pmid: "37859702"
title: "Artesunato induz ferroptose ao inibir a localização nuclear de SREBP2 em células de mieloma."
authors: "Liang L, Liu Y, Wu X, Chen Y"
journal: "International journal of medical sciences"
pubdate: "2023"
doi: "10.7150/ijms.86409"
source: "PMC Full Text"
Artesunato induz ferroptose ao inibir a localização nuclear de SREBP2 em células de mieloma.
Autores
Liang L, Liu Y, Wu X, Chen Y
Periodico
International journal of medical sciences (2023)
Conteudo
Artesunato induz ferroptose ao inibir a localização nuclear de SREBP2 em células de mieloma
Objetivo: O mieloma múltiplo (MM) é um câncer hematológico incurável caracterizado pela proliferação anormal de plasmócitos. O efeito terapêutico promissor dos inibidores seletivos de exportação nuclear no MM revela as amplas perspectivas terapêuticas da intervenção na localização nuclear. A proteína de ligação ao elemento regulador de esterol 2 (SREBP2) é uma molécula reguladora de lipídios que tem sido implicada no efeito da terapia medicamentosa para o MM. Foi relatado que a SREBP2 é regulada pelo medicamento antimalárico artesunato (ART) por meio da alteração de sua localização nuclear e demonstrou inibir a ferroptose em outros tumores. No entanto, o mecanismo pelo qual isso pode ocorrer não foi esclarecido no MM. Nosso estudo teve como objetivo explorar se o ART pode induzir ferroptose no MM por meio da localização nuclear de SREBP2.
Métodos: Para avaliar se a ferroptose é induzida pelo tratamento com ART no mieloma, utilizamos dois tipos de linhagens celulares de mieloma. Primeiramente, utilizamos uma série de abordagens moleculares e outras técnicas para investigar o impacto do ART no crescimento celular, produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), níveis de Fe2+, peroxidação lipídica e expressão de genes relacionados à ferroptose. Em seguida, exploramos ainda mais o mecanismo pelo qual a ferroptose pode ocorrer nessas células e a relação entre a ferroptose e a localização nuclear de SREBP2.
Resultados: O aumento de ERO, Fe2+ e peroxidação lipídica, bem como a inibição do crescimento celular, foram observados em células de mieloma após o tratamento com ART. A expressão do membro 4 da família de cadeia longa da acil-CoA sintetase (ACSL4) aumentou, enquanto a expressão da glutationa peroxidase 4 (GPX4) foi reduzida nas células tratadas com ART. A morte celular induzida por ART pôde ser revertida por ferrostatin-1 (Fer-1) e deferoxamina mesilato (DFO). A localização nuclear de SREBP2 em células de mieloma foi inibida, acompanhada pela regulação negativa do isopentenil pirofosfato (IPP) e GPX4, após o tratamento com ART.
Conclusão: Em conclusão, nosso estudo demonstrou que o medicamento antimalárico ART pode inibir a localização nuclear de SREBP2, regular negativamente o IPP e a GPX4 e, eventualmente, desencadear ferroptose em células de mieloma. Por meio deste estudo, esperamos estabelecer uma correlação entre as vias de localização nuclear e a mediação da ferroptose em células de mieloma e fornecer uma direção inovadora para a terapia relacionada à exploração.
Introdução
O mieloma múltiplo (MM), caracterizado pela proliferação anormal de plasmócitos na medula óssea, é a segunda neoplasia hematológica mais comum (15%). Atualmente, o MM é considerado incurável com um prognóstico insatisfatório. No entanto, o desenvolvimento e a aplicação bem-sucedidos do selinexor, um inibidor da proteína de exportação nuclear XPO1, mostraram algum potencial terapêutico em pacientes com MM. O selinexor é um novo tipo de medicamento que difere dos tratamentos anteriores usados para o MM e pode alcançar maior eficácia em pacientes com MM. O selinexor inibe o processo de exportação nuclear de uma série de proteínas supressoras de tumor (TSPs) e algumas proteínas reguladoras do crescimento, refletindo o potencial de regular a localização nuclear de proteínas para o tratamento do MM.
Recentemente, a modulação da localização nuclear de proteínas foi relatada como reguladora da ferroptose, uma forma de morte celular dependente de ferro caracterizada por peroxidação lipídica irrestrita e associada ao efeito terapêutico de tratamentos para múltiplos tumores malignos. Por exemplo, o processo de localização nuclear da proteína 1 associada ao BRCA1 (BAP1), supressora de tumor, é promovido pelo vetor de importação nuclear IPO2, o que resulta na inibição da expressão de SLC7A11 de maneira dependente de desubiquitinação e, finalmente, promove a ocorrência de ferroptose. A regulação da E-caderina da localização nuclear da proteína associada a Yes (YAP), por meio da via de sinalização Hippo, então regula a síntese da acil-CoA sintetase de cadeia longa membro 4 (ACSL4), um regulador chave da ferroptose. Portanto, a inibição da proliferação de células de mieloma pode ser induzida pela ferroptose que ocorre via regulação da localização nuclear de uma série de proteínas. No entanto, os efeitos relacionados dessa localização nuclear e da ferroptose no MM ainda não estão claros e precisam ser mais explorados.
Estudos recentes mostraram que altos níveis de expressão da proteína 2 de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBP2), um regulador chave no metabolismo lipídico, estão relacionados ao aumento da resistência a medicamentos no MM. Além disso, desencadear a ferroptose tem se mostrado capaz de aliviar a resistência a medicamentos em uma variedade de células tumorais malignas. Isso sugere que a SREBP2 pode regular a resistência a medicamentos do MM regulando a ferroptose. Curiosamente, embora a inibição da ferroptose tenha sido relatada como tendo uma relação estreita com a regulação positiva da SREBP2 no melanoma, poucos estudos se concentraram na interação entre SREBP2 e ferroptose no mieloma. O aumento dos níveis de expressão da SREBP2 promove um aumento em sua localização nuclear, o que é um pré-requisito para que ela desempenhe papéis reguladores. Essa descoberta indicou que pode haver uma relação estreita entre a localização nuclear da SREBP2 e a regulação da ferroptose em células de mieloma.
Alguns estudos mostraram que alguns medicamentos usados inicialmente como antiparasitários têm a capacidade de regular a localização nuclear de proteínas. Por exemplo, a ivermectina, que foi usada inicialmente para tratar estrongiloidíase e filariose linfática, descobriu-se que tem a capacidade de inibir o processo de importação nuclear mediado pela importina IPO1. O artesunato (ART), um medicamento de primeira linha contra a malária, foi relatado como regulador da localização nuclear de SREBP2 em glioma. Comparado à ivermectina, o ART está mais intimamente relacionado a neoplasias hematológicas e foi relatado como mediador da ocorrência de apoptose em células de mieloma. No entanto, se o ART pode mediar outras formas de morte celular regulada, como a ferroptose, ainda não foi explorado.
Portanto, no presente estudo, nosso objetivo foi explorar se o artesunato pode induzir ferroptose ao regular a localização nuclear de SREBP2, inibindo assim a proliferação de células de mieloma.
Métodos
Reagentes e anticorpos
As linhagens celulares humanas de mieloma múltiplo (MM) MM1S (Cat. No. iCell-h291), RPMI8226 (Cat. No. iCell-h183) e a linhagem celular humana de osteossarcoma U2OS (Cat. No. iCell-h218) foram obtidas da iCell Bioscience (China). A linhagem celular humana de epitélio brônquico BEAS-2B foi adquirida da BeNa Culture Collection (Cat. No. BNCC359274). O meio RPMI1640 foi adquirido da Gibco (Cat. No.8121369). O dimetilsulfóxido (DMSO) (Cat. No.196055) foi adquirido da MP Biomedicals (EUA). O soro fetal bovino (SFB) foi obtido da ExCell Bio (Cat. No. FSP500). A penicilina e estreptomicina (Pen Strep) (Cat. No. 1541-122) foi obtida da Gibco. O ART, com pureza de 98%, foi adquirido da Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd. (No. MB7317) e foi dissolvido em DMSO para este estudo. A ferrostatin-1 (Fer-1) (Cat. No. HY-100579), Z-VAD-FMK (Cat. No. HY-16658B), necrostatin-1 (Nec-1) (Cat. No. HY-15760), 3-metiladenina (3-MA) (Cat. No. HY-19312), deferoxamina mesilato (DFO) (Cat. HY-B0988) e GSK343 (Cat. No. HY-13500) foram obtidos da MedChemExpress (MCE). Anticorpos contra SREBP2 (ab30682, policlonal, 1:1000 e 1:200 para técnicas de Western blot e imunofluorescência, respectivamente), anticorpo IgG anti-coelho HRP (Cat. No. ab288151, 1:2000) e anticorpos secundários IgG H&L de cabra anti-coelho (Alexa Fluor® 488, Cat. No. ab150077, 1:200) foram adquiridos da Abcam. Anticorpos contra GPX4 (Cat. No. #52455, 1:1000) e GAPDH (Cat. No. #2118, 1:1000) foram obtidos da Cell Signaling Technology. Anticorpos contra ACSL4 (Cat. No. sc-365230, 1:1000) foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology.
Cultura celular, tratamento e transfecções
As células MM1S, RPMI8226, BEAS-2B e U2OS foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de SFB, 100 U/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina e foram incubadas a 37°C com 5% de CO2. Células em crescimento exponencial foram tratadas com DMSO (0.1%), ART, Fer-1, Z-VAD-FMK, Nec-1, 3-MA e DFO em várias concentrações e em diferentes combinações.
O RNA pequeno interferente (siRNA) contra SREBP2 foi projetado e sintetizado pela RiboBio (RiboBio, Guangzhou, China), e suas sequências foram as seguintes: Sequência 1, GATGCCTACTCTTCTCTTA; sequência 2, CAAGGAGAGTCTATACTGT; sequência 3, CGAGCACACTGGTTGAGAT. Para transfecção, siRNAs (concentração final de 50 nM) foram transfectados em células apropriadas usando Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, EUA),48 horas após a transfecção, os pellets celulares foram coletados e submetidos ao isolamento de RNA e análise por immunoblot.
Ensaios de viabilidade celular
Células MM1S e RPMI8226 foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de aproximadamente 6 × 104 células por poço. Células BEAS-2B e U2OS foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de aproximadamente 1 × 104 células por poço. Após tratamento por 48 horas, conforme indicado, 10 µl de Enhanced Cell Counting Kit-8 (Cat. No. C0043, Beyotime, Beijing, China) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas a 37°C por 2 horas. Após a incubação, o valor de absorbância (DO) de cada poço foi medido a 450 nm usando um leitor de microplacas (Thermo Fisher Scientific, EUA), e a razão de DO relativa foi calculada e usada para representar a viabilidade das células.
Medição de ferro
Células foram semeadas a uma densidade de 6× 104 células por poço em placas de cultura com fundo de vidro e incubadas com diferentes tratamentos por 48 horas. Após a incubação, o meio de cultura foi descartado e as células foram lavadas com RPMI 1640 3 vezes. Em seguida, RPMI 1640 contendo 1 µM de FerroOrange (Dojindo, Japão, Cat. F374) foi adicionado e as células foram incubadas por 30 minutos a 37°C no escuro. Finalmente, o conteúdo de Fe2+ nas células foi analisado usando um leitor de microplacas de fluorescência (ex 543 nm, em 580 nm) (Tecan Trading AG, Suíça). Além disso, imagens focais foram adquiridas com um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss invertido LSM 780 (Zeiss) usando uma objetiva de imersão em óleo Plan-Apochromat 100x/1.4 DIC. Três campos representativos foram capturados para cada condição usando tempos de exposição idênticos. As imagens foram obtidas com um filtro Cy3 (comprimentos de onda de excitação e emissão 514 e 525-596 nm, respectivamente). A resolução das imagens obtidas é de 1024×1024 pixels, com profundidade de pixel de 8 bits, tamanho do pinhole de 1 unidade Airy e média de linha de 2.
Estimativa da peroxidação lipídica
Para medir a peroxidação lipídica nas células, utilizamos um kit de ensaio de malondialdeído (MDA) de peroxidação (Cat. No. S0131M, Beyotime Biotech, China) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, após 48 horas de incubação com vários tratamentos, as células foram colhidas por centrifugação a 1.000 rpm a 4°C por 5 minutos. O sobrenadante foi coletado e o reagente ácido tiobarbitúrico (TBA) foi adicionado na proporção de 1:2, após o que a mistura foi aquecida a 100°C por 15 minutos. Após o aquecimento, a mistura foi resfriada à temperatura ambiente e centrifugada a 1000 g à temperatura ambiente por 10 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi removido e a absorbância foi medida a 532 nm usando um instrumento marcado com enzima. Ao mesmo tempo, os níveis intracelulares de hidroperóxidos lipídicos foram medidos usando uma sonda seletiva Liperfluo cuja concentração foi ajustada para 10 μM (Ex = 532 nm, Em = 535-650 nm) e um microscópio confocal de varredura a laser invertido Zeiss LSM 780 (Zeiss) usando uma objetiva de imersão em óleo 100x/1.4 DIC Plan-Apochromat. Três campos representativos foram capturados usando tempos de exposição idênticos para cada condição experimental. As imagens foram obtidas com o filtro FITC (ex 488 nm, em 525 nm). As imagens foram obtidas com resolução de 1024×1024 pixels, profundidade de pixel de 8 bits, tamanho do pinhole de 1 unidade Airy e média de linha de 2.
Medição de espécies reativas de oxigênio (ROS)
Após o tratamento por 48 h, as células foram colhidas e plaqueadas em placas de 6 poços a uma densidade de 6 × 10^4 células/poço. Em seguida, todas as células foram suspensas em DCFH-DA 1:1000 (Cat. No. S0033M, Beyotime Biotech, China) e incubadas a 37°C por 20 min. Após a incubação, as células foram lavadas com meio RPMI 1640 por 3 vezes. Finalmente, as ROS foram detectadas usando um leitor de microplacas multimodo Spark (Tecan Trading AG, Suíça). Além disso, as células foram analisadas por microscopia confocal usando um microscópio confocal de varredura a laser invertido Zeiss LSM 780 (Zeiss) e uma objetiva de imersão em óleo 40x/1.4 DIC Plan-Apochromat. Três campos representativos foram capturados usando tempos de exposição idênticos para cada condição experimental. As imagens foram obtidas com resolução de 1024×1024 pixels, profundidade de pixel de 8 bits, tamanho do pinhole de 1 unidade Airy e média de linha de 2 usando um filtro FITC (ex 488 nm, em 525).
O RNA total foi extraído utilizando o reagente TRIzol (Cat. No. T9424, Sigma, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA foi quantificado por espectrofotometria, e quantidades iguais (1 μg) foram transcritas reversamente para a síntese de cDNA usando o Kit Evo M-MLV RT com gDNA Eraser (Cat. No. AG11728, Accurate Biology, China). A análise de qPCR foi realizada em um termociclador de PCR quantitativo em tempo real Roche LightCycler® 480 com o Kit SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II (Rox plus) (Cat. No. AG11719, Accurate Biology, China) em um volume final de 10 μl. Cada amostra foi amplificada em triplicata. Os níveis de expressão gênica foram calculados usando o método 2-ΔΔCt e normalizados para a expressão de GAPDH. Os iniciadores usados para qRT-PCR foram os seguintes: GPX4 humano direto, 5'-ACAAGAACGGCTGCGTGGTGAA-3'; GPX4 humano reverso, 5'-GCCACACACTTGTGGAGCTAGA-3'; ACSL4 humano direto, 5'-CATCCCTGGAGCAGATACTCT-3'; ACSL4 humano reverso, 5'-TCACTTAGGATTTCCCTGGTCC-3'; SREBP2 humano direto, 5'-CTCCATTGACTCTGAGCCAGGA-3'; SREBP2 humano reverso, 5'-GAATCCGTGAGCGGTCTACCAT-3'; GAPDH humano direto, 5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'; GAPDH humano reverso, 5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'.
Western blotting
As proteínas citosólicas e nucleares foram extraídas usando kits de isolamento de proteínas citosólicas/nucleares (Cat. No. KGP1100, KeyGEN Biotech. Co., Ltd, Nanjing, China) de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas celulares foram extraídas usando tampão RIPA (Cat. No. P0013B, Beyotime Biotech, China) de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração da proteína extraída foi medida usando kits de proteína BCA (Cat. No. P0012, Beyotime Biotech, China). SDS-PAGE foi realizada para separar as proteínas, e as proteínas separadas foram transferidas para membranas de PVDF. Após o bloqueio com leite a 5%, as membranas foram fixadas durante a noite a 4°C em uma mistura contendo anticorpos primários: anti-SREBP2 (1:1000), anti-GAPDH (1:1000), anti-GPX4 (1:1000) ou anti-ACSL4 (1:1000). No dia seguinte, as membranas foram lavadas e, em seguida, incubadas com um anticorpo IgG anti-coelho HRP (1:2000) à temperatura ambiente por 1 h. As membranas foram visualizadas usando ECL hipersensível (Cat. No. P0018FS, Beyotime Biotech, China), e os dados foram coletados e analisados usando o software Image J.
Imunofluorescência
Após serem submetidas a diferentes tratamentos, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% (Cat. No. P0099, Beyotime Biotech, China) e lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Gibco) 2 vezes. Em seguida, as células foram coletadas e permeabilizadas com Triton X-100 a 0,3% (Cat. No. ST797, Beyotime Biotech, China) em lâminas de vidro (CITOGLAS, China) por 20 min. Após lavagem com PBS por 3 vezes, as células foram incubadas em BSA a 5% por 30 minutos. Em seguida, as células foram incubadas com um anticorpo contra SREBP2 durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as células foram incubadas com um anticorpo secundário Alexa Fluor® 488 IgG de cabra anti-coelho (H&L) por 1 hora a 37°C. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato suplementada com Tween 20 a 0,1% (Cat. No. ST825, Beyotime Biotech, China) (PBST), coradas com DAPI e examinadas em um microscópio confocal de varredura a laser invertido Zeiss LSM 780 (Zeiss).
Medição do pirofosfato de isopentenila (IPP)
A concentração de IPP foi medida de acordo com as instruções do Kit ELISA IPP Humano (Cat. No. KWN216841, KEVINO BIOLOGICAL TECHNOLOGY, China). Em resumo, os sobrenadantes das células de mieloma tratadas foram coletados usando tampão RIPA de acordo com o protocolo do fabricante. Os níveis de IPP nos sobrenadantes foram então avaliados usando ensaio imunoenzimático (ELISA). O reagente conjugado com HRP foi adicionado aos poços experimentais, e as placas foram incubadas por 60 minutos no escuro a 37°C. Após lavagem com solução de lavagem 1X, as soluções cromogênicas A e B foram adicionadas a cada poço, seguidas de outra incubação por 15 min no escuro a 37°C. Por fim, a solução de parada foi adicionada a cada poço, e a densidade óptica de cada poço a 450 nm foi lida dentro de 15 minutos usando um leitor de microplacas. A concentração de IPP em todas as amostras foi calculada com base na concentração e absorbância do padrão.
Análise estatística
Os dados foram analisados usando o software de estatística Graphpad. Os resultados foram apresentados como média ± EP. A comparação entre dois grupos foi realizada usando o teste t. As variações foram consideradas estatisticamente significativas quando P < 0,05.
Resultados
A morte celular induzida por ART em células de mieloma poderia ser resgatada pelo inibidor específico de ferroptose ferrostatin-1 (Fer-1).
Diferentes tipos de morte celular regulada podem ser distinguidos tratando as células com diferentes inibidores específicos de morte celular e medindo as variações subsequentes na viabilidade celular. Estudos anteriores relataram que a ART pode desencadear apoptose em células de mieloma, mas outros estudos também observaram que a ART pode desencadear morte celular regulada não apoptótica. Notavelmente, diferentes concentrações de ART foram utilizadas nesses estudos; especulamos que o tipo de morte celular induzido pelo tratamento com ART pode depender da concentração de ART utilizada. Portanto, queríamos explorar mais tipos de morte celular induzidos pelo tratamento com ART. Primeiro, avaliamos a viabilidade das células MM1S e RPMI8226 após tratamento com diferentes concentrações de ART por 48 horas e descobrimos que seus valores de IC50 eram 53,61 μM e 58,96 μM, respectivamente (Fig. 1). Em seguida, tratamos as células MM1S e RPMI8226 com 40 μM de ART, uma concentração inferior ao seu IC50 inicial, com ou sem o inibidor de pancaspase Z-VAD-FMK, que pode inibir a apoptose. Após 48 horas de incubação, descobrimos que a viabilidade das células nos dois grupos era aproximadamente igual (Fig. 2A, B-Esquerda), indicando que a ART pode induzir um tipo de morte celular não apoptótica em células de mieloma. Para confirmar ainda mais o tipo específico de morte celular induzido pela ART, tratamos sequencialmente duas linhagens de células de mieloma com ART e uma série de inibidores específicos de morte celular, incluindo ferrostatin-1 (Fer-1, inibidor específico de ferroptose), necrostatin-1 (Nec-1, inibidor específico de necrose celular) e 3-metiladenina (3-MA, inibidor específico de autofagia) (Fig. 2A, B-Direita). Os resultados mostraram que a viabilidade das duas linhagens de células de mieloma pôde ser resgatada pelo Fer-1, indicando que a ART pode induzir ferroptose em células de mieloma.
Para avaliar ainda mais o efeito da ART nas células, realizamos uma análise semelhante em duas linhagens celulares adicionais cujos IC50 eram maiores que os de MM1S e RPMI8226 e, portanto, consideradas resistentes à ART (Fig. Suplementar S1A, B). Após o tratamento com a mesma concentração de fármaco do presente estudo (ART=40 μM), tanto a linhagem celular epitelial brônquica humana BEAS-2B (IC50=63,47 μM) quanto a linhagem celular de osteossarcoma humano U2OS (IC50=70,74 μM) apresentaram redução na viabilidade celular (Fig. Suplementar S1A, B). Subsequentemente, tratamos as linhagens celulares BEAS-2B e U2OS com Z-VAD-FMK (inibidor específico de apoptose) e Fer-1 (inibidor específico de ferroptose), respectivamente, e descobrimos que o primeiro, e não o último, poderia resgatar a inibição da proliferação mediada pela ART (Fig. Suplementar S2A, B). Esses resultados sugerem que a ART induz apoptose, em vez de ferroptose, em linhagens celulares resistentes à ART.
Alteração dos níveis de Fe2+ relacionados à morte celular induzida por ART em células de mieloma
A ferroptose é um tipo de morte celular acompanhada por níveis elevados de Fe2+. Para determinar se a morte celular induzida por ART em células de mieloma foi causada por ferroptose, medimos os níveis de Fe2+ nos grupos ART0, ART40 e ART40+DFO. De acordo com a Figura 3, painéis A e B, um aumento cumulativo de Fe2+ foi observado em duas linhagens de células de mieloma após tratamento com ART, e o tratamento combinado com DFO reverteu esse aumento. Em seguida, medimos a viabilidade celular para explorar a relação entre o nível de Fe2+ e a morte celular induzida por ART. Descobrimos que o DFO, que teve um efeito negativo nos níveis de Fe2+, conseguiu resgatar a morte celular induzida por ART em células de mieloma (Figura 3C). Esses resultados indicaram que a ART induz ferroptose em células de mieloma. Para linhagens celulares resistentes à ART, a concentração de Fe2+ não apresentou alteração significativa após tratamento nas mesmas condições (Figura Suplementar S3A, B).
Alterações induzidas por ART nos níveis de ROS e peroxidação lipídica em células de mieloma
Níveis elevados de ROS e peroxidação lipídica representam a destruição da estrutura celular e da membrana e são características específicas da ferroptose. Após confirmar os efeitos da ART na viabilidade celular e nos níveis de Fe2+ em células de mieloma, exploramos os efeitos da ART na produção de ROS e na peroxidação lipídica. Os resultados na Figura 4 mostram que a ART pode induzir um aumento cumulativo de ROS. Aumentos semelhantes nos níveis de MDA (Figura 5A) e na fluorescência da sonda Liperfluo (Figura 5B), que representam a extensão da peroxidação lipídica, também foram observados. Para linhagens celulares resistentes à ART, os níveis de ROS ou peroxidação lipídica não apresentaram alteração significativa após tratamento nas mesmas condições (Figuras Suplementares S4,5 A,B).
O efeito da ART nos reguladores da ferroptose GPX4 e ACSL4
A glutationa peroxidase 4 (GPX4) e a ACSL4 são reguladores-chave da ferroptose. A GPX4 pode inibir diretamente a ferroptose, enquanto a ACSL4 pode regular positivamente a ferroptose promovendo a peroxidação lipídica da membrana. Para confirmar ainda mais que a ART tinha a capacidade de induzir uma série de alterações relacionadas à ferroptose, buscamos explorar se a expressão de GPX4 e ACSL4 era afetada em células MM1S e RPMI8226 após tratamento com ART. De acordo com os resultados mostrados na Figura 6, a expressão de GPX4 foi reduzida nas duas linhagens de células de mieloma, enquanto a expressão de ACSL4 aumentou. Para linhagens celulares resistentes à ART, a expressão de GPX4 ou ACSL4 não apresentou alteração significativa após tratamento nas mesmas condições (Figura Suplementar S6A-H).
Ferroptose induzida por ART em células MM via via SREBP2-IPP-GPX4
Nossos resultados mostraram que a ART pode induzir ferroptose em células MM1S e RPMI8226 em uma concentração específica, mas o mecanismo pelo qual isso ocorre não está claro. Estudos anteriores mostraram que a ART pode inibir a localização nuclear de SREBP2 em glioma e também pode inibir a expressão de metabólitos pertencentes à via do ácido metilvalproico (MVA), como HMGCR e isopentenil pirofosfato (IPP). O IPP é o precursor da CoQ10 e também é um substrato limitante para a isopentenilação enzimática do Sec-tRNA, afetando assim a expressão de GPX4. Portanto, especulamos que a ferroptose induzida por ART em células de mieloma pode ocorrer através da regulação da localização nuclear de SREBP2 e através da via SREBP2-IPP-GPX4.
Para explorar a via SREBP2-IPP-GPX4 na ferroptose induzida por ART, primeiro observamos as mudanças na localização nuclear de SREBP2 antes e após o tratamento com ART usando um microscópio confocal de varredura a laser. Em comparação com o grupo controle, a quantidade de SREBP2 localizada no núcleo foi significativamente reduzida nas células MM1S e RPMI8226 após o tratamento com ART (Fig. 7A, B). Para confirmar se a ART reduz apenas a localização nuclear de SREBP2 ou, de forma mais geral, os níveis totais da proteína SREBP2, posteriormente detectamos as mudanças no nível de expressão total de SREBP2 tratado com ART através de Western blot. Não houve alteração significativa na quantidade total de SREBP2 após o tratamento com ART das células de mieloma (Fig. 7C-F). Em seguida, avaliamos os efeitos da ART na expressão de SREBP2 no citoplasma e no núcleo separadamente. À medida que a concentração de ART aumentava, o conteúdo de SREBP2 no citoplasma aumentava, enquanto o conteúdo no núcleo diminuía (Fig. 7G, I). Essa observação também foi confirmada por uma razão núcleo:citoplasma diminuída após a administração de ART em comparação com células que não receberam ART (Fig. 7H,J), sugerindo que a ART afeta principalmente a localização nuclear de SREBP2, e não a quantidade total de SREBP2. Esses resultados indicaram que a localização nuclear de SREBP2 pode ser inibida pela ART.
Em seguida, exploramos se os níveis de IPP podem ser afetados pela ART. A concentração de IPP em ambas as linhagens de células de mieloma diminuiu após o tratamento com ART (Fig. 8). Para avaliar se a ART tem um efeito regulatório sobre a GPX4 através da via SREBP2-IPP-GPX4, primeiro avaliamos a expressão de GPX4 em células MM1S e RPMI8226 tratadas com ART em diferentes concentrações. A expressão de GPX4 diminuiu gradualmente com o aumento da concentração de ART (Fig. 9). Em seguida, usamos GSK343, um medicamento que foi relatado por promover a localização nuclear de SREBP2, para determinar se o tratamento com ART tem um impacto negativo na expressão de GPX4. A Fig. 10 mostra que o nível de expressão de GPX4 aumentou com o aumento das concentrações de GSK343, sugerindo que a interferência na localização nuclear de SREBP2 pode afetar a expressão de GPX4.
Para esclarecer melhor o mecanismo molecular da ferroptose celular mediada por ART, utilizamos siRNA para silenciar SREBP2 e detectamos as alterações em vários efeitos após o silenciamento. Selecionamos si-SREBP2-3, que apresenta o efeito de knockout mais aparente, como nosso principal meio de silenciar SREBP2 nos experimentos seguintes (Fig. 11A-D). Descobrimos que, em comparação com células transfectadas com siRNA controle, o silenciamento de SREBP2 em células de mieloma resultou em uma diminuição na viabilidade celular (Fig. 11E,F), que foi, até certo ponto, resgatada por Fer-1 (Fig. 11E,F). Ao mesmo tempo, os níveis de ROS (Fig. 11G-I), Fe2+ (Fig. 11M-O) e o grau de peroxidação lipídica (Fig. 11J-L) aumentaram em células de mieloma após serem transfectadas com si-SREBP2. Além disso, o silenciamento de SREBP2 pode levar à regulação negativa de GPX4 (Fig. 11P-S), sugerindo que, sob o tratamento com si-SREBP2, a quantidade total de SREBP2 diminui, levando a uma redução adicional em sua parte localizada no núcleo, desencadeando assim uma série de efeitos a jusante. Esses resultados indicam que a ART pode induzir ferroptose em células de mieloma através da via SREBP2-IPP-GPX4 (Fig. 12).
Discussão
O MM é a segunda neoplasia hematológica mais comum depois do linfoma. O MM é incurável e caracteristicamente tem prognóstico ruim, tornando necessário explorar novas abordagens de tratamento. Neste estudo, demonstramos que, em células de mieloma, o tratamento com ART inibiu a localização nuclear de SREBP2 e induziu ferroptose através do eixo SREBP2-IPP-GPX4, inibindo assim a proliferação.
ART, um medicamento de primeira linha contra o Plasmodium (o parasita causador da malária), mostrou-se promissor no tratamento de neoplasias hematológicas na última década, especialmente para lidar com resistência a medicamentos e tratamento em leucemia e linfoma. No entanto, o progresso tem sido lento no MM. A maioria dos estudos anteriores sobre ART em células de mieloma focou no papel na promoção da apoptose, e poucos outros tipos de morte celular foram explorados. Em 2014, um estudo focado em ART e células de mieloma mostrou que algumas das células de mieloma tratadas com ART não conseguiram reverter a inibição da proliferação mediada por inibidores de apoptose, como Z-VAD-mfk, sugerindo que a ART tinha uma potente capacidade de induzir morte celular não apoptótica em células de mieloma. No entanto, se esse tipo de morte celular não apoptótica era ferroptose não foi determinado. Estudos adicionais também observaram que a ART pode induzir um aumento nos níveis intracelulares de Fe2+ em células de mieloma, mas há uma falta de avaliação da inibição da proliferação em células de mieloma após a aplicação de quelantes de ferro ou a aplicação do inibidor específico de ferroptose Fer-1. Esses resultados nos levaram a considerar se havia outros tipos de morte celular regulada (RCD) associados ao uso de ART em células de mieloma, especialmente a ferroptose, que é dependente de Fe2+ e está associada a alterações nos níveis de Fe2+. Para avaliar isso, primeiro tratamos células de mieloma com ART e depois avaliamos uma série de características relacionadas à ferroptose, incluindo o efeito de resgate de vários inibidores de morte celular, alterações nos níveis de ROS e peroxidação lipídica, mudanças nos níveis de Fe2+ e seus efeitos na morte celular induzida por ART, e alterações em marcadores de ferroptose, como GPX4 e ACSL4. Descobrimos que, em uma concentração específica de ART, a inibição da proliferação de células de mieloma pode ser resgatada pelo inibidor específico de ferroptose Fer-1, mas não por outros tipos de inibidores de morte celular. Além disso, os níveis de ROS, peroxidação lipídica e Fe2+ aumentaram claramente após o tratamento com ART. Adicionalmente, a inibição da proliferação de células de mieloma induzida por ART pode ser resgatada por DFO, que diminui o nível de ferro nas células. Além disso, tanto GPX4 quanto ACSL4 exibiram expressão alterada relacionada à ferroptose. Todos esses resultados indicam que a ART tem potencial para induzir ferroptose em células de mieloma.
Notavelmente, quando expostas à mesma concentração de tratamento com ART, ocorreu apoptose em vez de ferroptose nas linhagens BEAS-2B e U2OS, que eram resistentes à ART. Isso sugere que a ART pode induzir ferroptose em células específicas. Holien et al. relataram que a ART também pode induzir apoptose em mieloma. No entanto, as linhagens celulares de mieloma utilizadas naquele estudo foram OH-2, IH-1 e INA-6, que diferiam das nossas. Embora pertençam à mesma linhagem de mieloma, seus contextos genéticos celulares podem ser diferentes. Enquanto isso, a concentração de ART capaz de produzir efeitos apoptóticos naquele estudo estava entre 5-10 μM, inferior à concentração do nosso estudo (40 μM). No entanto, foi relatado que as linhagens celulares de linfoma humano DAUDI e CA-46 desencadeavam ferroptose quando tratadas com ART na faixa de 5 a 10 μM em outro estudo. Esses achados indicam que a ART induz ferroptose dependendo de linhagens celulares e concentrações específicas.
A SREBP2 pertence ao mesmo subtipo da família SREBP que a SREBP1a e a SREBP-1c. A SREBP2 é composta por um domínio de atividade transcricional amino-terminal, rico em serina e prolina, uma estrutura de cadeia bHLH-LZ, dois segmentos transmembrana hidrofóbicos e um carboxi-terminal. Como um dos principais reguladores do metabolismo lipídico, a SREBP2 só pode desempenhar sua função reguladora quando localizada no núcleo. Em outras palavras, a alteração de sua localização nuclear pode afetar sua regulação a jusante. Com a relação conhecida entre a ART e a localização nuclear da SREBP2 no glioma, especulamos que a localização nuclear da SREBP2 regulada pela ART em células de mieloma pode impactar a ferroptose. Através de uma série de experimentos, descobrimos que a localização nuclear da SREBP2 foi inibida e os níveis de expressão de GPX4 e IPP diminuíram quando as células foram tratadas com ART em comparação ao grupo controle. A alteração oposta na expressão de GPX4 foi observada quando as células foram tratadas com GSK343, para promover a localização nuclear da SREBP2. Em conjunto, esses resultados indicam que a ART pode induzir ferroptose através da via SREBP2-IPP-GPX4 em células de mieloma.
No entanto, este estudo ainda apresenta algumas limitações. Primeiro, embora a distinção entre ferroptose e apoptose induzidas por ART tenha sido observada em uma concentração específica de ART, outros tipos raros não apoptóticos de MCR, como a morte induzida por cobre, não foram examinados. Estudos anteriores observaram que alterações nos níveis de GPX4 podem estar intimamente relacionadas à morte por cobre. Segundo, ao considerar as alterações no nível de genes relacionados à ferroptose, investigamos apenas a expressão de GPX4 e ACSL4 e não examinamos outros genes relacionados, como FTH1 e PTGS2. Exploraremos esses aspectos em pesquisas futuras.
Conclusão
Coletivamente, nosso estudo demonstra que a ART pode induzir ferroptose em células de mieloma ao inibir a localização nuclear de SREBP2. Por meio deste estudo, esperamos estabelecer uma correlação entre as vias de localização nuclear e a mediação da ferroptose em células de mieloma e fornecer uma direção inovadora para a exploração de terapias relacionadas.
Material Suplementar
A segmentação da separação de fases líquido-líquido de SRC-3 mediada por NSD2 sensibiliza o tratamento com bortezomibe no mieloma múltiplo
Inibidores não seletivos do proteassoma no mieloma múltiplo e perspectivas futuras
O circRNA circ_0001821 prediz um prognóstico desfavorável e promove a proliferação do mieloma múltiplo
Desenvolvimentos de biomarcadores prognósticos e preditivos no mieloma múltiplo
Segmentação do BCMA no Mieloma Múltiplo
Novo mecanismo de resistência a medicamentos aos inibidores do proteassoma no mieloma múltiplo
Segmentação de Proteínas de Exportação Nuclear na Terapia do Mieloma Múltiplo
A proteína de exportação nuclear XPO1 - da biologia à terapia alvo
Papel fisiopatológico dos canais e transportadores de cálcio no mieloma múltiplo
BAP1 liga a regulação metabólica da ferroptose à supressão tumoral
A importação nuclear do supressor tumoral BAP1 é governada pela transportina-1
Ferroptose: mecanismos, biologia e papel na doença. Nature reviews
Segmentação do metabolismo lipídico em células de mieloma múltiplo: Desenvolvimento racional de uma estratégia sinérgica com inibidores do proteassoma
O indutor de ferroptose erastina aumenta a sensibilidade das células de leucemia mieloide aguda a agentes quimioterápicos
Dissociação do Complexo HIF-2, Inibição Alvo e Resistência Adquirida com PT2385, um Inibidor de HIF-2 de Primeira Classe, em Pacientes com Carcinoma Renal de Células Claras
O Regulador Lipogênico SREBP2 Induz Transferrina em Células de Melanoma Circulantes e Suprime a Ferroptose
A ativação de p38α/S1P/SREBP2 pelo inibidor competitivo de SAM EZH2 GSK343 limita sua atividade anticancerígena, mas cria uma vulnerabilidade alvo em carcinoma hepatocelular
A inibição de SREBP por uma pequena molécula, betulina, melhora a hiperlipidemia e a resistência à insulina e reduz as placas ateroscleróticas
Uma pequena molécula que bloqueia a síntese de gordura ao inibir a ativação de SREBP
A via SREBP: regulação do metabolismo do colesterol por proteólise de um fator de transcrição ligado à membrana
Coadministração de ivermectina e albendazol: oportunidades para o controle da estrongiloidíase. The Lancet
Administração em massa de ivermectina, dietilcarbamazina, mais albendazol em comparação com dietilcarbamazina mais albendazol para redução da endemicidade da filariose linfática em Papua-Nova Guiné: um ensaio randomizado por clusters. The Lancet
O antiviral de amplo espectro ivermectina tem como alvo o heterodímero importina α/β1 do transporte nuclear do hospedeiro
O artesunato inibe a via do mevalonato e promove a senescência de células de glioma
Progresso da Pesquisa sobre Artemisina e Seus Derivados contra Neoplasias Hematológicas
Células de linfoma e mieloma são altamente sensíveis à parada do crescimento e apoptose induzidas pelo artesunato
Aumentando a Eficácia Antitumoral Ferroptótica via Amplificação Sítio-Específica da Peroxidação Lipídica Personalizada
Efeito do artesunato na inibição da proliferação e indução da apoptose de células de mieloma SP2/0 através da modulação de NFkappaB p65
Artesunato supera a resistência a medicamentos no mieloma múltiplo ao induzir estresse mitocondrial e apoptose não dependente de caspase
Ampliando horizontes: o papel da ferroptose no câncer
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Ferroptose: uma forma de morte celular não apoptótica dependente de ferro
Os Fundamentos Metabólicos da Ferroptose
A via do mevalonato é uma vulnerabilidade acionável do mieloma múltiplo positivo para t(4;14)
Mieloma múltiplo
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Artesunato ativa a via ATF4-CHOP-CHAC1 e afeta a ferroptose no Linfoma de Burkitt
Insights Recentes sobre SREBP como Mediador Direto da Fibrose Renal por Vias Independentes de Lipídios
Cobre induz morte celular ao direcionar proteínas lipoiladas do ciclo TCA
Acúmulo de esqualeno em linfomas auxotróficos para colesterol previne a morte celular oxidativa
Morte celular induzida por ART em células de mieloma. Células MM1S (esquerda) e RPMI8226 (direita) foram tratadas com ART por 48 h, e a viabilidade celular foi avaliada usando o ensaio CCK-8.
Avaliação do impacto do tratamento com diferentes inibidores específicos de morte celular na morte celular induzida por ART em células de mieloma. Células MM1S (A) e RPMI8226 (B) foram tratadas com ART (40 µM) em combinação com Z-VAD-FMK (10 µM), Fer-1 (2,5 µM), Nec-1 (30 µM) ou 3-MA (10 µM) por 48 h, e então a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio CCK-8. * P < 0,05, ** P < 0,01, em comparação com o grupo ART (40 μM), n=3. Os dados são apresentados como média ± EP.
Níveis de Fe2+ em células de mieloma MM1S e RPMI8226 após diferentes tratamentos. Células MM1S e RPMI8226 foram tratadas com 40 µM de ART na presença ou ausência de DFO (5 µM) por 48 h, e então os níveis de ferro foram medidos usando um leitor de microplacas fluorescente (A) e um microscópio confocal (B). A viabilidade celular foi determinada usando o ensaio CCK-8 (C). * P < 0,05, ** P < 0,01, em comparação com o grupo ART (40 μM), n=3. Os dados são apresentados como média ± EP.
Nível de ROS em células de mieloma após tratamento com ART. Células MM1S e RPMI8226 foram tratadas com diferentes concentrações de ART por 48 h, e então o nível de ROS foi medido usando um leitor de microplacas de fluorescência (A) e um microscópio confocal (B). Os níveis relativos de ROS medidos por um leitor de microplacas de fluorescência foram normalizados em relação aos medidos no grupo ART0. * P < 0,05, ** P < 0,01, em comparação com o grupo ART0, n=3. Os dados são apresentados como média ± EP.
Nível de peroxidação lipídica em células de mieloma após tratamento com ART. Células MM1S e RPMI8226 foram tratadas com diferentes concentrações de ART por 48 h, e então os níveis de MDA foram medidos como uma indicação de peroxidação lipídica, medidos de acordo com o MDA através de um leitor de microplacas de fluorescência (A) e quantificados por Liperfluo através de microscopia confocal (B). O nível relativo de MDA medido por um leitor de microplacas de fluorescência foi comparado ao do grupo ART0. * P < 0,05, ** P < 0,01, comparado com o grupo ART0, n=3.
O efeito do tratamento com ART nos reguladores de ferroptose GPX4 e ACSL4. Células MM1S e RPMI8226 foram tratadas com ART (40 μM) por 48 horas (A-H). Os níveis de mRNA de GPX4 (A, C) e ACSL4 (E, G) foram avaliados por qRT‒PCR (n = 3). Os níveis de proteína de GPX4 (B, D) e ACSL4 (F, H) foram avaliados por Western blotting (n = 3) * P < 0,05, ** P < 0,01. Os dados são apresentados como média ± EP.
O efeito do tratamento com ART na localização nuclear de SREBP2 em células de mieloma. Células MM1S e RPMI8226 foram tratadas com diferentes concentrações de ART por 24 h, e as alterações na localização de SREBP2 foram observadas por imunofluorescência (A,B) e por Western Blot (G,I). A alteração nos níveis totais da proteína SREBP2 foi observada por Western Blot (C-F). A localização nuclear de SREBP2 em células MM1S (H) e RPMI8226 (J) foi calculada como uma razão da fluorescência nuclear para citoplasmática usando o Image J. * P < 0,05, ** P < 0,01, comparado com o grupo ART0, n=3.
O efeito do tratamento com ART na concentração de IPP em células de mieloma. Células MM1S (A) e RPMI8226 (B) foram tratadas com diferentes concentrações de ART por 24 h, e então o nível de IPP foi medido usando um kit ELISA e um leitor de microplacas. * P < 0,05, ** P < 0,01, comparado com o grupo ART0, n=3.
O efeito do tratamento com ART na expressão de GPX4 em células de mieloma. Células MM1S (A e C) e RPMI8226 (B e D) foram tratadas com diferentes concentrações de ART (0, 10, 40 e 160 µM) por 24 h, então a expressão de GPX4 foi avaliada por Western blotting (n = 3) * P < 0,05, ** P < 0,01.
O efeito do tratamento com GSK343 na expressão de GPX4 em células de mieloma. Células MM1S (A e C) e RPMI8226 (B e D) foram tratadas com diferentes concentrações de GSK343 (0, 5, 10 e 20 μM) por 6 h, após o que a expressão de GPX4 foi avaliada por Western blotting (n = 3) * P < 0,05, ** P < 0,01.
Avaliação do impacto da transfecção com si-SREBP2 em células de mieloma. (A-D) qPCR (A,C) e Western blotting (B,D) da expressão de SREBP2 em células de mieloma transf ectadas com SREBP2-siRNAs ou siRNA controle negativo. (E,F) Viabilidade celular de células de mieloma transfectadas com siRNA controle negativo, SREBP2-siRNA ou SREBP2-siRNA +Fer-1, avaliada pelo ensaio CCK-8. (G-I) ROS de células de mieloma transfectadas com SREBP2-siRNA ou siRNA controle negativo, medidas usando um leitor de microplacas de fluorescência (G,H) e um microscópio confocal (I). (J-L) Nível de peroxidação lipídica em células de mieloma transfectadas com SREBP2-siRNA ou siRNA controle negativo, de acordo com o MDA através de um leitor de microplacas de fluorescência (J,K) e quantificado por Liperfluo através de microscopia confocal (L). (M-O) Níveis de Fe2+ em células de mieloma transfectadas com SREBP2-siRNAs ou siRNA controle negativo, medidos usando um leitor de microplacas fluorescente (M,N) e um microscópio confocal (O). (P-S) qPCR (P,R) e Western blotting (Q,S) da expressão de GPX4 em células de mieloma transfectadas com SREBP2-siRNAs ou siRNA controle negativo.* P < 0,05, ** P < 0,01, em comparação com o grupo si-NC, n=3. Os dados são apresentados como média ± DP.
Mecanismo pelo qual o ART induz ferroptose em células de mieloma. O artesunato (ART) pode induzir a inibição da localização nuclear de SREBP2, seguida pela regulação negativa de IPP e GPX4, para eventualmente desencadear ferroptose em células de mieloma.