pmid: "36928207"
title: "Ferroptose induzida por dihidroartemisinina na leucemia mieloide aguda: ligações com o metabolismo do ferro e metalotioneína."
authors: "Grignano E, Cantero-Aguilar L, Tuerdi Z, Chabane T, Vazquez R, Johnson N, Zerbit J, Decroocq J, Birsen R, Fontenay M, Kosmider O, Chapuis N, Bouscary D"
journal: "Cell death discovery"
pubdate: "2023 Mar 17"
doi: "10.1038/s41420-023-01371-8"
source: "PMC Full Text"

Ferroptose induzida por dihidroartemisinina na leucemia mieloide aguda: ligações com o metabolismo do ferro e metalotioneína.

Autores

Grignano E, Cantero-Aguilar L, Tuerdi Z, Chabane T, Vazquez R, Johnson N, Zerbit J, Decroocq J, Birsen R, Fontenay M, Kosmider O, Chapuis N, Bouscary D

Periodico

Cell death discovery (2023 Mar 17)

Conteudo

Ferroptose induzida por dihidroartemisinina na leucemia mieloide aguda: ligações com o metabolismo do ferro e metalotioneína
A artemisinina é um medicamento antimalárico que demonstrou propriedades anticancerígenas. Recentemente, foi relatado que a dihidroartemisinina (DHA) induz ferroptose, associada ao aumento de ferro. No presente estudo, determinamos o efeito do DHA em linhagens celulares leucêmicas na indução de ferroptose e no metabolismo do ferro, bem como o efeito citoprotetor desencadeado nas células leucêmicas. Descobrimos que o tratamento com DHA induz ferroptose precoce ao promover ferritinofagia e subsequente aumento de ferro. Além disso, nosso estudo demonstrou que o DHA ativou a sinalização do metabolismo do zinco, especialmente a regulação positiva da metalotioneína (MT). Como suporte, mostramos que a inibição das isoformas MT2A e MT1M potencializou a ferroptose induzida por DHA. Por fim, demonstramos que a ferroptose induzida por DHA altera o pool de glutationa, que é altamente dependente da resposta antioxidante mediada por MTs. Em conjunto, nosso estudo indicou que o DHA ativa a ferritinofagia e a subsequente ferroptose na LMA, e que as MTs estão envolvidas na regeneração de glutationa e na resposta antioxidante.
Introdução
A leucemia mieloide aguda (LMA) designa um grupo de doenças altamente heterogêneas que compartilham uma ativação contínua da sinalização oncogênica e uma sobrecarga de ferro. Grandes avanços no tratamento desses cânceres surgiram nos últimos anos, levando ao surgimento de terapias-alvo, como midostaurina, venetoclax e inibidores de mutantes de IDH, e imunoterapias (anticorpos Bispecific T Cells Engagers (BiTE) e células CAR-T). No entanto, a LMA ainda apresenta um prognóstico global ruim e permanece uma necessidade urgente de novos tratamentos.
Ferroptose refere-se a um mecanismo de morte celular não apoptótico e independente de caspase, que foi descrito pela primeira vez por Dixon e colegas em 2012. É impulsionada pelo acúmulo de ROS lipídicos, nos quais o ferro tem um papel importante na catalisação da peroxidação lipídica após a conclusão da reação de Fenton. Portanto, o ferro férrico favorece a geração de ROS lipídicos e, assim, induz a ferroptose. A ferroptose tem sido extensivamente estudada até o momento e vários indutores de ferroptose foram descritos. Entre esses fatores, compostos que diminuem os níveis de glutationa (GSH) ao inibir a importação de cisteína [erastina e sorafenibe ], que inibem a principal enzima antioxidante GPX4 [RSL3, FINO2 e FIN56 ] ou quelam diretamente a GSH [APR-246 ] podem induzir a ferroptose. Por outro lado, a ferrostatin1 e a liproxstatina são inibidores específicos da ferroptose, enquanto agentes depletores de ferro como deferoxamina (DFO) ou deferasirox (DFX) também prejudicam esse processo.

Foi demonstrado que o DHA induz ferroptose em vários modelos de câncer, pode reduzir a expressão de SLC7A11 e coopera com quimioterapias padrão para desencadear a ferroptose. Curiosamente, o DHA também pode induzir uma degradação autofágica da ferritina, denominada ferritinofagia, mas também uma degradação lisossomal da ferritina de maneira independente de autofagia, aumentando assim o nível de ferro livre celular e sensibilizando a célula à morte ferroptótica. No entanto, os dados sobre os efeitos ferroptóticos do DHA na LMA são escassos e seu efeito preciso no metabolismo do ferro e na ferritinofagia precisa ser esclarecido, visto que este medicamento pode constituir um novo agente terapêutico valioso contra esta doença.

Em nosso presente estudo, examinamos o efeito do DHA no metabolismo do ferro e na ferritinofagia em um grande painel de células leucêmicas após a indução da ferroptose. Descobrimos nesta análise que o DHA pode aumentar o nível transcriptômico da metalotioneína (MT), uma família de proteínas envolvida no metabolismo do zinco. A inibição da MT sensibiliza as células à ferroptose, que é induzida ao aliviar a regeneração de GSH e, assim, depletar esse metabólito.

Resultados

Uma sobrecarga exógena de ferro induz ferroptose e sensibiliza células leucêmicas à ferroptose induzida por compostos depletores de GSH

O Citrato Férrico (FAC) induz ferroptose em células de leucemia mieloide aguda e sensibiliza as células à toxicidade dos indutores de ferroptose.
a Curvas de viabilidade para as células indicadas 24 h após o tratamento. Barras de erro ± desvio padrão. b Porcentagem da concentração inibitória máxima (IC50%) do tratamento com FAC por 24 h em um painel de linhagens celulares de LMA com base na viabilidade celular (n = 3). Em nossos experimentos subsequentes, selecionamos duas linhagens celulares de LMA sensíveis ao FAC nessas faixas de concentração. c Coloração com C11-BODIPY de células MOLM-14 tratadas com doses crescentes de FAC + DMSO, FAC + erastina, FAC + Deferoxamina (DFO) ou FAC + Ferrostatina-1 (Fer-1). Os dados são expressos em % de células positivas (em comparação com células não coradas) (n = 3). d Curvas de viabilidade para células MOLM-14 ou OCI-AML2 tratadas com FAC e diversos indutores de ferroptose 24 h após o tratamento. Barras de erro, ± desvio padrão. e Curvas de viabilidade para células MOLM-14 ou OCI-AML2 tratadas com FAC e diversos inibidores de ferroptose 24 h após o tratamento. Barras de erro, ± desvio padrão. f Mapa de sinergia ilustrativo do co-tratamento de 24 h de células MOLM-14 com FAC e erastina. A viabilidade celular média de três experimentos independentes foi utilizada (n = 3).
Na ausência de dados satisfatórios na literatura atual sobre a adição de ferro férrico ou sua modulação em modelos leucêmicos, investigamos os efeitos de um excesso de citrato férrico de ferro exógeno (FAC) na LMA sobre o início da ferroptose, bem como seu efeito na sensibilização a indutores conhecidos de ferroptose. Para capturar a heterogeneidade das anormalidades genéticas da LMA, tratamos uma grande variedade de linhagens celulares de LMA com concentrações crescentes de FAC, variando de 10 a 1000 µM (Fig. 1a) e avaliamos a viabilidade celular após 24 h. Definimos três grupos em termos de sensibilidade ao tratamento com FAC de acordo com o valor de IC50, ou seja, células sensíveis cujo IC50 era <1000 µM (em vermelho), células resistentes cujo IC50 era >2000 µM (preto) e linhagens celulares de LMA moderadamente sensíveis cujo IC50 estava entre 1000 µM e 2000 µM (Fig. 1b). A linhagem celular de LMA mais sensível e a mais resistente entre este painel foram OCI-AML2 (IC50 = 157 µM) e K562 (IC50 = 4261 µM), respectivamente. Utilizamos as duas linhagens celulares mais sensíveis para todos os nossos experimentos subsequentes, ou seja, MOLM-14 e OCI-AML2. Em seguida, confirmamos que a toxicidade do FAC estava relacionada à indução de ferroptose usando coloração específica com C11-BODIPY, e que o FAC poderia sensibilizar células leucêmicas à ferroptose induzida por erastina (Era) (Fig. 1c). Observamos a partir desta análise que o FAC poderia sensibilizar células leucêmicas MOLM-14 e OCI-AML2 à morte celular ferroptótica induzida por baixas doses de erastina (1 µM) ou APR-246 (10 µM), agentes que atuam no pool de GSH intracelular (Fig. 1d), e que o efeito do FAC foi revertido pelo inibidor de ferroptose ferrostatin-1 (Fer-1) ou por quelantes de ferro como deferasirox (DFX) (Fig. 1e). Para avaliar o efeito sinérgico entre dois compostos, utilizamos um escore do modelo ZIP, um escore baseado nas respostas observadas da combinação de fármacos em comparação com as respostas esperadas da combinação calculadas por meio de um modelo de pontuação de sinergia. Consequentemente, a combinação de fármacos é classificada como sinérgica quando o escore ZIP é positivo (ou seja, o efeito da combinação é maior do que o esperado) ou antagônica quando o escore ZIP é negativo (ou seja, o efeito da combinação é menor do que o esperado). De acordo com o escore do modelo ZIP, FAC e erastina exibiram um efeito antileucêmico sinérgico (Fig. 1f). Coletivamente, esses dados indicam que uma sobrecarga de ferro exógeno por si só pode desencadear ferroptose. Além disso, a combinação da sobrecarga de ferro com erastina sensibiliza ainda mais certas células de LMA à morte celular ferroptótica.
DHA induz morte precoce por ferroptose
DHA induz ferroptose precoce em células de LMA.
a Curvas de viabilidade para as células indicadas 24 h após o tratamento. Barras de erro, ± desvio padrão (n = 6). b IC50% do tratamento com DHA por 24 h no mesmo painel de células AML com base na viabilidade celular (n = 6). c Marcação com C11-BODIPY de células MOLM-14 e OCI-AML2 tratadas com concentrações crescentes de DHA e DHA + Fer-1. Os dados são expressos em intensidade média de fluorescência (MFI) (fold/ células tratadas com DMSO) (n = 3). d % de apoptose (marcação com PI) de células MOLM-14 e OCI-AML2 tratadas com DHA e vários inibidores de morte celular em 24 h e 48 h (n = 3).

Em seguida, buscamos modular os estoques intracelulares de ferro de forma mais refinada por meio da ferritinofagia. De fato, esse fenômeno recentemente descrito pareceu oportuno, pois pode ser desencadeado a partir de um estoque pré-existente de ferritina, uma situação frequentemente encontrada em pacientes com LMA. Como ainda não foi encontrado nenhum composto que possa imitar especificamente os efeitos da ferritinofagia, decidimos avaliar se o DHA poderia induzir esse processo, uma vez que foi descrito como um de seus mecanismos de ação. Utilizamos um painel das mesmas linhagens celulares de LMA usadas na Fig. 1A, das três categorias de sensibilidade ao FAC, e as expusemos por 24 h a concentrações crescentes de DHA (Fig. 2a). Curiosamente, as mesmas linhagens celulares de LMA que eram sensíveis à ferroptose induzida por FAC também eram sensíveis aos efeitos antileucêmicos dose-dependentes do DHA, exceto pela linhagem celular SET2, que era moderadamente sensível ao FAC, mas altamente sensível ao DHA (Fig. 2a, b). Em relação à sensibilidade ao DHA, as linhagens celulares MOLM-14 e OCI-AML2 foram novamente consideradas as mais sensíveis e, subsequentemente, selecionadas para análises adicionais. Usando a marcação com C11-BODIPY, confirmamos que o DHA desencadeou forte ferroptose, que foi revertida pelo co-tratamento com Fer-1, conforme esperado (Fig. 2c). Em seguida, buscamos verificar se a ferroptose era o principal mecanismo de morte celular induzido pelo DHA nessas células leucêmicas. Pré-incubamos células AML com Fer-1, ZVAD-FMK (um inibidor pan-caspase), cloroquina (um inibidor tardio da autofagia), necrostatina-1s (Nec1s) ou DFX, um potente quelante de ferro, e as tratamos por 24 h com 10 µM de DHA. Os inibidores específicos de ferroptose Fer-1 e DFX foram os únicos a inibir fortemente a morte celular mediada por DHA em ambas as linhagens celulares de LMA (além de efeitos leves da cloroquina nas células OCI-AML2) após 24 h de tratamento, enquanto a inibição de caspase não conseguiu reverter o efeito de morte celular do DHA (Fig. 2d). Coletivamente, esses dados indicaram que o DHA induz uma resposta precoce de morte celular por ferroptose em linhagens celulares de LMA que são sensíveis ao FAC.

O DHA coopera com o FAC para aumentar o pool de ferro intracelular
O DHA aumenta o ferro intracelular e sinergiza com o tratamento com baixa dose de FAC.
a Nível de Fe2+ avaliado por coloração com Sirhonox após tratamento com DHA ou DHA + DFX por 3 h em MOLM-14 ou OCI-AML2. Os dados são expressos em MFI (fold/células tratadas com DMSO) (n = 3). b Análise por immunoblotting de CD71 e FTH1 em células MOLM-14 e OCI-AML2 tratadas com doses crescentes de DHA (1, 5 e 10 µM) por 24 h. c Análise por immunoblotting de IRP2, CD71 e FTH1 em células MOLM-14 tratadas com FAC 10 µM, DHA 5 µM ou ambos por 24 h. d Nível de Fe2+ avaliado por coloração com Sirhonox após tratamento com DHA, FAC ou combinação de ambos por 3 h. Os dados são expressos em intensidade média de fluorescência (MFI) (fold/células tratadas com DMSO) (n = 3).

Para estudar os efeitos do DHA no metabolismo do ferro, tratamos MOLM-14 e OCI-AML2 com 5 µM de DHA por diferentes períodos de tempo e avaliamos o pool de ferro lábil (LIP) por FC usando um corante específico para Fe2+ (FerroFarRed) que marca Fe2+ no retículo endoplasmático e no aparelho de Golgi. Assumimos que essa intensidade de coloração refletia o nível intracelular de LIP. Observamos um rápido aumento de 2 a 3 vezes na quantidade de LIP após o tratamento com DHA em ambas as linhagens celulares de LMA, que foi revertido por um co-tratamento com DFX (Fig. 3a). Esse aumento levou a uma regulação negativa contrária dose-dependente do receptor de transferrina-1 (TFR1, também conhecido como CD71) e subsequente aumento no nível de FTH1 após 6 h de tratamento, apesar de não haver grande acúmulo de FTH1 entre as doses de DHA de 2 e 10 µM em MOLM-14, conforme analisado por western blot (Fig. 3b) (Veja WesternBlots não cortados no material suplementar). A regulação negativa contrária da expressão do nível de CD71 após 24 h de exposição ao DHA também foi avaliada por análise de FC em células MOLM-14 e OCI-AML2 (S1). Em seguida, determinamos se o co-tratamento com DHA e FAC poderia cooperar no aumento do LIP e na toxicidade mediada pelo ferro em células MOLM-14 e OCI-AML2. Enquanto o tratamento com FAC (10 µM) por 24 h isoladamente aumentou o armazenamento de ferro na FTH1 e levou a uma drástica regulação negativa de CD71, o co-tratamento com DHA (5 µM) por 24 h induziu uma resposta de IRP2 caracterizada por uma diminuição na expressão de FTH1 (liberação de ferro) e uma leve regulação positiva na expressão de CD71 (Fig. 3c). Ao avaliar a concentração de LIP com o corante FerroFarRed, observamos um efeito cooperativo rápido no aumento do LIP (4 a 5 vezes) com o co-tratamento de FAC e DHA em ambas as linhagens celulares de LMA (Fig. 3d).

Coletivamente, esses dados indicaram que o DHA induz um aumento rápido e importante no LIP em linhagens celulares de LMA sensíveis. O co-tratamento com FAC potencializou ainda mais o acúmulo de ferro.

A ferritinofagia induzida por DHA participa de sua toxicidade
O DHA induz ferritinofagia em células de LMA.
a Análise de imunotransferência de LC3, NCOA4 e FTH1 em células MOLM-14 tratadas com FAC 10 µM, CQ 10 µM, DHA 5 µM ou combinação de FAC + DHA ou CQ + DHA por 12 h. b Análise de imunofluorescência de FTH1 ou LAMP2 em células MOLM-14 tratadas com DHA 5 µM, FAC 10 µM ou ambos por 16 h. c Curvas de viabilidade para as células indicadas em 24 h após tratamento com DMSO, cloroquina (10 µM) ou VPS-34in1 (5 µM) e DHA em doses crescentes. Barras de erro, ± desvio padrão (n = 3). d Análise de imunotransferência de CD71, NCOA4 e FTH1 em células MOLM-14 e OCI-AML2 tratadas com FAC 10 µM, VPS34-In1 5 µM e DHA 5 µM ou combinação de FAC + DHA ou VPS34-In1 + DHA por 24 h. e Curvas de viabilidade para células MOLM-14 ou OCI-AML2 transduzidas com scramble ou shNCOA4 tratadas com DHA em doses crescentes por 24 h e IC50% correspondente. Barras de erro, ± desvio padrão (n = 3).
Buscamos confirmar que o DHA poderia induzir ferritinofagia em nosso modelo de LMA. Primeiro, avaliamos o efeito da CQ (10 µM) ou FAC (50 µM), além do DHA (5 µM), por 24 h na linhagem celular MOLM-14. Enquanto a CQ leva a um acúmulo da expressão de NCOA4 e ao desaparecimento da banda lisossomal de FTH1 (banda inferior), o DHA sozinho aumentou a expressão de FTH1. Surpreendentemente, a adição de FAC ao DHA interrompeu o fluxo de ferritinofagia (aumento da banda superior e desaparecimento da banda inferior), imitando assim a adição de CQ (Fig. 4a). Para abordar a questão de se o aumento de FTH1 foi causado pela ativação de NRF2 após o tratamento com DHA, analisamos a expressão de NRF2 após exposição ao DHA (5 µM) por 6 h, isoladamente ou com o inibidor de NRF2 brusatol (10 nM). Observamos que o aumento da expressão de FTH1 e xCT mediado pelo DHA estava ligado à resposta antioxidante do NRF2 (S.2a). Em seguida, realizamos um experimento de imunofluorescência usando anticorpos contra LAMP2 (verde) e FTH1 (vermelho) após exposição ao DHA (5 µM) por 16 h. Confirmamos que o DHA induziu a colocalização entre FTH1 e o marcador lisossomal LAMP2 (setas brancas) (Fig. 4b). Para estudar melhor o impacto da ferritinofagia na toxicidade induzida pelo DHA, tratamos as células MOLM-14 ou OCI-AML2 com o inibidor de ferritinofagia mais específico, VPS34-in1, que inibe especificamente a atividade catalítica da VPS34 (5 µM) e comparamos com o cotratamento com CQ (10 µM) sob aumentos na dose de DHA. O VPS34-in1 reduziu mais fortemente a IC50 do DHA do que a CQ (ver Fig. 4c e S2b para os efeitos do VPS34-in1 nos níveis de FTH1 e NCOA4, determinados por western blot, em comparação com FAC ou o inibidor lisossomal BafA1). Usando um modelo sinérgico, confirmamos que tanto o DHA quanto o VPS34-in1 exibiram um forte efeito antagônico (escore ZIP < 10) (Fig. 4e). Em seguida, avaliamos se a inibição genética de NCOA4 poderia mitigar a toxicidade induzida pelo DHA. Após avaliar um knockdown efetivo de NCOA4 e aumento de FTH1 em células MOLM-14 e OCI-AML2 com dois construtos diferentes de shRNA indutível para NCOA4 (S 2c), comparamos os efeitos do tratamento com DHA nas linhagens celulares de LMA shSCR (scrambled) ou shRNA NCOA4. Observamos um aumento na IC50 nas linhagens celulares MOLM-14 e OCI-AML2 transduzidas com shRNA NCOA4 e tratadas com DHA, como esperado (Fig. 4d). No geral, esses resultados indicam que a atividade antileucêmica do DHA está relacionada à ferritinofagia induzida pelo DHA.
Identificação de regulação positiva de MTs após tratamento com DHA por análise transcriptômica
A análise transcriptômica identifica o metabolismo do zinco e a metalotioneína como moduladores da toxicidade do DHA.
a Esquerda: desenho experimental: MOLM-14 e OCI-AML2 transduzidas com scramble ou shNCOA4 foram tratadas com DMSO ou DHA 5 µM por 24 h. O RNA foi extraído e a análise transcriptômica foi realizada em triplicatas. Meio: diagrama de Venn do RNA enriquecido no grupo DHA (p < 0,05). Direita: vias enriquecidas no grupo DHA de acordo com a análise Enrichr (p < 0,05) (Em vermelho: as 4 principais vias enriquecidas). b Os dados transcriptômicos foram processados na análise de enriquecimento GSEA de acordo com a via KEGG2022. O enriquecimento das vias de Ferroptose e Homeostase do Zinco é mostrado. c Tabela das 4 principais vias enriquecidas na análise Enrichr e os genes correspondentes envolvidos. d Coloração C11-BODIPY de células OCI-AML2 tratadas com DHA 5 µM, Brusatol 10 nM, PPG 2 mM ou combinação de DHA + Brusatol ou DHA + PPG-1. Os dados são expressos em % de células positivas (em comparação com células não coradas) (n = 3). e Mapa de sinergia ilustrativo do co-tratamento de 24 h de células OCI-AML2 com DHA e PPG. A viabilidade celular média de três experimentos independentes foi utilizada (n = 3).
Nós desejamos elucidar os mecanismos envolvidos nos efeitos citoprotetores contra a atividade antileucêmica do DHA na LMA. Realizamos análise de RNAseq nas células MOLM-14 e OCI-AML2, expressando shSCR ou shRNA NCOA4, após tratamento com DHA a 5 µM por 24 h. Os dados brutos dos genes mais regulados positiva e negativamente nas células MOLM-14 shSCR e OCI-AML2 shSCR são apresentados em S3, mas nenhum desses genes foi de interesse da nossa perspectiva. Conforme mostrado no diagrama de Venn na Fig. 5a, 109 genes foram comuns aos quatro grupos e foram regulados positivamente após o tratamento com DHA em ambas as linhagens de LMA (FC > 2,0; P < 0,05). Em seguida, realizamos análise de enriquecimento usando a ferramenta web Enrichr, agrupando os quatro grupos após o tratamento com DHA. De acordo com o KEGG Pathway 2021, a via da ferroptose, que envolve os genes do metabolismo do ferro (FTH1, FTL, TF, HMOX1), genes envolvidos no transporte e metabolismo de aminoácidos (SLC7A11, SLC3A2, GCLC, GCLM) e genes envolvidos no metabolismo de poliaminas (SAT1, SAT2), foi considerada nesta análise como a mais enriquecida (OR = 8,23; P < 0,001) (Fig. 5b). O metabolismo de cisteína e serina-treonina também estiveram entre as vias enriquecidas com maior pontuação, como esperado. A expressão diferencial das principais proteínas entre células tratadas com DHA e células controle, para as vias de ferroptose, metabolismo do ferro e NRF2, é mostrada em S4. Surpreendentemente, após o tratamento com DHA, a via do metabolismo do zinco é significativamente enriquecida nas linhagens MOLM-14 e OCI-AML2 (OR = 5,5; P < 0,001). Essa via compreende vários membros MT (MT1M, MT1X, MT2A, MT1F, MT1G, MT1E), transportador de zinco (SLC30A1) ou transportador de cobre (SLC31A1). Confirmamos essas vias de enriquecimento usando análise GSEA e novamente identificamos ferroptose (NES = 2,08; P < 0,01) e metabolismo do zinco (NES = 1,79; P < 0,05) entre as vias com maior pontuação enriquecidas após o tratamento com DHA (Fig. 5c). Os dados referentes às seis vias com maior pontuação em MOLM-14 SCR ou OCI-AML2 SCR são apresentados em S5. Notavelmente, os resultados mostraram que, após o tratamento com DHA, a via de resposta antioxidante NRF2 é estatisticamente ativada (P < 0,05) em ambas as linhagens celulares, confirmando seu papel mencionado anteriormente. Confirmamos a regulação positiva das seis isoformas de MT identificadas na análise de enriquecimento por qPCR em MOLM-14 e OCI-AML2 após tratamento com DHA (5 µM) por 24 h (S6a).
A análise das isoformas de MT por qPCR nas linhagens celulares leucêmicas menos sensíveis THP-1 e K562 mostrou uma regulação positiva moderada em resposta ao tratamento com DHA, de até 2 vezes versus 3 a 6 vezes em MOLM-14 e OCI-AML2, respectivamente (S6b). Para confirmar o envolvimento da regulação positiva de MT na resposta antioxidante após o tratamento com DHA, utilizamos o composto PPG, que demonstrou reduzir a expressão de todas as isoformas de MT. O co-tratamento com PPG (2 mM) e DHA em células MOLM-14 e OCI-AML2 levou a um aumento muito forte na ferroptose, conforme demonstrado pela coloração com C11-BODIPY, enquanto o co-tratamento com o inibidor de NRF2 brusatol (10 nM) não produziu efeito (Fig. 5d). Nosso objetivo foi avaliar a inibição de MT pelo PPG nas mesmas linhagens celulares leucêmicas menos sensíveis mencionadas anteriormente (ou seja, THP-1 e K562), mas não conseguimos observar o mesmo efeito em comparação com MOLM-14 ou OCI-AML2 (S6c). Por fim, realizamos um ensaio de sinergismo entre DHA e PPG nas linhagens MOLM-14 e OCI-AML2 e descobrimos que ambos os compostos exibiram um efeito sinérgico moderado (Fig. 5e). Em conjunto, esses dados confirmam que a MT é regulada positivamente em resposta ao tratamento com DHA e que a pan-inibição de MT com PPG sensibiliza as células leucêmicas à ferroptose induzida por DHA.
Specific MT isoform downregulation sensitizes AML cells to ferroptosis inducers by mitigating the GSH pool
Desenho ilustrativo da regulação das Metalotioneínas e o envolvimento da regulação de MTF1 e NRF2.
As propriedades químicas únicas descritas acima determinam os papéis-chave das MTs na homeostase celular de Zn++ por meio da ligação de baixa afinidade de ~5–15% do pool de íons de Zn da célula, em combinação com duas classes de famílias de transportadores de Zn, a saber, proteínas similares a Zrt e Irt (ZIP, transportando Zn++ para o citoplasma) e transportadores de Zn (ZnT, transportando Zn++ para fora do citoplasma). Uma única MT pode conter até 7 átomos de Zn2+. As MTs estão envolvidas na desintoxicação de metais pesados, como Cu2+, Cd+ ou Pb+. Por exemplo, a oligomerização de MTs pode ocorrer tanto em formas nativas/não oxidativas quanto em formas oxidativas induzidas por altas concentrações de Cd2+, onde as subunidades de MT são covalentemente ligadas por pontes dissulfeto. Sob estresse oxidativo, as MTs podem liberar Zn2+ (apo-MT) para formar grupos tiol e participar na redução de GSSG/GSH. A atividade basal de TM é regulada por vários fatores de transcrição gerais. Além disso, as MTs podem ser ativadas por uma variedade de estímulos, incluindo íons metálicos, citocinas e fatores de crescimento. Vários reguladores da expressão induzível dos genes de MT foram identificados, incluindo o elemento responsivo a metais (MRE). Os MREs são classicamente necessários para a indução por metais. Os MREs atuam em conjunto com o fator de transcrição MTF1, dependente e responsivo ao zinco, que está envolvido na expressão induzível das MTs. Nesse sentido, os MREs, o MTF1 e os íons de Zn essenciais que se associam ao MTF1 contribuem para a expressão basal e induzível das MTs. O MTF1 também facilita independentemente o recrutamento de Sp1 e p300 para o complexo proteico em resposta ao zinco. Junto com os MREs, muitos promotores de MT contêm uma sequência consenso ARE e são induzidos pela resposta antioxidante mediada por NRF2. Todos os promotores do gene MT também contêm pelo menos uma caixa GC (sequência consenso GGGGCGGGG) que responde a membros da família constitutiva de fatores de transcrição de dedo de zinco Sp/XKLF, incluindo Sp1. Finalmente, foi demonstrado que o MTF1 é constitutivamente fosforilado em resíduos de serina e tirosina sob condições basais, tanto em células humanas quanto de camundongos. A indução com metais de transição (tanto cádmio quanto zinco) aumenta o nível de fosforilação do MTF1 por meio de uma via complexa envolvendo a proteína quinase C (PKC), fosfoinositol-3 quinase (PI3K), c-jun N-terminal quinase (JNK), tirosina quinase, caseína quinase II e sinalização de cálcio, bem como PTEN, que pode interagir com o MTF1 por meio de seu domínio fosfatase/C2.
As MTs são essenciais no metabolismo do zinco, na desintoxicação de metais pesados e nas defesas antioxidantes ao atuar na regeneração de GSH. O fator de transcrição responsivo a metais-1 (MTF1) desempenha um papel fundamental na transcrição de MT após o estresse oxidativo ser produzido por uma sobrecarga de metais pesados. Os genes MT contêm um Elemento de Resposta a Metais (MRE) em seus promotores que responde à ligação de MTF1 e Elementos de Resposta Antioxidante (AREs) que facilitam sua regulação positiva em resposta à ativação de NRF2. Os componentes essenciais da regulação de MT são mostrados na Fig. 6. Primeiro, hipotetizamos que a ativação de NRF2 poderia impulsionar a regulação positiva de MT após o tratamento com DHA e construímos dois shRNAs direcionados contra NRF2 (S7, sh2 NRF2 foi escolhido por sua melhor eficácia). No entanto, não observamos regulação negativa de MT após a inibição de NRF2 (S8). Decidimos então inibir MT2A diretamente, pois foi a isoforma mais regulada positivamente em nossa análise transcriptômica após a exposição a DHA. Essa inibição genética de MT2A não produziu efeito na sensibilização ao DHA e um efeito leve após o tratamento com indutores de ferroptose que atuam no pool de GSH, como erastina, APR-246 ou FIN56 (S9). Para decifrar essa falta de efeito, avaliamos o nível de RNA das isoformas de MT por qPCR após o tratamento com DHA. A inibição genética de MT2A no contexto do tratamento com DHA levou a uma rápida regulação positiva compensatória de outras isoformas de MT, principalmente MT1M (S10). Apesar dessa regulação de feedback, a inibição de MT2A foi capaz de sensibilizar células MOLM-14 e OCI-AML2 ao tratamento com erastina, com um aumento na razão GSSG (forma oxidada)/ GSH (S11).
A invalidação genética de MT2A e MT1M sensibiliza células a indutores de ferroptose.
a Curvas de viabilidade para as células indicadas 24 h após o tratamento. Barras de erro ± desvio padrão são mostradas (n = 6). b Mapas de calor mostrando a IC50% dos compostos indicados após 24 h de exposição em células MOLM-14 e OCI-AML2 transduzidas com shSCR, shMT2A ou shMT2A e siMT1M por 48 h (n = 6). c Coloração com C11-BODIPY de células MOLM-14 e OCI-AML2 transduzidas com shSCR, shMT2A ou shMT2A e siMT1M por 48 h e tratadas com DMSO, erastina (5 µM) ou erastina + GSH (1 mM). Os dados são expressos em mudança relativa em comparação com células SCR não tratadas (n = 3). d Gráficos de violino representando a viabilidade no ensaio Uptiblue para três pacientes com LMA transduzidos com siSCR ou siMT2A por 48 h e tratados com DHA (50 µM) isoladamente ou DHA + PPG (2 mM) por 24 h.
Portanto, decidimos coinibir a MT2A juntamente com a isoforma MT1M usando um siRNA direcionado contra MT1M nas linhagens de LMA MOLM-14 e OCI-AML2 transduzidas com shRNA MT2A. A inibição de ambas as isoformas levou a um leve aumento na sensibilização à morte celular após tratamento com DHA por 24 h (10 µM). Mais importante, a inibição de ambas as isoformas sensibilizou essas células à morte induzida por indutores de ferroptose que atuam no pool de GSH (erastina, APR-246 ou FIN56) (Fig. 7a). Notavelmente, a IC50 foi reduzida pela metade para a toxicidade da erastina nas células MOLM-14 e OCI-AML2 (Fig. 7b). Finalmente, quisemos confirmar que esse efeito era mediado por um prejuízo na regeneração de GSH e ligado à indução de ferroptose. Tratamos linhagens celulares MOLM-14 ou OCI-AML2 transduzidas com shMT2A ou shMT2A + siMT1M com erastina (5 µM) ou erastina + GSH (1 mM) por 16 h. Essas linhagens celulares duplamente transduzidas mostraram um aumento significativo na coloração C11-BODIPY em comparação com células shMT2A simples ou SCR, e esse efeito foi totalmente revertido com o cotratamento com GSH (Fig. 7c). Em seguida, transfectamos amostras de células leucêmicas medulares primárias de três pacientes (ver detalhes nas legendas da figura suplementar) com siMT2A marcado com Cya3 por 48 h para controlar a eficácia da transfecção e as tratamos com DHA (50 µM) ou DHA + PPG (2 mM). Observamos um aumento na citotoxicidade com ambos os compostos em células transfectadas com siMT2A em comparação com DHA sozinho (Fig. 7d). Coletivamente, esses dados apoiaram um papel protetor da expressão de MT através da geração de uma resposta anti-ferroptótica ao DHA em células de LMA que, de fato, é mediada pelo seu papel na regeneração do pool de GSH. Nossas descobertas atuais também sugerem que a inibição química de MT pode cooperar com DHA em células primárias de LMA em pacientes.
Discussão
A ferroptose é bastante distinta de outros tipos de morte celular regulada, como apoptose e necroptose. É caracterizada pelo acúmulo excessivo de EROs provenientes do metabolismo do ferro e da peroxidação lipídica. Evidências crescentes agora revelaram que induzir ferroptose pode constituir uma estratégia terapêutica atraente para superar a resistência das células cancerígenas à apoptose induzida por medicamentos.
Estudos anteriores demonstraram que o DHA promove a ferroptose por meio da indução de autofagia e, mais especificamente, por meio da ferritinofagia, embora resultados conflitantes tenham surgido recentemente. Em um estudo anterior, Du e colaboradores descobriram que o DHA pode desencadear ferroptose na linhagem celular leucêmica HL-60 ao aumentar a atividade do eixo de sinalização AMPK/mTOR/p70S6k e, subsequentemente, por meio da indução de autofagia, disfunção mitocondrial e liberação de ferro. Aqui, descobrimos que o DHA pode desencadear eficazmente a ferroptose em diferentes linhagens de células leucêmicas e observamos sua toxicidade independentemente do cenário genético. Confirmamos ainda que o DHA induz um fluxo ferritinofágico precoce, promovendo assim a liberação de ferro e permitindo a peroxidação lipídica, e que a toxicidade do DHA pode ser fortalecida pela adição de ferro férrico exógeno em baixas doses. Paradoxalmente, altas doses de ferro férrico prejudicaram a ferroptose induzida pelo DHA, provavelmente devido ao aumento do armazenamento de ferro, que é induzido pela estimulação imediata da síntese de FTH1.
Nosso presente estudo também destaca um novo papel do metabolismo do zinco, especialmente a família MT de pequenas proteínas ubíquas envolvidas na desintoxicação de metais pesados e na resposta ao estresse oxidativo, na regulação da ferroptose. Até onde sabemos, o único estudo anterior mencionando um papel da MT no contexto da ferroptose utilizou um modelo de hepatocarcinoma, onde uma isoforma MT1G mostrou-se capaz de mitigar a ferroptose induzida por sorafenibe por meio da ativação da via NRF2. Em nosso estudo atual, observamos uma regulação positiva global de algumas isoformas de MT, predominantemente MT2A, MT1M, MT1X, MT1E e MT1F, sob exposição ao DHA, enquanto a ativação da via NRF2 não estava envolvida. Essa regulação positiva geral complexifica a modulação da MT, pois a inibição de uma isoforma parece ser imediatamente compensada pela regulação positiva de outras no contexto do tratamento com DHA. No entanto, o uso de um inibidor químico irreversível pan de isoformas de MT, como o PPG, pode superar essa limitação.
Embora a inibição das isoformas mais superexpressas em nossos experimentos atuais, MT2A e MT1M, pareça não desempenhar um papel importante na resposta citotóxica dos ART, seu impacto foi considerado preponderante na resposta à indução de ferroptose por compostos que modulam o pool de GSH, seja por meio da inibição da importação intracelular de cisteína (erastina), inibição direta da GSH (APR-246) ou bloqueio indireto da enzima GPX4 (FIN56). Estudos anteriores revelaram que a MT pode regular a depleção de GSH por meio da modulação de suas enzimas biossintéticas. Aqui, confirmamos que a inibição da MT prejudica a regeneração da GSH e a consequente atividade da GPX4, sensibilizando assim as células à morte celular ferroptótica. Não se exclui a possibilidade de que a inibição da MT também possa modular o pool de ferro lábil, uma vez que estudos anteriores demonstraram a capacidade putativa da MT de ligar Fe2+ in vitro.
Vários ensaios clínicos concluídos (NCT00764036, NCT02353026, NCT02354534, NCT03100045, NCT02304289) e ensaios clínicos em andamento (NCT02633098, NCT03093129, NCT03792516, NCT04098744, NCT02786589) relataram a eficiência e a tolerância aceitável das artemisininas em pacientes com câncer. Entre outros indutores de morte celular, o DHA pode desencadear especificamente a ferroptose precoce em células leucêmicas e exibir um efeito sinérgico com a inibição de MT para promover a peroxidação lipídica. No entanto, indutores de ferroptose para os quais a depleção de GSH constitui o principal mecanismo, por exemplo, erastina, APR-246 ou FIN56, podem ser melhores candidatos para promover a morte celular ferroptótica no contexto da inibição de MT. Portanto, nosso presente estudo fornece evidências de que a modulação de MT pode ser um adjuvante promissor que melhorará a resposta à ferroptose em células leucêmicas em pacientes. Também fornecemos aqui um paradigma para uma compreensão mais aprofundada da ferroptose como uma potencial terapia futura contra o câncer.

Conclusão

O DHA pode desencadear a ferroptose em diferentes células leucêmicas de variada origem genética, e essa morte celular ferroptótica é mediada principalmente, mas não exclusivamente, pela indução de ferritinofagia e subsequente liberação de ferro intracelular. Além disso, a regulação positiva de MT foi demonstrada pela primeira vez como estando envolvida na mitigação da ferroptose, especialmente no contexto de compostos depletores de GSH. A inibição subsequente de MT pode sensibilizar as células leucêmicas à peroxidação lipídica in vitro ao prejudicar a regeneração de GSH. Esta estratégia requer investigação adicional para ser potencialmente traduzida em uma aplicação clínica in vivo viável.

Material e métodos

Linhagens celulares e reagentes

As linhagens celulares de LMA MOLM-14, OCI-AML2, HL-60, SET2, MV4-11, K562, THP-1, UT7-EPO, SKM1, NB4 e KASUMI-1 foram utilizadas. Os pacientes forneceram consentimento informado por escrito de acordo com a Declaração de Helsinque. Amostras de medula óssea (MO) foram obtidas de cinco pacientes com LMA recém-diagnosticada (características fornecidas na Tabela Suplementar S1). As células foram cultivadas em RPMI com glutamina (Gibco61870, Life Technologies® Saint Aubin, França) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 4 mM de glutamina. O Citrato Férrico (FAC) foi adquirido da Sigma. DHA, Ferrostatin-1, Deferoxamina (DFO), Deferasirox (DFX), QVD-OPH, APR-246, VPS34-in1, erastina, FIN56 e RSL3 para o estudo in vitro foram obtidos da Selleckchem (Houston, TX). L-C-Propargilglicina (PPG), Cloroquina e doxiciclina foram obtidos da Sigma–Aldrich (Saint-Louis, MO). FINO2 foi adquirido da Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI).

Construções
shRNA indutível de grampo curto (shRNA) direcionado a NCOA4, MT2A ou NRF2 foi construído e adquirido da Eurofins usando as seguintes sequências: NCOA4 #1: GGCAGCTCCAGTAATAGAGAA; #2 GGTTATCAAGCTCCTTACATA; NRF2 #1 GCTCCTACTGTGATGTGAAAT; #2 GCACCTTATATCTCGAAGTTT; MT2A #1 GCAAATGCAAAGAGTGCAAAT; #2 CAAATGCACCTCCTGCAAGAA e clonado em um plasmídeo pLKO-Tet-On–induzível ou pLKO.1 (plasmídeos #21915; Invitrogen, Cambridge, MA). O silenciamento mediado por siRNA da expressão gênica foi realizado com Lipofectamine RNAimax (Thermofischer, #13778150) de acordo com as diretrizes do fabricante. Construções de siRNA para MT1M (5’->3’#1 GCA AAG GGA CGU UGG AGA ACU; #2UGU GUC UGC AAA GGG ACG UUG) ou MTF1 (#1 CCU CAC CUU UCA GAC GUA UUU; #2 GCU CUC UUA CAA CCU CCA GAA) ou scramble foram desenhadas e encomendadas da Eurofins com repórter Cy5 modificado 5’ para controlar a eficácia da transfecção.
Empacotamento lentiviral e transdução
Células de empacotamento 293-T foram usadas para produzir construções lentivirais através de co-transfecção com plasmídeos codificando proteínas lentivirais. Após 24 h e 48 h de transfecção, os sobrenadantes foram coletados e ultracentrifugados a 22.000 rpm por 90 min a 4 °C por 2 dias consecutivos, filtrados através de um filtro de 0,4 μm e subsequentemente armazenados a −80 °C. Linhagens celulares de LMA foram semeadas a 2 × 10⁶/mL e alíquotas de 2–10 mL de sobrenadantes lentivirais foram adicionadas por 3 h. As células foram então cultivadas em meio com 10% de soro fetal bovino por 24 h e posteriormente selecionadas com puromicina por 48 h. Para indução de shRNA, 100 mg/mL de doxiciclina foi adicionada ao meio de cultura por 48 ou 72 h.
Ensaio baseado em citometria de fluxo
A aquisição e análise de dados foram conduzidas na Instalação de Citometria e Imunobiologia de Cochin. Para medições de ferro usando o corante BioTracker Far-red Labile Fe2+ (chamado FerroFarRed, #SCT037, Sigma; Thermofischer; Waltham, MA), 2 × 10⁵ células foram lavadas duas vezes em PBS para remover Fe2+ extracelular, então marcadas com 2 µM de Sirhonox por 60 min em uma incubadora de cultura de tecidos (37 °C, 5% CO2) no escuro e, em seguida, lavadas novamente duas vezes. As células sedimentadas foram então ressuspensas em 0,3 mL de PBS. Os dados de FCM foram coletados usando um citômetro de fluxo BD Navios. 10.000 eventos foram registrados para análise. A análise de dados foi então realizada com o software KALUZA. Para medições de produção de peróxidos lipídicos usando C11-BODIPY (581/591) (2 mM) (Thermofischer, Waltham, MA), 2 × 10⁵ células foram marcadas com C11-BODIPY em 1 mL de meio completo aquecido por 10 min em uma incubadora de cultura de tecidos (37 °C, 5% CO2) no escuro. As células foram então lavadas duas vezes e ressuspensas em 200 µL de PBS fresco. Os dados de FCM foram coletados usando um citômetro de fluxo C6 Accuri (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, França) com o software CFlow Plus. 10.000 eventos foram capturados para análise subsequente com o software CFlow Plus (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, França).
Ensaio GSSG/GSH
Para medições da razão GSSG/GSH usando o kit colorimétrico de ensaio de GSH (Abcam), o protocolo do fabricante foi utilizado. Resumidamente, 2 × 10⁵ células por condição foram semeadas, as células foram centrifugadas e ressuspensas em PBS frio e então lisadas em tampão GSH gelado. Uma mistura de solução contendo mistura NADPH, redutase de GSH e tampão de reação de GSH foi preparada. 20 µL de cada amostra ou solução padrão de GSH foram adicionados a 160 µL da mistura de reação e incubados por 10 min à temperatura ambiente. Finalmente, a absorbância a 405 nm ou 415 nm foi medida usando um leitor de microplacas Typhoon FLA9500 (GE Healthcare; IL).
Imunofluorescência
As células foram plaqueadas em lâminas revestidas com polilisina, tratadas por 16 h com DHA 5 µM ± FAC 10 µM. As células foram então fixadas com metanol, saturadas com PBS/BSA 3% e incubadas com anticorpo anti-FTH1 e anti-LAMP2 durante a noite. Após três lavagens com PBS–0,2%BSA-tween 0,01%, as células foram incubadas com anticorpos secundários, lavadas três vezes antes da montagem em lâminas de cobertura com Invitrogen™ Fluoromount-G™ Mounting Medium, com DAPI. As imagens foram coletadas com 16 séries ópticas z com um passo de 0,2 µm, usando o microscópio invertido Leica DMI6000 Spinning Disk. As séries z são exibidas como projeções máximas de z.
Extração de RNA, QPCR e análise transcriptômica
A extração de RNA total foi realizada usando o kit de extração de RNA (Qiagen). 1000 ng de cada amostra foram então transcritos reversamente usando RT Maxima (ThermoFisher) e o cDNA das amostras foi amplificado usando primers específicos: MT2A 5’-CTCCAAGTCCCAGCGAAC-3’; MT1A5’-GCTTGAGATCTCCAGCCTTACC-3’; MT1X5’-TCTCCTTGCCTCGAAATGGAC-3’; MT1M5’-GCTTGAGATCTCCAGCCTTACC-3’; MT reverso 3’-TTGCAGGAGGTGCATTTG-5’; Os dados foram normalizados para RNA de actina (actina humana 5′-GGGTCAGAAGGATTCCTATG-3′ e 3′-GGTCTAAACATGATCTGGG-5′). Para análise transcriptômica, a qualidade dos extratos de RNA foi analisada com Bioanalyzer 2100 (Agilent) e o sequenciamento em triplicata foi realizado com NextSeq™ 500 (Illumina). Os dados brutos foram analisados e normalizados usando o pacote DESeq2. As análises de enriquecimento foram realizadas usando o software GSEA 3.0 e a ferramenta web Enrichr.
Western blotting
Os extratos celulares totais e o western blotting foram realizados conforme descrito anteriormente. Os anticorpos contra NCOA4 foram da Bethyl, anti-FTH1, anti-LC3 foram da Cell Signaling. O anticorpo anti-CD71 foi adquirido da Proteintech. O anti-β-ACTINA foi da Sigma-Aldrich.
Medição de efeitos sinérgicos
A viabilidade celular foi calculada para cada combinação de doses de DHA e indutor de ferroptose usando a ferramenta web Synergy Finder (https://synergyfinder.fimm.fi/) e comparada a cada agente isoladamente. Os cálculos foram baseados no modelo ZIP.
Células LMA foram plaqueadas a 20 × 104/mL em 100 μl de RPMI suplementado com 10% de SBF antes da adição dos compostos. As células foram cultivadas na presença dos compostos teste por 24 a 48 h a 37 °C. A viabilidade foi quantificada usando o ensaio Uptiblue baseado em fluorescência (Interchim, Montluçon, França). Resumidamente, Uptiblue foi adicionado a cada poço em alíquotas de 10 mL. A fluorescência foi então medida com um scanner Typhoon FLA9500 (GE Healthcare; IL). Os valores de fluorescência foram normalizados para controles tratados com dimetilsulfóxido (DMSO) para cada linhagem celular de LMA. Os valores de concentração inibitória média (IC50) foram calculados usando uma curva de regressão não linear de três parâmetros com Graph Pad Prism v9 (GraphPad, La Jolla, CA, EUA). O mesmo método foi usado para células LMA primárias.
Análise estatística
Reagente ou recurso Fonte Identificador Anticorpo Ferritina Cadeia Pesada (FTH1), Monoclonal de Coelho Cell Signaling 4393 LAMP2, Monoclonal de Camundongo Cell Signaling 49067 NCOA4, Monoclonal de Coelho Bethyl A302-272A LC3B, Monoclonal de Coelho Cell Signaling 49067 CD71 Proteintech 10084-2-AP NRF2 Cell Signaling 12721 xCT Cell Signaling 12691 Compostos RSL3 SelleckChem S8155 FIN56 SelleckChem S8254 Erastina SelleckChem S7242 Ferrostatina-1 SelleckChem S7243 ZVAD-FMK Thermofisher Cat#S7023 Desferroxamina SelleckChem S5742 Deferasirox SelleckChem S1712 L -C-Propargilglicina (PPG) Sigma 81838 Brusatol Selleckchem S7956 Corantes de coloração C11-BODIPY Invitrogen D3861 GSSG/GSH Abcam ab156681
Todos os cálculos estatísticos foram realizados utilizando GraphPad Prism (versão 9.0). Os resultados são apresentados como média ± DP. As diferenças entre os dois grupos foram realizadas pelo teste t de Student. Comparações entre múltiplos grupos foram analisadas por ANOVA de uma via. A significância estatística foi definida como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 em comparação com o controle correspondente.
Informações suplementares
Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Informações suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41420-023-01371-8.
Contribuições dos autores
LCA, TC, ZT e NJ realizaram os experimentos. JD, NC, OK e MF forneceram amostras de LMA; JZ e RB revisaram o manuscrito; EG desenhou e realizou os experimentos, analisou os dados e escreveu o manuscrito. DB desenhou e supervisionou o programa de pesquisa, analisou os dados e revisou o manuscrito. Todos os autores aprovaram a versão final do manuscrito.
Disponibilidade de dados
Todos os dados estão disponíveis no texto principal ou nos materiais suplementares.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Referências
Diagnóstico e manejo da LMA em adultos: recomendações ELN 2017 de um painel internacional de especialistas
Da quelação de ferro à sobrecarga como estratégia terapêutica para induzir ferroptose em células leucêmicas
Roussel X, Daguindau E, Berceanu A, Desbrosses Y, Warda W, Neto da Rocha M, et al. Leucemia mieloide aguda: da biologia às práticas clínicas através do desenvolvimento e terapêutica pré-clínica. Front. Oncol. 2020 10.3389/fonc.2020.599933.
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A ferroptose induzida por Fin56 é suportada pela degradação de GPX4 mediada por autofagia e funciona sinergicamente com a inibição de mTOR para matar células de câncer de bexiga
Birsen R, Larrue C, Decroocq J, Johnson N, Guiraud N, Gotanegre M, et al. APR-246 induz morte celular precoce por ferroptose na leucemia mieloide aguda. Haematologica. 2021;107:403–416.
A diidroartemisinina (DHA) induz ferroptose e causa parada do ciclo celular em células de carcinoma de cabeça e pescoço
A DHA inibe a proliferação e induz ferroptose de células leucêmicas através da degradação da ferritina dependente de autofagia
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Estimativa moderada de mudança de dobra e dispersão para dados de RNA-seq com DESeq2
Análise de enriquecimento de conjuntos de genes: uma abordagem baseada em conhecimento para interpretar perfis de expressão genômica ampla
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Enrichr: ferramenta interativa e colaborativa de análise de enriquecimento de listas de genes em HTML5
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