi atenuada após o tratamento das células estromais com apigenina.
A metformina, um medicamento antidiabético amplamente utilizado, é um agente reaproveitável e pode exercer múltiplos efeitos benéficos, incluindo a redução do SASP sem causar citotoxicidade substancial às células senescentes,[ ] mantendo assim o potencial como agente senomórfico. Os resultados dos nossos ensaios envolvendo metformina geralmente fenocopiaram os derivados dos ensaios com apigenina na redução da malignidade das células cancerosas pela diminuição da atividade do CM das células estromais, indicando um padrão comum compartilhado por ambos os agentes (Figura S6E–H, Informações de Suporte). Assim, alvejar farmacologicamente o desenvolvimento do SASP com um agente senomórfico, como a apigenina, pode privar substancialmente as células cancerosas dessas funções adquiridas conferidas pelo CM estromal, especificamente a resistência a um medicamento quimioterápico. Essas descobertas implicam a possibilidade de desenvolver estratégias relevantes para melhorar a eficácia dos regimes anticancerígenos atuais.
Apigenina Combinada com Quimioterapia Reduz Efetivamente a Quimiorresistência
Dada a eficácia da apigenina em atenuar a expressão de SASP em células estromais senescentes e conter fenótipos malignos de células cancerígenas in vitro, é tentador perguntar se esse agente possui potencial para controlar patologias relacionadas à senescência in vivo. Para esse fim, sublinhagens de PSC27 foram misturadas com PC3, uma linhagem de câncer de próstata tipicamente maligna, em uma proporção pré-otimizada (1:, 4) para gerar recombinantes teciduais antes da inoculação subcutânea no flanco traseiro de camundongos com diabetes não obesa e imunodeficiência combinada grave (NOD/SCID). Os tamanhos dos tumores foram determinados 8 semanas depois para avaliação patológica. Em comparação com tumores compostos por PC3 e PSC27Naive, os xenoenxertos compreendendo PC3 e PSC27SEN estavam notavelmente aumentados. No entanto, o tratamento das células PSC27SEN com apigenina antes da construção do recombinante tecidual reduziu substancialmente os volumes tumorais (P < 0,01). Notavelmente, a eficácia da apigenina foi amplamente reproduzida pela rapamicina, que exerceu um efeito in vivo duradouro mesmo quando células humanas senescentes foram tratadas apenas uma vez por tal agente inibidor de SASP in vitro (Figura S7A, Informações de Suporte).[ ]
Para simular cenários clínicos, projetamos um regime pré-clínico envolvendo agentes genotóxicos e/ou apigenina (Figura 6A, Figura S7B, Informações de Suporte). Após um período de 2 semanas após a implantação subcutânea com captação de recombinante de tecido geralmente observável em animais hospedeiros, uma dose única de placebo ou MIT foi administrada no início da 3ª, 5ª e 7ª semana, com apigenina administrada 7 dias após cada uma dessas administrações, até o final de um regime de 8 semanas (Figura S7B, Informações de Suporte). Embora nenhum benefício significativo tenha sido observado no grupo da apigenina, a administração de MIT causou uma redução notável do tumor (redução de 57,8% no volume), confirmando a eficácia do MIT como agente quimioterápico. Quando a apigenina foi administrada após o MIT, observamos uma redução adicional no tamanho do tumor de 51,1%, correspondendo a uma diminuição total de 74,9% em comparação com o grupo placebo. Em seguida, investigamos se a senescência celular ocorreu nos xenotransplantes. Como esperado, no TME de tumores recombinantes PC3/PSC27, as células estromais exibiram uma expressão acentuadamente elevada de fatores SASP canônicos, incluindo IL-1α/IL-6, CXCL8, MMP1/MMP3, ANGPTL4 e AREG, um padrão que surgiu paralelamente ao aumento da regulação dos marcadores típicos de senescência p16INK4a e p21CIP1 no grupo MIT, indicando indução de senescência in vivo e expressão de SASP após tratamento quimioterápico (Figura 6C,D, Figura S7C, Informações de Suporte). Além disso, a coloração histológica indicou positividade aumentada para SA-β-Gal em xenotransplantes de camundongos expostos ao MIT, uma característica em nítido contraste com a apigenina, que não promoveu nem suprimiu a senescência celular (Figura 6E), uma tendência em linha com nossos resultados obtidos em ensaios in vitro (Figura 2A). As alterações foram observadas predominantemente em células estromais, em vez de células cancerosas adjacentes, indicando o potencial de repopulação de células cancerosas residuais e aquisição de resistência no TME danificado pelo tratamento. No entanto, após a administração de apigenina, a expressão de SASP foi atenuada, conforme evidenciado por dados de ensaios quantitativos baseados em transcritos (Figura S7D, Informações de Suporte).
Em seguida, investigamos como a expressão do SASP induz resistência terapêutica em células cancerígenas. Para explorar os mecanismos subjacentes, dissecamos tecidos de animais 7 dias após o início do tratamento, um ponto temporal imediatamente anterior ao surgimento de colônias resistentes. Em contraste com o grupo placebo, o tratamento com MIT por si só intensificou a sinalização de DDR (medida por γH2AX) e causou morte celular, especialmente apoptose (medida pela clivagem da caspase 3 (CCL), um marcador de apoptose) em células cancerígenas, quando a apigenina foi combinada com MIT, enquanto a administração de apigenina isoladamente não desencadeou nenhuma alteração, indicando eficácia limitada da apigenina quando usada como agente único para tratamento tumoral (Figura 6F–H). Após a coadministração de apigenina e MIT, as intensidades tanto do dano ao DNA quanto da apoptose foram ainda mais elevadas, indicando aumento da citotoxicidade na terapia combinada. Na análise por ELISA dos fatores SASP circulantes, AREG e EREG, descobrimos que o tratamento com MIT resultou em níveis elevados desses fatores na circulação, uma tendência que foi essencialmente revertida pela administração de apigenina (Figura 6I).
Como ponto adicional, permanece indeterminado se a PRDX6 está funcionalmente envolvida na regulação do SASP nas próprias células cancerígenas. Para tanto, geramos sublinhagens de PC3, nas quais a PRDX6 foi depletada por shRNAs (Figura S7E, Informações de Suporte). O crescimento de xenotransplantes compostos apenas por PC3 foi medido de forma semelhante ao do tumor composto por PSC27 e PC3. No entanto, notamos que o tratamento com apigenina não conferiu benefícios significativos na regressão tumoral (Figura S7F, Informações de Suporte), sugerindo que a sensibilidade relacionada às células estromais à apigenina não pode ser simplesmente reproduzida pelas células cancerígenas. Embora pareça haver uma tendência para tumores PC3 depletados de PRDX6 serem menores após o tratamento com apigenina, as alterações não foram estatisticamente significativas (P > 0,05). Nossos conjuntos de dados sugerem que, em resposta à quimioterapia mediada por MIT, as células cancerígenas também se tornam senescentes, mas não expressam um SASP típico, pois os níveis de expressão de vários fatores-chave do SASP, como IL1α, IL6, CXCL8 e MMP1, permaneceram amplamente inalterados (Figura 6C,D). Além disso, descobrimos que os índices de dano ao DNA/apoptose de tumores compostos inteiramente por células cancerígenas não apresentaram alterações significativas após o tratamento com apigenina (Figura S7G, Informações de Suporte). Assim, o efeito de regressão tumoral conferido pela apigenina não é detectável na ausência de células estromais, sugerindo um papel crítico das células estromais senescentes no desenvolvimento da resistência do câncer durante a quimioterapia.
Para estabelecer a segurança e eficácia da nossa estratégia terapêutica, foi realizada uma avaliação sistemática da fisiologia dos animais experimentais. Vale notar que os dados de avaliação geral indicaram que tanto a administração única quanto a coadministração foram bem toleradas, evidenciado pela ausência de perda de peso corporal entre os diferentes grupos durante todo o regime (Figura S8A, Informações de Suporte). Além disso, não foi observada flutuação notável no nível sérico de creatinina, ureia ou status metabólico, incluindo as atividades de fosfatase alcalina (ALP) e alanina aminotransferase (ALT), que representam um conjunto de medidas bioquímicas da função de órgãos principais, como fígado e rim (Figura S8B, Informações de Suporte). Portanto, a coadministração de um agente senomórfico e quimioterapia canônica tem o potencial de alcançar efeitos anticancerígenos máximos enquanto minimiza toxicidades sistêmicas graves.

Tratamento Pré-Clínico com Apigenina Alivia a Disfunção Física e o Declínio Cognitivo Relacionados à Idade

No microambiente tecidual, o SASP é um executor principal dos efeitos parácrinos das células senescentes e medeia vários efeitos biológicos locais e sistêmicos, incluindo aqueles subjacentes a patologias e que impactam a saúde geral.[ ] Para determinar a eficácia da apigenina na regulação de mudanças in vivo relacionadas à senescência, incluindo o envelhecimento do organismo, optamos por empregar camundongos submetidos à irradiação para estudos relacionados à idade. Resumidamente, camundongos do tipo selvagem (WT) foram expostos a uma dose subletal de irradiação corporal total (ICT) para induzir senescência substancial nos tecidos, seguido por intervenção senoterapêutica com apigenina ou veículo, este último um controle terapêutico (Figura  7A). Como resultado, os animais submetidos à ICT manifestaram um perfil fisiológico aberrante, exemplificado por pelagem aparentemente acinzentada (Figura 7B). No entanto, essa condição foi acentuadamente melhorada após o tratamento com apigenina.
A administração de apigenina melhora a função física de camundongos prematuramente envelhecidos após tratamento com WBI. A) Ilustração esquemática de um procedimento pré-clínico para animais C57BL/6J submetidos a tratamento com WBI e sujeitos a testes de função física. B) Uma imagem representativa do perfil corporal total dos animais experimentais. Foram estudados camundongos ingênuos, camundongos WBI submetidos a tratamento com veículo e camundongos WBI recebendo administração de apigenina, respectivamente. C) Coloração H&E para dissecar a morfologia dos tecidos pulmonares de camundongos conforme descrito em (b). Barra de escala, 100 µm. D) Imagens representativas da coloração SA-β-Gal (esquerda) e quantificação (direita) de tecidos renais de cada grupo. Barra de escala, 5 µm. E) Avaliação quantitativa da expressão do transcrito de marcadores de senescência (p16INK4a e p21CIP1) e vários fatores SASP em tecidos renais. Os sinais foram normalizados para amostras do grupo ingênuo por gene. (F–I) Avaliação quantitativa das funções físicas, incluindo força de preensão (F), resistência à suspensão (G), tempo no rotarod (H) e tempo necessário para atravessar a viga de equilíbrio (I), todas capacidades físicas típicas dos animais descritos em (A). n = 8. J) Teste do labirinto em Y dos camundongos. n = 8. K) Avaliação da memória de curto prazo dos animais conforme descrito em (A) por meio do teste de campo aberto durante uma exploração de 20 min. "1′" e "2′" denotam as zonas "central" e "periférica", respectivamente, do campo aberto (canto superior esquerdo). A trajetória representativa (esquerda) e a análise de quantificação (direita) indicam o tempo que os animais passaram nas duas zonas. n = 8. Cada ponto de dados representa um camundongo individual. n representa o número de animais por grupo. WBI, irradiação corporal total. H&E, hematoxilina e eosina. Os dados em (C–K) são apresentados como média ± DP e representativos de 3 réplicas biológicas independentes. Os valores de P foram calculados pelo teste t de Student. P > 0,05, P > 0,05, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.
Expansão do alvéolo pulmonar dependente da idade, uma importante alteração estrutural tecidual que contribui para a disfunção pulmonar, foi encontrada em camundongos tratados com WBI, mas bastante atenuada em animais que receberam tratamento com apigenina (Figura 7C). Nossos dados sugerem um benefício da suplementação com apigenina na prevenção do aparecimento de anormalidades pulmonares relacionadas à idade, uma vez que alterações na composição das vias aéreas e dos alvéolos podem causar disfunção respiratória e, eventualmente, promover distúrbios pulmonares crônicos durante o envelhecimento cronológico.[ ] Na avaliação histológica dos baços de camundongos idosos, observamos atrofia e desorganização da polpa branca, o principal órgão imune que compreende vários subtipos de células imunes, incluindo células DC, células T CD4+, CD8+ e células B CD19+, cujas alterações anormais podem contribuir para a disfunção imune associada à idade (Figura S9A, Informações de Suporte). No entanto, a apigenina demonstrou capacidade de melhorar o perfil estrutural dos tecidos esplênicos ao prevenir tais anormalidades. Além disso, a densidade das populações de células imunes derivadas do baço, particularmente células T CD4+ e células B CD19+, que residem principalmente na bainha linfocítica periarteriolar (PALS) e na região entre a PALS e os seios marginais, respectivamente,[ ] diminuiu acentuadamente no grupo WBI, mas a alteração foi revertida com o tratamento com apigenina.
A análise subsequente indicou o surgimento de células senescentes em vários órgãos principais, conforme demonstrado pelo aumento da positividade para SA‐β‐Gal nos tecidos do rim e baço desses animais após o tratamento com WBI (Figura 7D, Figura S9B, Informações de Suporte). Em comparação com camundongos tratados com veículo, a tendência de positividade para a coloração de SA‐β‐Gal permaneceu praticamente inalterada no grupo da apigenina, sugerindo que o tratamento com esse agente senomórfico não pode prevenir a senescência celular nesses animais. Observamos que a apigenina não conseguiu reduzir a expressão de marcadores-chave de senescência, incluindo p16INK4a e p21CIP1 (Figura 7E). Os dados foram validados ainda por análise de imunofluorescência da expressão de p21CIP1 no microambiente tecidual (Figura S9C, Informações de Suporte). No entanto, em contraste, um subconjunto de fatores SASP, incluindo IL6, CXCL8, IL1α, IL1β, CXCL1/3 e MMP1/3/9, que foram significativamente regulados positivamente após a exposição dos camundongos ao WBI, apresentou declínio notável nos animais tratados com apigenina, conforme exemplificado pelos dados da análise de tecidos renais (Figura 7E). Essa observação foi amplamente consistente com os dados obtidos de camundongos envolvidos em regimes quimioterápicos (Figura S7D, Informações de Suporte). Examinamos as amostras biológicas em nível proteico. Nossos dados indicaram que a regulação positiva do marcador SASP canônico IL6 em tecidos como o rim, após os animais terem sido submetidos ao tratamento com WBI, foi parcialmente revertida nos animais tratados com apigenina (Figura S9D,E, Informações de Suporte). Ao realizar ensaios ELISA para medir os níveis circulantes de AREG e EREG, observamos uma elevação aparente na concentração circulante desses fatores SASP em animais desafiados por irradiação, uma tendência que foi neutralizada pela administração de apigenina (Figura S9F,G, Informações de Suporte).

Em seguida, avaliamos se as intervenções pré-clínicas alteraram a função física nesses animais. Inesperadamente, camundongos submetidos ao WBI apresentaram desempenho reduzido em exercícios e força muscular, medidos por testes de força de preensão, resistência à suspensão, duração no rotarod e travessia em barra (Figura 7F–I). No entanto, os declínios em cada uma dessas atividades foram parcial, mas significativamente, revertidos com o tratamento dos animais prematuramente envelhecidos com apigenina, em comparação com o grupo veículo. Questionamos se a apigenina poderia melhorar de forma geral as condições de saúde, incluindo memória de curto prazo e ansiedade. Notavelmente, observamos uma recuperação básica da memória de curto prazo em animais envelhecidos que receberam tratamento com apigenina, conforme evidenciado pelos dados dos testes de labirinto em Y (Figura 7J). Dados de ensaios de campo aberto indicaram que a apigenina prolongou a duração da exploração da zona central de uma arena ampla, sugerindo que a ansiedade dos camundongos envelhecidos foi aliviada em comparação com o grupo veículo (Figura 7K). Os dados sugerem que a administração de apigenina representa uma abordagem eficaz para aliviar a disfunção física e evitar o comprometimento cognitivo durante o envelhecimento prematuro, promovendo a saúde geral.
Para estabelecer a segurança de nossa estratégia intervencional nesses animais imunocompetentes (C57BL/6J), foi realizada uma avaliação sistêmica e rotineira das contagens de células sanguíneas e dos índices bioquímicos séricos. Como resultado, observamos uma leve diminuição nas contagens de glóbulos brancos (GB) e glóbulos vermelhos (GV) em camundongos tratados com WBI (Figura S9H–J, Informações de Suporte). Embora a diferença tenha parecido insignificante, refletiu um declínio parcial da capacidade hematopoiética e da competência imunológica. Após a administração de apigenina, esses índices permaneceram geralmente inalterados, validando a segurança do tratamento com apigenina no sistema hematopoiético (Figura S9H‐L, Informações de Suporte). Não encontramos nenhuma anormalidade óbvia nos níveis séricos de creatinina, ureia e nas atividades de ALP e ALT, parâmetros bioquímicos hepáticos e renais (Figura S9M–P, Informações de Suporte). Em conjunto, nossos dados pré-clínicos suportam que regimes terapêuticos envolvendo um agente senomórfico, como a apigenina, em camundongos prematuramente envelhecidos, têm potencial para aliviar a disfunção sem causar citotoxicidade sistêmica.
Discussão
O envelhecimento afeta a integridade funcional de vários tipos de órgãos e leva a patologias degenerativas crônicas.[ ] A crescente população humana envelhecida na maioria dos países desenvolvidos gerou custos sociais e econômicos significativos, tornando o desenvolvimento de geroterapêuticas uma necessidade premente. Uma via promissora é explorar o potencial de produtos naturais, particularmente extratos botânicos, que são ricos em constituintes fitoquímicos com capacidade de servir como agentes promotores da saúde.[ ] Linhas crescentes de evidência sugerem que compostos derivados da natureza que visam a senescência celular têm potencial para melhorar a saúde de várias espécies de mamíferos, especificamente roedores e humanos.[ ] A senescência celular é um estado que representa uma parada permanente do ciclo celular na qual as células permanecem viáveis, mas contribui para a degeneração de órgãos e doenças relacionadas à idade quando um acúmulo limiar de células senescentes é excedido durante o curso do envelhecimento.[ ]
Os papéis patogênicos das células senescentes são bem reconhecidos, com esforços científicos e médicos mais recentes visando torná-las um alvo potencialmente tratável.[ ] Como mediador crítico dos efeitos fisiopatológicos associados às células senescentes, o SASP pode ser efetivamente alvo de duas estratégias principais: a eliminação de células senescentes com senolíticos e a inibição específica do próprio SASP usando senomórficos, em conjunto denominados senoterapêuticos.[ ] Resultados promissores foram observados em estudos pré-clínicos e, mais importante, em ensaios clínicos, que envolvem a administração de senolíticos para distúrbios relacionados à idade, incluindo doença renal diabética (DRD), fibrose pulmonar idiopática (FPI), edema macular diabético (EMD) ameaçador à visão e doença de Alzheimer (DA) em estágio inicial.[ ] Em contraste, uma grande vantagem dos senomórficos, por exemplo, rutina e resveratrol, é a capacidade de restringir seletivamente a expressão do SASP, mas sem a necessidade de eliminar populações de células senescentes in vivo.[ ] Essa abordagem, embora considerada farmacologicamente mais suave que os senolíticos, pode evitar efetivamente os efeitos potencialmente prejudiciais dos fatores do SASP, ao mesmo tempo que permite que as células senescentes permaneçam no microambiente tecidual, onde podem desempenhar papéis essenciais, como impedir o desenvolvimento tumoral ao aumentar a imunovigilância e outras atividades fisiologicamente essenciais.[ ]

Neste estudo, realizamos uma triagem in vitro de uma biblioteca de NMA para buscar candidatos a senoterapêuticos naturais e notamos um composto de molécula pequena, a apigenina, que exibe um efeito senomórfico proeminente. O tratamento de células senescentes com apigenina pode abolir a expressão de um amplo espectro de fatores do SASP que medeiam a ocorrência e progressão da maioria, senão de todas, as patologias relacionadas à idade.[ ] Dados de perfilagem proteômica ampla sugeriram a possibilidade de que HSPA8 interage com ATM e p38MAPK, duas moléculas conhecidas por estarem envolvidas na transdução de sinalização intracelular para permitir o desenvolvimento do SASP durante a senescência celular.[ ] Estudos adicionais indicaram que a apigenina interfere na comunicação cruzada entre ATM e HSPA8, bem como entre HSPA8 e p38MAPK, bloqueando assim mais de um mecanismo de sinalização que medeia funcionalmente a progressão do SASP, que geralmente ocorre de forma em cascata em células senescentes. A apigenina abole a transição do ASAP, uma resposta aguda das células após exposição ao estresse, para um SASP em escala total, um fenótipo crônico e pró-inflamatório. De fato, tal eficácia funcional lembra o 5Z-7-oxozeaenol, um inibidor de TAK1, que diminui a expressão do SASP ao restringir a atividade de TAK1, uma quinase envolvida no eixo ATM-TRAF6-TAK1 durante a resposta aguda ao dano ao DNA e que subsequentemente orquestra o engajamento das vias p38MAPK e PI3K/Akt/mTOR para sustentar a sinalização persistente do SASP.[ ]
PRDX6 é um membro 1‐Cys único da família das peroxirredoxinas, que compreende seis enzimas antioxidantes altamente conservadas (PRDX1‐PRDX6) com um resíduo de cisteína (cys) envolvido na redução de peróxido.[ ] PRDX6 tem atividades de peroxidase, fosfolipase A2 ácida independente de cálcio (aiPLA2) e aciltransferase de lisofosfatidilcolina (LPCAT), e é importante para a manutenção da reparação da peroxidação lipídica, sinalização inflamatória e resposta ao dano antioxidante.[ ] Embora a PRDX6 tenha sido extensivamente investigada em distúrbios cerebrais como DA e doença de Parkinson (DP), o papel funcional da PRDX6 na senescência celular e seus fenótipos associados permanece amplamente desconhecido. Neste estudo, primeiro avaliamos o efeito da apigenina na capacidade celular de eliminar H2O2. Os dados sugeriram que a apigenina reduziu a capacidade das células de eliminar H2O2, mas de forma menos eficaz do que o NAC, um inibidor seletivo da atividade de peroxidase, sugerindo que a eficácia da apigenina pode não depender de sua atividade de peroxidase. Após dissecação alternativa, realizada na atividade da PLA2, descobrimos que a capacidade da apigenina de atenuar a expressão de fatores pré‐inflamatórios estava de fato correlacionada com a supressão da atividade da PLA2 da PRDX6. Isso foi corroborado por ensaios envolvendo MJ33, um inibidor seletivo da PLA2 da PRDX6, que reduziu notavelmente a expressão de SASP de maneira dependente da concentração. Através de um ensaio de Co‐IP mediado por PRDX6 seguido de perfilamento por MS, descobrimos uma interação de HSPA8 com PRDX6, duas moléculas funcionalmente envolvidas na mediação do efeito senomórfico da apigenina. Mecanicamente, direcionar células senescentes com apigenina interfere na atividade da PLA2 da PRDX6, afetando a ativação de HSPA8 e abolindo eventos relacionados à HSPA8, incluindo suas interações com ATM e p38MAPK (Figura 8).

Um modelo de trabalho da apigenina como um novo agente senomórfico para direcionar células senescentes e exploração de seu potencial em futuros pipelines para tratar condições relacionadas à idade. Células senescentes sintetizam e secretam ativamente vários fatores SASP, que abrangem proteínas solúveis incluindo interleucinas pró‐inflamatórias, quimiocinas, fatores de crescimento e outros. O SASP hipersecretório das células senescentes afeta a fisiologia das células vizinhas e causa inflamação crônica no microambiente tecidual. Como um composto de pequena molécula derivado da natureza, a apigenina tem como alvo direto a PRDX6 para restringir sua atividade de PLA2, interrompendo a ativação de HSPA8 e interferindo em suas interações com ATM e p38MAPK em células senescentes. Ao restringir a expressão de SASP, a apigenina minimiza efetivamente o impacto das células senescentes na homeostase tecidual, prevenindo a disfunção orgânica e aliviando múltiplas condições relacionadas à idade.
Considerando o potencial proeminente da apigenina em atenuar a expressão da SASP, examinamos a capacidade deste composto em conter a malignidade de células cancerígenas. Os resultados experimentais indicaram que quase todas as funções adquiridas, nomeadamente uma série de fenótipos malignos aprimorados das células de CP (um modelo de célula cancerígena utilizado neste estudo), foram marcadamente reduzidas pela apigenina. Importante, a quimiorresistência aumentada das células cancerígenas conferida por suas contrapartes celulares senescentes foi amplamente diminuída na presença de apigenina, sugerindo a possibilidade de aplicar a apigenina em tratamentos anticancerígenos combinados. Estendemos ainda essas descobertas a um modelo de camundongo. Os dados mostraram que o tratamento bissemanal com apigenina via i.p. inibiu significativamente a expressão da SASP in vivo de camundongos portadores de xenotransplantes de CP, resultando em volumes tumorais significativamente reduzidos ao final dos regimes terapêuticos. Mais importante, a administração pré-clínica de apigenina a camundongos prematuramente envelhecidos por ICR atenuou notavelmente os sintomas relacionados à idade. Condições geriátricas típicas, incluindo modificação do pelo, expansão do volume alveolar, perda de força muscular, redução da resistência à suspensão e dificuldade de travessia em viga de equilíbrio, foram substancialmente melhoradas nos animais idosos que receberam administração de apigenina. Curiosamente, o comprometimento cognitivo, um déficit neurodegenerativo observado nesses camundongos, também foi prevenido pela apigenina. Embora estudos adicionais ainda sejam necessários para estabelecer os possíveis benefícios da apigenina na melhora de outras condições de saúde relacionadas à idade, nossas evidências pré-clínicas sugerem um papel proeminente da apigenina na mitigação da disfunção física de animais idosos, principalmente ao direcionar o fenótipo inflamatório associado à senescência, a SASP.
Uma das forças deste estudo é que determinamos o papel da apigenina contra a senescência celular ocorrendo em linhagens celulares representativas de diferentes origens de órgãos, bem como em diferentes formas de senescência induzidas por estímulos alternativos, incluindo os casos de RS, OIS e TIS. Neste estudo, focamos principalmente na TIS, pois o acúmulo de senescência em tecidos que de outra forma seriam saudáveis é um efeito fora do alvo da maioria das quimioterapias.[ ] Usamos BLEO, um agente genotóxico frequentemente usado para tratar cânceres, para indução de senescência in vitro e avaliações fenotípicas. Empregamos MIT, outro agente quimioterápico que induz senescência ao atuar como inibidor da topoisomerase II para causar danos ao DNA.[ ] A administração de MIT em camundongos experimentais desencadeou DDR significativa e senescência celular in vivo. A apigenina promoveu ainda mais tanto o dano ao DNA quanto a apoptose celular em focos tumorais, sugerindo que a quimiorresistência do câncer conferida pela senescência in vivo pode ser notavelmente enfraquecida pela apigenina. Até o momento, a maioria dos estudos senoterapêuticos ou antisenescência optou por usar senolíticos no design e complementação de intervenções pré-clínicas contra patologias relacionadas à idade, pois a remoção de células senescentes resulta em tecidos e órgãos rejuvenescedores, um benefício que foi demonstrado por múltiplos estudos, incluindo aqueles que aplicam agentes naturais.[ ] Embora seja bem estabelecido que o acúmulo de células senescentes leva à liberação persistente de fatores SASP e contribui para a inflamação de baixo grau que alimenta doenças degenerativas relacionadas à idade,[ ] muito menos esforço foi investido para explorar o potencial terapêutico de senomórficos para condições relacionadas à idade de longo prazo.
A apigenina é um flavonoide (4′,5,7‐trihidroxiflavona) e possui um potencial significativo como agente preventivo contra doenças crônicas. Com capacidade de eliminar radicais livres, a apigenina apresenta efeitos neuroprotetores, anti-inflamatórios e antioxidantes.[ ] Em contraste, seu potencial terapêutico para atingir células senescentes e minimizar os impactos patológicos relacionados à senescência por meio do bloqueio da expressão de SASP permaneceu amplamente negligenciado. Neste estudo, revelamos um novo mecanismo pelo qual a apigenina pode alterar especificamente o fenótipo de senescência, reduzindo a expressão de SASP. Demonstramos ainda os benefícios da apigenina para intervir contra patologias relacionadas à idade, abrindo uma nova via para explorar este composto de pequena molécula como um novo agente senomórfico. Em conjunto, nosso estudo apoia a possibilidade de que a apigenina, um flavonoide derivado de plantas, pode aliviar eficazmente distúrbios relacionados à idade, exemplificado pelo aumento da eficácia anticancerígena, melhora da função física e aprimoramento do comportamento cognitivo de camundongos prematuramente envelhecidos. Apresentamos uma série de dados de prova de conceito para mostrar que um agente senomórfico pode exercer efeitos geroprotetores significativos em doses relativamente baixas e com um perfil de segurança favorável. Este estudo fornece dados piloto e uma base para pesquisas futuras e desenvolvimento de compostos naturais como senoterapêuticos para prevenir, retardar ou aliviar uma série de patologias relacionadas à idade.

Seção Experimental
Cultura de Células
A linhagem primária de células estromais de próstata humana normal PSC27 foi um presente do Dr. Peter Nelson (Fred Hutchinson Cancer Center) e mantida em meio completo estromal conforme descrito anteriormente.[ ] As linhagens estromais de pulmão fetal humano WI38 e IMR90 foram obtidas da ATCC e cultivadas com meio F-12K suplementado com 10% de SBF. As linhagens epiteliais de câncer de próstata PC3, DU145 e LNCaP e a linhagem de rim embrionário humano 293T foram obtidas da ATCC e cultivadas com RPMI 1640 (10% de SBF). A linhagem epitelial de câncer de próstata M12 foi gentilmente fornecida pelo Dr. Stephen Plymate (Universidade de Washington), originalmente derivada da linhagem benigna BPH1, mas fenotipicamente neoplásica e metastática.[ ] Todas as linhagens foram testadas para contaminação por micoplasma e autenticadas com ensaios de STR.

Tratamentos Celulares
Células estromais foram cultivadas até 80% de confluência (CTRL) e tratadas com 50 µg/mL de bleomicina (BLEO). As células foram lavadas brevemente com PBS e mantidas por 8–10 dias antes da realização dos exames. Para a triagem de potenciais senolíticos, candidatos naturais (total de 66 na biblioteca NMA) (subconjunto Selleckchem L8300‐TCM) foram testados, cada um a 3 µg mL−1, na sobrevivência de 5,0 × 10³ células controle e senescentes por 3 dias. A avaliação subsequente dos efeitos desses agentes candidatos (cada um aplicado a 1 µg mL−1) foi conduzida para testar a extensão da inibição do SASP (ensaio para senomórficos). Para aqueles com potencial para atuar como senomórficos eficazes e seguros, foram realizadas avaliações adicionais. O agente fitoquímico apigenina foi examinado na faixa de 1–10 µM, sendo 10 µM determinado como a menor concentração eficaz para atividade senomórfica. Os senolíticos de controle positivo ABT‐263 (navitoclax) e PCC1 foram aplicados a 1,25 e 50 µM, respectivamente. O inibidor de pequena molécula de p38MAPK, SB203580, e o inibidor de PRDX6‐PLA2, MJ33, foram empregados a 10 µM, para tratar células senescentes em cultura antes da coleta para lise e análise de expressão.
Vetores, Vírus e Infecção
A sequência completa do gene humano PRDX6 foi clonada no vetor pHBLV‐U6‐MCS‐CMV‐ZsGreen‐PGK‐Puro (Hanbio Biotechnology). Pequenos RNAs em hairpin (shRNAs) direcionados ao PRDX6 (1#, fita senso 5′‐ GATCCGCTCCCAACTTTGAGGCCAATACCATTCAAGAGATGGTATTGGCCTCAAAGTTGGGAGCTTTTTTG‐3′, fita antissenso 5′‐ AATTCAAAAAAGCTCCCAACTTTGAGGCCAATACCATCTCTTGAATGGTATTGGCCTCAAAGTTGGGAGCG‐3′, 2#, fita senso 5′‐ GATCCGATTGCCCTTTCAATAGACAGTGTTTTCAAGAGAAACACTGTCTATTGAAAGGGCAATCTTTTTTG‐3′, fita antissenso 5′‐ AATTCAAAAAAGATTGCCCTTTCAATAGACAGTGTTTCTCTTGAAAACACTGTCTATTGAAAGGGCAATCG‐3′, scramble, fita senso 5′‐ GATCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTAATTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTC‐3′, fita antissenso 5′‐ AATTGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGAATTACGTGACACGTTCGGAGAACG‐3′) foram clonados no vetor pLKO.1‐Puro (Addgene). Após a produção por células 293T, os títulos lentivirais foram ajustados para infectar ≈90% das células. Células estromais foram infectadas durante a noite na presença de polibreno (8 µg mL−1), deixadas para se recuperar por 48 h, e selecionadas por 72 h antes de serem utilizadas para análises adicionais.
Bulk RNA‐seq e Bioinformática
Amostras de RNA total foram preparadas a partir de células PSC27 senescentes cultivadas com DMEM regular ou DMEM contendo apigenina (10 µM) por 3 dias consecutivos. A qualidade das amostras foi validada pelo Bioanalyzer 2100 (Agilent), e o RNA foi submetido ao sequenciamento pelo Illumina NovaSeq 6000, com os níveis de expressão gênica quantificados pelo pacote de software RSEM (https://deweylab.github.io/RSEM/). Resumidamente, os rRNAs nas amostras de RNA foram eliminados usando o kit RiboMinus Eukaryote (Qiagen), e bibliotecas de RNA‐seq específicas de fita foram geradas usando o kit TruSeq Stranded Total RNA (Illumina, San Diego, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante antes do sequenciamento profundo.
As leituras transcriptômicas de pares foram mapeadas para o genoma de referência (GRCh38.p14) (Genome Reference Consortium Human Build 38, INSDC Assembly GCA_0 00001405.28, 12.2013) (http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index) (ensembl_105) com anotação de referência do GENCODE v42 usando a ferramenta Bowtie. Leituras duplicadas foram identificadas usando o script mark duplicates das ferramentas Picard (1.98) (https://github.com/broadinstitute/picard), e apenas leituras não duplicadas foram retidas. Junções de splice de referência são fornecidas por um transcriptoma de referência (Ensembl build 73).[ ] Os valores de FPKM foram calculados usando o Cufflinks, com a expressão gênica diferencial chamada pela função de estimativa de máxima verossimilhança do Cuffdiff.[ ] Genes com expressão significativamente alterada foram definidos por um valor de P corrigido pela taxa de falsa descoberta (FDR) < 0,05. Apenas genes Ensembl 73 de status "conhecido" e biótipo "codificante" foram usados para análises posteriores.
As leituras foram aparadas usando Trim Galore (v0.6.1) (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) e a qualidade avaliada usando FastQC (v0.10.0) (http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/). Genes diferencialmente expressos foram subsequentemente analisados quanto ao enriquecimento de temas biológicos usando a plataforma de bioinformática DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) e o programa Ingenuity Pathways Analysis (http://www.ingenuity.com/index.html). Os dados brutos do RNA-seq em massa foram depositados no banco de dados NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) sob o código de acesso GSE273159.
Diagramas de Venn e valores de P empíricos associados foram gerados usando a ferramenta IntersectLists do USeq (v7.1.2).[ ] O valor t usado foi 22008, como o número total de genes de status "conhecido" e biótipo "codificante" nos genes Ensembl 73. O número de iterações usado foi 1000.
Para cada gene, o valor de FPKM foi calculado com base nas leituras alinhadas, usando Cufflinks.[ ] Escores Z foram gerados a partir dos FPKMs. O agrupamento hierárquico foi realizado usando o pacote R heatmap.2 e as funções distfun = "pearson" e hclustfun = "average".
Mapeamento de Interatores Únicos com Conjuntos de Dados de Alto Rendimento
A análise de moléculas interativas com ATM e p38MAPK foi realizada com o BioGRID (v4.4.237), um repositório de interações biomédicas com dados compilados por meio de esforços abrangentes de curadoria e usado como um banco de dados público arquivando e disseminando dados de interações genéticas e proteicas de todos os principais organismos modelo e humanos (thebiogrid.org).[ ] O BioGRID pesquisa 85467 publicações para 2800228 interações proteicas e genéticas, 31144 interações químicas e 1128339 modificações pós-traducionais de espécies de organismos modelo principais, com o humano selecionado como a espécie alvo ao longo deste estudo.
Ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA)
Para avaliar se a apigenina tem como alvo a proteína PRDX6, foram realizados experimentos de CETSA‐immunoblot. O CETSA é utilizado para examinar a eficiência de ligação entre fármaco e proteína. Brevemente, células PSC27 em cultura foram tripsinizadas e precipitadas por centrifugação, lisadas em gelo com tampão RIPA contendo coquetel inibidor de protease, e centrifugadas a 14 000 × g a 4 °C por 20 min. Cada lisado foi então aliquotado igualmente em várias partes em tubos EP, e incubado com apigenina à temperatura ambiente por 1 h. As amostras foram aquecidas por 3 min em diferentes temperaturas (30, 35, 40, 45 e 50 °C). As proteínas precipitadas foram separadas da fração solúvel por centrifugação, e fervidas a 95 °C por 10 min. As amostras foram subsequentemente utilizadas para análise de immunoblot.
Ensaios de Estabilização de Alvo Responsiva à Afinidade de Fármaco (DARTS)
Os ensaios DARTS foram realizados para medir a estabilidade da interação da pequena molécula apigenina com sua(s) proteína(s) alvo, e realizados de acordo com um protocolo previamente relatado.[ ] Células PSC27 foram lisadas com tampão de lisado IP em gelo com inibidores de protease e fosfatase, antes de serem centrifugadas a 4 °C e quantificadas pelo método BCA. Os lisados foram deixados aquecer rapidamente até a temperatura ambiente e DMSO ou apigenina (100 µM) foi adicionada aos lisados para incubação por 1 h em um rotador. As amostras foram digeridas por pronase (1, 300 (p/p), 10 µg mL−1) por 30 min à temperatura ambiente. A digestão foi interrompida por EDTA 0,5 M (pH 8,0), com as amostras fervidas em tampão de carregamento para SDS-PAGE e avaliação por immunoblot, ou diretamente submetidas à análise de MS para perfil proteômico. Os dados proteômicos resultantes dos DARTS foram depositados no ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) através do repositório parceiro iProX com um identificador único de conjunto de dados PXD055761.
Ensaios de Ressonância de Plasmônio de Superfície (SPR)
A afinidade de ligação da apigenina à PRDX6 humana recombinante (rhPRDX6) foi determinada a 22 °C com um instrumento Biacore T200 equipado com chips sensores CM5 (GE Healthcare).[ ] Resumidamente, a proteína rhPRDX6 (SinoBiological) foi diluída em solução de acetato de sódio (pH 4,5) até uma concentração final de 20 µg mL⁻¹. A proteína PRDX6 foi imobilizada em um chip sensor CM5 (GE Healthcare) por amina, permitindo o acoplamento com densidades finais de imobilização de 8000 RU. A proteína PRDX6 imobilizada foi então aplicada para capturar a apigenina. O tampão de corrida continha PBS-P (10 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCl, 0,05% de surfactante P20, pH 7,3) e 5% de DMSO. O pH foi alterado de 7,0 para 5,5 para ajustar a afinidade de ligação sob vários ambientes de pH. Os experimentos foram realizados a 25 °C, com uma série de concentrações (12,5; 6,25; 3,125; 1,56 e 0,78 µM) de apigenina analisadas a uma taxa de fluxo de 30 µL min⁻¹, com um tempo de injeção de 60 s e um tempo de dissociação de 60 s em cada ciclo de ligação. Uma imobilização em branco foi realizada na superfície de um canal do chip para ajustar a resposta de ligação. As constantes de associação e dissociação foram adquiridas usando o software Biacore T200 Evaluation (v3.0 GE Healthcare). Os dados foram exportados para o GraphPad Prism para plotar as curvas finais.
Pulldown de Proteínas Ligadas à Apigenina
Células PSC27 foram lisadas em tampão de lise IP no gelo com inibidores de protease e fosfatase, em seguida centrifugadas a 4 °C por 10 min, o sobrenadante foi coletado e submetido à quantificação de proteínas pelo método BCA. Em seguida, o sobrenadante foi dividido em 4 partes iguais, sendo que 2 delas foram pré-tratadas com concentrações 10 e 20 vezes maiores de apigenina não marcada, respectivamente, à temperatura ambiente por 30 min. Posteriormente, mediante tratamento com biotina ou biotina-apigenina (100 µM) com apigenina não marcada no tampão IP durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, 30 µL de beads de estreptavidina-agarose (Sigma–Aldrich) foram adicionados para ligação por 2 h a 4 °C. Após lavagem três vezes com tampão IP, as proteínas nas beads foram eluídas, separadas por SDS-PAGE e coradas com prata ou diretamente submetidas à separação de amostras para análise por EM.
Nano-LC-MS/MS para Análise Proteômica
Peptídeos foram resolvidos em ácido fórmico 0,1%, com o kit de quantificação de proteínas BCA utilizado para medir a concentração de peptídeos. As amostras foram separadas utilizando uma coluna analítica (75 µm × 15 cm, 3 µm, 100 Å) (C-18, Thermo Scientific) em um sistema de HPLC nanoflow Easy-nLC 1200 (Thermo Scientific), usando um gradiente LC de 120 min a 300 nL min⁻¹. O tampão A consiste em ácido fórmico 0,1% (v/v) em H₂O e o tampão B consiste em ácido fórmico 0,1% (v/v) em acetonitrila 80%. O gradiente de solução foi o seguinte: 1–5% B em 6 min, 5–26% B em 88 min, 26–40% B em 22 min, 40–100% B em 5 min, 90% B em 5 min. As análises de EM foram realizadas em um espectrômetro de massas Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). A varredura de EM foi realizada em modo de íons positivos com tensão de spray a 1900 V, com temperatura do tubo de transferência de íons a 320 °C. O software Xcalibur foi utilizado para adquirir dados de espectro de perfil em um padrão de aquisição dependente de dados (DDA). A varredura completa MS1 foi definida com resolução de 60000 @ m/z 200, alvo AGC 3e6 e IT máximo 50 ms pelo analisador de massas orbitrap (350-1800 m/z), seguido pelas varreduras 'top 15' MS2 geradas por fragmentação HCD com resolução de 15000 @ m/z 200, alvo AGC 1e5 e IT máximo 30 ms. A janela de isolamento foi definida em 1,6 m/z. A energia de colisão normalizada (NCE) foi definida em NCE 28%, com o tempo de exclusão dinâmica de 45 s. Precursores com carga 1, 7, 8 e > 8 foram excluídos da análise MS2.
Mineração de Banco de Dados dos Dados de EM
Todos os dados espectrométricos de massas brutos foram analisados usando MaxQuant 2.0.3.0 contra o banco de dados humano Swiss-Prot compreendendo 20423 sequências (2023). Carbamidometilação da cisteína foi selecionada como modificação fixa. Metionina oxidada, acetilação N-terminal de proteínas, acetilação de lisina, desamidação de asparagina e glutamina (NQ) foram selecionadas como modificações variáveis. A especificidade da enzima foi definida como tripsina. As tolerâncias da primeira busca e da busca principal (mecanismo de busca Andromeda) para peptídeos foram definidas em 20 ppm e 6 ppm, respectivamente. O corte mínimo para o comprimento do peptídeo foi definido em 7 aminoácidos, com o máximo de clivagens perdidas permitidas definido em 2. O FDR máximo para correspondência de espectro de peptídeo, proteínas e sítio foi definido em 0,01. Um mínimo de 2 peptídeos únicos de sequência foi necessário para identificação. A correspondência de características entre as execuções foi feita com uma janela de tempo de retenção de 2 min, com a função de quantificação livre de marcadores (LFQ) habilitada. Os resultados de quantificação de peptídeos e proteínas do MaxQuant dos arquivos "peptides.txt" e "proteinGroups.txt" foram importados para o software Perseus (versão 1.5.1.6) para análise adicional. A significância estatística entre os grupos foi avaliada usando testes t de Student (p < 0,05). As proteínas foram definidas como diferencialmente expressas se as razões fossem ≥ 1,5 ou ≤ 0,67 no grupo experimental em comparação com o controle.
Modelagem in Silico da Ligação da Apigenina à PRDX6
A sequência de aminoácidos da PRDX6 (código, P30041) foi obtida do UniProt. As estruturas da apigenina foram derivadas do PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) e, em seguida, foram minimizadas em energia pelo Molecular Operating Environment (MOE) (v2019.01.02), usando o campo de força MMFF94 com a convergência do gradiente definida em 0,1 kcal mol−1. A estrutura de microscopia por difração de raios X da PRDX6 (ID PDB, 5B6M) foi obtida do RCSB Protein Data Bank (PDB, https://www.rcsb.org/). As moléculas de água a mais de 4,5 Å do receptor foram removidas. Subsequentemente, todas as estruturas proteicas foram preparadas pelas ferramentas internas de preparação de estrutura do MOE e Protonate3D com os parâmetros padrão. O sítio de ligação de cada proteína foi gerado pelo módulo SiteFinder no MOE. O método de posicionamento foi definido como Triangle Matcher com a função de pontuação London dG, com o algoritmo de pontuação de refinamento definido como GBVI/WSA dG. Por fim, o modo de ligação com a melhor pontuação de docking foi selecionado para a próxima análise. A pontuação de docking denota a afinidade entre o receptor proteico e o ligante de docking. Quanto menor a pontuação de docking, melhor a afinidade.[ ]
Termoforese em Microescala (MST)
Para confirmação da ligação da apigenina à PRDX6 tipo selvagem e mutante, construções de PRDX6 com proteína GFP ou mutante (Cys91 e/ou Glu210 para alanina) clonadas em pcDNA3.1‐PRDX6‐EGFP‐C2 foram projetadas e superexpressas em células 293T, que foram lisadas 48 h depois para análise por MST usando o instrumento Nano Temper Monolith NT Labelfree (Nano Temper Technologies). Uma série de concentrações de apigenina (200, 100,50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 1.6, 0.8, 0.4 e 0.2 µM) foram misturadas com a solução de proteína PRDX6. Após incubação à temperatura ambiente por 5 min, as misturas foram carregadas em capilares MO‐AK002. As avaliações de MST foram realizadas com 20% de potência de MST e 20% de potência de LED com padrão nano‐BLUE. Os conjuntos de dados de MST foram processados usando o software NT analysis 1.5.41 (Nano Temper Technologies).
Avaliação da Atividade da Peroxirredoxina
A atividade da peroxirredoxina (Prdx) foi determinada usando o Kit de Ensaio de Peróxido de Hidrogênio (Beyotime). Resumidamente, a PRDX foi superexpressa em células PSC27, que foram então lisadas e quantificadas por BCA. Os lisados celulares foram incubados com uma série de concentrações de apigenina à temperatura ambiente por 10 min. H2O2 foi adicionado a uma concentração final de 50 µM, com as amostras incubadas por 5 min. Os reagentes do ensaio de H2O2 foram adicionados, com as amostras incubadas por 30 min à temperatura ambiente; o H2O2 remanescente foi determinado pela avaliação do valor de absorbância a 560 nm. N‐acetilcisteína (NAC) foi usada como controle positivo.
Avaliação da Atividade da Fosfolipase A2 (PLA2)
A atividade da fosfolipase A2 foi determinada de acordo com as instruções do fabricante (kit EnzChek Fosfolipase A2, Invitrogen). Resumidamente, células PSC27 superexpressando PRDX6 foram coletadas, lisadas e quantificadas por BCA. Para preparação da curva padrão, a solução estoque de PLA2 (500 U/mL) foi diluída com tampão de reação 1× para obter uma série de concentrações (0–10 unidades/mL) de PLA2. Para medição das amostras, quantidades iguais de proteína foram diluídas com tampão de reação PLA2 1× (1:1, v/v) até um volume de 50 µL, e 50 µL da mistura de lipossomos substrato foram adicionados a cada microplaca preta para incubação com um volume total de 100 µL por 10 min. A fluorescência dos padrões, controles e amostras foi medida em Ex460 nm/Em515 nm.

Ensaios de Imunoblot e Imunofluorescência

Lisados celulares totais foram preparados usando tampão de lise RIPA suplementado com coquetel inibidor de protease/fosfatase (Biomake). Membranas de nitrocelulose foram incubadas durante a noite a 4°C com anticorpos primários, e anticorpos secundários anti-camundongo ou anti-coelho conjugados com HRP (Vazyme) foram utilizados. Para análise de imunofluorescência, as células foram fixadas com formaldeído a 4% e permeabilizadas antes da incubação com anticorpos primários e secundários, cada um por 1 h. Após contracoloração com DAPI (0,5 µg mL−1), as amostras foram examinadas com um microscópio Imager A2. Axio (Zeiss) de luz vertical para analisar a expressão gênica específica.

Medições de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) Intracelulares

Os níveis de ROS intracelular foram determinados usando um Kit de Ensaio de ROS (Beyotime) que utiliza dicloro-di-hidro-fluoresceína diacetato (DCFH-DA) como sonda. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de 6 poços por 24 h a 37°C e então lavadas duas vezes com meio livre de soro. Meio contendo 10 µM de DCFH-DA foi adicionado. As células foram então incubadas por 20 min a 37°C, evitando luz durante a incubação. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com meio livre de soro, então observadas e fotografadas usando um microscópio de fluorescência (Nikon). A intensidade de fluorescência foi medida usando o software ImageJ (v1.51, NIH).

Caracterização Fenotípica Celular In Vitro
Para ensaios de proliferação de células cancerosas, 2 × 10⁴ células foram distribuídas em placas de 6 poços e co-cultivadas com meio condicionado derivado de células estromais (CM). Três dias depois, as células foram digeridas e contadas com hemocitômetro. Para ensaios de migração, as células foram adicionadas às câmaras superiores de transwells (poro de 8 µm), enquanto o CM estromal foi adicionado à câmara inferior. As células migrantes nas câmaras inferiores foram coradas com violeta cristal 12–24 h depois, com as amostras examinadas em um microscópio invertido Observer A1. Axio (Zeiss). Os ensaios de invasão foram realizados de forma semelhante aos experimentos de migração, exceto que os transwells foram revestidos com matriz de membrana basal (livre de vermelho de fenol, Corning). Alternativamente, as células cancerosas foram submetidas a ensaios de cicatrização de feridas realizados em placas de 6 poços, com os padrões de cicatrização registrados por um microscópio de campo claro. Para ensaios de quimiorresistência, as células cancerosas foram incubadas com CM estromal, com o agente quimioterápico MIT (mitoxantrona) fornecido nos poços por 3 dias na IC50 de cada linhagem celular, um valor predeterminado experimentalmente. A viabilidade celular foi avaliada por um kit CCK-8, com a absorbância a 450 nm medida usando um leitor de microplacas.

Animais Experimentais e Estudos Quimioterápicos
Os animais foram mantidos em uma instalação livre de patógenos específicos (SPF), com camundongos NOD/SCID (Centro de Pesquisa de Animais Modelo da Universidade de Nanquim) com aproximadamente 6 semanas de idade (≈20 g de peso corporal) utilizados. Dez camundongos foram incluídos em cada grupo, com xenoenxertos gerados subcutaneamente no flanco posterior sob inalação de isoflurano. Células estromais (PSC27) foram misturadas com células cancerosas (PC3) na proporção de 1:4 (ou seja, 250.000 células estromais misturadas com 1.000.000 de células cancerosas para formar recombinantes de tecido antes da implantação in vivo). Os animais foram eutanasiados entre 2 e 8 semanas após a implantação do tumor, de acordo com a carga tumoral ou requisitos experimentais. O crescimento tumoral foi monitorado semanalmente, com o volume tumoral (v) medido e calculado de acordo com o comprimento (l), largura (w) e altura (h) do tumor pela fórmula v = (π/6) × ((l+w+h)/3)[ ] Os tumores recém dissecados foram congelados rapidamente ou fixados para preparar amostras FFPE. As seções resultantes foram usadas para coloração por IHC contra antígenos específicos ou submetidas à coloração por hematoxilina/eosina.

Para estudos de quimiorresistência, os animais receberam implante subcutâneo de recombinantes de tecido conforme descrito acima e receberam dietas laboratoriais padrão por 2 semanas para permitir a absorção do tumor e o início do crescimento. A partir da 3ª semana (tumores atingindo 4–8 mm de diâmetro), MIT (doses de 0,2 mg kg−1) ou controles veículo foram administrados por injeção intraperitoneal (agentes terapêuticos por via i.p.), no 1º dia da 3ª, 5ª e 7ª semanas, respectivamente. A apigenina foi administrada 7 dias após cada administração de MIT ou veículo, em doses de 10 mg kg−1. Após a conclusão do regime terapêutico de 8 semanas, os animais foram eutanasiados, com os volumes tumorais registrados e os tecidos processados para avaliação histológica.
Ao final da quimioterapia e/ou tratamento direcionado, os animais foram anestesiados e o sangue periférico foi coletado por punção cardíaca. O sangue foi transferido para um tubo Eppendorf de 1,5 ml e mantido em gelo por 45 min, seguido de centrifugação a 9000 x g por 10 min a 4 °C. Os sobrenadantes claros contendo soro foram coletados e transferidos para um tubo Eppendorf estéril de 1,5 ml. Todos os marcadores séricos foram medidos usando tecnologia de lâmina seca no analisador químico IDEXX VetTest 8008 (IDEXX). Cerca de 50 µl da amostra de soro foram carregados na ponta da pipeta VetTest antes de serem ajustados firmemente no pipetador e as instruções do fabricante foram seguidas para exame posterior.
Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academies Press, 2011) e as diretrizes ARRIVE, e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Instituto de Nutrição e Saúde de Xangai (n.º SINH‐2023‐SY‐1/SINH‐2024‐SY‐1), da Academia Chinesa de Ciências. Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados e reduzir o sofrimento potencial.
Coloração SA‐β‐Gal de Tecido e Exame Histológico
Para a coloração SA‐β‐Gal, as seções congeladas foram secas a 37 °C por 20–30 min antes de serem fixadas por 15 min à temperatura ambiente. As seções congeladas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas com reagente de coloração SA‐β‐Gal (Beyotime) durante a noite a 37 °C. Após a conclusão da coloração SA‐β‐Gal, as seções foram coradas com eosina por 1–2 min, enxaguadas em água corrente por 1 min, diferenciadas em álcool ácido a 1% por 10–20 s e lavadas novamente em água corrente por 1 min. As seções foram desidratadas em concentrações crescentes de álcool e clarificadas em xileno. Após secagem, as amostras foram examinadas ao microscópio de campo claro.
Histologia e imuno-histoquímica
Amostras pré-clínicas de tecidos de camundongos foram fixadas durante a noite em formalina tamponada neutra a 10% e processadas para inclusão em parafina. Para avaliação histológica, a coloração padrão com hematoxilina/eosina foi realizada em cortes de 5–8 µm de espessura obtidos de cada bloco de amostra. Para imuno-histoquímica, as amostras de tumor foram primeiro fixadas em paraformaldeído a 4% e incluídas em parafina. Para avaliação, cortes de tecido foram obtidos de blocos FFPE, desparafinizados e incubados em tampão citrato de sódio 10 mM (pH 6,5) a 95 °C por 40 min para recuperação antigênica. A atividade da peroxidase foi bloqueada com H2O2 a 3% e os tecidos foram bloqueados em albumina de soro bovino a 5% por 30 min, antes de serem incubados com anticorpos primários (por exemplo, contra IL6 ou caspase 3 clivada [CCL3]), para avaliação da expressão de SASP ou avaliação de apoptose celular, respectivamente) durante a noite a 4 °C. Após 3 lavagens com PBS, os cortes de tecido foram incubados com anticorpo secundário biotinilado (diluição 1:200, Vector Laboratories) por 1 h à temperatura ambiente e depois lavados três vezes, após o que conjugados de estreptavidina-peroxidase de rábano (Vector Laboratories) foram adicionados e as lâminas incubadas por 45 min. A solução DAB (Vector Laboratories) foi então adicionada e as lâminas foram contracoradas com hematoxilina. Alternativamente, cortes de tecido congelados foram usados para coloração por imunofluorescência para sondar a expressão de proteínas alvo (por exemplo, indução de p21) em animais recebendo vários tratamentos pré-clínicos, com contracoloração realizada com DAPI. As imagens foram então capturadas com microscópio de epifluorescência.

Avaliação da Citotoxicidade In Vivo por Exames de Sangue
Para exame de sangue de rotina, 100 µL de sangue fresco foram obtidos de cada animal e misturados imediatamente com EDTA. As amostras de sangue foram analisadas com analisadores hematológicos da série Celltac Alpha MEK-6400 (Nihon Kohden). Para análises bioquímicas do soro, amostras de sangue foram coletadas e coaguladas por 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Uma alíquota de aproximadamente 50 µl de soro foi submetida à análise de creatinina, ureia, fosfatase alcalina (ALP) e alanina transaminase (ALT) por um analisador químico VetTest 8008 (IDEXX) conforme relatado anteriormente.[ ] Para testes de células sanguíneas, 50 µl de sangue fresco foram coletados de cada camundongo e misturados imediatamente com EDTA. Os níveis circulantes de hemoglobina, glóbulos brancos, linfócitos e plaquetas das amostras de sangue foram analisados por analisadores hematológicos automatizados da série Sysmex XN-1000 (Sysmex, XN-1000).
Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academies Press, 2011) e as diretrizes ARRIVE, e foram aprovados pelo IACUC do Instituto de Nutrição e Saúde de Xangai, Academia Chinesa de Ciências. Para cada regime pré-clínico, os animais foram monitorados quanto a condições como hipersensibilidade (alterações na temperatura corporal, respiração alterada e pelagem eriçada), peso corporal, mortalidade e alterações comportamentais (ou seja, perda de apetite e angústia), e foram descartados adequadamente de acordo com a gravidade patológica individual, conforme definido pelas diretrizes relevantes.
Teste de Campo Aberto
O teste de campo aberto foi empregado para avaliar a atividade locomotora e a ansiedade dos animais experimentais quando colocados em um ambiente desconhecido.[ ] As câmaras de campo aberto (c × l × a, 60 cm × 60 cm × 60 cm) foram feitas de Plexiglas com uma base quadrada não refletiva. A distância total percorrida em toda a câmara de campo aberto, a distância percorrida na zona central (30 cm × 30 cm, 50% da área total) e na zona de borda (20% da área total, ao longo das bordas) foram registradas. Menos atividade na zona central indicou comportamentos do tipo ansiedade.
Teste de Alternância Espontânea em Labirinto em Y
O comportamento de alternância espontânea indica a tendência dos camundongos de alternar suas escolhas (convencionalmente) não reforçadas em oportunidades sucessivas.[ ] A alternância espontânea no labirinto em Y foi empregada para avaliar a memória espacial de curto prazo e a memória operacional em camundongos por meio da medição de alternâncias espontâneas.[ ] O labirinto consistia em três braços, cada um com 31 cm de comprimento, 5 cm de largura e 10 cm de altura. Cada braço tinha marcadores de cores diferentes como pistas visuais distintas. Após serem colocados individualmente no centro do aparato, os camundongos foram autorizados a explorar livremente o labirinto durante uma sessão de 8 minutos. A alternância foi definida como entradas sucessivas nos três braços em conjuntos de tríades sobrepostas. O número de entradas nos braços e alternâncias foi registrado visualmente para calcular a porcentagem do comportamento de alternância com a seguinte fórmula: % Alternância = [Número de Alternâncias / (Número total de entradas nos braços - 2)] x 100. A alternância espontânea (%), definida como entradas sucessivas nos três braços em conjuntos de tríades sobrepostas, está associada à memória espacial de curto prazo.
Análise Estatística
Todos os experimentos in vitro foram realizados em triplicata, enquanto os estudos com animais foram conduzidos com pelo menos oito camundongos por grupo, exceto para ensaios envolvendo xenoenxertos apenas com PC3, nos quais foram utilizados três camundongos por grupo. Os dados são apresentados como média ± DP, exceto quando indicado de outra forma. O tamanho amostral (n) para cada análise estatística foi indicado sempre que possível. Métodos estatísticos usados para avaliar diferenças significativas com detalhes suficientes foram fornecidos. O GraphPad Prism (9.5.1) foi utilizado para coletar e analisar os dados, com significância estatística determinada de acordo com configurações individuais. Análises do modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox e do modelo de riscos proporcionais de Cox multivariado foram realizadas com o software estatístico SPSS. A significância estatística foi determinada por testes t de Student bicaudais não pareados, ANOVA de uma ou duas vias, testes de coeficientes de correlação de Pearson, Kruskal‑Wallis, testes de log‑rank, testes de Wilcoxon–Mann–Whitney ou testes exatos de Fisher. Quando a ANOVA indicou diferenças significativas, o teste post hoc de Tukey foi aplicado para comparar valores médios. Para todos os testes estatísticos, um valor de P < 0,05 foi considerado significativo. O tamanho amostral para cada experimento não foi pré‑determinado por método estatístico, e nenhum dado foi excluído das análises.

Conflito de Interesses
Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Contribuições dos Autores
H.Z. e Q.X. contribuíram igualmente para este trabalho. Y.S. concebeu este estudo, desenhou os experimentos e orquestrou o projeto. H.Z. realizou a maioria dos ensaios in vitro, parte dos experimentos in vivo e escreveu parte do manuscrito. Q.X. e Z.J. auxiliaram com cultura de células, tratamento com drogas, preparo de amostras e perfil proteômico de células senescentes humanas. R.S. conduziu a análise da expressão do fator SASP in vivo e testes de parâmetros bioquímicos do soro animal. Q.W., S.L., X.L., J.C. e J.L.K. forneceram aconselhamento construtivo e/ou supervisionaram um subconjunto específico de experimentos. W.Z. forneceu suporte financeiro parcial e contribuição conceitual. Y.S. e H.Z. realizaram a análise de dados, apresentação gráfica e finalizaram o manuscrito. Todos os autores leram criticamente e comentaram o manuscrito final.

Informações de Apoio
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados que apoiam os resultados deste estudo estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.