pmid: "41177867"
title: "A apigenina regula a sinalização CCR5/JAK1/STAT1/MMPs para aliviar a lesão cerebral secundária após hemorragia intracerebral e sua liberação aprimorada por meio de nanopartículas direcionadas."
authors: "Wu JW, Zhou YT, Wang BX, Shen LP, Zhang XQ, Du ZY, Wang P, Lu XJ, Miao ZL, Zhao XD"
journal: "Journal of nanobiotechnology"
pubdate: "2025 Nov 03"
doi: "10.1186/s12951-025-03748-6"
source: "PMC Full Text"
A apigenina regula a sinalização CCR5/JAK1/STAT1/MMPs para aliviar a lesão cerebral secundária após hemorragia intracerebral e sua liberação aprimorada por meio de nanopartículas direcionadas.
Autores
Wu JW, Zhou YT, Wang BX, Shen LP, Zhang XQ, Du ZY, Wang P, Lu XJ, Miao ZL, Zhao XD
Periodico
Journal of nanobiotechnology (2025 Nov 03)
Conteudo
Apigenina regula a sinalização CCR5/JAK1/STAT1/MMPs para aliviar a lesão cerebral secundária após hemorragia intracerebral e sua liberação aprimorada via nanopartículas direcionadas
A hemorragia intracerebral (HIC), um distúrbio cerebrovascular grave com alta mortalidade, leva à lesão cerebral secundária (LCS) principalmente por meio de neuroinflamação e ruptura da barreira hematoencefálica (BHE). Entre as cascatas patológicas, a ativação excessiva de macrófagos e a via de sinalização CCR5/JAK1/STAT1/MMPs desempenham papéis fundamentais na amplificação do dano neuronal. A apigenina (API), um flavonoide natural com propriedades anti-inflamatórias e neuroprotetoras, emergiu como um candidato terapêutico promissor para neutralizar esses processos. Neste estudo, desenvolvemos nanopartículas de PLGA carregadas com apigenina e funcionalizadas com DSPE-PEG2000-RVG29 e DSPE-PEG2000-ácido fólico (RVG/FA-NPs@API) para alcançar liberação direcionada a macrófagos inflamatórios e investigamos seus efeitos terapêuticos contra a LCS após HIC. Em um modelo murino de HIC, a administração de API melhorou significativamente os desfechos neurológicos, reduziu o edema cerebral, suprimiu a apoptose neuronal e preservou a integridade da BHE. Mecanicamente, a API ligou-se covalentemente ao JAK1 em Cys1052, inibindo sua fosforilação e subsequentemente regulando negativamente a cascata CCR5/JAK1/STAT1/MMPs. Além disso, as RVG/FA-NPs@API demonstraram excelente estabilidade, direcionamento cerebral eficiente e biocompatibilidade superior, alcançando eficácia terapêutica aprimorada em comparação com a API livre. Esses achados destacam uma nova estratégia para imunomodulação direcionada e fornecem insights translacionais sobre a liberação assistida por nanopartículas de compostos naturais para o tratamento da LCS induzida por HIC.
Resumo Gráfico
Informações Suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1186/s12951-025-03748-6.
Introdução
A hemorragia intracerebral (HIC) é um tipo de acidente vascular cerebral hemorrágico causado pela ruptura de vasos sanguíneos cerebrais, representando aproximadamente 15% de todos os AVCs, com uma taxa de mortalidade de até 70%. Após a HIC, a compressão mecânica do tecido cerebral circundante pelo hematoma é considerada a causa da lesão cerebral primária, enquanto a lesão cerebral secundária (LCS) resulta da lise dos glóbulos vermelhos dentro do hematoma. Esse processo desencadeia respostas inflamatórias, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial, apoptose neuronal e ruptura da barreira hematoencefálica (BHE). Embora as intervenções cirúrgicas atuais possam reduzir parcialmente a mortalidade em pacientes com HIC, a presença persistente de LCS piora significativamente os desfechos clínicos. Dados estatísticos indicam que apenas cerca de 20% dos pacientes com HIC recuperam o autocuidado básico dentro de seis meses, sobrecarregando famílias e a sociedade. Até o momento, nenhum tratamento farmacológico se mostrou eficaz em direcionar especificamente a LCS após HIC, tornando o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e alvos para mitigar a LCS induzida por HIC um desafio médico urgente.
Apigenina (API) é um composto flavonoide natural amplamente encontrado na natureza, derivado principalmente de plantas medicinais como aipo, salsa, tomilho e camomila. Estudos farmacológicos demonstraram que a API possui propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e antifibróticas significativas. Notavelmente, pesquisas também mostraram que a API pode promover a neurogênese ao regular positivamente fatores neurotróficos derivados do cérebro, aumentar a síntese de proteínas do neurofilamento e elevar a expressão de PSD-95 e sinaptotagmina. Além disso, foi demonstrado que a API protege a integridade da BHE em um modelo de hemorragia subaracnóidea ao inibir as respostas inflamatórias mediadas por TLR4. No entanto, o papel e os mecanismos subjacentes da API na HIC permanecem incertos.
A Janus quinase 1 (JAK1) é uma tirosina quinase intracelular não receptora composta pelos domínios FERM, SH2, pseudocinase e cinase, sendo capaz de fosforilar diversos genes e moléculas sinalizadoras a jusante, particularmente os transdutores de sinal e ativadores da transcrição (STATs). Além da JAK1, a família de proteínas JAK inclui JAK2, JAK3 e TYK2, que são amplamente expressas em múltiplos tipos celulares, especialmente em células relacionadas ao sistema imunológico. A via de sinalização JAK-STAT é ativada pela ligação de citocinas aos receptores de membrana e desempenha um papel fundamental na regulação da polarização de macrófagos, mediando a sinalização de interleucinas (ILs), interferons (IFNs) e quimiocinas. Como efetor a jusante da JAK1, o STAT1 regula a secreção de diversas enzimas proteolíticas, incluindo a metaloproteinase da matriz 9 (MMP9). A via de sinalização JAK-STAT-MMPs (metaloproteinases da matriz) é uma via inflamatória clássica que regula as proteínas de junção estreita na BHE, como a ocludina-1 (ZO-1) e a claudina-5 (CLDN5), contribuindo assim para a lesão hidrolítica e neuroinflamatória.
Como células imunes inatas, os macrófagos desempenham papéis críticos na fagocitose, apresentação de antígenos e produção de citocinas. Estudos anteriores confirmaram uma infiltração substancial de macrófagos ao redor do hematoma após HIC, onde esses macrófagos cooperam com a micróglia para promover a eliminação do hematoma através da fagocitose. No entanto, sob estimulação pelos produtos de degradação da hemoglobina, os macrófagos podem polarizar-se para o fenótipo pró-inflamatório M1, liberando fatores prejudiciais como as MMPs, exacerbando assim a LCE. Portanto, promover a polarização dos macrófagos para o fenótipo anti-inflamatório M2, preservando sua capacidade fagocítica e reduzindo a produção de fatores prejudiciais como as MMPs, é uma estratégia promissora para mitigar a LCE após HIC.
Sistemas de administração de nanofármacos têm sido amplamente aplicados no tratamento de doenças neurológicas devido à sua favorável capacidade de direcionamento, biodegradabilidade e penetração tecidual. O PLGA é um material biodegradável aprovado pela FDA que encapsula e sustenta eficazmente a liberação de fármacos de pequenas moléculas. Para direcionar precisamente macrófagos inflamatórios, desenvolvemos um sistema de nanopartículas carregadas com apigenina à base de PLGA (RVG/FA-NPs@API) modificado com o ligante da barreira hematoencefálica RVG29 e o ligante de direcionamento a macrófagos, ácido fólico (FA). O sistema evade a depuração reticuloendotelial, prolonga a circulação e integra a quimiotaxia mediada por neutrófilos com a responsividade mediada por macrófagos, permitindo a penetração espontânea da barreira hematoencefálica e o direcionamento seletivo de macrófagos M1, aumentando assim o acúmulo e a biodisponibilidade do fármaco nos locais da lesão. Além disso, empregamos simulação de dinâmica molecular, análise bioinformática e experimentos funcionais in vitro e In vivo para avaliar sistematicamente o mecanismo de ação e os efeitos neuroprotetores do API na HIC, visando fornecer novas estratégias terapêuticas e uma base translacional para o tratamento da LCS após HIC.
Materiais e métodos
Animais
Camundongos C57BL/6J fêmeas (6–8 semanas de idade, Cavens Laboratory Animal Co., Ltd., Changzhou, China) foram alojados sob condições controladas (22 ± 1 ℃, 55 ± 10% de umidade relativa, ciclo claro/escuro de 12 horas) e aclimatados por pelo menos três dias antes da cirurgia. Alimento e água foram fornecidos ad libitum. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Jiangnan, Wuxi (Número de Aprovação Ética: JN.No20220330c0480512[108]) e foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA.
Desenho experimental
O cronograma e o desenho experimental são mostrados na Fig. 1A. O teste de caminhada em grade (Grid Walking test), teste de rota-rod (Rotarod test), teste de colocação de membro anterior (Forelimb Placing test) e a medição do conteúdo de água cerebral foram realizados nos dias 1, 3 e 7; o teste de colocação de membro anterior foi repetido nos dias 14 e 21; e o labirinto aquático de Morris (Morris Water Maze) foi realizado no dia 35. Os grupos experimentais, números de animais e taxas de mortalidade observadas estão resumidos na Tabela S1.
Modelo de HIC
Conforme descrito anteriormente, o modelo de HIC foi estabelecido pela injeção de colagenase no ventrículo lateral. Os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 3% (30 mg/kg; Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Xangai, China). Cada camundongo foi colocado em um aparelho estereotáxico (RWD Life Science Co., Ltd., China), e um orifício foi perfurado no crânio (1 mm anterior ao bregma, 2 mm lateral à linha média). Uma microsseringa de 10 µL (Gaoge Co., Ltd., Xangai, China) foi inserida a 4 mm de profundidade no estriado direito. Em seguida, 0,5 µL de solução salina normal contendo 0,075 U de colagenase tipo IV (100162037, Sigma, EUA) foram injetados lentamente durante 5 min. Após a injeção, a agulha foi mantida no local por 5 min antes de ser retirada. O orifício foi selado com cera óssea, e o couro cabeludo foi suturado. No pós-operatório, os camundongos foram mantidos a 37,0 ± 0,5 °C usando uma almofada térmica. O grupo sham passou pelo mesmo procedimento, exceto que apenas solução salina normal foi injetada. No estudo de eficácia das nanopartículas, os camundongos submetidos à HIC foram aleatoriamente designados para cinco grupos (PBS, API, PLGA@API, RVG/FA-NPs@API). Às 24 h após a cirurgia, uma dose única foi administrada via injeção na veia da cauda (API equivalente a 1 mg/kg) para avaliar a circulação sistêmica e a capacidade de direcionamento.
Administração de medicamentos
Edaravona (HY-B0099, MedChemExpress, EUA), um agente neuroprotetor clinicamente aprovado para o tratamento de acidente vascular cerebral, foi utilizado como controle positivo. Edaravona e apigenina (A800500, Macklin, China) foram dissolvidas em um veículo composto por 10% de DMSO, 40% de PEG300, 5% de Tween-80 e 45% de solução salina. Às 24 h após a indução da HIC, medicamentos de pequenas moléculas, incluindo apigenina em doses baixa (5 mg/kg) e alta (20 mg/kg) e edaravona (30 mg/kg), foram administrados por via intraperitoneal para promover rápida absorção. Maraviroque (MVC), um antagonista seletivo de CCR5 (100 mg/kg para experimentos com animais ou 5 µL para experimentos com células, administrado por 6 h; S2003, Selleck Chemicals, EUA), foi dissolvido em 1% de DMSO. Em estudos com animais, o MVC foi administrado por via intraperitoneal em três momentos: 25 h antes da indução da HIC e 2 h e 23 h após a indução da HIC. MIP-1β/CCL4 recombinante de camundongo (rCCL4) (P6776, Beyotime, Xangai, China) tratou macrófagos por 12 h. Após a HIC, os grupos de tratamento receberam injeções intraperitoneais diárias de API ou edaravona por 7 ou 3 dias consecutivos. Os grupos sham-operados e HIC receberam volumes iguais de veículos. GM6001, um inibidor de MMP de amplo espectro, foi dissolvido em 5 µl de DMSO e administrado a camundongos via injeção na artéria carótida. Um composto de controle negativo (EMD Biosciences, La Jolla, CA, EUA) foi utilizado em paralelo.
Teste de comportamento neurológico
Testes comportamentais de curto e longo prazo foram realizados para avaliar déficits neurológicos em camundongos após HIC. Testes neurocomportamentais de curto e longo prazo foram conduzidos para avaliar déficits comportamentais após HIC em camundongos. Avaliações padronizadas foram realizadas de forma duplo-cega: (1) função neurológica utilizando a escala de Longa de 5 pontos; (2) integração sensório-motora pelo teste de colocação do membro anterior (taxa de resposta correta da pata dianteira esquerda); (3) coordenação motora e resistência pelo teste de rotarod acelerado (5–40 rpm/300 s, latência média de três tentativas); (4) coordenação dos membros pelo teste de caminhada em grade (frequência de passos em falso da pata dianteira esquerda); e (5) memória espacial pelo labirinto aquático de Morris no dia 35, incluindo 7 dias de treinamento com plataforma oculta (3 tentativas/dia) e um teste de sonda de 60 s, com medições do tempo no quadrante alvo, cruzamentos da plataforma e velocidade de natação. Antes da cirurgia, todos os camundongos foram submetidos a treinamento três vezes ao dia por três dias consecutivos. As avaliações comportamentais foram então repetidas nos dias pós-operatórios 1, 3 e 7. O teste de remoção adesiva e o LAM foram estendidos até o dia 28.
Avaliação do edema cerebral
Conforme descrito anteriormente, o conteúdo de água cerebral (BWC) foi medido usando o método de peso úmido/seco. Resumidamente, os cérebros foram rapidamente coletados 1, 3 e 7 dias após a injeção de colagenase. O peso úmido (PU) de cada região cerebral—incluindo os gânglios da base, córtex, cerebelo, hipocampo e tronco encefálico—foi registrado. As amostras foram então secas em estufa a 65 °C por 72 h para determinar o peso seco (PS). A extensão do edema cerebral foi avaliada calculando a razão entre o PU e o PS. A fórmula utilizada para determinar o BWC foi a seguinte: BWC (%) = [(PU - PS)/PU] × 100%.
Avaliação da permeabilidade da barreira hematoencefálica
Secções coronais do cérebro (20 μm) foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 20 min à temperatura ambiente e então incubadas por 2 h com IgG de cabra anti-rato purificada por afinidade conjugada com Cy3 (1:400; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Após a montagem, as imagens foram adquiridas usando um microscópio confocal LSM 700 (Carl Zeiss) e reconstruídas com Adobe Photoshop.
Coloração de Nissl e hematoxilina & eosina (H&E)
A coloração de Nissl avaliou a perda neuronal após HIC. Especificamente, secções coronais congeladas do cérebro com 16 μm de espessura foram imersas em solução de coloração de Nissl por 10 min, seguidas de 2 min de diferenciação em etanol graduado. As secções foram então montadas e observadas ao microscópio. Células positivas para Nissl foram quantificadas com aumento de 20× usando o software ImageJ (ImageJ 1.5, NIH, EUA). A coloração H&E foi realizada para avaliar o volume do hematoma. A secção contendo a maior área de hematoma—tipicamente ao nível do trajeto da agulha—foi selecionada para coloração. As secções coradas foram digitalizadas usando um microscópio Leica DM6, e o volume do hematoma foi medido usando o software ImageJ (ImageJ 1.5, NIH, EUA).
Coloração TUNEL
Para quantificar a apoptose neuronal 72 h após a HIC, foi realizada a coloração TUNEL (verde) utilizando um kit de detecção de apoptose in situ (C1088, Beyotime Biotechnology, Xangai, China). Neurônios TUNEL-positivos na região do hematoma foram contados manualmente. Três seções aleatórias foram analisadas para cada cérebro, e o número médio de neurônios TUNEL-positivos foi calculado utilizando o software ImageJ (ImageJ 1.5, NIH, EUA) com aumento de 200×. Os resultados foram expressos como a porcentagem (%) de neurônios TUNEL-positivos.
Western blot (WB)
As amostras de proteína foram misturadas com tampão de carregamento e aquecidas a 95 °C por 8–10 min, seguidas de eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS a 10% (E303-01, Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China). As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF ativadas com metanol (IPVH00010, Millipore, Billerica, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% em TBST à temperatura ambiente por 2 h e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários (diluição 1:1000). Após três lavagens com TBST (15 min cada), as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP (1:3000) à temperatura ambiente por 2 h. As bandas de proteína foram visualizadas utilizando reagentes de quimioluminescência intensificada (WBULP-100ML, Millipore, Billerica, MA, EUA) e analisadas quanto à densidade das bandas utilizando o software ImageJ (ImageJ 1.5, NIH, EUA). Os detalhes dos anticorpos são fornecidos na Tabela S2.
Isolamento de RNA e PCR quantitativa (qPCR)
O RNA total foi extraído do tecido cerebral 72 h após a HIC utilizando Trizol (79306, Qiagen, Hilden, Alemanha). O RNA foi transcrito reversamente em cDNA utilizando o Kit 5× All-in-One RT MasterMix (R333-01, Vazyme, Nanjing, China). A qPCR foi realizada em triplicata utilizando SYBR Green qPCR MasterMix (Q711-02, Vazyme, Nanjing, China). Os níveis de expressão de mRNA foram normalizados para β-actina e calculados utilizando o método 2-ΔΔCt. As sequências dos primers estão listadas na Tabela S3.
Imunofluorescência
Tecidos cerebrais embebidos em parafina foram seccionados com espessura de 4 μm para coloração por imunofluorescência. As secções foram primeiramente desparafinizadas e reidratadas em xileno e etanol graduado, seguidas de recuperação antigênica em tampão citrato de sódio em temperatura de ebulição por 1 h. Após o preparo, as secções foram bloqueadas com BSA 5% por 2 h e então incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários (diluição 1:150). No dia seguinte, as secções foram incubadas em temperatura ambiente por 1,5 h com anticorpos secundários — anti-coelho de cabra Cy3 (1:200, ab6939, Abcam, EUA) e anti-coelho de cabra Alexa Fluor 488 (1:200, ab150077, Abcam, EUA). Finalmente, as secções foram contracoradas com DAPI (C0065, Solarbio, Pequim, China) por 15 min, lavadas e imageadas usando um microscópio de fluorescência Zeiss (Zeiss Axio Imager 2, Alemanha). A imunofluorescência celular foi realizada de acordo com protocolos estabelecidos. As fibras neuronais foram quantificadas por coloração de imunofluorescência para MAP2, e o comprimento das fibras foi analisado por rastreamento com o software ImageJ. Células RAW264.7 ou HT-22 (3 × 10⁴ células por poço) foram semeadas em lamínulas em placas de 24 poços e cultivadas durante a noite. Após o tratamento com o fármaco, o meio de cultura foi removido e as células foram lavadas três vezes com PBS frio. As células foram então fixadas com paraformaldeído por 30 min, permeabilizadas com Triton X-100 0,5% por 15 min e bloqueadas com BSA 5% por 2 h. Anticorpos secundários marcados com fluorescência foram aplicados e incubados em temperatura ambiente por 1,5 h. As células, coradas com DAPI (C0065, Solarbio, Pequim, China) por 15 min, foram completamente lavadas e montadas com lamínulas. Imagens de fluorescência foram capturadas usando um microscópio Zeiss Axio Imager 2 (Alemanha).
Distribuição tecidual de RVG/FA-NPs@API em camundongos modelo de ICH
Camundongos modelo de ICH foram estabelecidos e injetados por via intravenosa com RVG/FA-NPs@API marcados com Cy5.5 (200 µL, 2 mg/mL) pela veia da cauda 24 h após a indução de ICH. A imagem de fluorescência in vivo foi realizada 1, 12 e 24 h após a injeção usando o sistema de imagem IVIS Spectrum (PerkinElmer, EUA). Após a eutanásia, os principais órgãos, incluindo cérebro, fígado, baço, pulmões, coração e rins, foram coletados para imagem ex vivo. A intensidade da fluorescência foi quantificada usando o software ImageJ para analisar o padrão de distribuição tecidual das nanopartículas.
Avaliação de direcionamento in vivo de RVG/FA-NPs@API
Após a eutanásia, o tecido cerebral foi coletado e dissociado em células únicas usando o Kit de Dissociação de Cérebro Adulto (130-107-677, Miltenyi Biotec, Alemanha). As células positivas para CD11b foram então enriquecidas usando MicroBeads CD11b (130-049-601, Miltenyi Biotec, Alemanha). As células enriquecidas foram submetidas à análise de citometria de fluxo usando anticorpos anti-CD86 de camundongo conjugados com PE (105007, BioLegend, EUA) na diluição de 5 µL por 1 milhão de células em um volume de coloração de 100 µL. A fluorescência Cy5.5 foi usada para avaliar a captação de nanopartículas. A proporção de células duplo-positivas Cy5.5⁺CD86⁺ foi analisada usando um citômetro de fluxo BD LSRFortessa™ X-20 (BD Biosciences, EUA) para avaliar a eficiência de enriquecimento de RVG/FA-NPs@API em macrófagos do tipo M1.
Análise de farmacologia de rede
A análise de farmacologia de rede foi conduzida conforme descrito anteriormente. Utilizamos bancos de dados, incluindo SwissTargetPrediction, PharmMapper e DrugBank, para identificar potenciais alvos associados à API. No banco de dados SwissTargetPrediction, alvos com pontuação de probabilidade superior a 0,1 foram selecionados como candidatos iniciais. Alvos relacionados à HIC foram recuperados do DisGeNET, OMIM e GeneCards. Para o banco de dados GeneCards, alvos com pontuação de relevância ≥ 20 foram incluídos. As palavras-chave usadas para a pesquisa incluíram "hemorragia intracerebral", "hemorragia dos gânglios da base", "acidente vascular cerebral hemorrágico" e "hemorragia intracraniana". Alvos relacionados a fármacos e doenças de cada banco de dados foram comparados, e entradas duplicadas foram removidas. A interseção dos dois conjuntos de alvos foi identificada e visualizada usando um diagrama de Venn da ferramenta online (https://bioinformatics.psb.ugent.be/).
Rede de interação proteína-proteína (PPI) e análise de enriquecimento
Os alvos sobrepostos do fármaco e da doença foram importados para o banco de dados STRING, com o organismo definido como Homo sapiens e o limite de pontuação de confiança definido como médio (0,4) para gerar uma rede PPI. Os dados de interação resultantes foram então importados para o software Cytoscape (versão 3.10.1), e os parâmetros de topologia de rede, incluindo grau, intermediação e centralidade de proximidade, foram analisados usando o plugin CytoHubba. A análise de enriquecimento funcional, incluindo enriquecimento de Ontologia Gênica (GO) e da via da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG), foi realizada usando o banco de dados Metascape (https://metascape.org/). Os critérios de triagem foram definidos como Homo sapiens e p < 0,05. As visualizações finais foram geradas usando a ferramenta de gráficos online WeChat.
Docking molecular
Docking molecular entre o API e a proteína JAK1—incluindo a proteína de comprimento total e cada um de seus quatro domínios individuais—foi realizado utilizando o AutoDock (versão 4.2.6). Os arquivos de estrutura da proteína no formato PDB foram obtidos do RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/). Após remover moléculas de água de solventes e ligantes, átomos de hidrogênio foram adicionados. Os arquivos PDBQT da proteína JAK1 e seus domínios foram preparados como arquivos receptores, enquanto o arquivo PDBQT do API foi utilizado como ligante para a análise de docking. Os resultados do docking foram analisados utilizando o AutoDockTools (versão 1.5.7), e as visualizações foram geradas utilizando o PyMOL (versão 2.4.1) e o Liplot (versão 2.2.8). O desvio quadrático médio (RMSD) entre as conformações ancoradas do API e sua estrutura original foi calculado utilizando o PyMOL. Um resultado de docking bem-sucedido foi aquele com RMSD ≤ 2,0 Å (0,2 nm).
Simulação de dinâmica molecular
As simulações de docking molecular e dinâmica molecular do API com a proteína JAK1 e seu domínio quinase foram realizadas utilizando o Discovery Studio (BIOVIA, Dassault Systèmes, Discovery Studio Modeling Environment, versão 2019). A simulação de dinâmica molecular envolveu as seguintes etapas: (1) O complexo proteína-ligante foi importado para o Discovery Studio, e a ferramenta "Prepare Protein" foi utilizada para pré-processar a estrutura da proteína. (2) O arquivo do ligante foi aberto, e o campo de força CHARMM36 foi aplicado para minimização de energia da proteína e do ligante antes da simulação. (3) O processo de dinâmica foi iniciado utilizando o protocolo "Standard Dynamics Cascade", com a janela do sistema solvente (Complex.dsv) definida como a janela ativa para a simulação de dinâmica molecular. (4) As flutuações das ligações de hidrogênio dentro do complexo proteína-ligante, juntamente com os valores de RMSD e flutuação quadrática média (RMSF) da cadeia principal e das cadeias laterais da proteína, foram analisadas utilizando o Discovery Studio.
Ensaio de atividade quinase in vitro
A proteína JAK2 humana ativa (Cat# J62-53G, Signal Chem, Canadá) foi diluída para uma concentração final de 0,1 µg/ml no Tampão de Diluição de Quinase III (Cat# K23-09, Signal Chem, Canadá) e, em seguida, incubada com substrato STAT3 marcado com His (3 µg), purificado a partir de células E. coli M15 utilizando esferas magnéticas Ni-NTA (Cat# 30210, Qiagen, Alemanha), juntamente com 5 µl de ATP. Diferentes concentrações de apigenina (10 µM e 20 µM; Cat# A800500, Macklin, China) foram adicionadas ao sistema de reação, que foi mantido a 30 ℃ por 30 min. As reações foram interrompidas adicionando-se tampão Laemmli 1× (Cat# 1610747, Bio-Rad, EUA) e fervendo a 95 ℃ por 5 min. O Western blotting foi realizado utilizando um anticorpo anti-fosfo-STAT3 (Cat# 9145, Cell Signaling Technology, EUA) para detectar a fosforilação de STAT3 mediada por JAK2 no resíduo Tyr705.
Cultura de células e ensaio de viabilidade celular
Viabilidade celular foi avaliada conforme descrito anteriormente. As linhagens celulares RAW264.7 e HT-22 (CL-0190/CL-0595, Procell Life Science & Technology Co., Ltd., Wuhan, China) foram semeadas em placas de 96 poços na densidade de 5 × 10³ células por poço em DMEM com alto teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram tratadas com várias concentrações (0, 12,5, 25, 50, 100 e 200 µM) de API ou API biotinilada por 12, 24 e 48 h. Após o tratamento, o reagente CCK-8 (C0038, Beyotime Biotechnology, Xangai, China) foi adicionado, e as células foram incubadas a 37 °C por 2 h em uma incubadora com 5% de CO₂. A absorbância foi medida a 450 nm usando um espectrofotômetro (Thermo Fisher Scientific, EUA).
Coloração de células vivas/mortas in vitro
A apoptose celular foi avaliada usando um método de coloração de células vivas/mortas. De acordo com as instruções do fabricante, foi utilizado um Kit de Ensaio de Viabilidade e Citotoxicidade Celular Calceína-AM/IP (C2015M, Beyotime, Xangai, China). Resumidamente, os neurônios cultivados foram lavados para remover esterases residuais do meio. Uma solução de trabalho contendo Calceína-AM (para células viáveis) e Iodeto de Propídio (IP, para células mortas) foi adicionada às células cultivadas, seguida por incubação a 37 °C por 30 min no escuro. Após a coloração, o estado das células vivas/mortas foi avaliado sob um microscópio de fluorescência (Zeiss Axio Imager 2, Alemanha). A proporção de células positivas para IP (mortas) em relação ao total de células foi quantificada para avaliar a integridade da membrana celular e a viabilidade.
Ensaio de pull-down para proteínas de ligação à API
Lisados de células RAW264.7 foram incubados durante a noite a 4 °C com biotina, API biotinilada ou API biotinilada pré-incubada com API livre. Após a incubação, esferas magnéticas conjugadas com estreptavidina (21115, Thermo Fisher Scientific, EUA) foram usadas para puxar para baixo (pull-down) as proteínas dos lisados a 4 °C por pelo menos 6 h. As esferas foram bem lavadas com PBS, e tampão de carregamento 5× foi adicionado. As amostras foram fervidas, e o sobrenadante foi coletado para detectar a proteína JAK1.
Ressonância de plasma de superfície (SPR)
A afinidade de ligação entre API e a proteína JAK1 (HY-P700583, MedChemExpress, EUA) foi avaliada usando o instrumento Biacore T200 baseado em SPR (Cytiva, Suécia). Um chip sensor CM5 foi usado para o experimento. A superfície do sensor foi ativada com uma mistura de 50 mM de NHS e 200 mM de EDC por 7 min. A proteína JAK1 (420 µg/mL), diluída em tampão acetato 10 mM (pH 4,5), foi imobilizada na superfície do chip a uma taxa de fluxo de 10 µL/min. A superfície foi então bloqueada com etanolamina 1 M (pH 8,5). Múltiplos ciclos de ligação foram realizados, e os sinais de resposta foram registrados com o tempo no eixo x e as unidades de resposta no eixo y. Os dados coletados foram ajustados usando o software de avaliação Biacore T200 com um modelo de ligação Langmuir 1:1 para determinar os parâmetros cinéticos, incluindo a constante de taxa de associação, constante de taxa de dissociação e constante de dissociação de equilíbrio. Os procedimentos experimentais e a análise de dados foram realizados pela TGTMED Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Xangai, China).
Ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA)
O CETSA foi realizado conforme descrito anteriormente. Resumidamente, camundongos ICH receberam injeção intraperitoneal de API (20 mg/kg), e células RAW264.7 foram tratadas com API (25 µM) por 8 h. Após o tratamento, o tecido cerebral do lado hemorrágico dos camundongos e os lisados proteicos das células RAW264.7 foram coletados. A estabilidade proteica foi avaliada em temperaturas variando de 50 °C a 71 °C. Após a desnaturação térmica, as amostras foram submetidas a três ciclos de congelamento e descongelamento usando nitrogênio líquido, em seguida centrifugadas a 20.000 rpm por 20 min a 4 °C. Os sobrenadantes foram coletados para análises posteriores.
Preparação de nanopartículas de PLGA e carregamento de API
Nanopartículas de PLGA carregadas com API foram preparadas pelo método de evaporação de solvente. Resumidamente, 50 mg de PLGA-COOH (LA: GA = 50:50, Mw = 30.000–60.000; P2191, Sigma-Aldrich, EUA) foram dissolvidos em 4 mL de diclorometano (DCM; D807825, Macklin, China), seguido pela adição de 10 mg de API. A mistura foi completamente agitada para formar a fase orgânica. Esta solução foi então adicionada gota a gota em 40 mL de uma fase aquosa contendo 1% de álcool polivinílico (PVA, Mw = 30.000–70.000; P8136, Sigma-Aldrich, EUA) sob condições de banho de gelo. Um sonicador de sonda (Scientz-IID, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd., China) foi usado para ultrassonicar a mistura a 200 W por 3 min (pausa de 2 segundos, pulso de 1 segundo). A emulsão resultante foi agitada a 500 rpm sob ventilação por 4 h para permitir a evaporação do DCM. As nanopartículas formadas foram coletadas por centrifugação a 12.000 rpm por 10 min (Modelo: 5810R, Eppendorf, Alemanha), lavadas três vezes com água deionizada e liofilizadas para armazenamento.
Funcionalização de superfície com RVG29 e FA
A modificação dupla foi alcançada pela incorporação de DSPE-PEG2000-RVG29 (HY-172705, MedChemExpress, EUA) e DSPE-PEG2000-FA (PS2-DEFA, Pengshuo Biotech, China). Resumidamente, 5 mg de nanopartículas de PLGA liofilizadas foram dispersas em 10 mL de PBS (pH 7,4), seguido pela adição de 0,5 mg de DSPE-PEG2000-RVG29 e 0,5 mg de DSPE-PEG2000-FA. A mistura foi sonicada em banho-maria a 37 °C por 10 min e agitada à temperatura ambiente por 12 h. As nanopartículas modificadas foram lavadas três vezes por centrifugação a 10.000 rpm, liofilizadas e designadas como RVG/FA-NPs@API. Para avaliar os respectivos papéis de direcionamento do RVG29 e FA, nanopartículas com modificação única também foram preparadas, nomeadamente RVG-NPs@API e FA-NPs@API. O procedimento foi idêntico ao do grupo de modificação dupla, exceto que apenas 0,5 mg de DSPE-PEG2000-RVG29 ou 0,5 mg de DSPE-PEG2000-FA foram adicionados, seguido de liofilização para armazenamento.
Caracterização do tamanho das partículas, potencial zeta e morfologia
A morfologia e o tamanho das nanopartículas foram caracterizados por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e espalhamento dinâmico de luz (DLS). TEM: Aproximadamente 3 µL de suspensão de nanopartículas foram depositados sobre uma grade de cobre de 200 mesh revestida com carbono, deixados em repouso à temperatura ambiente por 5 min, o excesso de líquido foi removido e corados negativamente com 3 µL de acetato de uranila a 1% (p/v) por 5 min. Após secagem, as amostras foram observadas a 80 kV usando um TEM (Tecnai-10, Philips, Holanda). DLS: O diâmetro hidrodinâmico, o índice de polidispersão (PDI) e o potencial ζ foram medidos usando um Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Reino Unido) com três réplicas independentes. Confirmação estrutural: RVG/FA-NPs@API (6 mg) foi dissolvido em DMSO-d6/D2O (3:2) e analisado por espectroscopia de 1 H NMR para verificar a conjugação.
Difração de raios X (XRD)
Os padrões de XRD foram obtidos usando um difratômetro equipado com um alvo de Cu e monocromador de grafite (Rigaku D/max 2500/PC, Japão). Radiação Cu-Kα (λ = 1,54 Å) foi usada como feixe incidente, com uma faixa de varredura de 5°−90°, operando a 40 kV e 200 mA, e uma taxa de varredura de 5°/min com tempo de contagem de 1 s.
Determinação da eficiência de encapsulação do fármaco (EE%) e eficiência de carga (LE%)
Para avaliar a EE% do fármaco, 5 mg de RVG/FA-NPs@API liofilizado foram dissolvidos em 1 mL de acetonitrila por sonicação. A concentração de API foi então determinada usando um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (Agilent 1260, EUA). Uma coluna C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm; Waters, EUA) foi usada com uma fase móvel de metanol:água (60:40, v/v) a uma vazão de 1,0 mL/min. O comprimento de onda de detecção foi ajustado para 340 nm. EE% e LE% foram calculadas com base na curva de calibração padrão.
Avaliação da estabilidade
Para avaliar a estabilidade de RVG/FA-NPs@API, as nanopartículas foram incubadas em tampão PBS e meio de cultura celular contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) por 0 e 24 h. Nos pontos de tempo designados, alíquotas da suspensão de nanopartículas foram coletadas e o tamanho das partículas foi medido usando DLS. Para avaliação da estabilidade de armazenamento a longo prazo, RVG/FA-NPs@API recém-preparado foi armazenado a 4 °C no escuro. Amostras foram coletadas nos dias 0, 15, 30, 45 e 60, e o tamanho das partículas foi medido via DLS para avaliar as mudanças ao longo do tempo.
Estudo de liberação do fármaco in vitro
Um total de 5 mg de RVG/FA-NPs@API foi ressuspenso em 1 mL de PBS (contendo 0,5% de Tween-80, a pH 7,4 ou pH 5,5) e colocado em uma bolsa de diálise (MW cut-off 10.000 Da; Spectrum Labs, EUA). A bolsa foi então imersa em 50 mL do tampão correspondente e incubada a 37 °C com agitação constante a 100 rpm. A 1, 2, 5, 7, 10, 25 e 50 h, 1 mL do meio de liberação foi coletado e substituído por um volume igual de tampão fresco. A concentração de API nas amostras de liberação foi determinada usando HPLC.
Avaliação da biocompatibilidade in vitro das nanopartículas
As células RAW264.7 foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1 × 10⁵ células/poço e polarizadas em macrófagos M1 por estimulação com LPS (1 µg/mL, L4391, Sigma-Aldrich, EUA) por 12 h, ou em macrófagos M2 por estimulação com IL-4 (20 ng/mL, 200-04, PeproTech, EUA) por 24 h. As células RAW264.7 polarizadas e as células HT22 foram então semeadas em placas de 96 poços (5 × 10³ células/poço) e cultivadas em DMEM com alto teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO₂. As células foram tratadas com RVG/FA-NPs@API em diferentes concentrações (5–25 µg/mL) por 24 h, seguidas pela adição de 10 µL/poço do reagente CCK-8 (Dojindo, Japão). Após incubação por 2 h a 37 °C, a absorbância foi medida a 450 nm.
Captação celular in vitro de nanopartículas
As células RAW264.7 foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 10⁵ células por poço e incubadas a 37 °C em atmosfera com 5% de CO₂ por 24 h. As células foram então transferidas para um meio DMEM fresco contendo RVG/FA-NPs@API marcado com FITC (conjugação FITC alcançada via enxerto covalente; Sigma-Aldrich, EUA) e incubadas por 6 h. Após a incubação, todas as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 20 min e lavadas com PBS. Os núcleos foram corados com DAPI por 15 min. Imagens de fluorescência foram capturadas usando um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM), e a captação celular de RVG/FA-NPs@API foi analisada quantitativamente usando um citômetro de fluxo (BD FACSvantage SE, EUA).
Análise estatística
Todos os experimentos foram conduzidos de forma randomizada e cega. Cada experimento in vitro foi repetido de forma independente pelo menos três vezes, e cada grupo in vivo incluiu mais de três camundongos. As análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism 10.0 (GraphPad Software Inc.). Para comparações entre dois grupos, foi utilizado o teste de comparação múltipla de Tukey. Para comparações de múltiplos grupos, foi aplicada análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias, seguida por testes post hoc apropriados. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os dados foram expressos como média ± desvio padrão (DP).
Resultados
Mortalidade animal e exclusão
Um total de 285 camundongos fêmeas C57BL/6 foram utilizados neste estudo, incluindo 261 no grupo de indução de HIC e 24 no grupo sham. Dezenove camundongos não apresentaram déficits neurológicos após a modelagem de HIC e não mostraram evidências de hematoma no tecido cerebral; portanto, foram excluídos da análise. A taxa de mortalidade geral foi de 7,4% (21/285). O grupo HIC + MVC apresentou a maior mortalidade (2/11), enquanto o grupo HIC + API 20 mg/kg apresentou a menor (2/60). Notavelmente, todos os camundongos nos grupos sham e controle sobreviveram até o final do experimento (Tabela S1).
Efeitos colaterais e toxicidade da API
API é um composto flavonóide, cuja estrutura é mostrada na Figura S1. Comparado com edaravona (Eda), ele exerce adicionalmente efeitos específicos na polarização de macrófagos e na via de sinalização CCR5/JAK1/STAT1. Dadas suas propriedades antitumorais, sua toxicidade potencial para tecidos normais foi avaliada. A predição de toxicidade usando ferramentas on-line indicou que o API possuía boa biocompatibilidade e era improvável de induzir efeitos tóxicos em camundongos em concentrações adequadas (Figuras S1A e S1B). Uma avaliação de segurança adicional foi realizada com base em estudos anteriores, com camundongos recebendo injeções intraperitoneais diárias de API a 5 mg/kg e 20 mg/kg por 7 dias consecutivos. A análise histológica (coloração H&E) do fígado, baço, pulmões e rins não revelou alterações estruturais significativas, confirmando sua biocompatibilidade favorável (Figuras S2A e S2C). Além disso, a análise bioquímica do soro de camundongos tratados com doses alta e baixa de API por 7 dias não mostrou diferenças significativas nos níveis de aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), creatinina sérica (CREA) ou ureia (UREA) em comparação com o grupo controle (Figura S2B).
O API melhora os déficits neurológicos e o edema cerebral induzidos por ICH em camundongos.
Os efeitos da API foram avaliados em um modelo de HIC em camundongos (Fig. 1 A, B). O sistema de pontuação de 5 pontos de Longa foi utilizado para avaliar déficits neurológicos de curto prazo durante as avaliações comportamentais. Em comparação ao grupo sham, os camundongos apresentaram comprometimentos neurológicos significativos um dia após a indução da HIC. No entanto, a administração diária de API nas doses de 5 ou 20 mg/kg por três ou sete dias consecutivos atenuou parcialmente esses déficits (Fig. 1 C). Além dos escores comportamentais, a API melhorou a função sensorial e motora em camundongos com HIC, conforme avaliado pelo teste de erro de pisada (foot-fault test), teste de rotarod acelerado e teste de remoção adesiva. O teste de erro de pisada revelou uma taxa de erro significativamente maior no membro anterior esquerdo dos camundongos com HIC, particularmente no dia 3 pós-HIC, em comparação aos controles sham. O tratamento com API em ambas as doses de 5 e 20 mg/kg reduziu significativamente a taxa de erro de pisada (Fig. 1D). No teste de rotarod, os camundongos com HIC tratados com API permaneceram na barra giratória por períodos mais longos, indicando recuperação parcial da coordenação motora (Fig. 1E). Além disso, a API reduziu significativamente o tempo necessário para detectar e remover as fitas adesivas no teste de contato e remoção adesiva, com melhora acentuada observada até o dia 21 pós-HIC. Isso sugere que a API promoveu a recuperação da função somatossensorial e motora (Fig. 1 F). Para avaliar a função cognitiva espacial, foi realizado o teste do labirinto aquático de Morris (MWM). A sonda de teste foi realizada no dia 35 após a HIC. A análise do trajeto de natação (Vídeo suplementar https://data.mendeley.com/datasets/8zx49bh5gb/1) mostrou que os camundongos sham nadaram predominantemente dentro do quadrante que continha a plataforma, enquanto os camundongos com HIC tiveram dificuldade em localizar o alvo. O tratamento com API melhorou acentuadamente o desempenho nesta tarefa (Fig. 1 J). Em comparação aos camundongos com HIC não tratados, os camundongos tratados com API apresentaram maior frequência de travessias sobre a plataforma (Fig. 1L) e aumento do tempo gasto no quadrante alvo (Fig. 1M). As velocidades de natação foram semelhantes entre todos os grupos (Fig. 1 K), indicando capacidades motoras comparáveis. Esses achados sugerem que a API melhora o aprendizado espacial e a memória em camundongos com HIC, com efeitos dose-dependentes na recuperação neurológica. O conteúdo de água cerebral (BWC) foi medido em 24, 48 e 72 h após a HIC para avaliar o edema cerebral. Em comparação ao grupo sham, o conteúdo de água nos gânglios da base e no córtex estava significativamente elevado nos dias 1, 3 e 7 pós-HIC (Figs. 1G-I), enquanto nenhuma alteração significativa foi observada no cerebelo, hipocampo ou tronco cerebral.
Notavelmente, edema cerebral acentuado foi observado nos gânglios da base e no córtex no 3º dia pós-HIC, o qual foi efetivamente aliviado pelo tratamento com API (Fig. 1H). O extravasamento de azul de Evans realizado no 3º dia pós-HIC demonstrou ainda aumento da permeabilidade da BHE no hemisfério ipsilateral dos camundongos com HIC. Essa disrupção foi parcialmente revertida pela administração de API (Figs. 2 A-I). Em resumo, os déficits neurológicos de curto prazo, o edema cerebral e a disrupção da BHE foram mais graves no 3º dia após a HIC, sendo este, portanto, selecionado como desfecho primário para os experimentos animais subsequentes.
API Alivia Déficits Neurológicos de Curto e Longo Prazo Induzidos por ICH em Camundongos. (A) Linha do tempo da administração do medicamento e testes comportamentais; (B) Diagrama esquemático do modelo de ICH e localização do hematoma; (C) Déficits neurológicos avaliados pelo sistema de pontuação de 5 pontos de Longa; (D) Teste de erro de pisada: porcentagem de passos errados do membro anterior esquerdo em relação ao total de passos; (E) Teste do rotarod: tempo que os camundongos levaram para cair da barra giratória; (F) Teste de colocação do membro anterior: avaliação da resposta motora (colocação do membro anterior esquerdo) à estimulação tátil das vibrissas esquerdas; (G-I) Análise estatística do BWC em diferentes regiões cerebrais nos dias 1, 3 e 7 após ICH; (J) Trajetórias de natação representativas de cada grupo no 35º dia pós-operatório no teste do labirinto aquático de Morris (MWM); (K) Comparação das velocidades de natação entre os grupos; (L) Comparação do número de cruzamentos sobre a plataforma no quadrante alvo original; (M) Comparação do tempo gasto no quadrante alvo (Quadrante IV). Todos os dados são apresentados como média ± DP. A significância estatística foi determinada usando ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 vs. grupo ICH, n ≥ 6; ns: não significativo
Efeitos do API no Volume do Hematoma e na Permeabilidade da BHE em Camundongos com ICH. (A) Diagrama esquemático mostrando diferentes regiões cerebrais no hemisfério ipsilateral, incluindo gânglios da base, córtex, cerebelo, hipocampo e tronco encefálico; (B) Morfologia macroscópica dos tecidos cerebrais de diferentes grupos no ensaio de azul de Evans; (C) Coloração com azul de Evans no limite do hematoma em tecidos cerebrais de cada grupo de tratamento; (D) Ilustração do procedimento cirúrgico utilizado para estabelecer o modelo animal de ICH; (E) Análise quantitativa das imagens coradas com azul de Evans; (F) Medições de absorbância do azul de Evans nos hemisférios afetados; (G) Quantificação da área do hematoma em cada grupo; (H) Contagem de núcleos na região peri-hematomal (n = 3); (I) Quantificação de corpos de Nissl na área central da hemorragia (n = 3). Os dados são apresentados como média ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. grupo ICH; ns: não significativo
API promove a resolução do hematoma e inibe a apoptose neuronal induzida por ICH in vivo
Para investigar mais profundamente os efeitos neuroprotetores do API contra SBI induzida por HIC, avaliamos a expressão de marcadores relacionados à apoptose, incluindo Bax, Bcl-2 e caspase-9 clivada. Em comparação com o grupo HIC, o tratamento com API aumentou de forma dose-dependente a expressão de Bcl-2 e reduziu os níveis de Bax e caspase-9 clivada na região peri-hematomal, indicando um efeito antiapoptótico (Figs. 3 A-C, E-F). Para avaliar o acúmulo do fármaco, amostras de soro e tecido cerebral ao redor do hematoma foram coletadas 4 horas após a administração de alta dose de API e analisadas por LC-MS direcionada. Os resultados revelaram que o API estava altamente enriquecido no sangue e no tecido cerebral, particularmente na área peri-hematomal (Figura S3). A imunofluorescência para MAP2 mostrou que o tratamento com alta dose de API reverteu a necrose cavitária causada pela HIC, preservando as fibras neuronais que pareciam "superficialmente desconectadas, mas estruturalmente contínuas". Em comparação com a organização normal dos neurofilamentos, o tratamento com alta dose de API preservou efetivamente a quantidade de neurofilamentos, mas apresentou um arranjo mais "desordenado", indicando retenção parcial de estruturas axonais danificadas e sugerindo regeneração neural em andamento (Fig. 3D). Esses achados apoiam a hipótese discutida na introdução, sugerindo que o API promove a preservação e regeneração dos neurofilamentos. Em seguida, no terceiro dia após a HIC, secções cerebrais coronais de cada grupo foram submetidas às colorações H&E, Nissl e TUNEL (Fig. 3 K). A coloração H&E revelou formação significativa de hematoma no grupo HIC em comparação com o grupo sham, enquanto o tratamento com API inibiu a expansão do hematoma (Figs. 3G-H). A coloração H&E adicional no local da injeção de colagenase indicou que o API acelerou efetivamente a resolução do hematoma (Fig. 3I). A coloração de Nissl foi utilizada para avaliar a integridade neuronal. No grupo sham, os neurônios exibiram morfologia intacta com corpos de Nissl proeminentes e fortemente corados no citoplasma. Em contraste, os neurônios do grupo HIC apresentaram danos morfológicos acentuados, incluindo ruptura da membrana, deformação e retração, acompanhados por redução da coloração dos corpos de Nissl. O tratamento com API restaurou de forma dose-dependente a morfologia neuronal, particularmente na região dos gânglios da base (Fig. 3 J). A coloração TUNEL demonstrou muitas células apoptóticas ao redor do hematoma no grupo HIC. O tratamento com API reduziu significativamente o número de células apoptóticas de maneira dose-dependente (Fig. 3L).
API atenua a morte neuronal e acelera a remoção do hematoma após HIC. (A) Análise de Western blot da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e da proteína antiapoptótica Bcl-2 em tecidos cerebrais de cada grupo; (B-C) Análise quantitativa dos níveis de expressão de Bax e Bcl-2, n = 6; (D) Imunocoloração para MAP2 mostrando a expressão de MAP2 em cortes cerebrais de diferentes grupos, barra de escala = 50 μm. A imagem representativa mostra sinais positivos para MAP2 no centro do hematoma (tratamento com API em dose alta); (E) Análise de Western blot da Caspase-9 e sua forma clivada (Caspase-9 clivada) no tecido cerebral perihematomal; (F) Análise de Western blot da expressão de Caspase-9 e Caspase-9 clivada, n = 6; (G) Representação esquemática do hematoma cerebral total após HIC, com cada cérebro dividido em cinco segmentos, ~2 mm por segmento; (H) Quantificação do volume do hematoma em cada grupo; (I) Imagens representativas coradas com H&E de cortes de tecido cerebral de cada grupo, barra de escala = 200 μm; (J) Coloração de Nissl mostrando alterações morfológicas nos neurônios ao redor do hematoma, com grânulos irregulares azul-escuros representando os corpúsculos de Nissl, barra de escala = 200 μm; (K) Ilustração esquemática das regiões cerebrais usadas para colocalização das colorações H&E e Nissl; (L) Coloração TUNEL detectando células apoptóticas em tecidos cerebrais perihematomais de cada grupo, com grânulos fluorescentes verdes indicando células TUNEL-positivas, barra de escala = 100 μm. Todos os dados são apresentados como média ± DP. A significância estatística foi determinada usando ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 vs. grupo HIC, n ≥ 6; ns: não significativo
API atua na via JAK-STAT inibindo a fosforilação da proteína JAK1
A farmacologia de rede identificou 70 alvos sobrepostos entre API e ICH (Fig. 4A-B). A análise de PPI e CytoHubba destacou MMP2, MMP9, MMP3, SRC, APP, KDR, ESR1 e EGFR como nós centrais (Fig. 4C-F). A validação funcional com o inibidor de MMP de amplo espectro GM6001 mostrou que API ou GM6001 isoladamente reduziram significativamente o conteúdo de água no cérebro (Fig. 4G) e o extravasamento de Azul de Evans (Fig. 4H), sem efeito aditivo quando combinados, indicando a inibição de MMP como um mecanismo downstream chave do API. A análise GeneMANIA dos 10 principais alvos hub revelou enriquecimento na atividade de tirosina quinase, regulação inflamatória e atividade de metalopeptidase (Fig. 4I-J; Figura S4). A análise GO implicou fosforilação de proteínas, atividade quinase e ligação a quinases, enquanto o enriquecimento KEGG apontou para as vias de sinalização JAK-STAT, NF-κB, IL-17 e TRP (Fig. 4K-L). A simulação de docking molecular e dinâmica molecular mostrou forte ligação do API ao JAK1 (−9,9 kcal/mol), abaixo do limiar de −5,0 kcal/mol (Figura S5A). A visualização no PyMOL indicou o API se encaixando em uma bolsa profunda do JAK1 (Fig. 4M; Figura S5B), formando ligações de hidrogênio com Asp1039, His885 e Glu925 (Fig. 4N). Os padrões de ligação se sobrepuseram aos do inibidor de JAK1, JAK1201 (Fig. 4O), e a dinâmica molecular confirmou a estabilidade do complexo (Figura S5C-E). Além disso, os resultados de docking molecular para a família MMP mostraram que o API exibiu energias de ligação relativamente baixas com MMP9, MMP2 e MMP3 (Figura S5F-H), e as conformações de menor energia foram obtidas (Figura S5I-K), sugerindo que o API também pode possuir potencial atividade de ligação às MMPs. In vivo, a fosforilação de JAK1 e STAT1 estava marcadamente aumentada no tecido peri-hematomal no dia 3 após ICH em comparação com Sham, enquanto o tratamento com API reduziu os níveis de fosforilação de forma dose-dependente (Fig. 4P-U).
API inibe a via de sinalização JAK-STAT ao ligar-se à proteína alvo JAK1. (A) Estrutura química e fórmula molecular da API; (B) Diagrama de Venn mostrando 70 alvos sobrepostos entre API e genes relacionados à HIC; (C) Rede PPI da API para HIC construída usando o banco de dados STRING; (D) Informações dos nós dos alvos relevantes na rede PPI; (E) Visualização da rede PPI usando Cytoscape, onde nós maiores representam alvos principais e cores mais escuras indicam associações mais fortes, com o círculo interno destacando os alvos centrais; (F) Identificação dos alvos centrais na rede PPI usando o plugin CytoHubba; (G) Análise quantitativa do BWC em camundongos entre diferentes grupos de tratamento; (H) Micrografias representativas mostrando extravasamento de IgG na vasculatura cerebral; (I) Análise de associação funcional dos alvos centrais usando GeneMANIA; (J) Análise de associação funcional da proteína alvo JAK1 usando GeneMANIA; (K) Gráfico de enriquecimento GO abrangendo BP, componentes celulares (CC) e funções moleculares (MF); (L) Análise de enriquecimento da via KEGG realizada usando Metascape; (M) Modelo de docking molecular da API com JAK1 visualizado no PyMOL; (N) Visualização no PyMOL mostrando interações de ligações de hidrogênio entre API e aminoácidos-chave da JAK1; (O) Visão asteroidal da estrutura do co-cristal JAK1 (PDB: 6RSC), onde o anel interno indica resíduos de contato direto e o anel externo indica resíduos de contato indireto, codificados por cores e dimensionados com base na estrutura secundária e número de átomos de contato; (P) Análise WB da expressão de p-JAK1/JAK1 em tecidos cerebrais perihematomais de cada grupo; (Q-R) Quantificação dos níveis das proteínas p-JAK1 e JAK1 por WB, n = 6; (S) Análise WB da expressão de p-STAT1/STAT1 em tecidos cerebrais de cada grupo; (T-U) Análise quantitativa dos níveis das proteínas p-STAT1 e STAT1, n = 6. Todos os dados são apresentados como média ± DP. A significância estatística foi determinada usando ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs. grupo HIC; ns: não significativo
API inibe a expressão de MMPs mediada por JAK-STAT para proteger os neurônios de lesões induzidas por macrófagos
MMP9, MMP2 e MMP3 foram identificados como alvos principais da API na HIC. O docking molecular revelou energias de ligação de −8,5, −7,5 e −7,9 kcal/mol, respectivamente, indicando potencial interação direta com MMPs (Fig. 5A). Western blot mostrou regulação positiva robusta de MMPs no tecido perihematomal após HIC, que foi reduzida de forma dose-dependente pela API (Fig. 5B), acompanhada pela preservação da expressão de ZO-1 e CLDN5 (Fig. 5C).
Em células RAW264.7, os ensaios CCK-8 não demonstraram citotoxicidade significativa do API em concentrações ≤ 50 µM com durações de tratamento < 24 h (Fig. 5D). Com base na dinâmica de p-JAK1 induzida por LPS (Fig. 5E), foram selecionadas concentrações de 25 e 50 µM com exposição de 12 h. Nessas condições, o API suprimiu significativamente a expressão de MMP9 e MMP3 induzida por LPS (Fig. 5F), confirmado por imunofluorescência (Fig. 5G, H), e inibiu de forma dose-dependente a regulação positiva de p-JAK1 e p-STAT1 (Figura S6). O meio condicionado de macrófagos estimulados por LPS (LPS-AM, 12 h) reduziu acentuadamente a viabilidade de HT-22, enquanto o meio de macrófagos pré-tratados com API (LPS-API-AM) melhorou a sobrevivência (Fig. 5I). Em células HT-22, o LPS-AM aumentou Bax e diminuiu BCL-2, alterações parcialmente revertidas pelo API (Fig. 5J, K). O LPS-AM também reduziu a expressão de NF-200, PSD-95 e GAP-43, enquanto o API restaurou esses marcadores (Fig. 5L, M); a coloração de células vivas/mortas confirmou ainda mais o aumento da sobrevivência neuronal (Fig. 5N). Esses resultados indicam que o API suprime a liberação de MMP durante a ativação de macrófagos, preservando assim a integridade da BHE e mitigando a lesão neuronal após HIC.
O API Melhora a Função da BHE e Inibe a Neurotoxicidade Mediada por Macrófagos via Supressão de MMP. (A) Modelo de docking molecular do API com MMP9 visualizado usando PyMOL e LigPlot, modelo de docking molecular do API com MMP3, modelo de docking molecular do API com MMP2; (B) Análise por Western blot (WB) da expressão de MMP9, MMP2 e MMP3 em tecidos cerebrais de camundongos e quantificação correspondente, n = 6; (C) Análise por WB da expressão de ZO-1 e CLDN5 em tecidos cerebrais e quantificação correspondente, n = 6; (D) Viabilidade de macrófagos avaliada pelo ensaio CCK-8, n = 6; (E) Análise por WB da expressão de p-JAK1 após estimulação com LPS, n = 6; Análise por WB da expressão de p-JAK1 em diferentes pontos de tempo após estimulação com LPS, n = 3; (F) Análise por WB e quantificação da expressão de MMP sob diferentes concentrações de tratamento com API, n = 3; (G-H) Detecção por imunofluorescência da expressão de MMP9 e MMP3, barra de escala = 50 μm; (I) Viabilidade celular de neurônios HT-22 após co-cultura com macrófagos tratados de forma diferente, após 12 h de tratamento com API em várias concentrações, viabilidade celular de neurônios HT-22 tratados com 40 μM de API; (J) Coloração por imunofluorescência de Bax; (K) Análise por WB da expressão de Bax e Bcl-2 em cada grupo, n = 3; (L) Análise por WB da expressão de NF-κB, PSD-95 e GAP-43 em neurônios, n = 3; (M) Coloração por imunofluorescência de NF-κB; (N) Coloração de células vivas/mortas para avaliar a viabilidade neuronal em cada grupo, com verde indicando células vivas. Todos os dados são apresentados como média ± DP. A significância estatística foi determinada usando ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. grupo HIC; ns: não significativo
Ativação da via CCR5/JAK1/STAT1/MMP no tecido cerebral peri-hematomal após HIC
Para aumentar a confiabilidade, dados de amostras clínicas de HIC foram recuperados do banco de dados GEO e submetidos à análise de DEGs. Após a normalização do conjunto de dados GSE24265, foram identificados 1.733 DEGs, incluindo 573 genes regulados negativamente e 1.160 genes regulados positivamente (Fig. 6A; Figura S7A). A análise de enriquecimento GO indicou envolvimento significativo de migração de leucócitos, adesão de leucócitos, regulação de respostas inflamatórias, ligação a receptores de citocinas, ligação a receptores de quimiocinas e ligação ao receptor de quimiocina CCR5 (Figura S7B-D). A visualização por gráfico de vulcão e mapa de calor mostrou ainda expressão elevada de CCL20 e CCL4 no tecido peri-hematoma (Fig. 6B), sugerindo possível acúmulo de monócitos/macrófagos. A análise de expressão gênica também revelou níveis elevados de CCL4, CCL5, CCR5, JAK1, STAT3 e MMP3 (Fig. 6C).
A análise de rede de coexpressão gênica ponderada (WGCNA) demonstrou que, com um limiar suave de 10, o índice de ajuste topológico R2 atingiu 0,7. Os módulos MEbrown e MEyellow foram fortemente correlacionados com o fenótipo de HIC, e a análise de enriquecimento indicou ativação de vias, incluindo sinalização de quimiocinas e lisossomo, com envolvimento a jusante da via JAK-STAT (Fig. 6D-H). Juntamente com os resultados de DEGs, esses achados sugerem que a via de sinalização CCR5-JAK1-STAT1-MMPs pode ser ativada após HIC.
Para avaliar melhor essa possibilidade, foram realizados qPCR e Western blot em tecido cerebral de camundongos peri-hematoma (Figura S7E-J). O qPCR mostrou expressão elevada de CCL3, CCL4 e CCL5 (Fig. 6I). O Western blot revelou regulação positiva acentuada de CCR5 no dia 3 após HIC, acompanhada por alterações dinâmicas em p-JAK1, Iba-1 e MMP9, que diminuíram no dia 7 (Fig. 6J). O tratamento com o inibidor específico de CCR5, MVC, reduziu significativamente os níveis de p-JAK1, p-STAT1, MMP3 e MMP9 (Fig. 6K). Em experimentos celulares, a estimulação com rCCL4 aumentou a expressão de CCR5 e p-JAK1 em macrófagos, enquanto o MVC bloqueou parcialmente esse efeito (Fig. 6L-M). A imunofluorescência confirmou esses achados (Fig. 6N).
Ativação da Via de Sinalização CCR5-JAK1-STAT1-MMPs na Região Peri-Hemática Após HIC.
(A) Gráfico de vulcão dos DEGs. Vermelho indica genes com expressão aumentada, cinza indica genes não significativos e azul indica genes com expressão reduzida. Critérios de triagem: p < 0,05 e log₂FC ≥ 0,5; (B) Mapa de calor dos DEGs, com vermelho indicando expressão alta e azul indicando expressão baixa; (C) Gráfico de barras da expressão de CCL4, CCL5, CCR5, JAK1, STAT3 e MMP3; (D) Mapa de calor das relações módulo-característica com os grupos HIC e controle, onde vermelho indica correlação positiva e azul indica correlação negativa; (E-F) Análises de enriquecimento GO e KEGG dos DEGs no módulo marrom; (G-H) Análises de enriquecimento GO e KEGG dos DEGs no módulo amarelo; (I) Validação por qPCR da expressão de CCL3, CCL4 e CCL5 após HIC; (J) Análise por WB e quantitativa dos níveis proteicos de CCR5, IBA-1, p-JAK1, JAK1 e MMP9 em tecidos cerebrais nos dias 1, 3 e 7 pós-HIC; (K) Análise por WB das proteínas relacionadas à via JAK1-STAT1-MMP no dia 3 pós-HIC; (L) Avaliação da expressão de CCR5 em macrófagos sob diferentes condições de tratamento após administração do inibidor de CCR5 MVC (100 mg/kg). O tratamento com rCCL4 aumentou a expressão de CCR5, enquanto API não mostrou efeito significativo; (M) Sob estímulo com rCCL4 (1 μg/mL), a avaliação da expressão de p-JAK1 revelou que MVC (5 μM) inibiu sua expressão; (N) Análise por imunofluorescência dos níveis de fosforilação de p-JAK1 em macrófagos após intervenção com MVC. Todos os dados são apresentados como média ± DP. A significância estatística foi determinada usando ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 vs. grupo HIC ou grupo HIC + 3 d; ns: não significativo
Coletivamente, esses resultados sugerem que CCR5 pode atuar como um receptor a montante de JAK1, transmitindo sinais após a ligação de quimiocinas para promover a fosforilação de JAK1 e subsequente expressão de p-STAT1 e MMPs. A via CCR5/JAK1/STAT1/MMPs pode contribuir para a ruptura da barreira hematoencefálica e déficits funcionais após HIC, embora validação in vivo adicional seja necessária.
API promove a polarização M2 de macrófagos tratados com LPS e reduz os níveis de expressão de TNF-α e IL-1β.
O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) foi realizado para analisar a heterogeneidade celular dentro do hematoma da HIC. Os resultados revelaram heterogeneidade acentuada, com os macrófagos exibindo a maior atividade de agregação, enquanto as células NK, células B e células DC mostraram atividade relativamente baixa (Figura S8A). A expressão de CCL5 foi enriquecida em células T CD8 e células NK, consistente com a análise de DEG (Figura S8B). O perfil de genes marcadores em distintos tipos celulares e o enriquecimento de GO em macrófagos indicaram a ativação da via de sinalização JAK-STAT mediada por CCL (Figura S8C, D). A expressão de MMP9 foi marcadamente maior em macrófagos em comparação com outros tipos celulares, exceto células DC (Figura S8E), sugerindo que os macrófagos são uma fonte principal de MMP9. A análise de curso temporal dos exsudatos do hematoma de pacientes com HIC mostrou que a abundância de macrófagos diminuiu substancialmente 66 h após a cirurgia e permaneceu em um nível mais baixo subsequentemente (Figura S8F, G).
Estudos anteriores relataram que os macrófagos M1 dominam durante a fase inicial da HIC, e sua redução está independentemente associada a desfechos favoráveis em 90 dias. Essas descobertas sugerem que os macrófagos M1 podem contribuir negativamente para a patologia da HIC ao secretar citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e IL-1β, sustentar respostas inflamatórias, promover a liberação de MMP e interromper a barreira hematoencefálica. Consistentemente, experimentos in vitro mostraram que a estimulação com LPS aumentou marcadamente a expressão de TNF-α e IL-1β em macrófagos (Figura S8H, K, L) e induziu a expressão de p-JAK1 (Figura S8H-J). O tratamento com API reduziu os níveis de TNF-α e IL-1β de maneira dose-dependente e suprimiu a regulação positiva de p-JAK1 induzida por LPS. A imunofluorescência demonstrou ainda que o LPS aumentou a expressão de iNOS e reduziu os níveis de Arg1, enquanto o tratamento com API reverteu essas alterações (Figura S8M, N). A análise de Western blot confirmou que o API promoveu uma mudança da polarização de macrófagos M1 para M2 (Figura S8O-Q).
O API co-localiza fortemente e se liga firmemente ao JAK1, sugerindo um padrão de ligação covalente irreversível entre eles.
API liga-se diretamente à JAK1 e afeta sua fosforilação. Imunofluorescência com API marcada com biotina mostrou colocalização com JAK1 em macrófagos (Fig. 7A-B; Figura S9). Ensaios de pull-down confirmaram ainda mais a interação (Fig. 7C). DARTS e CETSA demonstraram que o API aumentou a estabilidade da JAK1 de maneira dependente da concentração, enquanto SPR revelou forte afinidade (Kd = 9,956 × 10⁻⁶ M) (Fig. 7D-H). Experimentos de ordem de adição indicaram ligação irreversível. Quando as API-beads foram adicionadas primeiro, JAK1 foi consistentemente precipitada independentemente da presença de API (Fig. 7I). Em contraste, a pré-incubação com API impediu a captura subsequente de JAK1 pelas API-beads (Fig. 7J). Ensaios de quinase in vitro não mostraram efeito significativo do API na atividade de JAK2 (Fig. 7K). Realizamos ainda análises de docking molecular do API com os domínios quinase de JAK1 (RCSB PDB ID: 5E1E), JAK2 (RCSB PDB ID: 2B7A) e JAK3 (RCSB PDB ID: 3PJC) (Fig. 7L). Os resultados revelaram que o API apresentou a menor energia de ligação com JAK1 (–9,4 kcal/mol). O modelo de docking indicou formação de ligações de hidrogênio com os resíduos GLU, LEU e ARG, sugerindo a afinidade de ligação mais forte. Em contraste, as energias de ligação com JAK2 e JAK3 foram marcadamente maiores (–9,3 kcal/mol para ambos), implicando interações mais fracas ou menos estáveis.
API Co-localiza-se e Liga-se Irreversivelmente à Proteína Alvo JAK1.(A) As estruturas químicas da API e da API-biotina são mostradas; (B) Após tratamento de macrófagos com 50 nM de API-biotina por 6 horas, a coloração por imunofluorescência foi realizada usando anticorpo anti-biotina (vermelho) e anticorpo primário anti-JAK1, seguido por anticorpo secundário fluorescente (verde) para marcar a proteína alvo JAK1. Os núcleos foram corados com DAPI (azul). Imagens representativas de três experimentos independentes são exibidas, com caixas brancas indicando regiões de co-localização entre API e JAK1. Barra de escala = 50 μm; (C) API se liga a JAK1. Esferas magnéticas conjugadas com API foram competidas com ou sem API livre para ligação a JAK1 em lisados de macrófagos, e WB detectou as proteínas ligadas; (D-E) API aumentou a resistência da proteína JAK1 à degradação proteolítica, conforme determinado pelo ensaio DARTS; (F) A análise de SPR confirmou a interação de ligação entre API e JAK1; (G-H) CETSA foi realizada usando lisados de macrófagos para avaliar a estabilidade térmica de JAK1 após tratamento com 50 μM de API; (I) API liga-se irreversivelmente a JAK1. No grupo de co-tratamento, lisados de macrófagos foram incubados com esferas magnéticas conjugadas com API por 12 horas na presença ou ausência de API livre; (J) No grupo pós-tratamento, os lisados foram primeiro incubados com esferas magnéticas conjugadas com API por 12 horas, seguido por mais 12 horas de incubação com ou sem API livre. No grupo pré-tratamento, os lisados foram pré-incubados com API livre por 12 horas e depois incubados com esferas magnéticas conjugadas com API por mais 12 horas para verificar a ligação competitiva. (K) Ensaios de quinase JAK2 in vitro sob condições PTE (0 μM, 10 μM, 20 μM); (L) Análise de docking molecular da API com os domínios quinase de JAK1 (RCSB PDB ID: 5E1E), JAK2 (RCSB PDB ID: 2B7A) e JAK3 (RCSB PDB ID: 3PJC). Todos os dados são apresentados como média ± DP. A significância estatística foi determinada por ANOVA de duas vias seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 vs. grupo Veículo; ns: não significativo
Para investigar a interação covalente entre API e JAK1, realizamos uma análise detalhada dos domínios estruturais da JAK1. A proteína JAK1 compreende quatro domínios: FERM, SH2, pseudocinase e cinase. Os domínios FERM e SH2 são responsáveis pela transdução de sinal por meio de interações com receptores extracelulares. O domínio pseudocinase aumenta a atividade catalítica do domínio cinase, enquanto o domínio cinase em si possui uma função catalítica, convertendo ATP em ADP e promovendo a fosforilação da JAK1, ativando assim a via de sinalização JAK-STAT. A análise comparativa revelou que o API exibe a maior afinidade de ligação entre os quatro domínios ao domínio cinase (Figura S10A; Figura S11A). Essa interação é mediada por pontes de hidrogênio formadas com aminoácidos como Asp, His e Glu, com pontuações de ligação mostrando resultados consistentes (Figura S10A). Essa interação explica a capacidade do API de modular a fosforilação da JAK1.
A simulação de dinâmica molecular revelou ainda que os valores de RMSD da cadeia principal e das cadeias laterais do complexo API-JAK1 e seus componentes permaneceram estáveis dentro de 2,0 Å (Figura S10C-D). Esses achados indicam que o complexo do domínio cinase API-JAK1 manteve uma conformação estável sob condições dinâmicas. A variação dependente do tempo no comprimento das pontes de hidrogênio dentro da trajetória do complexo pequena molécula-proteína também foi analisada (Figura S10B). A simulação de dinâmica molecular demonstrou que o API foi profundamente inserido na fenda do domínio cinase da JAK1, causando um aperto de todo o complexo. Essa inserção levou ainda a uma elevação da cadeia lateral esquerda e a uma curvatura da cadeia lateral superior, resultando em uma conformação de "Perna para cima" e "Cabeça para baixo" (Figura S10F). Essas mudanças conformacionais induzidas pelo API no domínio cinase da JAK1 podem ser críticas na regulação de sua atividade catalítica. Para identificar ainda mais os aminoácidos-chave envolvidos na interação API-JAK1 cinase, realizamos mutagênese in silico (cálculo de energia livre de ligação) para identificar resíduos cruciais dentro do sítio ativo. Os resultados mostraram que Gly887, His918, Asp921, Leu1024 e Lys908 foram resíduos-chave mediando a interação com o API por meio da formação de pontes de hidrogênio (Figura S11B-D). Esse achado é consistente com os resultados de docking molecular. Embora a ligação por ponte de hidrogênio seja uma interação não covalente reversível, ela representa a etapa inicial de reconhecimento que pode facilitar a subsequente ligação covalente entre o API e a cinase JAK1.
O grupo carbonila α,β-insaturado na estrutura do API forma uma reação covalente com tiol com a cisteína 1052 no domínio cinase da JAK1.
A análise estrutural do API identificou três características críticas: (1) três grupos fenólicos, (2) uma ligação éter e (3) um grupo carbonila α,β-insaturado. A docagem molecular sugeriu que os grupos hidroxila fenólicos atuavam como doadores de ligação de hidrogênio, enquanto a ligação éter funcionava como aceptor de ligação de hidrogênio (Figura S10A). Com base em relatos anteriores, hipotetizou-se que a carbonila α,β-insaturada interagia covalentemente com resíduos de cisteína no domínio quinase JAK1. Para testar isso, JAK1 foi incubado com API-beads na presença ou ausência de β-mercaptoetanol (BME), ditiotreitol (DTT) ou ácido iodoacético (IAA), um agente alquilante de cisteína. As API-beads não conseguiram capturar JAK1 quando qualquer um desses reagentes estava presente, indicando competição por tióis (Figura S12A). O CETSA revelou que a estabilidade térmica de JAK1 induzida por API foi significativamente reduzida após o tratamento com IAA (Figura S12B-C), e o DARTS mostrou que BME ou DTT aboliram a estabilização mediada por API, resultando em maior degradação de JAK1 (Figura S12D). Consistentemente, BME ou DTT prejudicaram o efeito inibitório do API na fosforilação de JAK1 (Figura S12E). Esses achados destacam o papel essencial do grupo carbonila α,β-insaturado na ligação covalente entre API e resíduos de cisteína de JAK1.
Para explorar as relações estrutura-atividade, dois derivados foram sintetizados: catequina (CAT), que carece parcialmente da carbonila α,β-insaturada, e naringina (NAR), que a carece completamente (Figura S12F). Em comparação com API, a CAT exibiu supressão reduzida da fosforilação de JAK1, enquanto a NAR perdeu quase completamente a atividade inibitória (Figura S12G). Ensaios de pull-down mostraram ainda que API-beads precipitaram a proteína JAK1 e que o excesso de API livre bloqueou esse efeito, enquanto CAT e NAR não apresentaram atividade semelhante (Figura S12H). Ensaios de citotoxicidade demonstraram que Biotin-Linker-API e seus derivados não exibiram toxicidade significativa nas concentrações testadas (Figura S13A-E). Além disso, medições de ATP mostraram que a CAT reduziu moderadamente os níveis de ATP, enquanto a NAR causou uma redução acentuada (Figura S13F).
Análise da sequência de JAK1 identificou oito resíduos de cisteína conservados dentro do domínio quinase (Figura S12I). Para determinar sua contribuição potencial, mutagênese sítio-dirigida foi realizada para substituir cada cisteína por alanina (Cys892Ala, Cys944Ala, Cys988Ala, Cys1052Ala, Cys1078Ala, Cys1116Ala, Cys1120Ala e Cys1131Ala) (Figura S14A-H, Figura S15). Modelagem estrutural sugeriu Cys1052 como a mais estrategicamente posicionada para adição de Michael com o grupo carbonila α,β-insaturado da API, estando na proximidade mais próxima da porção reativa. A mutagênese sítio-dirigida de todas as oito cisteínas para alanina confirmou essa previsão: apenas a mutação de Cys1052 aboliu a ligação covalente API-JAK1 (Figura S12J-Q). A API inibiu a fosforilação de JAK1 do tipo selvagem, mas esse efeito foi acentuadamente atenuado no mutante Cys1052Ala (Figura S12S). Nenhum efeito comparável foi observado em JAK2, e as beads de API não conseguiram puxar a proteína JAK2 (Figura S12K, R). O alinhamento de sequências demonstrou que Cys1052 é altamente conservada entre espécies (Figura S12L).
Funcionalmente, a mutação de Cys1052 de JAK1 reduziu a capacidade da API de suprimir a expressão de MMP9 em células RAW264.7 (Figura S12U) e aboliu seu efeito neuroprotetor indireto contra apoptose em neurônios HT-22 (Figura S12T). A coloração vivo/morto confirmou ainda que sobrenadantes de células RAW tratadas com LPS e portadoras da mutação Cys1052Ala induziram morte marcante de células HT-22, apesar do tratamento com API (Figura S12V).
Em conjunto, esses resultados indicam que a API inativa JAK1 por meio de uma reação de adição de Michael, na qual seu grupo carbonila α,β-insaturado se liga covalentemente a Cys1052 dentro do domínio quinase de JAK1, uma modificação crítica para a neuroproteção mediada por API contra lesão induzida por macrófagos.
Construção bem-sucedida de RVG/FA-NPs@API visando macrófagos inflamatórios
Um sistema de nanotransporte de Apigenina com direcionamento ao sistema nervoso central e responsividade ao microambiente inflamatório (RVG/FA-NPs@API) foi construído com sucesso (Fig. 8 A). A análise de DRX mostrou que NPs@API exibiram picos amplos amorfos em ~ 16,7° e 22,5°; FA-NPs@API exibiram um pico adicional em ~ 28,5°; e RVG/FA-NPs@API apresentaram ainda novos picos em ~ 19,5° e 32,1° (Fig. 8B). Espectros de 1H RMN confirmaram a conjugação bem-sucedida de FA e RVG29, com sinais de prótons característicos observados em δ 6,6–6,8 ppm e δ 8,6–8,7 ppm para folato, e em δ 7,2–7,4 ppm e δ 3,0–3,2 ppm para aminoácidos de RVG29 (Fig. 8 C).
A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) revelou nanopartículas esféricas, uniformemente dispersas e com limites nítidos (Fig. 8D). As medições por DLS mostraram tamanhos médios de ~ 170 nm, 187 nm e 195 nm, e potenciais Zeta de −20,1 mV, −24,02 mV e − 28,6 mV para NPs@API, FA-NPs@API e RVG/FA-NPs@API, respectivamente (Fig. 8E-F). A análise por HPLC indicou uma eficiência de encapsulação de 68% e uma capacidade de carga de fármaco de 7,5% para RVG/FA-NPs@API (Fig. 8G). Os ensaios de liberação do fármaco demonstraram que a liberação de API foi marcadamente acelerada em pH 5,5 em comparação com pH 6,5 e 7,4 (Fig. 8H), indicando um comportamento ácido-responsivo. Microambientes ácidos (pH < 6,8) são comuns em doenças cerebrais, incluindo glioma, inflamação e acidente vascular cerebral isquêmico. Em modelos de glioma e acidente vascular cerebral isquêmico, o pH extracelular foi relatado como caindo para ~ 6,5, e em núcleos gravemente isquêmicos ou necróticos, até mesmo para ~ 6,0. Dados o efeito de massa do hematoma, a toxicidade do ferro decorrente da lise de eritrócitos e a neuroinflamação intensa, é provável que o microambiente patológico da HIC atinja, ou até mesmo fique abaixo, desse nível de acidificação. Os estudos de estabilidade não mostraram alteração significativa no tamanho das partículas ao longo de 24 h em PBS ou DMEM contendo 10% de soro (Fig. 8I), e as RVG/FA-NPs@API permaneceram estáveis por pelo menos 60 dias a 4°C sob condições de proteção contra luz (Fig. 8J). Coletivamente, esses dados demonstram que as RVG/FA-NPs@API possuem uma estrutura estável, carregamento eficiente de fármaco e responsividade ao microambiente ácido da HIC, fornecendo uma base para a validação funcional subsequente.
Síntese e Caracterização das RVG/FA-NPs@API. (A) Ilustração esquemática da síntese das RVG/FA-NPs@API, criada no BioRender; (B) Padrões de difração de raios-X (DRX) mostrando mudanças na estrutura cristalina das nanopartículas; (C) Espectros de RMN de ¹H para caracterização estrutural das nanopartículas; (D) Imagens de TEM mostrando a morfologia das NPs@API, FA-NPs@API e RVG/FA-NPs@API, barra de escala = 100 nm; (E) Tamanhos médios de partículas de nanopartículas modificadas de diferentes formas medidos por DLS; (F) Cargas superficiais das nanopartículas determinadas por análise de potencial zeta; (G) Eficiência de encapsulação (EE%) e eficiência de carregamento (LE%) de API em RVG/FA-NPs@API determinadas por HPLC; (H) Perfis de liberação de API das RVG/FA-NPs@API sob diferentes condições de pH avaliados por diálise; (I) Estabilidade do tamanho de partícula das RVG/FA-NPs@API em PBS e DMEM contendo 10% de SFB ao longo de 24 horas medida por DLS; (J) Estabilidade de armazenamento a longo prazo das RVG/FA-NPs@API a 4°C no escuro medida por DLS. Todos os experimentos foram repetidos três vezes
As RVG/FA-NPs@API exibem biocompatibilidade e capacidade de direcionamento favoráveis in vitro e in vivo
Estudos in vitro e in vivo avaliaram sistematicamente a biocompatibilidade e a capacidade de direcionamento do RVG/FA-NPs@API (Figura S16A). Ensaios CCK-8 não mostraram citotoxicidade para células RAW264.7 ou HT22 (Figura S16B). Em macrófagos M1 tratados com LPS, o RVG/FA-NPs@API marcado com FITC exibiu fluorescência citoplasmática marcadamente mais forte do que o NPs@API (Figura S16C), com a citometria de fluxo confirmando taxas significativamente maiores de FITC-positivos (Figura S16D). A captação foi dependente do tempo e mostrou uma clara preferência por macrófagos M1 em relação aos M2, com intensidade de fluorescência ~ 2,5 vezes maior, enquanto o NPs@API não direcionado não mostrou diferença (Figura S16E). O bloqueio do receptor com MVC ou FA livre reduziu significativamente a captação, com o MVC exercendo inibição mais forte (Figura S16E), indicando que o RVG29 tem como alvo o CCR5 enquanto o FA tem como alvo o FR, mediando conjuntamente a entrega específica para M1.
A imagem in vivo demonstrou que camundongos ICH + RVG/FA-NPs@API exibiram fluorescência cerebral marcadamente mais forte em comparação com ICH + NPs@API (Figura S16F). A análise de distribuição revelou que o RVG-NPs@API aumentou os sinais cerebrais, mas se acumulou no fígado, enquanto o FA-NPs@API se enriqueceu principalmente no fígado e no baço, com sinais cerebrais mais fracos. Em contraste, o RVG/FA-NPs@API mostrou a fluorescência cerebral mais forte com acúmulo periférico reduzido (Figura S16G). A citometria de fluxo confirmou ainda que a proporção de macrófagos CD86 + Cy5.5 + M1 foi maior no grupo RVG/FA-NPs@API, superando a das partículas de ligante único (Figura S16H). Juntos, esses achados demonstram que o RVG/FA-NPs@API possui excelente biocompatibilidade, robusta capacidade de direcionamento cerebral e entrega específica para macrófagos M1, fornecendo uma base sólida para a imunomodulação direcionada na HIC.
O RVG/FA-NPs@API inibe a via CCR5/JAK1/STAT1/MMPs dos macrófagos e alivia a neurotoxicidade mediada por macrófagos.
O mecanismo pelo qual RVG/FA-NPs@API regula os estados inflamatórios dos macrófagos e influencia a lesão neuronal foi investigado usando um protocolo in vitro de três etapas: ativação de macrófagos com LPS, intervenção com RVG/FA-NPs@API e subsequente cocultura com neurônios (Fig. 9A). Em células RAW264.7 estimuladas com LPS, RVG/FA-NPs@API reduziu significativamente a expressão de mRNA e proteína de CCR5, bem como os níveis de p-JAK1 e p-STAT1, sem afetar JAK1 total ou STAT3. A expressão de MMP9 e MMP3 também foi acentuadamente suprimida (Figs. 9B). TNF-α e IL-1β foram significativamente regulados negativamente (Fig. 9D). A imunofluorescência revelou diminuição de iNOS e aumento de Arg1, indicando uma mudança da polarização M1 para M2 (Fig. 9E). No modelo de cocultura com Transwell, a viabilidade neuronal aumentou significativamente quando exposta a sobrenadantes de macrófagos tratados com RVG/FA-NPs@API em comparação com macrófagos tratados com LPS (Fig. 9F). A coloração vivo/morto confirmou redução da necrose e apoptose neuronal, com morfologia preservada (Fig. 9G). WB demonstrou ainda regulação negativa de Bax e regulação positiva de Bcl-2, NF200, PSD95 e GAP43 nos neurônios (Fig. 9H). Coletivamente, RVG/FA-NPs@API inibiu citocinas e MMPs derivadas de macrófagos, promoveu a polarização M2 e conferiu neuroproteção ao aliviar a inflamação e preservar a integridade estrutural neuronal.
RVG/FA-NPs@API Alivia a Neurotoxicidade ao Inibir a Via CCR5/JAK1/STAT1/MMPs em Macrófagos.(A) Diagrama esquemático ilustrando o modelo de inflamação de macrófagos induzida por LPS, a intervenção de RVG/FA-NPs@API e seu mecanismo neuroprotetor, criado no BioRender; (B) Nível de expressão de mRNA de CCR5 em células RAW264.7 detectado por RT-qPCR; (C) Níveis de expressão proteica de CCR5, JAK1, p-JAK1, STAT1, p-STAT1, MMP9 e MMP3 em macrófagos determinados por WB; (D) Níveis de expressão proteica de TNF-α e IL-1β em células RAW264.7 detectados por WB; (E) Imunofluorescência de iNOS e Arg1 em células RAW264.7, barra de escala = 25 μm; (F) Viabilidade celular de neurônios HT-22 após cocultura com diferentes grupos de tratamento avaliada pelo ensaio CCK-8; (G) Apoptose e morte neuronal avaliadas por dupla coloração com Calceína-AM/IP, barra de escala = 50 μm; (H) Níveis de expressão das proteínas Bax, Bcl-2, NF200, PSD95 e GAP43 em neurônios detectados por WB. Todos os experimentos celulares foram repetidos três vezes. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001,****p < 0,0001 entre os grupos
RVG/FA-NPs@API Alivia o SBI
No modelo de HIC induzido por colagenase, PBS, Apigenina e PLGA@API foram usados como controles para avaliar a eficácia terapêutica de RVG/FA-NPs@API (Fig. 10A). No escore de Longa, teste do rotarod, teste de caminhada em grade e teste de colocação do membro anterior, tanto os grupos HIC + Apigenina quanto HIC + PLGA@API mostraram melhora significativa em comparação com o grupo HIC, enquanto o grupo RVG/FA-NPs@API demonstrou aprimoramento adicional em todas as medidas comportamentais (Figura S17A-D). No labirinto aquático de Morris no dia 35, os camundongos no grupo RVG/FA-NPs@API exibiram um número significativamente maior de cruzamentos sobre a plataforma e maior tempo gasto no quadrante alvo em comparação com os grupos HIC + Apigenina e HIC + PLGA@API, indicando recuperação superior da cognição e memória espacial (Figura S17E-F). A comparação direta das estratégias de direcionamento mostrou que as nanopartículas duplamente modificadas (RVG/FA-NPs@API) superaram as nanopartículas de modificação única (RVG-NPs@API ou FA-NPs@API) em todos os ensaios comportamentais, enquanto ambos os grupos de modificação única foram superiores às NPs@API não direcionadas, mas exibiram limitações claras (Figura S18A-F).
A análise do conteúdo de água cerebral revelou que a Apigenina e o PLGA@API reduziram o acúmulo de água nos gânglios da base e no córtex, enquanto o RVG/FA-NPs@API proporcionou redução adicional no edema cerebral (Fig. 10B). As análises histológicas com coloração HE e Nissl mostraram menor volume de hematoma, redução do dano tecidual e arranjo neuronal mais intacto no grupo RVG/FA-NPs@API (Figs. 10C-D). A coloração TUNEL (fluorescência verde) indicou a menor proporção de neurônios apoptóticos no grupo RVG/FA-NPs@API (Fig. 10E). A imunofluorescência demonstrou ainda uma regulação negativa mais forte de iNOS (verde) e regulação positiva de Arg1 (vermelho) no grupo RVG/FA-NPs@API, confirmando uma mudança pronunciada da polarização de macrófagos M1 para M2 (Fig. 10F). Os resultados de Western blot apoiaram essas descobertas, mostrando a maior redução em CCR5, p-JAK1, p-STAT1, MMP9 e MMP3, juntamente com a regulação positiva acentuada de ZO-1 e CLDN5 no grupo RVG/FA-NPs@API (Fig. 10G).
RVG/FA-NPs@API Alivia a LCE em Camundongos com HIC. (A) Diagrama esquemático do fluxo de trabalho experimental ilustrando a estratégia de intervenção e o desenho dos grupos de RVG/FA-NPs@API no modelo de HIC, criado no BioRender; (B) CEC em cada grupo medida pelo método de peso úmido-seco; (C) Alterações patológicas no tecido cerebral avaliadas por coloração H&E, barra de escala = 100 μm; (D) Arranjo e densidade neuronal no tecido cerebral avaliados por coloração de Nissl, barra de escala = 100 μm; (E) Proporção de neurônios apoptóticos no tecido cerebral detectada por coloração TUNEL, com células TUNEL-positivas mostradas em verde, barra de escala = 50 μm; (F) Níveis de expressão de iNOS (verde) e Arg1 (vermelho) no tecido cerebral detectados por imunofluorescência, barra de escala = 25 μm; (G) Níveis de expressão proteica de CCR5, p-JAK1, p-STAT1, MMP9, MMP3, ZO-1 e CLDN5 no tecido cerebral detectados por WB. Cada grupo incluiu n = 6 animais. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 entre os grupos.
Importante, a coloração de H&E dos principais órgãos (coração, fígado, baço, pulmão, rim) não mostrou toxicidade aparente em todos os grupos (Figura S19). Coletivamente, esses resultados demonstram que RVG/FA-NPs@API exercem efeitos terapêuticos superiores em comparação com Apigenina livre e nanopartículas não direcionadas, inibindo a sinalização inflamatória, reduzindo a apoptose, protegendo a barreira hematoencefálica e reprogramando a polarização de macrófagos, apoiando seu potencial para intervenção em lesão cerebral secundária após HIC.
Discussão
Após HIC, o sangue periférico entra no cérebro através de vasos rompidos, levando à formação de hematoma. Subsequentemente, células imunológicas do sangue periférico migram para o cérebro e se diferenciam em macrófagos/micróglia, participando ativamente dos processos biológicos subsequentes (PB). Devido à fisiopatologia complexa da HIC e às preocupações de segurança, nenhum agente neuroprotetor demonstrou ainda eficácia em ensaios clínicos. Este estudo destaca o potencial terapêutico promissor do API, particularmente em aliviar a ruptura da BHE e reduzir a apoptose neuronal causada pela HIC. No entanto, a tradução desses achados do laboratório para a aplicação clínica enfrenta obstáculos significativos. Os APIs ainda encontram várias limitações em ambientes clínicos, incluindo solubilidade em água, meia-vida biológica e desafios de otimização de dose. Portanto, há uma necessidade urgente de modificações estruturais e desenvolvimento de novas formulações. Além disso, os APIs demonstraram múltiplos efeitos em vários tipos celulares, reforçando ainda mais seu potencial como agentes terapêuticos multi-alvo. Este estudo focou principalmente no papel funcional do API em macrófagos, contribuindo indiretamente para a neuroproteção. Pesquisas futuras explorarão os efeitos do API em outros tipos celulares para aumentar seu potencial terapêutico em neurônios.
Nas últimas décadas, a JAK tornou-se um importante alvo no desenvolvimento de fármacos, particularmente para o tratamento de doenças imunológicas e inflamatórias. Em ensaios clínicos, os inibidores de JAK foram identificados como agentes eficazes para suprimir respostas inflamatórias. Consequentemente, esforços significativos foram dedicados à identificação de pequenos inibidores moleculares das proteínas JAK para o tratamento de distúrbios relacionados à inflamação imunológica. As proteínas JAK compreendem vários domínios funcionais: FERM (banda quatro-ponto-um, ezrina, radixina, moesina), homologia Src 2 (SH2), um domínio pseudocinase e um domínio quinase. Esses domínios são ainda divididos em sete subdomínios, denominados JH1-JH7. JH1 e JH2 estão localizados na extremidade C-terminal, enquanto JH3-JH7 residem na região N-terminal. JH1 codifica o domínio quinase catalítico responsável pela fosforilação de ATP e é essencial para a atividade da quinase. JH2 é um domínio pseudocinase sem atividade enzimática intrínseca, mas desempenha um papel regulatório fundamental na modulação da função de JH1. JH3 e JH4 contribuem para a manutenção da integridade estrutural da quinase, enquanto JH5, JH6 e JH7 estão envolvidos na modulação da atividade de JH1 e JH2. A interação entre JAK e seu receptor é crucial. As citocinas—incluindo IFNs, ILs e fatores de crescimento—e seus receptores correspondentes servem como ativadores primários da JAK. Após a ligação do ligante, o complexo receptor-ligante ativa a JAK associada ao receptor, catalisando a fosforilação dos resíduos de tirosina no receptor. Esse evento de fosforilação desencadeia o recrutamento de proteínas STAT a jusante, essenciais para mediar várias funções biológicas.
Neste estudo, fomos os primeiros a identificar e descrever o papel do API na promoção da depuração inata do hematoma e na facilitação da recuperação neurológica de curto e longo prazo em um modelo murino de HIC. Investigações adicionais revelaram que o eixo CCR5-JAK1-STAT1-MMPs foi ativado na região peri-hematomal após a HIC. Verificou-se que o API se liga à forma ativada de JAK1, levando à inativação da quinase JAK1, inibição de sua fosforilação e supressão das vias de sinalização a jusante. Esses achados corroboram a hipótese de que o API tem como alvo seletivo e inibe o eixo CCR5-JAK1-STAT1-MMPs, melhorando significativamente a SBI após HIC em camundongos.
Identificar alvos de medicamentos é fundamental para o desenvolvimento terapêutico. Para investigar o alvo celular direto do API, projetamos uma sonda de molécula pequena (API-biotina) baseada na estrutura do API e descobrimos que ela se liga efetivamente à proteína JAK1. Curiosamente, na presença do API, essa ligação ocorreu de forma irreversível em um modo "primeiro a entrar". Simulações subsequentes de docking molecular e dinâmica molecular indicaram que o API formou uma ligação covalente com o domínio quinase do JAK1. Notavelmente, a ligação do API ao domínio catalítico induziu mudanças conformacionais, incluindo movimentos de "levantamento de perna" e "corcunda". Essas transições conformacionais podem estar associadas à perda da atividade catalítica da quinase do JAK1. Os resíduos Gly887, His918, Asp921, Leu1024 e Lys908 foram considerados críticos nesse processo de ligação. Embora nosso estudo tenha demonstrado alterações conformacionais dentro do domínio quinase após a ligação do API, ele não explorou totalmente os efeitos em todos os quatro domínios do JAK1 nem definiu as mudanças estruturais precisas dentro de cada domínio. No entanto, essas descobertas sugerem que o API exerce seus efeitos principalmente modulando os domínios estruturais do JAK1.
Hipotetizamos que o ambiente químico formado pelas interações entre a molécula de API e os aminoácidos dentro de bolsas de ligação adjacentes desempenha um papel crítico na ligação covalente. Com base na literatura anterior, focamos no grupo carbonila insaturado do API e nos resíduos de cisteína dentro do domínio quinase do JAK1. Usando estratégias como redução da α-insaturação, alquilação de resíduos de cisteína e realização de mutações de alanina em todos os oito resíduos de cisteína dentro do domínio quinase, nossos resultados identificaram o grupo tiol da Cys1052 como o sítio de ligação covalente do API no JAK1. Essa ligação exibiu especificidade estrutural, permitindo que o API reconhecesse e se ligasse seletivamente ao JAK1.
Notavelmente, nossos resultados demonstraram que o API teve como alvo seletivo o JAK1, mas não o JAK2. Essa seletividade foi atribuída a um resíduo de glicina no sítio correspondente do JAK2, cujo grupo carboxila não é reativo ao API. Análises estruturais do JAK3 e TYK2 revelaram ainda que os sítios correspondentes contêm resíduos de glicina e histidina, respectivamente, nenhum dos quais atende aos critérios estruturais necessários para uma ligação estável com o API. Uma limitação deste estudo é que, devido a restrições de tempo e outros fatores, não validamos experimentalmente a especificidade do API contra outros membros da família JAK, como JAK3 e TYK2. No entanto, até onde sabemos, o API representa o primeiro inibidor alostérico de molécula pequena que tem como alvo direto e modula o resíduo Cys1052 dentro do domínio quinase do JAK1 para bloquear sua fosforilação. Notavelmente, o resíduo Cys1052 não foi previamente identificado como um sítio druggable para a inibição do JAK1.
Este estudo desenvolveu RVG/FA-NPs@API, projetado para entrega específica a macrófagos inflamatórios do tipo M1. O sistema apresentou características favoráveis tanto em experimentos in vitro quanto in vivo, incluindo tamanho de partícula uniforme, carga superficial estável e comportamento de liberação sustentada. Também demonstrou excelente estabilidade biológica e de armazenamento sob diversas condições de pH e FBS. Em um modelo de hemorragia intracerebral (HIC) em camundongos, o RVG/FA-NPs@API mostrou acúmulo direcionado substancial em sítios inflamatórios e boa biocompatibilidade. Suprimiu significativamente a expressão de p-JAK1, p-STAT1, MMP3, MMP9, TNF-α e IL-1β, promoveu a polarização de macrófagos M1 para M2 e melhorou a viabilidade e sobrevivência neuronal. Experimentos em animais confirmaram ainda que este sistema de nanopartículas reduziu efetivamente o volume do hematoma, preservou a integridade da barreira hematoencefálica (BHE) e melhorou os desfechos comportamentais. Além disso, a integração com microcápsulas programáveis comutáveis por luz pode permitir a administração precisa e personalizada de fármacos via microfluídica, fornecendo um conceito potencialmente valioso para sistemas de liberação programável por luz e futuras aplicações clínicas. No entanto, várias limitações deste estudo devem ser reconhecidas. A biossegurança a longo prazo requer validação adicional, falta verificação em amostras clínicas e certos mecanismos de sinalização permanecem incompletamente resolvidos. Em particular, o papel do eixo CCR5/JAK1/STAT1/MMP na mediação da ruptura da BHE e disfunção motora não foi verificado diretamente.
Este estudo ainda apresenta várias limitações. Primeiro, os achados são baseados principalmente em um modelo de HIC em camundongos, e as diferenças na patologia e farmacocinética entre animais e humanos limitam a tradução clínica direta. Segundo, apenas doses e janelas de tratamento limitadas foram testadas, deixando a dosagem ideal, o perfil de segurança e a eficácia a longo prazo incertos. Terceiro, o trabalho focou principalmente na sinalização CCR5/JAK1/STAT1/MMPs em macrófagos, enquanto os papéis dos neurônios, astrócitos e células endoteliais permanecem insuficientemente explorados. Quarto, embora o sistema de nanopartículas RVG/FA tenha mostrado direcionamento favorável, a produção em larga escala, a estabilidade a longo prazo e a potencial imunogenicidade podem representar desafios para a aplicação clínica.
Estudos futuros podem ser ampliados nas seguintes direções. Primeiro, a validação em modelos animais de grande porte e ensaios pré-clínicos é necessária para avaliar a eficácia e segurança para a tradução clínica. Segundo, sequenciamento de célula única e transcriptômica espacial devem ser utilizados para elucidar de forma abrangente os efeitos da apigenina em múltiplos tipos celulares e vias de sinalização. Terceiro, estratégias de tratamento otimizadas, incluindo gradientes de dose, janelas terapêuticas e terapias combinadas, devem ser investigadas para alcançar a máxima eficácia com efeitos colaterais mínimos. Quarto, a plataforma de nanopartículas RVG/FA pode ser estendida para administrar outros fármacos ou moléculas genéticas para HIC e doenças neurológicas mais amplas. Quinto, edição gênica e análises de amostras clínicas devem ser empregadas para validar o papel crítico do sítio JAK1-Cys1052, enquanto CCR5/MMPs ou marcadores inflamatórios periféricos podem ser explorados como potenciais biomarcadores para orientar a terapia de precisão.
Em conclusão, o sistema de nanopartículas RVG/FA-NPs@API teve como alvo o resíduo de cisteína conservado Cys1052 no domínio quinase de JAK1, bloqueando sua fosforilação e inibindo a via de sinalização CCR5/JAK1/STAT1/MMPs a jusante. Isso resultou em efeitos anti-inflamatórios e neuroprotetores, aliviando significativamente a LDH após HIC. Este estudo fornece novos insights e uma potencial estratégia terapêutica para a intervenção da LDH após HIC.
Conclusão
Neste estudo, ao construirmos RVG/FA-NPs@API direcionadas a macrófagos inflamatórios, validamos sistematicamente seus efeitos neuroprotetores significativos contra a LDH em um modelo de HIC em camundongos. Os resultados demonstraram que RVG/FA-NPs@API teve como alvo efetivo macrófagos inflamatórios do tipo M1 no cérebro, aliviou significativamente os déficits neurológicos, reduziu o edema cerebral e inibiu a apoptose neuronal. O mecanismo subjacente envolveu principalmente a regulação negativa do eixo de sinalização CCR5/JAK1/STAT1, que suprimiu a expressão de MMPs, estabilizou a BHE e mitigou as respostas inflamatórias e a citotoxicidade.
Informações Suplementares
Abreviações
ALT
Alanina aminotransferase
ANOVA
Análise de variância
API
Apigenina
API-biotina
Apigenina marcada com biotina
AST
Aminotransferase
BHE
Barreira hematoencefálica
BME
β-Mercaptoetanol
BP
Processos biológicos
BWC
Conteúdo de água cerebral
CAT
Catequina
CC
Componentes celulares
CCR5
Receptor de quimiocina tipo 5 C-C
CETSA
Ensaio de deslocamento térmico celular
CLDN5
Claudina-5
CLSM
Microscópio confocal de varredura a laser
CCL4
Ligante 4 de quimiocina C-C
SNC
Sistema nervoso central
CREA
Creatinina sérica
DARTS
Estabilidade alvo responsiva à afinidade do fármaco
DCM
Diclorometano
DEGs
Genes expressos diferencialmente
DLS
Espalhamento de luz dinâmico
DTT
Ditiotreitol
PS
Peso seco
EE%
Eficiência de encapsulação
FA
Ácido fólico
SBF
Soro fetal bovino
GO
Ontologia genética
H&E
Hematoxilina e eosina
HPLC
Cromatografia líquida de alta eficiência
IAA
Ácido iodoacético
HIC
Hemorragia intracerebral
IFNs
Interferons
ILs
Interleucinas
JAK1
Janus quinase 1
KEGG
Enciclopédia de genes e genomas de Kyoto
LE%
Eficiência de carregamento
MF
Funções moleculares
MMP9
Metaloproteinase-9 da matriz
MMPs
Metaloproteinases da matriz
MVC
Maraviroc
MWM
Labirinto aquático de Morris
NAR
Naringenina
p-JAK1
JAK1 fosforilado
p-STAT1
STAT1 fosforilado
PPI
Interação proteína-proteína
PVA
Álcool polivinílico
qPCR
PCR quantitativa
RMSD
Desvio quadrático médio da raiz
RMSF
Flutuação quadrática média da raiz
RVG/FA-NPs@API
Nanopartículas de PLGA carregadas com apigenina funcionalizadas na superfície com DSPE-PEG2000-RVG29 e DSPE-PEG2000-ácido fólico
SBI
Lesão cerebral secundária
scRNA-seq
Sequenciamento de RNA de célula única
SD
Desvio padrão
SPR
Ressonância de plasmon de superfície
STATs
Transdutores de sinal e ativadores da transcrição
TEM
Microscopia eletrônica de transmissão
UREA
Ureia
WB
Western blot
WGCNA
Análise de rede de coexpressão gênica ponderada
WW
Peso úmido
ZO-1
Zônula oclusiva-1
Nota do editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e filiações institucionais.
Jia-Wei Wu, Yi-Ting Zhou e Bing-Xin Wang são primeiros autores coautores
Contribuições dos autores
J.-W. Wu, Y.-T. Zhou e B.-X. Wang realizaram os experimentos e coletaram os dados. L.-P. Shen, X.-Q. Zhang e Z.-Y. Du contribuíram para a análise e interpretação dos dados. P. Wang auxiliou no desenvolvimento da metodologia e forneceu suporte técnico. X.-J. Lu, Z.-L. Miao e X.-D. Zhao conceberam e desenharam o estudo, supervisionaram o projeto e revisaram o manuscrito. J.-W. Wu redigiu o manuscrito. Todos os autores revisaram e aprovaram a versão final do manuscrito.
Financiamento
Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Concessão nº 82071381); pelo Fundo do "Décimo Quarto Plano Quinquenal" da Disciplina Médica Chave Provincial de Jiangsu (ZDXK202227); e pelo Fundo do Projeto de Ciência e Tecnologia para o Desenvolvimento Social da Província de Jiangsu (BE2022695).
Disponibilidade de dados
Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo e/ou em seus arquivos de material suplementar. Investigações adicionais podem ser direcionadas ao autor correspondente.
Declarações
Aprovação ética e consentimento para participação
Todos os experimentos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Jiangnan, Wuxi (Nº de Aprovação Ética: JN.No20220330c0480512[108]) e foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA.
Consentimento para publicação
Não aplicável.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Referências
O jejum intermitente reduz a neuroinflamação na hemorragia intracerebral através da via Sirt3/Nrf2/HO-1
A ativação do CCR5 promove a piroptose neuronal dependente de NLRP1 através da via CCR5/PKA/CREB após hemorragia intracerebral
A puerarina atenua a lesão cerebral precoce induzida por hemorragia intracerebral possivelmente pela ativação do sinal PI3K/Akt mediando a supressão da via NF-κB
Alfa-asarona melhora a deterioração neurológica de ratos com hemorragia intracerebral ao aliviar a lesão cerebral secundária por meio de vias anti-excitotoxicidade
O cérebro transforma células natural killer que exacerbam o edema cerebral após hemorragia intracerebral
Li X, Sr, Liu W, Jiang G, Lian J, Zhong Y, Zhou J, et al. Celastrol melhora a disfunção mitocondrial neuronal induzida por hemorragia intracerebral ao direcionar a proteína de troca ativada por cAMP‐1. Adv Sci. 2024;11. 10.1002/advs.202307556.
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Alterações imunes no sangue periférico e hematoma de pacientes com hemorragia intracerebral
Modificação covalente de Keap1 em Cys77 e Cys434 por Pubescenoside A suprime a ativação do inflamassoma NLRP3 induzida por estresse oxidativo na lesão de isquemia-reperfusão miocárdica
Liao L-X, Song X-M, Wang L-C, Lv H-N, Chen J-F, Liu D, et al. Inibição altamente seletiva de IMPDH2 fornece a base da terapia antineuroinflamação. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114. 10.1073/pnas.1706778114.
Uma estratégia de revestimento PEG responsiva ao pH para aumentar o enriquecimento de pequenas vesículas extracelulares em direção a regiões de doença com microambiente ácido
Apigenina tem como alvo a fetuína-A para melhorar a resistência à insulina induzida pela obesidade
Sinalização Jak-stat em inflamação e doenças relacionadas ao estresse: implicações para intervenções terapêuticas
Descoberta de fármacos de moléculas pequenas visando a via JAK-STAT
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Via de sinalização JAK-STAT, imunodeficiência, inflamação, desregulação imunológica e erros inatos da imunidade
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