pmid: "28012440"
title: "A inibição do Nrf2 reverte a resistência de células de câncer de cabeça e pescoço resistentes à cisplatina à ferroptose induzida por artesunato."
authors: "Roh JL, Kim EH, Jang H, Shin D"
journal: "Redox biology"
pubdate: "2017 Apr"
doi: "10.1016/j.redox.2016.12.010"
source: "PMC Full Text"
A inibição do Nrf2 reverte a resistência de células de câncer de cabeça e pescoço resistentes à cisplatina à ferroptose induzida por artesunato.
Autores
Roh JL, Kim EH, Jang H, Shin D
Periodico
Redox biology (2017 Apr)
Conteudo
A inibição de Nrf2 reverte a resistência de células de câncer de cabeça e pescoço resistentes à cisplatina à ferroptose induzida por artesunato
O artesunato, um medicamento antimalárico, foi reaproveitado como um medicamento anticancerígeno devido à sua indução de morte celular via produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). No entanto, os mecanismos moleculares que regulam a morte de células cancerígenas e a resistência das células ao artesunato permanecem obscuros. Investigamos os mecanismos moleculares por trás dos efeitos antitumorais do artesunato e uma abordagem para superar a resistência ao artesunato no câncer de cabeça e pescoço (HNC). Os efeitos do artesunato e da trigonelina foram testados em diferentes linhagens celulares de HNC, incluindo três linhagens celulares de HNC resistentes à cisplatina. Os efeitos desses medicamentos, bem como a inibição de Keap1, Nrf2 e HO-1, foram avaliados por viabilidade celular, morte celular, produção de glutationa (GSH) e ROS, expressão proteica e modelos de xenoenxerto tumoral em camundongos. O artesunato matou seletivamente células de HNC, mas não células normais. A sensibilidade ao artesunato foi relativamente baixa em células de HNC resistentes à cisplatina. O artesunato induziu ferroptose em células de HNC ao diminuir os níveis celulares de GSH e aumentar os níveis de ROS lipídicas. Esse efeito foi bloqueado pela co-incubação com ferrostatin-1 e um pré-tratamento com trolox. O artesunato ativou a via do elemento de resposta antioxidante (ARE) de Nrf2 em células de HNC, o que contribuiu para a resistência à ferroptose. O silenciamento de Keap1, um regulador negativo de Nrf2, diminuiu a sensibilidade ao artesunato em células de HNC. O silenciamento genético de Nrf2 ou a trigonelina reverteu a resistência à ferroptose de células de HNC silenciadas para Keap1 e resistentes à cisplatina ao artesunato in vitro e in vivo. A ativação da via Nrf2–ARE contribui para a resistência ao artesunato das células de HNC, e a inibição dessa via abole o HNC resistente à ferroptose.
Resumo condensado
Nossos resultados mostram a eficácia e o mecanismo molecular do tratamento com artesunato no câncer de cabeça e pescoço (HNC). O artesunato matou seletivamente células de HNC, mas não células normais, ao induzir uma ferroptose dependente de ferro e acumulada de ROS. No entanto, esse efeito pode ser subótimo em alguns HNCs resistentes à cisplatina devido à ativação da via do elemento de resposta antioxidante (ARE) de Nrf2. A inibição da via Nrf2–ARE aumentou a sensibilidade ao artesunato e reverteu a resistência à ferroptose em células de HNC resistentes.
Resumo gráfico
A inibição de Nrf2 atenua a resistência ao artesunato em células de HNC resistentes à cisplatina. O artesunato (Arts) mata seletivamente HNCs, mas não células normais, por meio da indução de ferroptose dependente de ferro e mediada por ROS. No entanto, o Arts aumentou a expressão de Nrf2, o que contribuiu para a resistência à ferroptose. Assim, a supressão de Nrf2 potencializa a ferroptose e causa a morte de células de HNC resistentes.
Destaques
- O artesunato matou seletivamente células cancerígenas ao induzir ferroptose.
- Isso foi subótimo em alguns HNCs resistentes à cisplatina devido à ativação da via Nrf2–ARE.
O silenciamento de Keap 1 induziu a ativação de Nrf2 e diminuiu a sensibilidade ao artesunato em células de CCP.
A ativação da via Nrf2–ARE contribuiu para a resistência à ferroptose das células de CCP.
O silenciamento de Nrf2 ou a trigonelina aumentaram a sensibilidade ao artesunato e reverteram a resistência à ferroptose.
Introdução
O câncer de cabeça e pescoço (CCP) é o sexto tipo de câncer mais comum no mundo, responsável por aproximadamente 650.000 novos casos de câncer e 350.000 mortes por câncer a cada ano. O carcinoma de células escamosas constitui mais de 90% dos CCPs que surgem nos órgãos essenciais responsáveis pela respiração, deglutição, articulação e fala, incluindo a cavidade oral/nasal, laringe e faringe. O CCP é comumente tratado com a abordagem multimodal de cirurgia, radioterapia e quimioterapia sistêmica. A radioterapia e a quimioterapia são tipicamente usadas para preservar a morfologia e a funcionalidade dos órgãos afetados pelo CCP. A cisplatina é usada como agente quimioterápico de primeira linha em combinação com radioterapia em um protocolo de preservação de órgãos para CCP. No entanto, a cisplatina é comumente associada à resistência adquirida e à toxicidade de vários órgãos em ambientes clínicos, o que leva a uma falha no manejo do paciente oncológico. Portanto, uma nova abordagem para contornar a resistência e a toxicidade da cisplatina é muito urgente para o tratamento melhorado do CCP. Recentemente, a indução de morte celular regulada não apoptótica foi apresentada como uma estratégia útil para eliminar células cancerígenas resistentes à apoptose induzida por drogas.
O artesunato é um derivado semi-sintético solúvel em água da artemisinina e um tratamento de primeira linha para a malária. O artesunato foi reposicionado como um fármaco anticancerígeno que induz a morte celular pela produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). As artemisininas aumentaram a toxicidade anticancerígena utilizando ferro ferroso para gerar radicais que poderiam matar células cancerígenas. O artesunato também induz apoptose mitocondrial mediada por ERO lisossomais e tem como alvo os sistemas de reparo e danos ao DNA em células cancerígenas resistentes a drogas quimioterápicas convencionais. Além disso, um relato recente sugeriu que o artesunato induzia estresse mitocondrial dependente de ferro, produtor de ERO, e apoptose não dependente de caspase. Recentemente, o artesunato foi identificado como um ativador específico de uma nova ferroptose não apoptótica, dependente de ferro e independente de caspase, que matava células cancerígenas resistentes com reprogramação do KRAS oncogênico. O artesunato foi testado por seus efeitos anticancerígenos em vários tipos de malignidades humanas, mas raramente usando células de CCP.
Ferroptose é uma nova forma de morte celular regulada, distinta da apoptose, necroptose e morte celular autofágica nos níveis morfológico, bioquímico e genético. Além disso, a inibição do antiportador cistina/glutamato (xCT), uma molécula-chave relacionada à ferroptose, pode induzir a erradicação da resistência de células cancerígenas à radioterapia ou quimioterapia convencionais. Recentemente, foi demonstrado que a ativação da via p62-Keap1 (proteína 1 associada à ECH semelhante a Kelch)-Nrf2 (fator 2 relacionado ao fator nuclear eritroide 2) determina a resposta terapêutica a terapias direcionadas à ferroptose em células cancerígenas.
Nosso estudo anterior sugeriu que a resistência à cisplatina em carcinomas de cabeça e pescoço (CCPs) pode ser superada pela indução da ferroptose. Além disso, o artesunato regula negativamente a RAD51 e aumenta a formação de γH2AX, resultando na sensibilização de células de câncer de ovário à cisplatina. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam a morte de células cancerígenas e a resistência ao artesunato permanecem obscuros. A resistência das células cancerígenas à ferroptose induzida por artesunato tem sido pouco estudada em cânceres humanos, incluindo CCPs. Investigações sobre este tópico levarão a uma melhor compreensão molecular e terapêutica de como o artesunato supera a resistência dos CCPs à quimioterapia convencional. Aqui, investigamos os mecanismos moleculares dos efeitos antitumorais e da resistência baseados no artesunato e identificamos uma abordagem para superar a resistência dos CCPs. A ativação da via do elemento de resposta antioxidante (ARE) do Nrf2 contribuiu para a resistência à ferroptose em células de CCP resistentes à cisplatina, e uma terapia combinada direcionando a via Nrf2-ARE com artesunato eliminou a resistência dos CCPs in vitro e in vivo.
Materiais e métodos
Linhagens celulares
As linhagens celulares de CCP (HN2–10) e as linhagens SNU foram adquiridas do Korea Cell Line Bank (Seul, República da Coreia) e autenticadas por impressão digital de DNA baseada em repetições curtas em tandem e reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex. As células foram cultivadas em meio mínimo essencial de Eagle ou meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) com 10% de soro fetal bovino a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Queratinócitos orais normais ou fibroblastos foram obtidos de pacientes submetidos a cirurgia oral e utilizados em ensaios in vitro. Três linhagens celulares de CCP resistentes à cisplatina (HN3-cisR, HN4-cisR e HN9-cisR) foram desenvolvidas a partir das linhagens parentais HN3, HN4 e HN9, respectivamente, submetendo-as à exposição contínua a concentrações crescentes de cisplatina. As concentrações inibitórias médias (IC50) da cisplatina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) nas células de CCP parentais (2,2–3,5 µM) e resistentes à cisplatina (25,5–38,9 µM) foram determinadas usando ensaios de viabilidade celular.
Ensaios de viabilidade celular
A viabilidade celular após exposição ao artesunato (1–100 μM, Sigma-Aldrich) e/ou trigonelina (100 μM, Sigma-Aldrich) com ou sem inibição e ativação genética de Nrf2 foi avaliada utilizando ensaios de MTT, exclusão por azul de tripano e clonogênico. Para o ensaio de MTT, as células foram incubadas com o composto de tetrazólio MTT (3-[4]-2,5-difenil-2H-tetrazólio brometo; Sigma-Aldrich) por 4 h, seguidas por um tampão de solubilização por 2 h. Em seguida, a absorbância foi medida a 570 nm usando um leitor de microplacas SpectraMax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). O ensaio de exclusão por azul de tripano foi realizado com coloração de azul de tripano a 0,4%, e as células foram contadas usando um hemocitômetro. O ensaio clonogênico foi realizado com uma solução de violeta cristal a 0,5% e quantificação do número de colônias (>50 células) após 14 dias em cultura. Um ensaio de morte celular foi realizado usando coloração com anexina V e iodeto de propídio (PI) (Sigma-Aldrich). As células coradas positivamente foram contadas usando citometria de fluxo e o software Cell Quest Pro (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA). Todos os ensaios foram realizados com amostras em triplicata e repetidos três vezes. O índice de combinação (IC) da interação medicamentosa foi calculado usando o método Chou–Talalay, com IC<1 definido como interação sinérgica (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ, EUA).
Síntese de glutationa e medição de ROS
Os níveis celulares de GSH foram medidos nos lisados de células expostas a diferentes fármacos por 24 h usando um kit colorimétrico de detecção de GSH (BioVision Inc., Milpitas, CA, EUA). A geração celular de ROS no sobrenadante de lisados de células HNC tratadas por 24 h foi medida adicionando 10 µM de 2ʹ,7ʹ-diclorofluoresceína diacetato (DCF-DA) (ROS citosólico; Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, EUA) ou 2 µM de C11-BODIPY C11 (peroxidação lipídica; Thermo Fisher Scientific) por 30 min a 37 °C. Os níveis de ROS foram analisados usando um citômetro de fluxo FACSCalibur equipado com CellQuest Pro (BD Biosciences).
Interferência de RNA e transfecção gênica
Para o silenciamento do gene KEAP1, células HN9 sensíveis à cisplatina foram semeadas. Para o silenciamento dos genes NFE2L2 e HMOX1, células HN3 e HN9-cisR resistentes à cisplatina foram semeadas. As células foram transfectadas 24 h depois com 10 nM de RNA pequeno interferente (siRNA) ou siRNA controle scrambled (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, EUA). Para o knockdown estável de KEAP1 ou NFE2L2, as células HN9-cisR foram transfectadas com um vetor lentiviral contendo RNA pequeno em grampo (shRNA) direcionado contra KEAP1 ou NFE2L2 ou shRNA controle (Transomic, Huntsville, AL, EUA). Células com transfecção estável foram selecionadas usando 2 µg/mL de puromicina (Sigma-Aldrich). O silenciamento gênico induzido por siRNA ou shRNA foi confirmado usando Western blotting e PCR quantitativo por transcrição reversa (RT–qPCR) a partir de 1 a 2 µg de RNA total de cada amostra usando o sistema SuperScript® III RT-PCR (Thermo Fisher Scientific).
Western blotting
As células foram plaqueadas, cultivadas até 70% de confluência e, em seguida, submetidas ao tratamento com os fármacos indicados. As células foram lisadas a 4 °C em tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (Thermo Fisher Scientific). Um total de 50 µg de proteína foi resolvido por SDS-PAGE em géis de 10–12%, transferido para membranas de nitrocelulose ou difluoreto de polivinilideno, e sondado com anticorpos primários e secundários. Os seguintes anticorpos primários foram utilizados: Nrf2, Keap1, NQO1, HO-1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido), xCT, p53, RAD51 e CD44 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). β-actina (Sigma-Aldrich) foi utilizado como controle de carga. Todos os anticorpos foram diluídos entre 1:500 e 1:5000.
Ensaio de atividade transcricional de Nrf2
A atividade transcricional de Nrf2 foi avaliada utilizando um kit Cignal Antioxidant Response Reporter (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.
Estudos pré-clínicos
Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da nossa instituição. Camundongos nus machos BALB/c atímicos de seis semanas de idade (nu/nu) foram adquiridos da Central Lab Animal Inc. (Seul, República da Coreia). Células HN9 (5×106) com ou sem transfecção de shRNA controle ou KEAP1 foram injetadas subcutaneamente em cada flanco. Os camundongos com nódulos palpáveis após as injeções celulares foram submetidos a tratamento com veículo, artesunato ou trigonelina. Após a eutanásia, os tumores foram extraídos e comparados entre os grupos. Em outro conjunto de experimentos pré-clínicos, células HN9-cisR (5×106) com ou sem transfecção de shRNA controle ou NFE2L2 foram injetadas subcutaneamente no flanco de camundongos nus. A partir do dia em que nódulos macroscópicos dos implantes tumorais foram detectados, os camundongos foram submetidos a seis tratamentos diferentes: veículo, artesunato (50 mg/kg diariamente, administração oral) ou trigonelina (50 mg/kg diariamente, administração oral) com transfecções de shRNA controle ou NFE2L2. Após a eutanásia, os tumores foram isolados e analisados para medições de GSH celular e coloração por imunofluorescência da formação de γH2AX. Unidades de fluorescência arbitrárias (AFU) foram comparadas entre os tumores tratados diferentemente. Testes U de Mann–Whitney bicaudais foram utilizados para comparar as diferenças estatísticas entre os grupos de tratamento.
Resultados
O artesunato mata seletivamente células cancerosas enquanto preserva células normais
O artesunato diminuiu a viabilidade de células HNC (câncer de cabeça e pescoço) tanto sensíveis à cisplatina (HN3, HN4 e HN9) quanto resistentes à cisplatina (HN3-cisR, HN4-cisR e HN9-cisR) de forma dose-dependente (Fig. 1A). A HN9 foi mais sensível ao artesunato do que a HN3 ou a HN4; no entanto, todas as células foram mortas por 100 μM de artesunato. As três linhagens celulares HNC resistentes à cisplatina apresentaram sensibilidade relativamente menor ao artesunato quando comparadas às suas linhagens parentais sensíveis à cisplatina. A viabilidade celular das linhagens HNC e células normais foi avaliada para determinar a sensibilidade ao artesunato. A viabilidade da maioria das linhagens HNC diminuiu significativamente, enquanto a maioria dos ceratinócitos orais humanos normais (HOK) e fibroblastos orais (HOF) sobreviveu ao tratamento com 50 μM de artesunato (Fig. 1B). A capacidade de formação de colônias diminuiu significativamente nas células HNC sensíveis à cisplatina e foi preservada nas células normais quando comparada às células HNC resistentes à cisplatina (Fig. 1C). As microfotografias representativas da inibição do crescimento celular pelo artesunato são mostradas na Fig. 1D.
O artesunato induz morte celular ferroptótica em células HNC
O artesunato diminuiu significativamente o número de células e colônias (todos P<0,001) (Fig. 2A e B). A viabilidade celular (a partir da coloração com anexina V–PI e medições de ATP) diminuiu significativamente nas células HNC (P<0,001) (Fig. 2C). A viabilidade diminuiu ainda mais com a adição de holo-transferrina (20 μg/mL), enquanto esse efeito foi marcadamente bloqueado pelo pré-tratamento com o quelante de ferro deferoxamina (100 mM) ou o antioxidante trolox (0,5 mM) (P<0,01). Além disso, os níveis totais de ROS e ROS lipídicos (a partir de medições de DCF-DA e BODIPY C11) aumentaram significativamente nas células HNC tratadas com artesunato, e esse efeito foi marcadamente bloqueado pela co-incubação das células HNC com ferrostatina-1 (20 μM) ou trolox (0,5 mM), mas não com necrostatina-1 (20 μM) (Fig. 2D). Em conjunto, nossos achados sugeriram que o artesunato induziu morte celular ferroptótica em células HNC.
A ativação do Nrf2 contribui para a resistência das HNCs à ferroptose induzida por artesunato
O artesunato diminuiu os níveis das proteínas xCT, RAD51 e Keap1, mas aumentou os níveis das proteínas p53 e Nrf2 nas células HN9 e HN9-cisR (Fig. 3A). Os níveis basais de Nrf2 foram maiores em células HNC resistentes à cisplatina quando comparadas com células sensíveis à cisplatina, e Nrf2, seu ARE, HO-1 e NQO1 foram ativados em células HNC após exposição ao artesunato (Fig. 3B). O artesunato ativou Nrf2 ao inibir Keap1, conforme demonstrado pelos indutores de ferroptose erastina e sulfassalazina (Fig. 3C). No entanto, os níveis de mRNA de Nrf2 permaneceram inalterados em três células HNC resistentes à cisplatina expostas ao artesunato ou à erastina (Fig. 3D). A expressão de Nrf2 nos extratos nucleares de células HNC tratadas com artesunato ou erastina aumentou acentuadamente (Fig. 3E). O artesunato e a erastina também induziram a atividade transcricional do repórter de luciferase do promotor de Nrf2, ARE, HO-1 e NQO1 (Fig. 3F e G). O silenciamento do gene KEAP1 ativou a via Nrf2-ARE e subsequentemente aumentou o número de células HN9 sensíveis tratadas com artesunato (Fig. 4A–C). A sensibilidade diminuída das células HN9 com Keap1 silenciado ao artesunato foi revertida por um tratamento combinado incluindo o silenciamento de Nrf2 ou o uso do inibidor de Nrf2 trigonelina (100 μM) (Fig. 4D). O artesunato diminuiu significativamente os níveis de glutationa (GSH) celular e causou acúmulo de ROS lipídicos, e esse efeito foi significativamente aumentado pela co-incubação de trigonelina em células HN3-cisR (P<0,05) (Fig. 4E e F).
A inibição da via Nrf2-ARE reverteu a resistência à ferroptose induzida por artesunato
O silenciamento dos genes Nrf2 e/ou HO-1 diminuiu a viabilidade celular de células HNC resistentes à cisplatina mais do que as células controle com siRNA após exposição ao artesunato (Fig. 5A e B). Em células HN3-cisR transfectadas com siNrf2, a viabilidade celular e o nível de GSH celular diminuíram significativamente, e os níveis de ROS celular aumentaram significativamente em comparação com o controle de siRNA. Esses efeitos foram bloqueados pelo pré-tratamento com o antioxidante trolox (P<0,01) (Fig. 5C–E).
Os efeitos in vivo do silenciamento genético ou farmacológico de Nrf2 em células HNC foram examinados. A inibição do crescimento tumoral induzida por artesunato foi reduzida em camundongos nus tratados com células HN9 transfectadas com shRNA Keap1 em comparação com camundongos controle com shRNA (Fig. 6A). No entanto, o co-tratamento com trigonelina diminuiu significativamente o crescimento tumoral in vivo e os níveis de GSH celular em camundongos que receberam células HN9 com Keap1 silenciado e Nrf2 ativado (Fig. 6B e C). Os volumes tumorais foram acentuadamente menores em camundongos nus tratados com células HN9-cisR transfectadas com shNrf2 ou trigonelina (Fig. 6D). Os níveis de GSH celular diminuíram muito e a formação de γH2AX aumentou muito nos tumores de camundongos co-tratados com artesunato e transfecção de shNrf2 ou trigonelina em comparação com camundongos controle com shRNA ou camundongos tratados apenas com artesunato ou trigonelina (P<0,05) (Fig. 6E e F). Portanto, o artesunato induziu sensibilidade ao artesunato em células HNC resistentes in vivo por meio da formação de γH2AX e depleção de GSH.
Discussão
O presente estudo examinou se o artesunato eliminou efetivamente as CECCs in vitro e in vivo. O artesunato matou seletivamente as células de CECC ao induzir uma ferroptose dependente de ferro e com acúmulo de EROs. No entanto, isso pode ser subótimo em algumas CECCs resistentes à cisplatina devido à ativação da via Nrf2–ARE. O silenciamento de Keap1, um regulador negativo de Nrf2, induziu a ativação da via Nrf2-ARE e diminuiu a sensibilidade ao artesunato nas células de CECC, produzindo assim células de CECC resistentes à ferroptose. O silenciamento genético de Nrf2 ou a trigonelina reverteu a resistência à ferroptose das células de CECC com silenciamento de Keap1 e resistentes à cisplatina. Portanto, o tratamento com artesunato em combinação com o direcionamento da via Nrf2-ARE eliminou efetivamente as células de CECC resistentes in vitro e in vivo. Este estudo é o primeiro a relatar os mecanismos moleculares da morte celular e resistência induzidas pelo artesunato em CECCs, bem como um método eficaz para superar a resistência à ferroptose.
O artesunato é um agente antimalárico usado preferencialmente à quinina como tratamento de primeira linha para malária grave em áreas endêmicas, por exemplo, malária por Plasmodium falciparum. O artesunato é um derivado semi-sintético solúvel em água das artemisininas, um grupo de medicamentos descoberto na década de 1970 por Tu Youyou, um dos ganhadores do Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2015. A artemisinina foi isolada do qinghao (Artemisia annua L ou absinto-doce) e usada como fitoterápico na medicina tradicional chinesa por pelo menos 2000 anos. A morte dos parasitas é causada pela ativação do heme e do óxido de ferro, resultando na geração de radicais livres que danificam proteínas suscetíveis.
Pesquisas iniciais avaliaram os efeitos anticancerígenos da artemisinina e seus derivados no carcinoma hepatocelular e em outros tipos de câncer. As EROs são liberadas quando o grupo peróxido lactona na estrutura do fármaco entra em contato com as altas concentrações de ferro comuns nas células cancerígenas. Assim, ocorre apoptose mitocondrial a partir da geração dependente de ferro de estresse oxidativo citotóxico. O artesunato também induz dano oxidativo ao DNA, quebras persistentes na dupla fita de DNA e a resposta ao dano nas células cancerígenas. Esses efeitos foram claramente observados em células de CECC sensíveis e resistentes à cisplatina em nosso estudo. No entanto, o padrão de morte celular induzido pelo artesunato pareceu ser uma nova forma de morte celular regulada, ou seja, ferroptose, com base em sua dependência de ferro, produção de EROs e morte celular independente de caspase. Dois relatos recentes também identificaram o artesunato como um ativador específico da ferroptose, destacando assim seu potencial para superar a resistência das células cancerígenas.
O estudo atual mostrou que o artesunato induziu ferroptose em células de CEC por meio da depleção de glutationa celular e acúmulo de EROs. Os efeitos foram abolidos pelo aumento da quelação de ferro celular e pela eliminação de EROs. O ferro é um nutriente dietético essencial que apresenta concentrações aumentadas em células cancerígenas para apoiar o crescimento celular. Células não cancerígenas são mais suscetíveis à adição de ferro do que à depleção de ferro. O ferro cicla entre formas oxidadas e reduzidas, contribuindo assim para a formação de radicais livres e a modulação da morte celular com EROs. A ferroptose é uma forma recentemente caracterizada de morte celular não apoptótica dependente de ferro, com características morfológicas e mecanísticas distintas. A ferroptose causa morte celular através do acúmulo de EROs lipídicas mediado pelo ferro e da interferência na integridade celular e na fluidez e permeabilidade da membrana. Nosso trabalho, bem como observações anteriores, identificaram o artesunato como um indutor específico de ferroptose em células cancerígenas com padrões distintos de morte celular, nomeadamente depleção de glutationa e acúmulo de EROs lipídicas. Semelhante aos relatos sobre erastina e sulfassalazina, os efeitos baseados no artesunato podem ser resultado da ativação do ferro ferroso e do bloqueio dos transportadores de cistina-glutamato. No entanto, nosso estudo mostrou ainda que a sensibilidade ao artesunato diminuiu em alguns CECs resistentes à cisplatina devido à ativação da via Nrf2–ARE. De fato, essa via também se mostrou capaz de diminuir a sensibilidade ao artesunato em células CEC sensíveis, contribuindo assim para a resistência à ferroptose das células CEC.
O Nrf2 é o principal regulador das moléculas antioxidantes nas células. De fato, o Nrf2 é um fator de transcrição oncogênico que desempenha um papel fundamental contra o estresse ambiental ou intracelular e controla os abundantes sistemas antioxidantes celulares responsáveis pela produção de GSH em células cancerígenas. As células cancerígenas frequentemente apresentam superexpressão de Nrf2, o que está associado ao aumento da resistência às terapias anticancerígenas e a resultados de sobrevida ruins em pacientes com câncer. Como o Nrf2 é constantemente degradado pela atividade proteassomal do Keap1, a inibição do Keap1 pode ativar a via Nrf2-ARE sob estresses oxidativos e eletrofílicos. A sensibilidade das células cancerígenas às terapias direcionadas à ferroptose é determinada pela ativação da via de sinalização antioxidante p62-Keap1-Nrf2. Essa via é um regulador negativo chave da ferroptose em células de carcinoma hepatocelular. A inibição de p62, do ARE de HO-1, NQO1 e da cadeia pesada da ferritina-1 aumentou significativamente a atividade antitumoral dos indutores de ferroptose, por exemplo, erastina, sulfassalazina e sorafenibe, em células de hepatoma. O knockdown de p62 promove o acúmulo da proteína Keap1 e potencializa a degradação de Nrf2 mediada por Keap1, sugerindo que a interação p62-Keap1 é responsável pela expressão de Nrf2 durante a ferroptose. No presente estudo, a ferroptose induzida por artesunato foi subótima em algumas células HNC resistentes devido à ativação da via Nrf2–ARE. As linhagens celulares de câncer resistentes à cisplatina mostraram menor suscetibilidade à morte celular ferroptótica induzida por artesunato. Além disso, a inibição genética de Nrf2 e/ou HO-1 ou o tratamento com trigonelina aumentaram a supressão do crescimento, o acúmulo de ROS e a morte celular ferroptótica quando coadministrados com artesunato. A inibição de Nrf2 combinada com indutores de ferroptose eliminou efetivamente as células HNC resistentes (Fig. 7).
O artesunato foi reaproveitado com sucesso como um medicamento anticancerígeno para vários tipos de câncer. O papel do artesunato como um medicamento anticancerígeno eficaz está sob investigação ativa em ensaios clínicos de fase I–II. A eliminação seletiva de células cancerígenas, mas não de células normais, pode ser a principal vantagem do artesunato, que já é conhecido por ser geralmente seguro e bem tolerado, mesmo no feto durante gestações no primeiro trimestre. No entanto, a terapia inibitória de Nrf2 combinada com artesunato será examinada com cautela em ambiente pré-clínico, pois o Nrf2 tem um efeito protetor contra danos oxidativos em tecidos normais. Nosso estudo levará a uma melhor compreensão molecular e terapêutica da ferroptose e do artesunato, o que pode levar à eliminação de células cancerígenas resistentes, por exemplo, células HNC resistentes à cisplatina.
Conclusão
Nosso estudo mostrou que o artesunato matou seletivamente células de CEC por induzir uma nova forma de ferroptose dependente de ferro e acumuladora de ROS lipídicas. No entanto, a morte celular ferroptótica pelo artesunato pode ser subótima em alguns CECs resistentes à cisplatina devido à ativação da via de sinalização antioxidante Nrf2–ARE. A inibição da via Nrf2–ARE aumentou a sensibilidade ao artesunato e reverteu a resistência à ferroptose em células de CEC. Investigações adicionais in vivo e clínicas devem ser conduzidas para explorar essa promissora terapia combinada baseada em artesunato para pacientes com tipos de câncer resistentes.
Contribuições dos autores
Jong-Lyel Roh e Eun Hye Kim conceberam e desenharam os experimentos. Jong-Lyel Roh, Eun Hye Kim, Hyejin Jang e Daiha Shin realizaram os experimentos. Jong-Lyel Roh e Eun Hye Kim analisaram os dados. Jong-Lyel Roh e Eun Hye Kim contribuíram com reagentes/materiais/ferramentas de análise; Jong-Lyel Roh e Eun Hye Kim redigiram o rascunho, verificaram e revisaram. Todos os autores aprovaram a submissão desta versão para esta publicação.
Financiamentos
Este estudo foi apoiado por uma Bolsa (nº 2015R1A2A1A15054540) do Programa de Pesquisa Básica em Ciências através do (NRF), e uma Bolsa (nº HI15C2920) do Projeto Coreano de P&D em Tecnologia da Saúde através do (KHIDI), , Seul, República da Coreia (J.L. Roh).
Declaração de conflito de interesses
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Referências
Estatísticas globais do câncer, 2012, CA
Avanços recentes no câncer de cabeça e pescoço
Padrões de regressão tumoral com base na duração do acompanhamento em pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço tratados com radioterapia ou quimiorradioterapia
Valor prognóstico da tomografia por emissão de pósitrons/tomografia computadorizada volumétrica em pacientes com carcinoma nasofaríngeo tratados com quimiorradioterapia concomitante
Quimioterapia concomitante à base de platina ou cetuximabe com radioterapia para câncer de cabeça e pescoço localmente avançado: uma revisão sistemática e meta-análise de estudos publicados
Mecanismos moleculares da resistência à cisplatina
Marcas do câncer: a próxima geração
Necrose regulada: relevância da doença e oportunidades terapêuticas
Artesunato versus quinina para tratamento de malária falciparum grave: um ensaio randomizado
Efeitos terapêuticos do artesunato no carcinoma hepatocelular: reaproveitamento de um antigo agente antimalárico
Reaproveitamento do fármaco antimalárico artesunato como um novo agente terapêutico para carcinoma metastático de células renais devido à sua atenuação do crescimento tumoral, metástase e angiogênese
Uma nova abordagem conceitual de tratamento para glioblastoma recidivante: mineração coordenada das vias de sobrevivência com nove medicamentos reaproveitados (CUSP9) pela Iniciativa Internacional para Melhoria Acelerada do Cuidado do Glioblastoma
A sabedoria das multidões e o reaproveitamento do artesunato como um fármaco anticâncer
Melhora da citotoxicidade das artemisininas em direção às células cancerosas pelo ferro ferroso
Melhora da citotoxicidade da artemisinina em direção às células cancerosas por nanopartículas de nanotubos de carbono mediadas por transferrina
Artesunato induz apoptose mediada por ROS em células T de leucemia resistentes à doxorrubicina
Artesunato ativa apoptose mitocondrial em células de câncer de mama via produção de espécies reativas de oxigênio lisossomais catalisada por ferro
Artesunato derivado da medicina tradicional chinesa induz dano e reparo ao DNA
Artesunato induz dano oxidativo ao DNA, quebras persistentes na fita dupla do DNA e a resposta ao dano ATM/ATR em células cancerígenas
Artesunato sensibiliza células de câncer de ovário à cisplatina ao regular negativamente RAD51
Artesunato supera a resistência a medicamentos no mieloma múltiplo ao induzir estresse mitocondrial e apoptose não dependente de caspase
Identificação do artesunato como um ativador específico da ferroptose em células de câncer pancreático
O derivado da artemisinina artesunato induz radiossensibilidade em células de câncer cervical in vitro e in vivo
Artesunato induz apoptose mediada por ROS e p38 MAPK e neutraliza o crescimento tumoral in vivo em células de rabdomiossarcoma embrionário
Contribuição das espécies reativas de oxigênio para a parada do crescimento e morte de células de câncer de ovário pelo medicamento antimalárico artesunato
Ferroptose: morte por peroxidação lipídica
Ferroptose: processo e função
Ativação da via p62-Keap1-NRF2 protege contra ferroptose em células de carcinoma hepatocelular
Indução da morte celular ferroptótica para superar a resistência à cisplatina no câncer de cabeça e pescoço
Estabelecimento e caracterização de uma linhagem celular de carcinoma de células escamosas oral resistente à cisplatina, H-1R
Estudos de combinação de medicamentos e sua quantificação de sinergia usando o método de Chou-Talalay
A descoberta da artemisinina (qinghaosu) e dádivas da medicina chinesa
Genômica da resistência a medicamentos do antimalárico artemisinina
Terapia experimental do hepatoma com artemisinina e seus derivados: atividade in vitro e in vivo, quimiossensibilização e mecanismos de ação
Ferro e câncer: insights recentes
O papel do ferro e das espécies reativas de oxigênio na morte celular
NRF2 e câncer: o bom, o ruim e a importância do contexto
Modulação do estresse oxidativo como estratégia anticâncer
Nrf2 aumenta a resistência de células cancerígenas a medicamentos quimioterápicos, o lado escuro do Nrf2
Estresses oxidativos e eletrofílicos ativam Nrf2 através da inibição da atividade de ubiquitinação de Keap1
Farmacocinética populacional do artesunato e diidroartemisinina durante administração oral prolongada de artesunato a pacientes com câncer de mama metastático
Estudo piloto duplo-cego, controlado por placebo, da terapia oral com artesunato para câncer colorretal
Embriotoxicidade dos antimaláricos artemisinina e consequências potenciais para uso em mulheres no primeiro trimestre
O medicamento antimalárico artesunato melhora o dano oxidativo pulmonar na asma alérgica experimental
Artesunato protege contra lesão pulmonar induzida por sepse via indução da heme Oxigenase-1
Artesunato mata seletivamente células de câncer de cabeça e pescoço (CCP) mas não células normais. (A, B) A viabilidade celular foi avaliada após exposição a diferentes concentrações de artesunato (Arts) em células normais (HOK e HOF) e células CCP, incluindo células resistentes à cisplatina (cis) (HN3-cisR, HN4-cisR e HN9-cisR) e suas células parentais (HN3, HN4 e HN9). (C) Ensaios clonogênicos de células CCP e células normais expostas a diferentes concentrações de Arts foram realizados em triplicata. (D) Microfotografias mostram células CCP sensíveis à cis (parentais) e resistentes após exposição a veículo ou 50 μM de Arts por 72 h.
Fig. 1.
Artesunato induz ferroptose mediada por ROS e dependente de ferro em células CCP. (A) Mudança no número de células HN9 sensíveis à cis tratadas com 50 μM de Arts em diferentes dias de tratamento. As células não receberam pré-tratamento ou receberam pré-tratamento com holo-transferrina (HTF, 20 μg/mL), o quelante de ferro deferoxamina (DFO, 100 mM) ou o antioxidante trolox (0,5 mM). As barras de erro representam o erro padrão de três experimentos independentes, cada um realizado em triplicata. (B) Ensaio de formação de colônias para células CCP resistentes à cis tratadas com 50 μM de Arts por 72 h. (C) A morte celular foi determinada por coloração com anexina V e PI e citometria de fluxo. A viabilidade celular foi medida pelos níveis de ATP celular em células HN9 expostas a 50 μM de Arts por 72 h. As células foram pré-tratadas com HTF, DFO ou trolox. (D) Elevação de ROS total (DCF-DA) e lipídica (BODIPY C11) em células HN9 expostas a 50 μM de Arts por 24 h com ou sem necrostatin-1 (Nec-1, 20 μM), ferrostatin-1 (Fer-1, 20 μM) e trolox (0,5 mM). As barras de erro representam o erro padrão de três réplicas. *P<0,01 em relação a Arts sozinho.
Fig. 2.
Artesunato aumenta os níveis de expressão de Nrf2 durante a ferroptose em células CCP. (A, B) Análises de Western blot de células HN9 sensíveis à cis e três células CCP resistentes à cis expostas a Arts por 24 h. β-actina foi usada como controle de carregamento. (C) Mudança nos níveis de proteína Nrf2, Keap1 e HO-1 após exposição a dimetilsulfóxido como controle (NT), 50 μM de Arts, 20 μM de erastina ou 2 mM de sulfassalazina (SAS) em células HN9-cisR. *P<0,01 em relação ao controle. (D) Os níveis de mRNA de Nrf2 foram avaliados em três tipos de células CCP resistentes à cisplatina expostas a 50 μM de Arts ou 20 μM de erastina por 24 h. (E, F) Expressão de Nrf2 em extratos nucleares e atividade transcricional de Nrf2 em células HN3-cisR tratadas com 50 μM de Arts ou 20 μM de erastina por 24 h. (G) Mudanças nos níveis de mRNA de HO-1 e NQO1 em células CCP resistentes à cis expostas a 50 μM de Arts ou 20 μM de erastina por 24 h. As barras de erro representam o erro padrão de três réplicas. *P<0,01 em relação ao controle NT.
Fig. 3.
A ativação de Nrf2 contribui para a resistência da ferroptose em HNC. (A-D) Células HN9 sensíveis à cis foram transfectadas com siRNA controle (siCtr), siKeap1 ou siNFE2L2. O mRNA (A), as proteínas (B), o número de células (C) e a viabilidade celular (D) foram medidos após a transfecção com ou sem Arts. (E, F) Os níveis de GSH celular e ROS lipídicos foram medidos em células HN3-cisR expostas a 25 ou 50 μM de Arts com ou sem trigonelina (Trig; 100 μM). As barras de erro representam o erro padrão de três réplicas. *P<0,05 em relação ao controle; *P<0,01 entre os grupos.
Fig. 4.
A inibição de Nrf2 reverteu a resistência ao artesunato. (A, B) O silenciamento dos genes Nrf2 e HO-1 foi examinado usando um siRNA controle (siCtr) e siRNA contra NFE2L2 e HMOX1. *P<0,01 em relação ao siCtr, **P<0,01 em relação à transfecção com siNFE2L2. (C–E) Alterações no número de células, GSH celular e níveis de ROS total de células HN3-cisR expostas a 25 ou 50 μM de Arts, trolox (0,5 mM) ou as combinações. *P<0,05 e **P<0,01 comparados entre grupos.
Fig. 5.
O silenciamento genético ou farmacológico de Nrf2 sensibiliza células HNC resistentes ao Arts. (A) A sensibilidade ao Arts foi aumentada pela inibição genética de Nrf2 em células HN9 após transfecção de shRNA Keap1 em camundongos nus. *P<0,05 versus o shRNA controle. (B, C) Medição do crescimento tumoral e dos níveis de GSH celular de tumores coletados de camundongos nus implantados com células HN9 com transfecção de shRNA controle ou Keap1. *P<0,05 comparado entre dois grupos. (D) Crescimento in vivo de células HN3-cisR com shRNA controle ou Nrf2 e administração oral diária de 50 mg/kg de Arts ou trigonelina (Trig). (E, F) Coloração por imunofluorescência da formação de γH2AX (cor vermelha) e medição de GSH celular em tumores HN9-cisR transfectados com shRNA controle ou Nrf2 após tratamento com Arts ou Trig. Unidades arbitrárias de fluorescência (AFU) foram comparadas entre grupos. As barras de erro representam o erro padrão. *P<0,05 comparado entre dois grupos; ** P<0,01 em relação ao controle ou comparado entre dois grupos. (Para interpretação das referências a cores nesta legenda de figura, o leitor é remetido à versão online deste artigo.)
Fig. 6.
A inibição de Nrf2 atenua a resistência ao artesunato em células HNC resistentes à cis. O artesunato (Arts) mata seletivamente HNCs, mas não células normais, por meio da indução de ferroptose dependente de ferro e mediada por ROS. No entanto, o Arts aumentou a expressão de Nrf2, o que contribuiu para a resistência à ferroptose. Assim, a supressão de Nrf2 aumenta a ferroptose e causa a morte de células HNC resistentes.
Fig. 7.