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pmid: "34558645"
title: "A diidroartemisinina desencadeia ferroptose em células de câncer hepático primário ao promover e a resposta a proteínas desenroladas‑induzida regulação positiva da expressão de CHAC1."
authors: "Wang Z, Li M, Liu Y, Qiao Z, Bai T, Yang L, Liu B"
journal: "Oncology reports"
pubdate: "2021 Nov"
doi: "10.3892/or.2021.8191"
source: "PMC Full Text"

A diidroartemisinina desencadeia ferroptose em células de câncer hepático primário ao promover e a resposta a proteínas desenroladas‑induzida regulação positiva da expressão de CHAC1.

Autores

Wang Z, Li M, Liu Y, Qiao Z, Bai T, Yang L, Liu B

Periodico

Oncology reports (2021 Nov)

Conteudo

A diidroartemisinina desencadeia ferroptose em células de câncer hepático primário ao promover a resposta a proteínas mal dobradas e a regulação positiva da expressão de CHAC1

A diidroartemisinina (DHA), um derivado da artemisinina, tem sido investigada como um potencial fármaco antitumoral no câncer hepático primário (PLC). A ferroptose é uma forma de morte celular dependente de ferro que pode ser impulsionada por indutores de peroxidação lipídica. O presente estudo teve como objetivo determinar se e como o DHA poderia promover a morte de células de PLC induzindo ferroptose. No total, quatro linhagens celulares de PLC com diferentes status de p53, incluindo Hep3B (p53 nulo), Huh7 (p53 mutante), PLC/PRF/5 (p53 mutante) e HepG2 (p53 tipo selvagem), foram tratadas com várias concentrações de DHA. Os efeitos do DHA em todos os três ramos da resposta a proteínas mal dobradas (UPR) foram avaliados. Para desativar as UPRs, utilizou-se RNA pequeno interferente para silenciar a expressão do fator de transcrição ativador (ATF)4, da proteína 1 de ligação ao X-box (XBP1) ou do ATF6 em células de PLC. O efeito do DHA na atividade do promotor de Chac glutationa específica γ-glutamilciclotransferase 1 (CHAC1) foi avaliado usando um ensaio repórter de luciferase dupla. Os resultados revelaram que a morte induzida por DHA em células de PLC foi irrelevante para o status de p53. As células de PLC expostas ao DHA exibiram características clássicas de ferroptose, como aumento dos níveis de espécies reativas de oxigênio lipídicas e malondialdeído, sobrecarga de ferro e diminuição da atividade ou expressão de glutationa (GSH), glutationa peroxidase 4, membro 11 da família 7 de transportadores de solutos (SLC) e membro 2 da família 3 de SLC. Os efeitos antitumorais do DHA em células de PLC foram significativamente enfraquecidos por dois inibidores típicos de ferroptose, ferrostatin-1 e mesilato de deferoxamina, enquanto os efeitos antitumorais foram aumentados após sobrecarga de ferro. Além disso, o DHA ativou todos os três ramos da UPR (ramo da quinase 3 do fator de iniciação da tradução eucariótica 2α/fator de iniciação da tradução eucariótica 2A/ATF4, ramo da quinase/endorribonuclease transmembrana dependente de inositol 1α/XBP1 e ramo do ATF6) in vitro. Notavelmente, a ferroptose induzida por DHA foi significativamente atenuada após o silenciamento da expressão de ATF4, XBP1 ou ATF6. Além disso, a atividade do promotor de CHAC1, um gene capaz de degradar GSH, foi aumentada pelo DHA, mas enfraquecida quando os três fatores de transcrição da UPR mencionados foram silenciados. Em conclusão, os achados do presente estudo sugeriram que o DHA pode induzir efetivamente a ferroptose em células de PLC através da ativação de UPRs antissobrevivência e da regulação positiva da expressão de CHAC1.

Introdução
Cânceres hepáticos primários (CHPs), dos quais o tipo mais predominante é o carcinoma hepatocelular, são a terceira principal causa de mortalidade relacionada ao câncer no mundo, depois do câncer de pulmão. A morbidade dos CHPs varia acentuadamente entre as regiões geográficas do mundo, com as taxas mais altas observadas na África subsaariana e no Leste Asiático. Os principais fatores de risco para CHP incluem infecção crônica pelos vírus das hepatites B/C, consumo excessivo de álcool, doença hepática gordurosa não alcoólica e exposição a aflatoxinas. Embora os tratamentos atuais, incluindo ablação local percutânea, ressecção cirúrgica e transplante hepático, melhorem a sobrevida de pacientes com CHP, a taxa de mortalidade continua a aumentar devido ao crescimento populacional e às altas taxas de recorrência. Portanto, estudos moleculares adicionais sobre CHPs são urgentemente necessários para identificar novos alvos para o tratamento do CHP.

A ferroptose é uma forma de morte celular não apoptótica dependente de ferro relatada pela primeira vez por Dixon et al. em 2012. Esse tipo de morte celular é causado pela peroxidação lipídica letal e suas características típicas, como a superprodução de espécies reativas de oxigênio (ERO) lipídicas e o comprometimento da crista e da membrana mitocondrial externa, são diferentes de outros tipos de morte celular regulada. O membro 11 da família 7 de transportadores de solutos (SLC7A11) e o membro 2 da família 3 de transportadores de solutos (SLC3A2) controlam a importação de cisteína e cistina extracelulares e regulam a síntese de glutationa (GSH). A depleção de GSH leva à supressão da glutationa peroxidase (GPX)4, uma glutationa peroxidase chave conhecida por catalisar a redução de ERO lipídicas.

Uma das principais razões para a resistência terapêutica no câncer foi descoberta como sendo a resistência intrínseca ou adquirida das células cancerígenas à apoptose mediada por executores. Em comparação com células não cancerígenas, as células cancerígenas frequentemente necessitam de maior quantidade de ferro para promover sua proliferação. Interessantemente, essa dependência de ferro também tornou as células cancerígenas mais sensíveis à ferroptose. Portanto, pequenas moléculas, como erastina, sorafenibe e molécula pequena letal seletiva para Ras-3/-5, que foram consideradas capazes de induzir o acúmulo dependente de ferro de ERO lipídicas, estão atualmente sendo avaliadas quanto ao seu potencial na terapia do câncer. A identificação de drogas capazes de induzir a ferroptose pode fornecer novos insights sobre o potencial da ferroptose como um novo alvo para o tratamento do CHP.
A artemisinina é uma lactona trioxânica sesquiterpênica originalmente extraída de Artemisia annua L., e seus derivados foram descobertos como agentes antimaláricos eficazes. Até o momento, além de sua conhecida aplicação antimalárica, as artemisininas estão sendo avaliadas quanto ao seu potencial no tratamento de múltiplos tipos de câncer devido à sua segurança estabelecida registrada em milhares de pacientes com malária. Ooko et al trataram 60 linhagens celulares cancerígenas com 11 derivados de artemisinina e analisaram os perfis de expressão de 30 genes relacionados ao ferro nessas linhagens celulares por meio de hibridização por microarranjo. Os resultados constataram que os valores de IC50 das artemisininas analisadas estavam significativamente correlacionados com a expressão de ≥20 genes relacionados ao ferro. Esses achados sugeriram o envolvimento das artemisininas na indução de ferroptose em células cancerígenas. O artesunato é o derivado da artemisinina mais frequentemente relatado, tendo sido descoberto por desencadear ferroptose em células malignas. A diidroartemisinina (DHA), um derivado semissintético da artemisinina, demonstrou exibir atividade antitumoral em PLC tanto in vitro quanto in vivo. O papel da DHA na indução de ferroptose em células cancerígenas foi relatado pela primeira vez em células de carcinoma de cabeça e pescoço por Lin et al, e posteriormente em células leucêmicas por Du et al e em células de glioma por Chen et al. No entanto, até onde sabemos, atualmente não há evidências diretas que descrevam o papel da DHA na indução de ferroptose em PLC. Contudo, um estudo anterior de Wang et al relatou que a DHA aumentou os níveis intracelulares de ERO em células de câncer hepático LM3, sugerindo que a DHA pode desencadear ferroptose em células de PLC.

As células cancerígenas podem prosperar sob condições microambientais hostis. Dentro das massas tumorais, foi relatado que o estresse do retículo endoplasmático (RE) é induzido pela privação de nutrientes, limitação de oxigênio e alta demanda metabólica. Descobriu-se que as células malignas iniciam a resposta a proteínas mal enoveladas (UPR) para lidar com o estresse do RE. Os sensores residentes no RE, fator de iniciação eucariótico 2 α quinase 3 (eIF2), quinase transmembrana/endorribonuclease 1α dependente de inositol (IRE1α) e fator de transcrição ativador (ATF)6, coordenam a UPR se proteínas mal enoveladas se acumularem e agregarem além de um limiar tolerável. A regulação positiva de ATF4, induzida por indutores de ferroptose, como erastina e artesunato, é considerada um efeito compensatório, uma vez que sua inibição demonstrou aumentar ainda mais a ferroptose em células cancerígenas. Em células de glioma, a via de sinalização PERK/ATF4 foi ativada por DHA e regulou negativamente a ferroptose induzida por DHA. No entanto, até onde sabemos, estudos que investigam os papéis dos ramos da UPR mediados por ATF6 e IRE1α na ferroptose são escassos e como a DHA afeta esses dois mediadores da UPR permanece amplamente desconhecido.
No presente estudo, quatro linhagens celulares de CHC, Hep3B, Huh7, PLC/PRF/5 e HepG2, foram tratadas com diferentes concentrações de DHA na presença ou ausência de inibidores de ferroptose ou íons de ferro. Para desativar as UPRs, RNA pequeno interferente foi utilizado para silenciar a expressão de ATF4, XBP1 ou ATF6 em células de CHC.
Materiais e métodos
Produtos químicos
Ferrostatin-1 e DHA foram adquiridos da Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. e dissolvidos em DMSO para concentrações finais de estoque de 5 e 50 mM, respectivamente. Sal de deferoxamina mesilato (DFOM; MedChemExpress) e cloreto de ferro hexaidratado (Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.) foram dissolvidos em H2O destilada para concentrações finais de estoque de 50 mM e 2 mg/l, respectivamente.
Linhagens celulares e cultura
As linhagens celulares de CHC, Hep3B (p53 nulo), Huh7 (mutante p53 659 A>G), PLC/PRF/5 (mutante p53 747 G>T) e HepG2 (p53 tipo selvagem), foram adquiridas do The Cell Bank of Type Culture Collection of The Chinese Academy of Sciences. Cada linhagem celular foi submetida à análise de perfil de repetições curtas em tandem para autenticação. Todas as linhagens celulares estavam livres de micoplasma. As células Hep3B, PLC/PRF/5 e HepG2 foram mantidas em Meio Essencial Mínimo Eagle (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) suplementado com 10% de SBF (HyClone; Cytiva), enquanto as células Huh7 foram cultivadas em DMEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) suplementado com 10% de SBF. As células foram mantidas em uma incubadora de células HF-90 (KG Medical Industries) em uma atmosfera com 5% de CO2 a 37°C.
Transfecção celular
As sequências do RNA pequeno interferente (siRNA/si) ATF4, si-proteína de ligação a X-box 1 (XBP1), si-ATF6 ou si-Chac glutationa específica γ-glutamilciclotransferase 1 (CHAC1) estão listadas na Tabela I. A região codificadora do gene CHAC1 foi inserida em um plasmídeo pECMV-3×FLAG-N para superexpressão (Fenghui Biotechnology Co., Ltd.). Células de CHC semeadas em placas de 6 poços foram transfectadas com siRNA (100 pM) ou plasmídeo pECMV-3×FLAG-N (vetor contendo o gene CHAC1) (2 µg) misturados com 6 µl de Lipofectamine® 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 37°C por 24 h, em seguida tratadas com DHA por mais 24 h.
Ensaio de kit de contagem celular (CCK)-8
As células de CHC foram tratadas com diferentes concentrações de DHA, e então a viabilidade celular foi determinada usando um ensaio CCK-8 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA). Resumidamente, as células de CHC foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 3×10³ células/poço e cultivadas por 24 h. Após a incubação, as células foram tratadas com 2, 5, 7,5, 10, 20, 30, 40 ou 50 µM de DHA por 24 h. As células foram subsequentemente incubadas com 10 µl de CCK-8 por 1 h e a absorbância de cada poço foi medida a um comprimento de onda de 450 nm usando um leitor de microplacas (BioTek Instruments, Inc.). Para alguns experimentos, DFOM (10 µM para células Huh7 e 50 µM para as outras linhagens celulares), ferrostatin-1 (5 µM para células HepG2 e 1 µM para as outras linhagens celulares) ou íons de ferro exógenos (10 µg/ml de cloreto de ferro hexaidratado) foram usados para tratar células de CHC na presença de DHA.
Estabelecimento de um modelo de camundongo com tumor xenoenxerto de células PLC

Um total de 32 camundongos machos BALB/c nus (idade, 6–8 semanas; peso, 18–20 g) foram obtidos da HFK Bioscience Co. Ltd. e alojados em uma instalação livre de patógenos específicos. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (n=8/grupo) e células PLC foram injetadas subcutaneamente nos camundongos nus. Os volumes tumorais foram determinados usando a seguinte fórmula: 0,5 × comprimento do tumor × (largura do tumor)2. Quando os tumores xenoenxertados cresceram até 80–100 mm3, metade dos camundongos de cada grupo recebeu 100 mg/kg de DHA por 5 dias/semana por gavagem. Após 21 dias, todos os camundongos foram anestesiados com isoflurano (2,5%; Yuyan) e sacrificados imediatamente por deslocamento cervical. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Zhengzhou (Zhengzhou, China).

Hematoxilina e eosina (H&E)

Os tecidos tumorais foram coletados, fixados com paraformaldeído a 4% (Xilong Chemicals) durante a noite a 4°C, embebidos em parafina e cortados em secções de 5 µm de espessura. As secções foram subsequentemente desparafinizadas e reidratadas, e então incubadas com agentes de coloração H&E (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), de acordo com o protocolo do fabricante.

Medição dos níveis de ERO

Os níveis totais (Jiancheng Bioengineering Institute) e de ERO lipídicas (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) foram determinados usando kits de ensaio de ERO, de acordo com os protocolos dos fabricantes, os quais foram baseados na detecção de diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF) (cat. no. E004) e fluorescência C11-BODIPY® 581/591 (cat. no. D3861), respectivamente. As intensidades de fluorescência do DCF e C11-BODIPY foram analisadas utilizando um leitor automático de microplacas M200 PRO (Tecan Group, Ltd.) ou um citômetro de fluxo NovoCyte (Agilent Technologies, Inc.), respectivamente. Os dados brutos do citômetro de fluxo foram analisados usando NovoExpress versão 1.4.1 (Agilent Technologies, Inc.).

Medição das concentrações de ferro

Os níveis intracelulares de ferro ferroso foram analisados usando um kit de ensaio de ferro (cat. no. TC1015; Leagene Biotech), de acordo com o protocolo do fabricante. A leitura foi medida em um leitor automático de microplacas M200 PRO a um comprimento de onda de 562 nm.

Medição dos níveis de malondialdeído (MDA) e glutationa (GSH), e da atividade da glutationa peroxidase (GSH-PX)

Kits (todos do Jiancheng Bioengineering Institute) foram usados para determinar os níveis de MDA (cat. no. A003-1) e GSH (cat. no. A061-1), e a atividade de GSH-PX (cat. no. A005), de acordo com os protocolos dos fabricantes.

Transcrição reversa seguida de PCR quantitativa (RT-qPCR)
O RNA total foi extraído de células PLC tratadas com DHA por 1, 6, 12 ou 24 h com um kit RNAsimple (Tiangen Biotech Co., Ltd.). Os RNAs foram transcritos reversamente para cDNA usando um kit TIANSeq M-MLV (Tiangen Biotech Co., Ltd.) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, os RNAs foram incubados em uma máquina de PCR LifeExpress Classic (Hangzhou Bioer Co., Ltd.) a 25°C por 10 min, 42°C por 50 min e, em seguida, a 80°C por 10 min para interromper a reação. O splicing do mRNA de XBP1 (NM_005080 e NM_001079539) foi avaliado usando qPCR com um par de iniciadores: Forward, 5′-AAACTTTTGCTAGAAAATCAGC-3′ e reverse, 5′-CAATACCGCCAGAATCCA-3′, que abrangiam o sítio de splicing. As condições de termociclagem foram: 95°C por 5 min; seguidas de 36 ciclos de 95°C por 10 seg, 52°C por 20 seg, 72°C por 30 seg e 25°C por 5 min. Isso permitiu a detecção de dois fragmentos (252 e 226 pb). Os produtos de PCR foram subsequentemente analisados usando um gel de agarose a 1,5%.

Western blotting
A proteína total foi extraída dos lisados celulares totais usando tampão de lise RIPA (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) suplementado com PMSF a 1%. As proteínas nucleares foram isoladas usando um kit de Extração de Proteínas Nucleares e Citoplasmáticas, de acordo com o protocolo do fabricante (Beyotime Institute of Biotechnology). A concentração de proteína foi determinada usando um kit de ensaio BCA (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) e, 10–20 µg de amostra de proteína foram separados via SDS-PAGE (8–15%). As proteínas resolvidas foram subsequentemente transferidas para membranas de PVDF (MilliporeSigma) e bloqueadas com leite desnatado a 5% por 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram então incubadas com anticorpos primários (listados na Tabela II) a 4°C durante a noite. Após a incubação com anticorpo primário, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários a 37°C por 1 h. As bandas de proteína foram visualizadas usando reagentes ECL (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.). GAPDH foi usado como controle de carga para lisados celulares totais, e Histona H3 foi usado como controle de carga nuclear.

Ensaio repórter de luciferase dupla pGL3
Os potenciais sítios de ligação para ATF4, XBP1 e ATF6 no promotor do gene CHAC1 foram previstos usando JASPAR () e PROMO (). O promotor (−2.000 a +30 pb) do gene CHAC1 foi inserido em um repórter de luciferase pGL3 e a atividade do promotor foi determinada analisando a razão luciferase firefly/Renilla, de acordo com o protocolo do fabricante (Promega Corporation).

Análise estatística
A análise estatística foi realizada usando GraphPad Prism versão 8.0 (GraphPad Software, Inc.) e os dados são apresentados como média ± DP. As diferenças estatísticas entre os grupos foram determinadas usando ANOVA de uma ou duas vias seguida pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni. P<0,05 foi considerado para indicar uma diferença estatisticamente significativa.

Resultados
A ferroptose induzida por DHA em células PLC é independente do status de p53
Considerando o envolvimento da p53 na ferroptose, quatro linhagens celulares de CHC com diferentes status de p53, Hep3B (p53 nulo), Huh7 e PLC/PRF/5 (ambas com p53 mutante) e HepG2 (p53 do tipo selvagem), foram tratadas com concentrações crescentes de DHA por 24 h. Os dados revelaram que o DHA inibiu a sobrevivência de todas as linhagens celulares de CHC, independentemente do seu status de p53 (Fig. 1A). Subsequentemente, dois diferentes inibidores de ferroptose, DFOM (um quelante de ferro) e ferrostatin-1 (um inibidor da peroxidação lipídica) foram utilizados para tratar células de CHC na presença de DHA. Os resultados revelaram que os efeitos citotóxicos do DHA nas células de CHC foram atenuados por ambos os inibidores de ferroptose (Fig. 1A). Por outro lado, a adição de íons de ferro exógenos aumentou ainda mais os efeitos do DHA (Fig. 1A).

O valor de IC50 do DHA foi de 29,4±1,7 µM para células Hep3B, 32,1±4,5 µM para células Huh7, 22,4±3,2 µM para células PLC/PRF/5 e 40,2±2,1 µM para células HepG2 (Fig. 1B). Esses achados sugeriram que as células HepG2 foram as mais resistentes ao DHA, seguidas pelas células Huh7 e Hep3B, enquanto as células PLC/PRF/5 foram as menos resistentes. De acordo com os valores de IC50, as células HepG2, Huh7, Hep3B e PLC/PRF/5 foram posteriormente tratadas com 40, 35, 30 ou 25 µM de DHA, respectivamente.

Após incubação com DHA por 1, 6, 12 ou 24 h, as células de CHC foram coletadas para analisar os conteúdos de ROS total e lipídica (Fig. 1C e D), níveis de MDA (Fig. 1E) e concentrações de ferro (Fig. 1F). Os resultados revelaram que os níveis de ROS, MDA e ferro aumentaram nas células de CHC expostas ao DHA. Esses dados sugeriram que o DHA pode atuar como um indutor de ferroptose em células de CHC in vitro.

Sabe-se que o bloqueio da síntese de GSH facilita o acúmulo de ROS tóxicas. Portanto, o conteúdo de GSH em células de CHC tratadas com DHA foi analisado utilizando um kit comercial. Em comparação com as células controle, a razão GSH/dissulfeto de glutationa (forma oxidada da GSH) diminuiu nas células expostas ao DHA (Fig. 1G). Os níveis de expressão de GPX4, SLC7A11 e SLC3A2, e a atividade de GSH-PX também foram inibidos pelo tratamento com DHA (Fig. 1H e I). Por outro lado, os níveis de expressão de CHAC1 foram regulados positivamente em resposta ao tratamento com DHA (Fig. 1I). Esses dados sugeriram que o DHA pode atuar como um regulador negativo da síntese de GSH em células de CHC.

O DHA limita o crescimento tumoral de xenoenxertos de CHC in vivo
Os efeitos do DHA no crescimento de PLC in vivo foram investigados adicionalmente injetando subcutaneamente células de PLC em camundongos imunodeficientes; nenhuma perda de peso ou problemas de saúde foi observada nos camundongos. O DHA foi então administrado aos camundongos quando os volumes tumorais atingiram 80–100 mm³. Os volumes tumorais foram registrados a cada 3 dias e, 3 semanas depois, os tumores xenotransplantados foram coletados. Como mostrado na Fig. 2A-C, o DHA limitou, mas não inibiu completamente, a formação de tumores xenotransplantados de PLC. Além disso, o DHA aumentou o acúmulo de ROS (Fig. 2D) e diminuiu a atividade de GSH-PX (Fig. 2E) nas massas tumorais. Esses dados, juntamente com os resultados mencionados dos experimentos in vitro, indicaram que o DHA pode induzir ferroptose tanto in vitro quanto in vivo.
O DHA ativa os três ramos da UPR em células de PLC
Como o DHA induziu ferroptose em todas as células de PLC analisadas tanto in vivo quanto in vitro, alterações nas moléculas associadas à UPR foram investigadas em seguida nas células PLC/PRF/5 e HepG2. Os dados demonstraram que todos os três ramos das vias de sinalização da UPR foram ativados pelo DHA, o que foi evidenciado pelos níveis elevados de expressão de PERK fosforilado, fator de iniciação da tradução eucariótica 2A (eIF2α), IRE1α, ATF4, ATF6 nuclear e XBP1 emendado (Fig. 3A-D). Notavelmente, descobriu-se que o DHA ativa a sinalização PERK/eIF2α/ATF4 mais cedo nas células PLC/PRF/5 do que nas células HepG2 (Fig. 3A-D). Para determinar o papel da UPR ativada na ferroptose mediada por DHA, ATF4, XBP1 e ATF6 foram silenciados com seus respectivos siRNAs (Fig. 4A e E). As eficiências de transfecção dos siRNAs foram primeiro determinadas em células de PLC por western blotting ou análise de RT-PCR (Fig. S1). Após o knockdown dos três sensores da UPR, a viabilidade das células de PLC aumentou (Fig. 4B e F), e o conteúdo de ROS total (Fig. 4C e G) e lipídico (Fig. 4D e H) diminuiu. Os níveis de expressão de GPX4, SLC7A11, SCL3A2 e CHAC1 foram restaurados em diferentes graus nas células após o knockdown dos três fatores de transcrição da UPR (Fig. 5A-F). Até onde sabemos, esses dados indicaram, pela primeira vez, que o DHA pode ativar a UPR como um mecanismo antissurvival em células de PLC.
O DHA promove a transcrição de CHAC1 ao ativar as UPRs em células de PLC
Múltiplos sítios de ligação para os fatores de transcrição foram encontrados no promotor do CHAC1 (Fig. 6A). Como o DHA foi capaz de regular positivamente a expressão de ATF4, XBP1 e ATF6, foi hipotetizado que este agente pode promover a transcrição do CHAC1. Os resultados do ensaio repórter de luciferase dual pGL3 validaram que o DHA aumentou a atividade do promotor do gene CHAC1 (Fig. 6B e C, painel esquerdo), e que este efeito foi suprimido após o knockdown de ATF4, XBP1 ou ATF6 (Fig. 6B e C, painel direito). Para validar ainda mais o papel do CHAC1 na ferroptose induzida por DHA, siRNA foi utilizado para silenciar a expressão do CHAC1 (Fig. 6D e E). Os resultados revelaram que a ferroptose induzida por DHA foi suprimida pelo siCHAC1 (Fig. 6F-I). Um fragmento codificador do CHAC1 sem a região 3′UTR foi inserido em um vetor de expressão, o que resultou na ausência de efeito do siRNA direcionado à região 3′UTR do CHAC1 (si*CHAC1) sobre sua expressão. Além disso, foi descoberto que a superexpressão do CHAC1 sensibilizou as células PLC ao DHA (Fig. 7).

Discussão
A indução da ferroptose está atualmente sendo investigada como uma abordagem alternativa para erradicar células cancerígenas resistentes à apoptose. Vários derivados da artemisinina, como artesunato, arteméter e arteéter, demonstraram matar células cancerígenas induzindo ferroptose. Além disso, estudos anteriores revelaram que o DHA atua como um indutor de ferroptose em células cancerígenas. Consistente com os achados desses estudos anteriores, o presente estudo demonstrou que o DHA matou células PLC induzindo ferroptose.
O método clássico para determinar se um fármaco pode induzir ferroptose é co-tratar células cancerígenas com bloqueadores de ferroptose ou íons de ferro. Os efeitos antitumorais dos indutores de ferroptose, como erastina e sorafenibe, foram atenuados por quelantes de ferro (como DFOM) e inibidores da peroxidação lipídica (como ferrostatin-1), mas aumentados após a adição de íons de ferro exógenos. No presente estudo, com base nos resultados de IC50, foi sugerido que as células PLC eram mais resistentes à citotoxicidade induzida por DHA quando a ferroptose era suprimida por DFOM ou ferrostatin-1. Em contraste, a adição de cloreto de ferro hexaidratado sensibilizou as células PLC ao DHA. Vale ressaltar que o tratamento com DFOM ou ferrostatin-1 não aboliu completamente os efeitos antitumorais do DHA, sugerindo que desencadear a ferroptose pode não ser o único método pelo qual o DHA pode induzir citotoxicidade em células PLC. Embora o DHA tenha demonstrado induzir ferroptose em outros tipos de células cancerígenas, o presente estudo foi o primeiro a demonstrar tais efeitos em células PLC, até onde sabemos.
p53 é um gene supressor de tumor chave, e mutações no gene ou sua perda de função são conhecidas por promover a tumorigênese. SLC7A11 e SLC3A2 controlam a importação de cisteína e cistina extracelulares e regulam a síntese de GSH. Notavelmente, tanto o p53 do tipo selvagem quanto o mutante defeituoso em acetilação foram descobertos por reduzir a expressão de SLC7A11, inibindo assim a síntese de GSH e sensibilizando as células tumorais à ferroptose. Em vista do papel chave do p53 na ferroptose associada ao SLC7A11, o presente estudo teve como objetivo investigar a citotoxicidade do DHA em quatro linhagens celulares de PLC com diferentes status de p53. Os dados atuais demonstraram que o DHA pode induzir efetivamente a ferroptose nas células PLC analisadas, mesmo nas células p53 nulas (células Hep3B). Vale ressaltar que o DHA também exibiu atividade antitumoral contra PLC ao ativar a caspase 3, um regulador chave da apoptose, independentemente do status do p53. Essa descoberta, juntamente com os resultados do presente estudo, sugeriu que o DHA pode exercer seus efeitos antitumorais de forma independente do p53. Assim, o DHA pode representar uma droga atrativa para tratar cânceres com p53 mutante ou deficiente.

GPX4 foi identificada pela primeira vez por Ursini et al em 1982 e, desde então, demonstrou-se que ela reduz hidroperóxidos reativos de fosfatidilcolina e suprime a peroxidação lipídica. A depleção de GSH foi considerada como reguladora negativa da expressão de GPX4. Em células cancerosas, demonstrou-se que a ferroptose é induzida pela inativação da GPX4. Para explorar melhor como o DHA induz a ferroptose em células PLC, o conteúdo de GSH e a expressão e atividade da GPX4 foram analisados. Os dados atuais revelaram que o DHA reduziu a síntese de GSH e regulou negativamente a expressão de GPX4 em células PLC. A atividade diminuída da GPX4 observada em células PLC expostas ao DHA pode resultar da expressão regulada negativamente da GPX4. Embora um estudo de Lin et al tenha apoiado as descobertas do presente estudo, um estudo recente de Chen et al não relatou resultados consistentes. O último estudo demonstrou que o DHA induziu ferroptose em células de glioma e regulou positivamente a expressão de GPX4 em células cancerosas U251 e U373 como um mecanismo compensatório. Atualmente, uma explicação razoável para tais descobertas paradoxais não foi encontrada. Não obstante, essas descobertas sugeriram que os efeitos do DHA na regulação da expressão de GPX4 em diferentes tipos de tumores sólidos podem ser inconsistentes, e investigações adicionais sobre os mecanismos subjacentes são justificadas.
O presente estudo também buscou determinar se a UPR ativada pelo DHA desempenhava um papel na ferroptose. A UPR é coordenada por três ramos, a saber, os ramos PERK/eIF2α/ATF4, IRE1α/XBP1 e ATF6. Em resposta ao estresse do RE, a PERK é autofosforilada para induzir a fosforilação do eIF2α, promovendo assim a tradução de ATF4. Uma vez fosforilada, a IRE1α cliva o XBP1 em sua forma curta. A ATF6 transloca-se para o núcleo celular para funcionar como um fator de transcrição após ser clivada do RE. A ATF4 foi sugerida como protetora contra a ferroptose devido à sua capacidade de ativar a transcrição do SLC7A11. Nosso estudo anterior também demonstrou que a ATF4 atuou como um fator de sobrevivência na ferroptose induzida por erastina em células PLC. Portanto, foi levantada a hipótese de que o bloqueio da via de sinalização PERK/eIF2α/ATF4 poderia aumentar ainda mais os efeitos antitumorais do DHA em células PLC. No entanto, ao determinar a viabilidade celular e os níveis de ROS, os resultados mostraram que o knockdown de ATF4 atenuou os efeitos citotóxicos do DHA. Notavelmente, a ferroptose induzida por DHA foi atenuada após o knockdown de XBP1 ou ATF6. Diferentemente da maioria dos estudos anteriores que revelam papéis antiferroptóticos dessas proteínas da UPR, os achados do presente estudo sugeriram que as proteínas da UPR atuaram como moléculas pró-ferroptóticas em células PLC tratadas com DHA.

Devido ao papel observado da ATF4 na indução da expressão de SLC7A11, poucas evidências anteriores apoiam o papel pró-ferroptótico da ATF4 observado no presente estudo. No entanto, um estudo anterior avaliando os efeitos do artesunato, outro indutor clássico de ferroptose, em células de linfoma de Burkitt apoiou indiretamente os achados do presente estudo. Um estudo anterior mostrou que a ATF4 ativou a transcrição de CHAC1 para aumentar a ferroptose induzida por artesunato em células DAUDI e CA-46. Descobriu-se que CHAC1 funciona como uma γ-glutamil ciclotransferase para induzir a degradação de GSH. Esses achados sugeriram que a regulação positiva da ATF4 também pode levar à degradação de GSH. É possível que o DHA, assim como o artesunato, ative mecanismos importantes para a degradação de GSH, que são mediados por proteínas da UPR, em vez da síntese de GSH. No presente estudo, os resultados do ensaio repórter da luciferase dupla demonstraram que o DHA aumentou a atividade do promotor do gene CHAC1. Embora os efeitos da ATF4 na expressão de CHAC1 tenham sido relatados, o presente estudo foi o primeiro a demonstrar que XBP1 e ATF6 também regulam positivamente a expressão de CHAC1, até onde sabemos.
Existem várias limitações no presente estudo. Primeiro, apenas a expressão dos principais reguladores da UPR, ATF4, XBP1 e ATF6, foi silenciada em células PLC. Como os níveis de expressão endógena desses fatores já são abundantes em células PLC estimuladas com DHA, no presente estudo, o silenciamento de sua expressão foi considerado mais adequado. A ativação dos ramos da UPR por diferentes estímulos leva a diferentes resultados em células de CHC, tanto resultados pró-apoptóticos quanto anti-apoptóticos já foram relatados anteriormente. A simples superexpressão de ATF4, XBP1 ou ATF6 em células de CHC sem DHA pode demonstrar sua própria contribuição para a viabilidade das células de CHC. No entanto, tais efeitos podem não estar relacionados ao DHA. Ainda assim, para elucidar melhor os papéis da UPR ativada na ferroptose induzida por DHA, estudos adicionais devem investigar os efeitos da superexpressão desses reguladores em células PLC. Segundo, vários sítios de ligação para XBP1 e ATF6 foram identificados no promotor do CHAC1. Embora o objetivo do presente estudo tenha sido demonstrar como o DHA afetou a atividade do promotor do CHAC1, as localizações específicas onde esses sensores da UPR se ligam ainda precisam ser determinadas.
Em conclusão, os achados do presente estudo sugeriram que o DHA pode induzir efetivamente a ferroptose e ativar as UPRs em células PLC. O silenciamento de reguladores-chave das UPRs suprimiu os efeitos tóxicos do DHA nas células PLC, o que foi demonstrado através da regulação negativa da expressão de CHAC1, um gene-chave responsável pela degradação da GSH. O DHA também promoveu a transcrição de CHAC1. Esses achados podem fornecer novas perspectivas sobre os efeitos antitumorais do DHA, sugerindo que a UPR induzida por DHA promove a morte celular em PLC.
Material Suplementar
Financiamento
Nenhum financiamento foi recebido.
Disponibilidade de dados e materiais
Todos os dados gerados e/ou analisados durante o presente estudo estão incluídos no artigo publicado.
Contribuições dos autores
ZW e TB desenharam o estudo, realizaram os experimentos e analisaram os dados. ZW redigiu o manuscrito. ML, YL e ZQ realizaram os experimentos e auxiliaram na análise dos dados. LY e BL realizaram os experimentos e revisaram o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final. ZW e TB confirmaram a autenticidade dos dados.
Aprovação ética e consentimento para participação
Todas as diretrizes institucionais e nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório foram seguidas. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Zhengzhou (Zhengzhou, China).
Consentimento do paciente para publicação
Não aplicável.
Interesses concorrentes
Os autores declaram que não possuem interesses concorrentes.
Abreviaturas
DHA
diidroartemisinina
ROS
espécies reativas de oxigênio
MDA
malondialdeído
GSH
glutationa
GSSG
glutationa oxidada
GPX4
glutationa peroxidase 4
PERK
proteína quinase R-like do retículo endoplasmático
eIF2
fator de iniciação eucariótico 2
ATF4
fator de transcrição ativador 4
ATF6
fator de transcrição ativador 6
IRE1α
inositol-requiring transmembrane kinase/endoribonuclease 1α
XBP1
X box-binding protein 1
CHAC1
ChaC glutationa específica γ-glutamilciclotransferase 1
SLC7A11
membro 11 da família 7 de transportadores de solutos
SLC3A2
membro 2 da família 3 de SLC
Referências
Uma visão global do carcinoma hepatocelular: Tendências, risco, prevenção e manejo
Carcinoma hepatocelular: Epidemiologia e carcinogênese molecular
Epidemiologia do carcinoma hepatocelular: População-alvo para vigilância e diagnóstico
Epidemiologia da hepatite viral e carcinoma hepatocelular
Recorrência do câncer hepatocelular após ressecção: Padrões, tratamentos e prognóstico
Ablação percutânea para carcinoma hepatocelular: Comparação de várias técnicas de ablação e cirurgia
Ferroptose: Uma forma de morte celular não apoptótica dependente de ferro
O desenvolvimento do conceito de ferroptose
Mecanismos da ferroptose
Vias de morte apoptótica e não apoptótica em células tumorais
Visando a ferroptose para eliminar o câncer
Ferroptose: Um nexo de morte celular regulada que liga metabolismo, biologia redox e doença
Fosfatidiletanolaminas de ácido araquidônico e adrênico oxidados direcionam células para a ferroptose
Artemisininas: Ações farmacológicas além da antimalárica
Derivados de artemisinina induzem morte celular dependente de ferro (ferroptose) em células tumorais
Artesunato ativa a via ATF4-CHOP-CHAC1 e afeta a ferroptose no linfoma de Burkitt
Identificação do artesunato como um ativador específico da ferroptose em células de câncer pancreático
O inibidor 968 da glutaminase-1 potencializa a eficácia antitumoral da diidroartemisinina em células de carcinoma hepatocelular
Diidroartemisinina exibe atividade antitumoral contra carcinoma hepatocelular in vitro e in vivo
Diidroartemisinina (DHA) induz ferroptose e causa parada do ciclo celular em células de carcinoma de cabeça e pescoço
DHA inibe a proliferação e induz ferroptose em células leucêmicas através da degradação autofágica dependente da ferritina
A resposta a proteínas desenoveladas induzida pela diidroartemisinina atenua a ferroptose via via PERK/ATF4/HSPA5 em células de glioma
Efeitos tumorigênicos e imunossupressores do estresse do retículo endoplasmático no câncer
O impacto do ambiente de enovelamento de proteínas do retículo endoplasmático no desenvolvimento do câncer
ATF4 promove angiogênese e morte neuronal e confere ferroptose de maneira dependente de xCT
O microRNA-193a estimula a repopulação de células de câncer pancreático e metástase através da modulação da sinalização TGF-beta2/TGF-betaRIII
O impacto da eutanásia e enucleação na densidade de axônios da córnea de camundongos e na morfologia dos terminais nervosos
miR-137 regula a ferroptose ao atingir o transportador de glutamina SLC1A5 no melanoma
p53 e a regulação da apoptose de hepatócitos: Implicações para a patogênese da doença
O ciclo cistina/cisteína: Um ciclo redox que regula suscetibilidade versus resistência à morte celular
Ferroptose como uma atividade mediada por p53 durante a patogênese da doença
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O DHA reduz o crescimento tumoral do CHP em camundongos nus. (A e B) Células de CHP foram injetadas subcutaneamente em camundongos imunodeficientes. O DHA (100 mg/kg/dia, 5 dias/semana) foi administrado aos camundongos quando os volumes tumorais atingiram 80–100 mm³. Os volumes tumorais foram registrados a cada 3 dias, e (C) 3 semanas depois, os tumores xenoenxertados foram coletados para coloração com hematoxilina e eosina (barra de escala, 100 µm). (D) As atividades de ROS e (E) GSH-PX nos tecidos tumorais foram determinadas. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão de quatro repetições. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 vs. controle (0 h). DHA, diidroartemisinina; CHP, câncer hepático primário; ROS, espécies reativas de oxigênio; GSH-PX, glutationa-peroxidase.

O DHA ativa as UPRs em células de CHP in vitro. Células HepG2 e PLC/PRF/5 foram tratadas com 40 e 25 µM de DHA, respectivamente, por 1, 6, 12 ou 24 h. (A e C) Os níveis de expressão proteica de moléculas associadas à UPR foram avaliados por western blotting. Os níveis relativos de expressão proteica das moléculas indicadas estão listados abaixo dos blotts. (B e D) RNAs totais foram isolados para analisar a formação de sXBP1 em células de CHP. DHA, diidroartemisinina; CHP, câncer hepático primário; UPR, resposta a proteínas mal-dobradas; p-, fosforilado; t-, total; PERK, proteína quinase R-like do retículo endoplasmático; eIF2α, fator de iniciação eucariótico 2α; IRE1α, quinase/endorribonuclease transmembrana dependente de inositol 1α; ATF, fator de transcrição ativador.

Os efeitos citotóxicos do DHA são atenuados após a supressão da UPR. (A e E) SiRNAs específicos foram sintetizados para alvejar ATF4, XBP1 e ATF6 em células de CHP. Um total de 24 h após a transfecção com siRNA, células HepG2 e PLC/PRF/5 foram tratadas com 40 ou 25 µM de DHA, respectivamente, por 24 h. (B e F) A viabilidade celular foi determinada usando um Cell Counting Kit-8, e (C e G) os níveis intracelulares de ROS total e (D e H) de ROS lipídicos foram determinados por citometria de fluxo. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão de três repetições. ***P<0,001 vs. DHA + siNC. DHA, diidroartemisinina; UPR, resposta a proteínas mal-dobradas; siRNA, RNA interferente pequeno; ATF, fator de transcrição ativador; XBP1, proteína 1 de ligação à caixa X; sXBP1, forma emendada de XBP1; unXBP1, forma não emendada de XBP1; CHP, câncer hepático primário; ROS, espécies reativas de oxigênio; NC, controle negativo; M, % do controle.
Depleção das proteínas UPR restaura parcialmente a expressão de moléculas associadas à ferroptose em células PLC na presença de DHA. (A-F) siRNAs específicos foram sintetizados para alvejar ATF4, XBP1 e ATF6 em células PLC. Após 24 h da transfeção com siRNA, células HepG2 e PLC/PRF/5 foram tratadas com 40 ou 25 µM de DHA, respectivamente, por 24 h. Proteínas celulares foram extraídas para analisar os níveis de expressão proteica de proteínas associadas à UPR por western blot. (B e E) RNAs totais foram isolados para analisar os níveis de expressão de mRNA de sXBP1 em células PLC. siRNA, RNA pequeno interferente; ATF, fator de transcrição ativador; XBP1, proteína de ligação ao X box 1; sXBP1, forma emendada de XBP1; unXBP1, forma não emendada de XBP1; PLC, câncer hepático primário; UPR, resposta à proteína mal dobrada; NC, controle negativo; GPX4, glutationa peroxidase 4; SLC, família de transportadores de solutos; CHAC, ChaC glutationa específica γ-glutamilciclotransferase.

O DHA aumenta a atividade do promotor do gene CHAC1. (A) Sítios de ligação potenciais para ATF4, XBP1 e ATF6 no promotor do gene CHAC1. (B e C) O ensaio repórter da luciferase pGL3 foi realizado para determinar a atividade do promotor de CHAC1. Para suprimir a expressão de CHAC1, 2 siRNAs foram sintetizados para alvejar CHAC1 em células PLC. Após 24 h da transfeção com siRNA, células HepG2 e PLC/PRF/5 foram tratadas com 40 ou 25 µM de DHA, respectivamente, por 24 h. (D e E) Os níveis de expressão proteica de GPX4 e CHAC1 foram determinados por western blot. (F e G) A viabilidade celular, os níveis de MDA e as razões GSH/GSSG, bem como (H e I) os níveis intracelulares de ROS lipídicas foram determinados. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão de três repetições. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 vs. controle. DHA, diidroartemisinina; PLC, câncer hepático primário; CHAC1, ChaC glutationa específica γ-glutamilciclotransferase 1; ATF, fator de transcrição ativador; XBP1, proteína de ligação ao X box 1; siRNA, RNA pequeno interferente; GPX4, glutationa peroxidase 4; ROS, espécies reativas de oxigênio; MDA, malondialdeído; GSSG, glutationa oxidada; siRNA, RNA pequeno interferente; NC, controle negativo; M, % do controle.

A superexpressão de CHAC1 sensibiliza células PLC ao DHA. Si*CHAC1 alvejando exclusivamente a região 3′ não traduzida foi usado para suprimir a expressão endógena de CHAC1. (A e D) A supressão de CHAC1 foi avaliada por western blot. (B e E) A viabilidade celular e (C e F) os níveis de MDA foram determinados. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão de quatro repetições. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 vs. controle. DHA, diidroartemisinina; siRNA, RNA pequeno interferente; NC, controle negativo; CHAC1, ChaC glutationa específica γ-glutamilciclotransferase 1; PLC, câncer hepático primário; MDA, malondialdeído.

Sequências de siRNA.
Sequência de siRNA, 5′-3′ siATF4-1   Avançar GUCCUCCACUCCAGAUCAUTT   Reverso AUGAUCUGGAGUGGAGGACTT siATF4-2   Avançar UGGAUAUCACUGAAGGAGATT   Reverso UCUCCUUCAGUGAUAUCCATT siXBP1-1   Avançar GCAAGUGGUAGAUUUAGAATT   Reverso UUCUAAAUCUACCACUUGCTT siXBP1-2   Avançar CCUAAAGUUCUGCUUCUGUTT   Reverso ACAGAAGCAGAACUUUAGGTT siATF6-1   Avançar GAAAUGUCGGUUCAGAUAUTT   Reverso AUAUCUGAACCGACAUUUCTT siATF6-2   Avançar GAGCCACUGAAGGAAGAUATT   Reverso UAUCUUCCUUCAGUGGCUCTT siCHAC1-1   Avançar GACGCUCCUUGAAGAUCAUTT   Reverter AUGAUCUUCAAGGAGCGUCTT siCHAC1-2   Avançar GCCACAACCUUGAAUACUUTT   Reverter AAGUAUUCAAGGUUGUGGCTT si*CHAC1   Avançar UGGGAAGCUCAUCACUACATT   Reverter UGAGUGAGUGAGCUUCCCATT Controle negativo   Avançar UUCUCCGAACGUGUCACGUTT   Reverter ACGUGACACGUUCGGAGAATT
siRNA, pequeno RNA interferente; XBP1, proteína 1 de ligação ao X-box; ATF4, ativador do fator de transcrição 4; ATF6, ativador do fator de transcrição 6; CHAC1, γ-glutamilciclotransferase 1 específica para glutationa ChaC.
Anticorpos usados para análise de Western Blot.
Anticorpos primários Fornecedor Cat. não. Diluição ATF4 Cell Signaling Technologies, Inc. 1:3.000 SLC3A2 AB108300 1:5.000 CHAC1 AB76386 1:1.000 p-IRE1α Affinity Biosciences DF8322 1:1.000 IRE1α DF7709 1:1.000 PERK AF5304 1:1.000 p-PERK Thermo Fisher Scientific, Inc. 60004-1-Ig 1:10.000 Anticorpos Histona H3 Bioss bs-0349R 1:1.000 IgG-peroxidase de rábano silvestre Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.
ATF4, ativador do fator de transcrição 6; p, fosforilado; PERK, proteína quinase ER semelhante a R; eIF2α, fator de iniciação eucariótica 2α; IRE1α, quinase transmembrana / endoribonuclease 1α que requer inositol; GPX4, glutationa peroxidase 4; CHAC1, γ-glutamilciclotransferase 1 específica de glutationa ChaC; SLC, família de transportadores de soluto.