pmid: "39256387"
title: "Vetores sintéticos para ativar o eixo motriz da ferroptose."
authors: "Jiang J, Yang L, Xie Q, Liu X, Jiang J, Zhang J, Zhang S, Zheng H, Li W, Cai X, Liu S, Li R"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2024 Sep 10"
doi: "10.1038/s41467-024-52312-7"
source: "PMC Full Text"

Vetores sintéticos para ativar o eixo motriz da ferroptose.

Autores

Jiang J, Yang L, Xie Q, Liu X, Jiang J, Zhang J, Zhang S, Zheng H, Li W, Cai X, Liu S, Li R

Periodico

Nature communications (2024 Sep 10)

Conteudo

Vetores sintéticos para ativar o eixo condutor da ferroptose
A ferroptose é uma estratégia promissora para a terapia do câncer, com numerosos inibidores de seus eixos de frenagem sendo investigados como potenciais fármacos. No entanto, poucos estudos exploraram o potencial de ativar os eixos condutores para induzir a ferroptose. Neste estudo, lipossomas decorados com peróxido de fosfatidilcolina (LIPPCPO) são sintetizados para induzir a ferroptose ao direcionar o transportador de metal divalente 1 (DMT1). Descobre-se que LIPPCPO aumenta o efluxo lisossômico de Fe2+ ao induzir cisteinilação do DMT1 lisossômico, resultando na supressão da glutationa peroxidase 4 (GPX4), depleção de glutationa e ferroptose em células de câncer de mama e xenoenxertos. Importante, a morte celular ferroptótica induzida por LIPPCPO é independente da resistência adquirida à radiação, quimioterapia ou agentes direcionados em 11 linhagens de células cancerígenas. Além disso, um forte efeito sinérgico de ferroptose é observado entre LIPPCPO e um fármaco aprovado pela FDA, artesunato, bem como raios X. A fórmula de LIPPCPO encapsulando artesunato inibe significativamente o crescimento tumoral e a metástase e melhora a taxa de sobrevida de camundongos fêmeas portadores de câncer de mama. Essas descobertas fornecem uma estratégia distinta para induzir a ferroptose e destacam o potencial do LIPPCPO como um vetor para potencializar os efeitos terapêuticos dos indutores convencionais de ferroptose.
Indutores de ferroptose têm potencial para a terapia do câncer. Aqui, os autores identificam um lipossoma decorado com peróxido capaz de induzir ferroptose e aumentar a eficácia de agentes quimioterápicos e radioterapia.
Introdução
A ferroptose é um tipo de morte celular recentemente descoberto, intimamente associado ao metabolismo de ferro, lipídios e aminoácidos. É caracterizada por alterações morfológicas, bioquímicas e genéticas únicas que a distinguem de outras formas de morte celular. A ferroptose atraiu considerável interesse de pesquisa devido ao seu papel potencial na biologia tumoral, particularmente em cânceres refratários. Os microambientes tumorais adversos frequentemente representam um dilema nas terapias convencionais contra o câncer, pois os tratamentos (por exemplo, quimio-agentes, radiações ionizantes) podem ajudar a estabelecer controle local e paliação, mas também podem levar as células cancerígenas a se tornarem mais refratárias. A ferroptose oferece novas oportunidades terapêuticas para potencializar os tratamentos oncológicos na conquista de cânceres refratários. Por exemplo, o IFNγ liberado por células T CD8+ ativadas na imunoterapia reduz a captação de cistina, aumenta a peroxidação lipídica e intensifica a ferroptose, contribuindo assim para a eficácia antitumoral da imunoterapia. Células cancerígenas persistentes tolerantes a fármacos são altamente sensíveis à ferroptose.
Desde a definição de ferroptose pelo grupo de Stockwell em 2012, várias moléculas reguladoras foram identificadas. Estas incluem o sistema xc−, glutationa peroxidase 4 (GPX4), 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA), coenzima Q10 (CoQ10), proteína 1 supressora de ferroptose (FSP1), lipoxigenases (LOXs), antígeno epitelial de próstata de seis transmembrana 3 (STEAP3), transportador de metal divalente 1 (DMT1), pool de ferro lábil e peróxidos lipídicos (LOOH). Esses índices de ferroptose podem ser integrados em uma rede de sinalização abrangente, que consiste em dois eixos de freio, incluindo sistema xc−/GSH/GPX4 e vitamina B5/acetyl-CoA/HMG-CoA/CoQ10/FSP1 para degradação de peróxidos lipídicos, e dois eixos motores envolvendo produção de peróxidos lipídicos (PUFA/LOXs/LOOH) e metabolismo do ferro (STEAP3/DMT1/Fe2+/LOOH). Entre eles, GPX4, FSP1 e sistema xc− nos eixos de freio são considerados desempenhar papéis críticos no controle da ferroptose. Inibidores químicos direcionados a essas proteínas foram extensivamente estudados como indutores candidatos de ferroptose. Por exemplo, erastina e sulfassalazina foram identificados como inibidores do sistema xc−; RSL3, FINO2, FIN56 e altretamina poderiam inibir diretamente a atividade da GPX4; Estatinas (por exemplo, atorvastatina) poderiam reduzir indiretamente a atividade da GPX4 ao suprimir a HMG-CoA redutase. No entanto, poucos deles tiveram sucesso na translação clínica, o que exige uma reconsideração das formas de indução da ferroptose. A ativação dos eixos motores representa uma estratégia promissora, mas faltam ativadores sintéticos. Entre as proteínas reguladoras nos eixos motores da ferroptose, o DMT1 é a proteína transmembrana crítica como um interruptor para controlar o efluxo de ferro ferroso através dos compartimentos lisossomais. Dado que o lisossomo é o destino da maioria dos objetos em nanoescala, especulamos que o ativador do DMT1 poderia ser identificado a partir de objetos nanométricos.
Neste estudo, nosso objetivo foi identificar os candidatos mais promissores de um grupo de 70 materiais sintéticos, incluindo lipossomos funcionalizados e nanomateriais metálicos e carbonáceos, por meio da triagem fluorescente do acúmulo de peróxidos lipídicos em células. Como resultado, lipossomos decorados com peróxido (LIPPO) foram descobertos como um potencial ativador. Uma reação de peroxidação catalisada por lipoxigenase V foi desenvolvida para construir formulações de LIPPO com diferentes caudas hidrofóbicas ou cabeças hidrofílicas. Avaliamos a estabilidade e a capacidade de direcionamento do LIPPO em diferentes fluidos biológicos e esferoides de células cancerígenas, respectivamente. Nossos resultados indicaram que o LIPPCPO, composto por 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PC, 18:2), apresentou o melhor desempenho. Simulações dinâmicas (DMs) revelaram uma forte interação entre o LIPPCPO e o DMT1 lisossomal, o que foi posteriormente validado em células com knockdown de DMT1 (KD). Examinamos os eventos em cascata na ferroptose induzida por LIPPCPO por meio de imageamento de Fe2+ subcelular, peroxidação lipídica, ensaio de depleção de GSH e imunoblots de GPX4. O potencial da ferroptose induzida por LIPPCPO foi testado em 11 linhagens celulares resistentes, incluindo câncer de mama, carcinoma hepático, câncer de pulmão e melanoma. Além disso, carregamos um fármaco aprovado pela FDA, artesunato (AS), no LIPPCPO para sinergizar a ferroptose em células de câncer de mama. Para avaliar o efeito antitumoral do AS@LIPPCPO, utilizamos imageamento por bioluminescência, avaliação da taxa de sobrevivência animal e avaliação de metástase em um modelo ortotópico de tumor mamário. Nossos achados indicam que a ferroptose induzida por LIPPCPO tem potencial como estratégia para terapia do câncer, e a combinação com artesunato aumenta ainda mais sua eficácia.
Resultados
Descoberta de indutores de ferroptose a partir de nanomateriais sintéticos
Engenharia e caracterização do LIPPO.
A Imagem esquemática mostrando a síntese do LIPPO. O LIPPO foi preparado por oxidação mediada por LOX de fosfolipídios (DG, PC, PS), evaporação, sonicação e extrusão. B Imagens representativas do lipossomo e do LIPPCPO foram adquiridas por criomicroscopia eletrônica (n = 3). C Mapa de calor exibindo o acúmulo de peróxidos lipídicos em células induzido por 15 nanomateriais representativos. D Imagens de confocal de lipossomos-FITC retidos em organoides de células 4T1 (n = 3). Organoides de células 4T1 foram cultivados em meio de cultura normal ou em condições simuladoras do microambiente tumoral (ácido e hipóxia). Após incubação com FITC-LIPPO por 72 h, os organoides foram corados com Hoechst 33342 para imageamento confocal. Os círculos tracejados indicam os organoides celulares. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Caracterização de fosfolipídios puros e peróxidos de fosfolipídios por LC-MS
Lipossomos Tempo de retenção (min) m/z DG 15,4 634 DGOOH 13,3 666 PC 13,5 782,5 PCOOH 10,1 814,5 PS 9,5 784,7 PSOOH 4,8 816,7
Tempo de retenção (Rt), DG 1,3-dilinoleoil glicerol, DGOOH peróxidos de DG, PC 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, PCOOH peróxidos de PC, PS 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (sal sódico), PSOOH peróxidos de PS, m/z razão massa-carga.

Considerando que lipossomas têm sido utilizados com sucesso como vetores nanométricos em aplicações clínicas, preparamos vários lipossomas utilizando fosfolipídios puros (PL) ou PL funcionalizados com grupos hidroxila (PL-OH), carboxila (PL-COOH) e peróxido (PL-OOH) nas caudas hidrofóbicas. Como PL-OOH não está disponível comercialmente, desenvolvemos uma reação catalisada por lipoxigenase para prepará-lo. Especificamente, evaporamos uma solução de 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PC, 18:2) para formar uma camada de PL que permitiu que reações de peroxidação ocorressem na presença de lipoxigenase V (5-LOX). Conforme mostrado na Fig. 1A, a 5-LOX catalisou a oxidação na posição bis-alílica de fosfolipídios poli-insaturados para formar grupos peróxido de maneira estereoespecífica. As camadas lipídicas funcionalizadas foram submetidas a sonicação e extrusão para preparar lipossomas decorados com peróxido de fosfolipídio (LIPPO). O LIPPO resultante foi analisado por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). PL e PL-OOH puderam ser diferenciados por seus tempos de retenção em LC, bem como pelos picos de íons moleculares em MS. PC e PCOOH foram detectados em 13,5 min e 10,1 min com picos de íons moleculares em m/z 782,5 e m/z 814,5, respectivamente (Tabela 1). A morfologia e o tamanho do LIPPCPO foram visualizados adicionalmente por microscopia crioeletrônica (crio-ME). Conforme mostrado na Fig. 1B e na Fig. Suplementar S1, uma estrutura vesicular unilamelar esférica com diâmetro de aproximadamente 87 nm foi detectada. Além disso, coletamos outros materiais sintéticos, incluindo nanomateriais metálicos e carbonáceos, e os submetemos a uma caracterização abrangente do tamanho primário, tamanho hidrodinâmico, carga superficial e peroxidação lipídica (Tabela Suplementar S1). Embora a maioria dos nanomateriais inorgânicos tenha formado aglomerados em água, todas as amostras de lipossomas apresentaram tamanhos hidrodinâmicos de 90–150 nm em solução.
Como a peroxidação lipídica desempenha um papel crucial na ferroptose, utilizamos um substrato fluorescente (C11-BODIPY) para peróxidos lipídicos a fim de investigar o impacto de 70 nanomateriais. Após incubação com os nanomateriais, as células MCF-7 resistentes à doxorrubicina (MCF-7R) tratadas foram coradas com C11-BODIPY, que emite fluorescência verde ao reagir com peróxidos lipídicos celulares. Um sistema de imageamento de alto conteúdo foi utilizado para analisar a razão de intensidade de fluorescência verde vs. vermelha. Embora a maioria dos nanomateriais não tenha apresentado efeito significativo (Tabela Suplementar S1), o LIPPCPO induziu acúmulo dose-dependente de peróxidos lipídicos nas células, conforme mostrado por um mapa de calor exibindo a intensidade de fluorescência dos peróxidos lipídicos induzidos por nanomateriais representativos (Fig. 1C). Lipossomas (LIP) preparados na ausência de LOX foram utilizados como controle. Adicionalmente, preparamos três lipossomas decorados com peróxido de fosfolipídeo (LIPPO) com diferentes cabeças hidrofílicas utilizando PC, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (PS, 18:2) e 1,3-dilinoelaidoil glicerol (DG, 18:2). Como a injeção intravenosa é a via de administração mais comum para formulações lipossomais na clínica, os LIPPO devem atravessar diferentes meios biológicos para atingir seu destino, ou seja, os lisossomos das células tumorais. Portanto, avaliamos a estabilidade das amostras de LIPPO em três contextos biológicos representativos, incluindo soro, fluido simulado de microambiente tumoral (TMSF) e fluido simulado fagolisossomal (PSF). Após 24 h de incubação, a atividade das três amostras de LIPPO permaneceu relativamente estável no soro, sugerindo que esses lipossomas funcionalizados poderiam manter sua atividade durante a circulação sanguínea (Fig. Suplementar S2). Interessantemente, esses lipossomas funcionalizados exibiram alta atividade em TMSF e PSF, com declínio de 8,67–41,52% na intensidade de fluorescência relativa (RFI). Além disso, comparamos a retenção dos três lipossomas em organoides de células 4T1 cultivados sob condições hipóxicas e normais. Os lipossomas foram marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC), e sua retenção nos organoides foi visualizada por microscopia confocal após 72 h de incubação. Conforme representado na Fig. 1D, a retenção de todos os três lipossomas funcionalizados em organoides sob condições hipóxicas e ácidas foi maior do que sob condições normais de cultivo. As razões de lipossomas retidos foram calculadas com base nas intensidades de fluorescência nos organoides (Fig. Suplementar S3). Notavelmente, entre os três lipossomas testados, o LIPPCPO apresentou a maior retenção em organoides de células 4T1, indicando que pode permitir uma interação prolongada com as células cancerígenas.
Impactos dos LIPPO em células resistentes a medicamentos
Efeitos letais dos LIPPO em células resistentes a medicamentos.
A Teste de viabilidade celular em células MCF-7R. Células MCF-7R foram tratadas com lipossomas ou LIPPO contendo 100 μM de peróxidos lipídicos (LIPDGPO, LIPPCPO, LIPPSPO) por 24 h. A viabilidade celular foi detectada por ensaios MTS (n = 4 culturas celulares tratadas de forma independente). Os dados são apresentados como média ± DP. **p < 0,01 e ***p < 0,001 em comparação ao controle pelo teste t de Student bicaudal. B Índices de dependência de resistência (RDIs) de LIPPCPO e agentes antitumorais em nove pares de células cancerígenas resistentes e sensíveis. Os RDIs representam as razões de IC50 dos agentes antitumorais em células resistentes vs. sensíveis. A375-R1 definido como resistência de células A375 à dacarbazina; B16-R1 definido como resistência de células B16 à dacarbazina; A549-R1 definido como resistência de células A549 à cisplatina; LLC-R1 definido como resistência de células LLC à cisplatina; B16-R2 definido como resistência de células B16 ao vemurafenibe; HepG2-R1 definido como resistência de células HepG2 ao sorafenibe; LLC-R2 definido como resistência de células LLC ao gefitinibe; B16-R3 e 4T1-R1 definidos como resistência de células B16 e 4T1 aos raios X, respectivamente. C Aquisição de resistência sob exposição a DTX e LIPPCPO. Um ensaio de evolução de resistência adquirida a medicamentos foi realizado expondo 4T1-R a escalonamento de dose de DTX e LIPPCPO em intervalos de 24 h a partir de 0,25 × IC50 por 60 dias. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Para investigar os efeitos do LIPPO em células resistentes a medicamentos, primeiro examinamos os efeitos letais do LIPPO. Conforme mostrado na Tabela Suplementar S2, as células cancerígenas desenvolveram resistências robustas após exposição prolongada a agentes antitumorais, resultando em um valor de IC50 pelo menos 10 vezes maior em comparação com suas células parentais. Avaliamos os efeitos do LIPPO em organoides de células MCF-7 resistentes à doxorrubicina (MCF-7R) usando um ensaio MTS e incluímos lipossomas construídos com DG, PC ou PS puros para comparação. Como mostrado na Fig. 2A, todos os lipossomas puros não tiveram impacto na viabilidade celular, enquanto três LIPPO inibiram significativamente a proliferação de células MCF-7R. Entre eles, o LIPPCPO apresentou o efeito letal mais forte (80,33%) em células MCF-7R e foi selecionado para exames adicionais. Em comparação com DG e PS, o LIPPO à base de PC exibiu maior estabilidade em PSF, capacidade de penetração aprimorada em organoides tumorais e efeitos letais potentes contra células cancerígenas (Fig. 2A). Atribuímos o desempenho superior do LIPPCPO ao grupo cabeça de colina da PC, que o torna zwitteriônico em pH fisiológico e facilita fortes afinidades de ligação com outras biomoléculas.
Em seguida, examinamos a proporção de peróxido no LIPPCPO para obter uma fórmula otimizada para morte celular eficaz. Conforme mostrado na Fig. Suplementar S4a, os efeitos de morte do LIPPCPO aumentaram com a proporção de peróxidos e atingiram um platô (>80% de morte celular) nas células MCF-7R e 4T1-R com 40% de peróxidos de PC (Fig. Suplementar S4b), que foi selecionada como a fórmula ideal para exames posteriores. Nesta fórmula ideal, as células MCF-7R tratadas com LIPPCPO exibiram uma diminuição significativa dependente do tempo na viabilidade celular de 0 a 24 h, com a proporção de células vivas atingindo um nível mínimo de 17,3% após 48 h (Fig. Suplementar S5). Os níveis de saturação das caudas de PC impactaram significativamente a citotoxicidade do LIPPCPO. Entre os fosfolipídios com níveis variados de saturação (18:0, 18:1 e 18:2), apenas o LIPPCPO derivado de PC poli-insaturada (18:2) foi capaz de matar efetivamente as células cancerígenas (Fig. Suplementar S6). Além disso, avaliamos o efeito de morte do LIPPCPO em células mais resistentes à quimio, rádio ou terapia-alvo, calculando o índice de dependência de resistência (RDI), que é a razão dos valores de IC50 de agentes antitumorais em células resistentes em relação às células parentais (Tabela Suplementar S3). Embora o LIPPCPO tenha demonstrado eficácia relativamente menor em comparação com medicamentos clínicos em células cancerígenas sensíveis, seu efeito de morte permaneceu consistente independentemente das tolerâncias adquiridas em células resistentes, exibindo os RDIs do LIPPCPO em um em todas as células resistentes (Fig. 2B). Este resultado indica que os efeitos de morte do LIPPCPO são independentes das resistências adquiridas. Mais importante ainda, sua estrutura oca permite a carga eficiente de medicamentos clínicos, permitindo a morte sinérgica de células cancerígenas.
Em clínicas, pacientes com câncer que inicialmente respondem a agentes antitumorais podem adquirir rapidamente resistência secundária a esses agentes após alguns tratamentos. Para examinar se a administração de LIPPCPO em células resistentes resulta na geração de resistência secundária, tratamos células 4T1-R com LIPPCPO por escalonamento de dose por dois meses. Também incluímos um quimio-agente sensível, docetaxel (DTX), para comparação (Fig. Suplementar S7). Surpreendentemente, o LIPPCPO mostrou efeitos antitumorais persistentes sem desencadear resistência detectável em células 4T1-R durante o tratamento de longo prazo (Fig. 2C). Em contraste, as células 4T1-R desenvolveram rapidamente uma resistência robusta ao tratamento com DTX, exibindo um incremento de 15 vezes no valor de IC50 nas células adquiridas.
Eventos de sinalização em cascata na ferroptose induzida por LIPPCPO
Eventos em cascata de ferroptose induzidos por LIPPCPO.
A Imagens de microscopia confocal da colocalização de lipossomas FITC e DMT1 em células MCF-7R (n = 3). As células MCF-7R tratadas foram coradas com anticorpos anti-DMT1 (vermelho). Hoechst 33342 foi usado para corar os núcleos celulares (azul). B Cisteinilação induzida por LIPPCPO no domínio topológico do DMT1 voltado para o compartimento lisossomal. Os lisossomos em células tratadas com LIPPCPO ou células não tratadas foram isolados para separação do DMT1 por eletroforese em gel. As bandas de DMT1 foram digeridas com tripsina para análise por espectrometria de massas (Thermo, Easy nLC1200/Q Exactive plus). Picos em m/z de 752,23 e 1165,90 indicam a formação de pontes dissulfeto em dois peptídeos. C Imagens de microscopia confocal da distribuição de Fe2+ em células MCF-7R (n = 3). As células MCF-7R tratadas foram coradas com FeRhoNox-1 (vermelho). Hoechst 33342 foi usado para corar os núcleos celulares (azul). Fe(NH4)2(SO4)2 (FAS, 100 μM) foi usado como controle positivo. D Viabilidade celular em células MCF-7R do tipo selvagem e DMT1-KD expostas a 100 μM de LIPPCPO por 24 h (n = 5 culturas celulares tratadas independentemente). E Efeitos dos quelantes de ferro na morte celular induzida por LIPPCPO. Células MCF-7R foram pré-tratadas com 100 μM de deferoxamina (DFO) ou deferiprona (DFP) por 2 h e, em seguida, tratadas com 100 μM de LIPPCPO por 24 h. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio MTS (n = 6 culturas celulares tratadas independentemente). F Imagens confocais de peróxidos lipídicos em células MCF-7R (n = 3). G Western blotting de GPX4 e H Níveis de GSH em células MCF-7R e 4T1-R. As células MCF-7R e 4T1-R tratadas foram coradas com o kit de coloração de peroxidação lipídica Image-iT para observar o acúmulo de peróxidos lipídicos nas células. RSL3 (25 μM) foi usado como controle positivo. Os lisados celulares foram submetidos a um ensaio de Western blotting para avaliar a expressão de GPX4, e os níveis de GSH foram detectados por um kit de ensaio GSH/GSSG (n = 3 culturas celulares tratadas independentemente). Os dados são apresentados como média ± DP para (D), (E) e (H). **p < 0,01 e ***p < 0,001 em comparação com o controle pelo teste t de Student bicaudal para (D), (E) e (H). Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Comparamos os efeitos do inibidor de apoptose (Z-VAD-FMK), do inibidor de necrose (necrostatin-1, Nec-1) e do inibidor de ferroptose (ferrostatin-1, Fer-1) nas mortes celulares induzidas por LIPPCPO. Conforme destacado na Fig. Suplementar S8, os efeitos do pré-tratamento com Fer-1 na morte celular induzida por LIPPCPO foram marcantes. Notavelmente, essa intervenção levou a um aumento substancial na viabilidade celular, com melhorias variando de 62% a 72% observadas em ambas as linhagens celulares MCF-7R e 4T1-R. Esses achados ressaltam o papel central da ferroptose no fenômeno de morte celular observado. Para desvendar os eventos sequenciais que impulsionam a ferroptose, examinamos ainda a distribuição intracelular de LIPPCPO especificamente em células MCF-7R. A imagem por microscopia confocal revelou que lipossomas marcados com FITC foram internalizados nas células após 12 h de incubação (Fig. Suplementar S9) e se sobrepuseram significativamente (89,6%) aos lisossomos corados com anticorpos para proteína 1 de membrana associada a lisossomos (LAMP-1) (Fig. Suplementar S10). O LIPPCPO internalizado apresentou forte associação com DMT1, conforme demonstrado por sua colocalização em microscopia confocal (Fig. 3A), bem como pela alta afinidade de ligação (−5,7 kcal/mol) em simulações de dinâmica molecular (DM). Em seguida, isolamos lisossomos de células tratadas com LIPPCPO para extrair proteínas lisossomais para separação por eletroforese em gel. A banda do gel contendo DMT1 foi submetida à digestão por tripsina. Os peptídeos adquiridos foram detectados por espectrometria de massas para análise proteômica. Alterações significativas de peso molecular foram detectadas em dois domínios topológicos voltados para o compartimento lisossomal. Conforme mostrado na Fig. 3B, picos de massa em m/z de 752,23 e 1165,90 indicam a formação de pontes dissulfeto em dois peptídeos do tratamento com LIPPCPO. Especificamente, as cisteínas nas posições 245, 248, 334 e 365 formam duas cistinas após reação com LIPPCPO, indicando uma cisteinilação de DMT1. As sequências dos dois peptídeos foram determinadas pela análise dos íons fragmento correspondentes nos espectros de massa (Fig. Suplementar S11). Em contraste, o grupo controle exibiu um pico proeminente de GMFVPSCSGCR em m/z 754,23, indicando um nível mínimo de cisteinilação (Fig. Suplementar S12). A ocorrência de reações de cisteinilação é ainda apoiada por simulações de DM. Especificamente, os resultados de DM demonstraram uma associação rápida de peróxidos de PC com DMT1 dentro de 50 ns, durante a qual os peróxidos de PC interagem com aminoácidos dentro dos domínios transmembrana (TMD) 5 e 8 (Fig. Suplementar S13). Notavelmente, os TMD 5 e 8 contêm cisteínas nas posições 245, 248, 334 e 365, sugerindo uma alta probabilidade de interação de peróxidos lipídicos com essas cisteínas.
Como os lisossomos são um reservatório de íons ferrosos e o DMT1 controla o transporte de ferro, a cisteinilação do DMT1 pelo LIPPCPO pode promover o efluxo de Fe2+ para o citoplasma. Para confirmar isso, o FeRhoNox-1 não luminescente foi usado para detectar Fe2+ lábil nas células, e uma fluorescência vermelha difusa do FeRhoNox-1 foi observada nas células tratadas com LIPPCPO (Fig. 3C), indicando que o LIPPCPO internalizado nos lisossomos poderia direcionar a distribuição espacial do Fe2+ lisossomal no citoplasma. No entanto, o conteúdo total de ferro nas células apresentou alterações limitadas (Fig. Suplementar S14). Para confirmar ainda mais o papel do DMT1, uma linhagem celular com knockdown de DMT1 (DMT1-KD) foi estabelecida para examinar o efeito do LIPPCPO. O knockdown de DMT1 em células MCF-7R diminuiu drasticamente os efeitos do LIPPCPO na liberação de íons ferrosos, e o efeito letal do LIPPCPO teve um declínio de 29,76% nas células DMT1-KD (Fig. 3D, Fig. Suplementar S15). Os quelatos de ferro deferiprona (DFP) e deferoxamina (DFO) resgataram eficientemente 60,6% e 62,34% da morte celular induzida por LIPPCPO, respectivamente (Fig. 3E). Todos esses resultados indicam que o LIPPCPO pode ter como alvo o DMT1 nos lisossomos, facilitar o efluxo de Fe2+ e induzir a morte celular dependente de ferro, ou seja, ferroptose.
Para validar ainda mais esse tipo de morte celular, examinamos outros eventos em cascata nas vias de ferroptose. Como os íons ferrosos redox-ativos no pool de ferro lábil podem impulsionar a peroxidação não enzimática de lipídios, primeiro examinamos a peroxidação lipídica em células MCF-7R por coloração com C11-BODIPY. O RSL3, que impede a degradação de peróxidos lipídicos, foi incluído como controle positivo. Como mostrado na Fig. 3F, os acúmulos de peróxidos lipídicos induzidos por LIPPCPO em células MCF-7R são semelhantes ao efeito do RSL3, conforme demonstrado pela intensa fluorescência verde do C11-BODIPY oxidado. Para eliminar esse sinal de perigo, os organismos vivos desenvolveram uma selenoenzima central, a GPX4, que utiliza glutationa (GSH) para catalisar a degradação de peróxidos lipídicos. Portanto, detectamos as quantidades de GSH e GPX4 em lisados celulares. Os Western blots mostraram que o tratamento com LIPPCPO suprimiu a expressão de GPX4 nas células com uma diminuição de 0,23 vezes (Fig. 3G, Fig. Suplementar S16) e induziu mais de 70% de depleção de GSH (Fig. 3H). No geral, esses resultados sugerem que o LIPPCPO pode induzir morte celular ferroptótica em células cancerígenas resistentes por internalização lisossomal, interação com DMT1, liberação de Fe2+ lisossomal, peroxidação lipídica, supressão de GPX4 e depleção de GSH.
Para validar o efeito ferroptótico do LIPPCPO in vivo, um modelo de câncer de mama singênico foi estabelecido em camundongos BALB/c por transplante ortotópico de células 4T1-R transfectadas com luciferase de vaga-lume (fLuc-4T1-R). A distribuição do LIPPCPO foi visualizada por marcação com iodo-125 (125I) em tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT/CT). Conforme mostrado na Fig. S17a suplementar, a radioatividade foi detectada pela primeira vez nos tumores 6 h após a injeção, aumentou gradualmente até um pico às 24 h e diminuiu ao fundo às 48 h. Durante o tratamento, não houve perda significativa de peso corporal em nenhum dos camundongos tratados (Fig. S17b suplementar). Curiosamente, o LIPPCPO mostrou acúmulo significativo nos tumores. Dado que a corona superficial é cada vez mais considerada um parâmetro-chave responsável pela distribuição biológica de objetos nanométricos, especulamos que o LIPPCPO poderia formar uma corona superficial única em camundongos com câncer de mama. Para investigar isso, o LIPPCPO foi incubado com amostras de plasma de camundongos saudáveis e com câncer. Os constituintes da corona superficial no LIPPCPO foram analisados por proteômica. Uma comparação dos constituintes da corona revelou 105 proteínas com expressão mais de 2 vezes maior na corona do LIPPCPO formada no plasma de camundongos com câncer (Tabela S4 suplementar). Entre estas, treze proteínas altamente abundantes, incluindo a chaperona do retículo endoplasmático BiP (HSPA5), β-arrestina-1 (ARRβ1), proteína associada à proliferação 2G4 (PA2G4), sintase de ácidos graxos (FASN), lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL), fator de von Willebrand tipo A (VWFA), anexina, proteína tirosina quinase (PTK), proteína semelhante à Ras GTPase ativadora (IQGAP1), proteína dissulfeto isomerase (PDI), inibidor inter-alfa-tripsina (IαI), desintegrina-metaloprotease de mamíferos (ADAMs) e proteína 1 regulada positivamente por hipóxia (HYOU1), estão intimamente associadas ao crescimento tumoral, proliferação, metástase ou microambiente (Fig. S18 suplementar). Esses constituintes na corona do LIPPCPO podem contribuir para seu acúmulo nos tumores.

Ferroptose induzida pelo tratamento com LIPPCPO in vivo.

A Imagens representativas da distribuição de Fe2+ em células tumorais (n = 3). As células tumorais foram extraídas do tecido tumoral tratado com LIPPCPO e coradas com FeRhoNox-1 para imageamento confocal. B Imagens representativas do acúmulo de peróxidos lipídicos nos tumores. Os tumores foram ressecados de camundongos portadores de tumor tratados com LIPPCPO e corados com C11-BODIPY para imageamento no sistema IVIS. C Imagens representativas de imuno-coloração (4-HNE, caspase-3 clivada e RIP3) em seções tumorais (n = 3). DTX: docetaxel. D Avaliação da expressão de GPX4 em lisados de tecido tumoral (n = 3). Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados Fonte.
O LIPPCPO internalizado lisossomalmente reage com as cisteínas nos sítios 245 e 248, 334 e 365 da DMT1 para formar duas cistinas. Essa pós-modificação impulsiona a função de efluxo da DMT1 e exporta mais Fe2+ no citoplasma, resultando em depleção de GSH, supressão de GPX4 e acúmulo de lipoperóxidos. Esses eventos culminam em ferroptose.
Camundongos portadores de tumor foram injetados por via intravenosa com DTX ou LIPPCPO. Após aproximadamente 8 dias de transplante ortotópico, os camundongos qualificados foram designados aleatoriamente em três grupos e receberam diferentes agentes, incluindo solução salina, DTX (36 mg/kg) e LIPPCPO (100 mg/kg) no 1º, 4º e 7º dia. Amostras de tumor foram coletadas no 2º e 10º dia e submetidas a imageamento pelo sistema IVIS, imunocoloração e análise por Western blot. As células tumorais extraídas foram utilizadas para validar a morte celular ferroptótica. Embora o teor total de ferro fosse semelhante em todos os tratamentos (Fig. Suplementar S14), um sinal fluorescente significativo de FeRhoNox-1 foi observado no citoplasma das células tumorais tratadas com LIPPCPO, indicando uma elevação do pool de ferro lábil (Fig. 4A). Além disso, os tumores foram corados com C11-BODIPY para imagear peróxidos lipídicos utilizando o sistema IVIS. Os tumores tratados com LIPPCPO mostraram um forte sinal fluorescente emitido pelo C11-BODIPY oxidado após reação com peróxidos lipídicos (Fig. 4B), exibindo um aumento de 3,6 vezes na acumulação de peroxidação lipídica nos tumores (Fig. Suplementar S19). Adicionalmente, elaboramos a análise de marcadores de morte celular, incluindo 4-HNE (indicativo de ferroptose), caspase-3 clivada (associada à apoptose) e RIP3 (relacionada à necrose), em seções de tumor tratadas com LIPPCPO. Conforme representado na Fig. 4C, observamos expressão abundante de 4-HNE nas seções de tumor tratadas com LIPPCPO. Esse achado é significativo, pois o 4-HNE é um produto reativo da peroxidação lipídica e serve como um indicador de ferroptose. A expressão pronunciada de 4-HNE indica acúmulo de peróxidos lipídicos nos tumores tratados com LIPPCPO, consistente com nossos achados in vitro. Em contraste, notamos um aumento significativo na expressão de caspase-3 clivada nos tumores tratados com DTX, sugerindo que a apoptose contribui para o efeito antitumoral do DTX. Notavelmente, a morte celular necrótica não foi observada em tumores tratados com LIPPCPO ou DTX, conforme indicado pela ausência de alterações significativas na expressão de RIP3 em ambos os tratamentos. Além disso, os tecidos tumorais tratados foram homogeneizados em lisados para examinar a expressão de GPX4, revelando um declínio drástico (0,37 vezes) de GPX4 nos lisados de tumor tratados com LIPPCPO em comparação com o controle veículo (Fig. 4D, Fig. Suplementar S20). Esses dados validam bem a indução de ferroptose mediada por LIPPCPO in vivo. Tanto os resultados in vitro quanto in vivo sugerem que o LIPPCPO internalizado lisossomalmente pode induzir a cisteinilação da DMT1 (Fig. 5). Essa pós-modificação potencializa a função de efluxo da DMT1 para elevar o nível de Fe2+ no citoplasma, induzindo supressão de GPX4, depleção de GSH, acúmulo de peróxidos lipídicos e morte celular ferroptótica.
Atividade antitumoral das formulações de LIPPCPO
Antes de realizar aplicações in vivo, avaliamos extensivamente a biocompatibilidade do LIPPCPO. Primeiro, testamos o efeito do LIPPCPO em glóbulos vermelhos usando um ensaio de hemólise. Os resultados mostraram que o LIPPCPO em concentrações de 40–200 μM não causou liberação visível de hemoglobina (Figura Suplementar S21). Também avaliamos a biossegurança do LIPPCPO medindo 15 índices bioquímicos no sangue. Os resultados, apresentados na Tabela Suplementar S5, demonstraram nenhuma alteração significativa nas contagens de células imunes, contagens de glóbulos brancos, níveis de plaquetas, volume médio de plaquetas, etc. Além disso, descobrimos que, embora o LIPPCPO tenha induzido morte ferroptótica significativa em células cancerígenas, as células de tecido normal foram menos sensíveis (Figura Suplementar S22, Tabela Suplementar S6).
Em comparação com indutores de ferroptose convencionais, o LIPPCPO exibiu uma via de ferroptose distinta ao ativar o eixo motor. Dada a estrutura oca do LIPPCPO, levantamos a hipótese de que o carregamento de indutores de ferroptose hidrofóbicos poderia sinergizar o efeito de ferroptose em células cancerígenas. Para testar isso, carregamos vários indutores de ferroptose relatados, incluindo sulfassalazina (SSZ), atorvastatina (AT), artesunato (AS) e altretamina (HMM), no LIPPCPO. Curiosamente, o AS, um medicamento aprovado pelo FDA, mostrou fortes efeitos de morte sinérgica com o LIPPCPO, com um fator de correlação de 0,1 (Tabela Suplementar S7). Portanto, selecionamos AS@LIPPCPO para tratar tumores de mama resistentes em estágio avançado (com um tamanho tumoral grande de ∼150 mm3, ∼14 dias).
Efeitos terapêuticos das formulações de LIPPCPO em camundongos com câncer de mama.
A Ilustração esquemática do tratamento com a formulação LIPPCPO em camundongos portadores de tumor. Após 14 dias da implantação das células fLuc-4T1-R, cada camundongo recebeu soro fisiológico (n = 5 camundongos), Artesunato (AS) (11,7 mg/kg, n = 5 camundongos), LIPPCPO (100 mg/kg, n = 5 camundongos) ou AS@LIPPCPO (111,7 mg/kg, n = 5 camundongos) três vezes por semana. B Curvas de crescimento tumoral de cada camundongo. Após receberem os tratamentos indicados, os volumes tumorais de cada camundongo foram registrados a cada 3 dias e exibidos como cinética de crescimento tumoral. C Imagens de bioluminescência de camundongos portadores de tumor. Animais recebendo diferentes tratamentos foram submetidos a imagens de bioluminescência (BLI) usando um sistema de espectro de imagem IVIS nos dias 0, 7, 14, 21 e 28. D Imagem ex vivo de metástases pulmonares. Camundongos portadores de tumor recebendo diferentes tratamentos foram sacrificados no 28º dia para visualização de focos metastáticos nos pulmões. BF: campo claro, BLI: imagem de bioluminescência. E Curvas de Kaplan–Meier exibindo as taxas de sobrevivência dos camundongos portadores de tumor tratados ao longo de 60 dias. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem.
Os camundongos portadores de câncer de mama foram divididos aleatoriamente em quatro grupos e tratados com injeções intravenosas de solução salina, AS (11,7 mg/kg), LIPPCPO (100 mg/kg) ou AS@LIPPCPO (111,7 mg/kg) no 1º, 4º e 7º dia (Fig. 6A). Dos quatro tratamentos, o AS apresentou efeitos limitados no crescimento do câncer de mama resistente. Em contraste, LIPPCPO e AS@LIPPCPO inibiram significativamente o crescimento tumoral, conforme observado na Fig. 6B e na Fig. Suplementar S23. O tratamento combinado resultou em tamanhos de tumor 2,5 vezes menores que os do controle veicular, demonstrando um potente efeito antitumoral. Esses resultados foram ainda validados por imagem de bioluminescência (BLI), uma modalidade de imagem óptica não invasiva que nos permitiu visualizar os sinais bioluminescentes catalisados pelas células fLuc-4T1-R in vivo. Conforme mostrado na Fig. 6C, camundongos não tratados e tratados com AS exibiram luminescência intensa com valores 20,8 e 18,5 vezes maiores que os tratamentos com AS@LIPPCPO, respectivamente (Fig. Suplementar S24a), indicando rápida duplicação das células fLuc-4T1-R. A rápida proliferação das células fLuc-4T1-R levou à deficiência de nutrientes e necrose celular, evidenciadas pela diminuição dos sinais de luminescência nos centros dos tumores no 21º dia. Curiosamente, tanto os tratamentos com LIPPCPO quanto com AS@LIPPCPO não apresentaram metástases pulmonares detectáveis, enquanto os animais injetados com veículo e solução de AS exibiram de 12 a 25 focos metastáticos por pulmão, com aumento de 9,2 e 6,9 vezes na intensidade da luminescência, respectivamente (Fig. 6D, Fig. Suplementar S24b). Como resultado, todos os animais portadores de tumor não tratados ou tratados com AS morreram ou atingiram estado moribundo em até 45 dias. No entanto, no grupo AS@LIPPCPO, três dos cinco camundongos sobreviveram por mais de 60 dias, indicando uma extensão significativa no tempo de sobrevivência em camundongos portadores de câncer de mama em estágios avançados (Fig. 6E). Esses dados demonstram que o tratamento com AS@LIPPCPO pode estender efetivamente o tempo de sobrevivência de camundongos portadores de câncer de mama em estágios avançados.

Além disso, examinamos os efeitos do LIPPCPO na radioterapia. Camundongos portadores de câncer de mama foram divididos aleatoriamente em quatro grupos e tratados com solução salina, LIPPCPO (100 mg/kg), raios X (6 grays) ou uma combinação de LIPPCPO e raios X (Fig. Suplementar S25a). Conforme mostrado na Fig. Suplementar S25b, c, a combinação de LIPPCPO e raios X exibiu o efeito inibitório mais potente no crescimento tumoral, com um volume tumoral médio de 197,8 mm³ no dia 21. Em contraste, animais que receberam solução veicular, apenas terapia com raios X e apenas LIPPCPO apresentaram volumes tumorais de 614,1 mm³, 419,4 mm³ e 313,6 mm³, respectivamente. Esses resultados indicam que o LIPPCPO poderia potencialmente servir como um agente sinérgico tanto na quimioterapia quanto na radioterapia.

Discussão
A resistência adquirida e intrínseca às terapias convencionais contra o câncer continua sendo um grande obstáculo no tratamento oncológico. Apesar de inúmeros estudos pré-clínicos e clínicos voltados para superar a resistência a medicamentos, o progresso tem sido limitado. A desregulação da apoptose é o principal mecanismo responsável pelo câncer refratário, e a ativação de vias de morte celular não apoptóticas, como a ferroptose, pode oferecer uma via terapêutica distinta. Esforços recentes têm se concentrado na exploração de inibidores químicos dos eixos de freio da ferroptose, como o sistema xc−/GSH/GPX4 e a vitamina B5/aceti-CoA/HMG-CoA/CoQ10/FSP1, para a terapia do câncer. No entanto, indutores convencionais de ferroptose, como a erastina, frequentemente levam a toxicidade sistêmica grave. A deposição elevada de ferro em células cancerígenas devido ao seu rápido metabolismo e proliferação torna a elevação do pool de ferro lábil uma estratégia promissora para induzir ferroptose na terapia do câncer. Neste estudo, projetamos um lipossomo funcionalizado com peróxido (LIPPCPO) para induzir ferroptose através do eixo DMT1/Fe2+/LOOH para terapia do câncer refratário. Nosso LIPPCPO tem como alvo o DMT1 nos lisossomos, facilita o efluxo de Fe2+ para o citoplasma e induz a morte celular ferroptótica dependente de ferro. O mecanismo de indução de ferroptose do LIPPCPO difere do de indutores convencionais de ferroptose, como erastina e RSL3, que têm como alvo principal a proteína reguladora central GPX4 dentro do eixo de frenagem da ferroptose. Em nosso estudo, as células tratadas com LIPPCPO mostraram uma elevação significativa no pool de ferro lábil e no acúmulo de peróxidos lipídicos devido a interações diretas com o DMT1. No entanto, o LIPPCPO induziu uma diminuição menos pronunciada nos níveis da proteína GPX4, sugerindo que o LIPPCPO pode ter um forte efeito sinérgico com indutores de ferroptose que visam o eixo de frenagem. Importante, o mecanismo único de ferroptose do LIPPCPO permitiu que ele exibisse um efeito de morte maior em células cancerígenas do que em células normais. A administração do LIPPCPO in vivo não alterou os índices bioquímicos no sangue, nem provocou quaisquer alterações patológicas nos principais órgãos, indicando uma menor citotoxicidade em células normais.
O metabolismo do ferro é um processo rigorosamente controlado tanto nos níveis celular quanto sistêmico por uma rede abrangente de sinalização. Em mamíferos, o DMT1 é o principal responsável pela captação de ferro dietético nas membranas plasmáticas dos enterócitos no trato gastrointestinal. Após entrar na corrente sanguínea via ferroportina (FPN) e se ligar aos receptores de transferrina (TfRs), o ferro é levado para os endossomos. Após a redução pelas famílias do antígeno epitelial de seis transmembrana da próstata (STEAP), o ferro ferroso pode ser bombeado pelo DMT1 lisossomal para elevar o pool de ferro lábil. Embora vários inibidores de TfRs ou DMT1 tenham sido descobertos para prevenir a captação excessiva de ferro no tratamento da hemocromatose hereditária relacionada à sobrecarga de ferro, atualmente não existem ativadores disponíveis de DMT1 ou TfRs para aumentar a captação de ferro. Curiosamente, a deposição elevada de ferro foi relatada na doença de Parkinson, e um estudo recente demonstrou que a cisteinilação induzida por NO do DMT1 poderia aumentar a captação de Fe2+ nas células. Inspirados por esse fenômeno, projetamos fosfolipídios funcionalizados com peróxido para substituir o NO na cisteinilação do DMT1, que foram internalizados eficientemente nos lisossomos. A internalização lisossomal facilita as interações entre o DMT1 e o LIPPCPO. Como esperado, o LIPPCPO ativa a função de efluxo do DMT1, eleva o pool de ferro lábil e induz ferroptose. Em conjunto, nosso estudo descobriu um material sintético para impulsionar a função do DMT1.
A estrutura química dos fosfolipídios, incluindo comprimento da cadeia, grupo cabeça polar e estado de saturação, impacta significativamente a ferroptose induzida por LIPPO. Vale ressaltar que a reação de peróxido nos fosfolipídios ocorre frequentemente nas unidades de 1,4-pentadieno das cadeias fosfolipídicas. Portanto, o estado de saturação é particularmente crítico, pois determina o número de grupos peróxido que podem interagir com DMT1. Nosso estudo demonstra que apenas LIPPCPO derivado de fosfolipídios poli-insaturados pode induzir morte celular ferroptótica. Essa descoberta é consistente com um relatório do grupo de Stockwell, que mostrou que fosfolipídios contendo caudas de ácidos graxos poli-insaturados, especialmente aqueles com duas dessas caudas, induzem significativamente a ferroptose em células cancerígenas. Além disso, nossos dados indicam que o tipo de grupo cabeça polar nos fosfolipídios é outro parâmetro crucial. Ele afeta as interações com células e moléculas-alvo, modulando sua eficácia na indução da ferroptose. Entre os três fosfolipídios testados: PC, DG e PS, LIPPCPO exibe a maior retenção em organoides de células cancerígenas e a maior eficiência de eliminação. No entanto, os impactos dos comprimentos das cadeias na ferroptose ainda são pouco compreendidos. Isso se deve principalmente à disponibilidade limitada de fosfolipídios comercialmente disponíveis com os mesmos grupos cabeça polares e estado de saturação, mas comprimentos de cadeia diferentes, tornando comparações abrangentes desafiadoras. Portanto, estudos futuros devem explorar as relações entre estruturas de fosfolipídios e ferroptose para identificar potentes indutores de ferroptose.
Em resumo, este estudo demonstrou o potencial de LIPPCPO para induzir ferroptose em células cancerígenas, elevando o pool de ferro lábil via DMT1 e induzindo eventos celulares, incluindo acúmulo de LOOH, supressão de GPX4 e depleção de GSH. A ativação de DMT1 pode ser atribuída à cisteinilação induzida por LIPPCPO nos sítios 245, 248, 334 e 365 de DMT1. O LIPPCPO foi eficaz em induzir mortes celulares ferroptóticas em células cancerígenas resistentes a terapias convencionais, como quimio-, radio- e terapia-alvo. Além disso, a fórmula AS@LIPPCPO exibiu um forte efeito ferroptótico sinérgico, resultando em melhores taxas de sobrevivência de camundongos com câncer de mama ao inibir o crescimento tumoral e a metástase. Nosso estudo destaca uma abordagem distinta para induzir ferroptose e fornece um vetor sintético promissor para aumentar os efeitos terapêuticos de indutores convencionais de ferroptose.
Métodos
Declaração de ética
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Cuidados com Animais de Laboratório da Universidade de Soochow (Nº 202109A0130). O tamanho máximo do tumor permitido pelo comitê de ética/conselho de revisão institucional é de 2000 mm3. Os tamanhos dos tumores em todos os experimentos nunca excederam esse limite.
Materiais e reagentes
Mini-extrusor, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PC, 18:2) e 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (PS, 18:2) foram adquiridos da Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, EUA). O kit de peroxidação lipídica, C11-BODIPY (581/591), isotiocianato de fluoresceína (FITC), Hoechst 33342, lisado RIPA, aglutinina de germe de trigo marcada com Alexa Fluor 594 (WGA) e o anticorpo DMT1 (PA5-35136) foram obtidos da Thermo Fisher Scientific (Grand Island, NY, EUA). Cisplatina, Dacarbazina, Vemurafenibe, Sorafenibe e Genfitinibe foram obtidos da MedChemExpress (Monmouth Junction, Nova Jersey, EUA). Cloridrato de doxorrubicina foi adquirido da Aladdin (Xangai, China). Ferrostatina-1, Polibreno e Puromicina foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). TNF-α foi obtido da BD Biosciences (San Jose, CA, EUA). Deferiprona (DFP), Deferoxamina (DFO) e 1,3-dilinoleoil glicerol (DG, 18:2) foram adquiridos da Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EUA). CHX, Z-VAD-FMK, Nec-1, GPX4 (ab125066), LAMP-1 (ab278043), RIP3 (ab62344) e anticorpo β-actina (ab8227) foram obtidos da Abcam (Cambridge, MA, EUA). O anticorpo 4-HNE (MA5-27570) foi adquirido da Invitrogen (CA, EUA). Um anticorpo Caspase-3 clivada (bs-2593R) foi adquirido da Bioss Inc. (Boston, EUA). Vetores lentivirais foram obtidos da GenePharma Co., Ltd. (Xangai, China). Soro fetal bovino (FBS) foi obtido da Gibco (Gemini, Woodland, EUA). Meio RPMI 1640 e meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) foram adquiridos da Corning (NY, EUA). Penicilina, Estreptomicina e Tripsina-EDTA foram adquiridos da HyClone Laboratory (South Logan, Utah, EUA).
Simulação de dinâmica molecular
A simulação de dinâmica molecular foi utilizada para explorar as interações entre a proteína DMT1 e derivados de PC, incluindo PC pura, PC carboxílico, PC hidroxil e PC peróxido. Especificamente, usamos o Autodock Vina 1.1.2 para ancorar os derivados de PC e a proteína DMT1 com um valor de exaustividade de 100. Após uma simulação de 50 ns, calculamos a energia livre de ligação relativa dos derivados de PC e da proteína DMT1 usando os métodos MM-PBSA/GBSA.
Preparação, separação e caracterização de peróxidos lipídicos
Para criar uma monocamada de fosfolipídio, PC, PS ou DG dissolvidos em clorofórmio a 600 μM foram adicionados a um balão de fundo redondo de 5 mL. Os solventes foram removidos por um evaporador rotatório por 10 min a 25 °C, 80 rpm e 400 mbar. As monocamadas de fosfolipídio resultantes foram reagidas com O2 em 1 mL de PBS ou meio RPMI 1640 contendo 105 unidades de lipoxigenase tipo-V (5-LOX) por 4 h a 37 °C. Após sonicação por 30 s, os sobrenadantes contendo peróxidos lipídicos foram centrifugados (Allegra 64R, Beckman) a 20.000 × g por 10 min para coletar os sobrenadantes. As camadas orgânicas foram extraídas três vezes com 4 mL de CHCl3, concentradas por um concentrador centrífugo a vácuo (CentriVap 7810040, Labconco) e armazenadas a −80 °C para análise posterior.
Os extratos de peróxido de fosfolipídeo foram analisados usando um sistema LC (Agilent 1100 Series, Santa Clara, CA, EUA) acoplado a um espectrômetro de massas LTQXL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) com uma fonte de ionização por electrospray (ESI). Amostras de injeção de 3 μL foram separadas por uma coluna Xqua C8 (55 °C) a uma vazão de 0,25 mL/min com um gradiente de 5–95% da fase móvel B em 20 min. O eluente foi varrido por um MS no modo de ionização positiva com temperatura do capilar a 350 °C, corrente da fonte a 4 μA, tensão da fonte a 3,5 kV, vazão do gás de bainha a 25 arb, vazão do gás auxiliar a 8 arb, tensão da lente do tubo a 120 V e m/z de largura de isolamento a 1,5. As faixas de varredura foram de 100–1000 m/z. Os dados de MS foram coletados e analisados pelo software Xcalibur (Thermo Xcalibur 2.2). Para obter peróxidos de fosfolipídeo puros, os extratos foram separados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A fase móvel A era 60% de acetonitrila em água, e a fase móvel B era acetonitrila/isopropanol (10/90, v/v), contendo 10 mM de formiato de amônio. Volumes de amostra de injeção de 5 μL foram separados por uma coluna Xqua C8 (2,1 mm × 100 mm, 3,5 μm, 100 Å) a uma vazão de 0,25 mL/min com um gradiente de 5–95% da fase móvel B em 30 min. O eluente de 13–21 min foi coletado por minuto e concentrado por um concentrador centrífugo a vácuo por 2 h. As amostras concentradas foram posteriormente caracterizadas por análise de LC-MS, conforme relatado anteriormente.

Construção e caracterização do LIPPO
Para construir as amostras de LIPPO, utilizamos um método de hidratação em filme fino seguido de extrusão. Misturamos PC, PS ou DG com seus peróxidos em diferentes proporções de massa (100%, 90%, 80%, 60%, 40%, 20% e 0%) e dissolvemos 200 μM das misturas de fosfolipídeos resultantes em clorofórmio. Um filme fino de lipídeo molecular único foi formado em um balão de fundo redondo usando evaporação rotatória (25 °C) e hidratado com 1 mL de água DI ou meio RPMI 1640. Após sonicação (40 W) por 30 s em banho-maria, obtivemos LIPPO heterogêneo. Os lipossomas uniformes foram adquiridos extrudando o LIPPO heterogêneo com um extrusor Avanti equipado com membranas de policarbonato de 0,1 μm. O LIPPO adquirido foi caracterizado usando espalhamento de luz dinâmico (Zetasizer Nano ZS90, Malvern) e microscopia crioeletrônica (Talos F200C 200 kV, FEI).
Encapsulação de moléculas de fármacos em LIPPO
Para encapsular moléculas de fármacos no LIPPCPO, dissolvemos sulfassalazina, atorvastatina, artesunato ou altretamina em DMSO a 200 μM e os adicionamos a 500 μL de clorofórmio contendo 120 μM de PC e 80 μM de peróxidos de PC. Evaporamos os solventes usando um evaporador rotatório (120 rpm) à temperatura ambiente para obter um filme em um balão de fundo redondo, que então hidratamos com 1 mL de água DI. Após sonicação (40 W) por 30 s em banho-maria e extrusão por um extrusor Avanti equipado com membranas de policarbonato de 0,1 μm, removemos os fármacos hidrofóbicos livres por centrifugação a 20.000 × g por 10 min para obter formulações lipossomais encapsulando os fármacos. As formulações lipossomais encapsulando fármacos foram então liofilizadas usando um concentrador centrífugo a vácuo e dissolvidas em DMSO ou metanol para detecção por espectroscopia UV-Vis. A eficiência de encapsulação (EE) foi calculada usando a seguinte equação: onde CL e CT são as concentrações dos fármacos hidrofóbicos carregados nas formulações lipossomais e as concentrações totais de fármacos usadas para a encapsulação nas formulações lipossomais, respectivamente.
Preparação de FITC-LIPPCPO e 125I-LIPPCPO
O PC marcado com FITC foi sintetizado por conjugação covalente de FITC ao PC. Resumidamente, 10 mg de 1,2-dioleoil-sn-glicerol e 0,238 mg de 4-Dimetilaminopiridina (DMAP) foram dissolvidos em 2 mL de tolueno anidro e colocados em um balão de fundo redondo de três bocas de 25 mL com agitação magnética sob N2. O balão foi colocado em banho de gelo e 200 μL de 2-cloro-1,3-dioxafosfolano-2-óxido em tolueno (41,5 mg/mL) foram adicionados via uma seringa de 1 mL. Em seguida, 100 μL de trietilamina (TEA) em tolueno (37 mg/mL) foram adicionados gota a gota, e a mistura reacional foi agitada por 4 h à temperatura ambiente. Após isso, 200 μL de N-Boc-N,N′-dimetiletilenodiamina em acetonitrila a 3,68 mg/mL foram adicionados ao balão, e a mistura foi reagida por 4 h a 65 °C. Os produtos em pellet foram coletados por evaporação rotatória (100 rpm) à temperatura ambiente para remover os solventes, e lavados três vezes com 0,5 mL de hidreto de hexila para remover a TEA. A desproteção BOC dos produtos foi realizada adicionando 1 mL de CF3COOH e 1 mL de CH2Cl2 e reagindo à temperatura ambiente por 3 h. Os produtos desprotegidos foram adquiridos por evaporação rotatória para remover solventes e lavados três vezes com 1 mL de CH2Cl2. Os produtos foram reagidos com 2 mL de FITC em metanol (3,75 mg/mL, pH 8∼9) por 6 h à temperatura ambiente. Os produtos brutos de FITC-PC foram obtidos por evaporação rotatória para remover solventes, lavados três vezes com 1 mL de água DI e 1 mL de CH2Cl2, e finalmente dissolvidos em 1 mL de tetraidrofurano. As amostras brutas de FITC-PC em tetraidrofurano foram purificadas por uma coluna SPE C8 que foi pré-tratada com 1 mL de metanol e 1 mL de água DI e eluída com 30 mL de água DI, 30 mL de metanol e 15 mL de isopropanol. Os eluatos purificados de FITC-PC em isopropanol foram concentrados usando um concentrador centrífugo a vácuo.
125I-marcado 4-tetradecilfenol foi sintetizado por reação de substituição eletrofílica entre o hidrogênio adjacente do grupo fenol no 4-tetradecilfenol e o cátion de iodo. Especificamente, 1 mg de 1,3,4,6-tetracloro-3α,6α-difenilglicouril dissolvido em 1 mL de triclorometano foi adicionado a um frasco de 5 mL. Os solventes foram evaporados em um evaporador rotativo (120 rpm) à temperatura ambiente para obter um filme no frasco de fundo redondo. Em seguida, 200 μL de solução de 4-tetradecilfenol em acetonitrila (5 mg/mL) foi adicionada ao frasco, e os solventes foram removidos para formar um filme no frasco com um evaporador rotativo (120 rpm) à temperatura ambiente. Um total de 500 μCi de Na125I disperso em 100 μL de tampão KOH-H3PO4 (0,1 M, pH 7) foi adicionado ao frasco a uma taxa de fluxo de 10 μL a cada 3 min durante 30 min. Após isso, 25 μL de acetonitrila foram completamente misturados com a solução de reação. As amostras de sobrenadante foram coletadas por centrifugação a 15.000 × g por 10 min e purificadas por uma coluna SPE pré-tratada com 3 mL de metanol anidro e 3 mL de água deionizada. O 4-tetradecilfenol marcado com 125I foi coletado após lavagem com 3 mL de acetonitrila e seco a 60 °C. O FITC-PC e o 4-tetradecilfenol marcado com 125I foram adicionados no processo de construção do LIPPCPO com uma proporção mássica de 1:9 para obter FITC-LIPPCPO e 125I-LIPPCPO.
Cultura de células
As linhagens celulares de câncer de mama MCF-7 (Cat: CBP61090) e 4T1 (Cat: CBP60352), linhagem celular de câncer de pulmão A549 (Cat: CBP60084), linhagens celulares de melanoma A375 (Cat: CBP60329) e B16 (Cat: CBP60334), linhagem celular de hepatoma HepG2 (Cat: CBP60199) foram adquiridas do Cell Bank Type Culture Collection (CAS, Xangai, China). As células LLC foram gentilmente doadas pelo Dr. Sijin Liu (Shandong First Medical University). Células normais de fígado, pulmão e pele foram extraídas de tecidos de camundongos. Todas as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 ou DMEM suplementado com 10% de SBF e 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2. Linhagens celulares resistentes a drogas foram estabelecidas de acordo com um método relatado com algumas modificações. Dacarbazina (0–1500 µM), doxorrubicina (0–2 μg/mL) e cisplatina (0–10 μg/mL), vemurafenibe (0–100 µM), sorafenibe (0–20 µM) e genfitinibe (0–40 µM) foram usados para tratar células cancerosas em concentrações alteradas gradualmente. Após 2–4 meses de tratamento, oito linhagens celulares resistentes foram obtidas, incluindo A375-R1 (dacarbazina, DTIC), B16-R1 (dacarbazina, DTIC), 4T1-R (doxorrubicina, DOX), A549-R1 (cisplatina, DDP), LLC-R1 (cisplatina, DDP), B16-R2 (vemurafenibe, Vem), HepG2-R1 (sorafenibe, SOR) e LLC-R2 (genfitinibe, Gef). Células resistentes à radiação (B16-R3, 4T1-R1) foram estabelecidas pela exposição das células progenitoras a 5–10 Grays de raios X por semana durante 10–20 semanas. Células MCF-7 resistentes à doxorrubicina (MCF-7R) foram gentilmente doadas pelo Dr. Xiangshen Liu (Instituto de Câncer e Medicina Básica, Academia Chinesa de Ciências). A Tabela Suplementar S8 justificou os tratamentos específicos para cada célula.
Acúmulo de peroxidação lipídica induzido por LIPPCPO em células
Alíquotas de 100 μL de suspensões de MCF-7R (5 × 10³ células/poço) foram adicionadas a cada poço de placas de 96 poços e cultivadas a 37 °C durante a noite. Os sobrenadantes foram então substituídos por 100 μL de meio RPMI 1640 contendo 0–100 μM de LIPPCPO por 12 h. Enquanto isso, as mesmas quantidades de LIPPCPO foram adicionadas a soluções de alginato de sódio a 1,5% em peso para preparar microesferas de alginato de cálcio usando um gerador de gotículas eletrostático. Alíquotas de 100 μL de suspensões de microesferas também foram adicionadas a cada poço de placas de 96 poços (5 × 10³/poço) e cultivadas a 37 °C. Para detectar o acúmulo de peróxidos lipídicos nas células, as células e microesferas tratadas foram lavadas com PBS e coradas com 10 μM de reagente C11-BODIPY (581/591) por 1 h. Após lavagem três vezes com PBS, as células e microesferas coradas foram analisadas usando um sistema de imagem de alto conteúdo. O acúmulo de peróxidos lipídicos nas células foi avaliado usando a seguinte fórmula: Onde FTG e FTR representam a fluorescência do BODIPY C11 nos canais verde e vermelho, respectivamente, emitida por células expostas ao LIPPCPO; FBG e FBR são a fluorescência do BODIPY C11 nos canais verde e vermelho, respectivamente, emitida pelas esferas de gel contendo LIPPCPO.
Transfecção celular
Células MCF-7R foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 2 × 10⁵ células por poço e cultivadas durante a noite. Complexos de reagentes de transfecção de vetor lentiviral foram preparados em meio RPMI 1640 contendo lentivírus com RNA de grampo pequeno (shRNA) de DMT1 ou lentivírus com shRNA de controle de vetor não direcionado, e agente de transfecção polibreno (5 μg/mL). Os complexos foram então adicionados às células e incubados por 48 h. Posteriormente, as células foram substituídas por meio RPMI 1640 fresco contendo puromicina (20 μg/mL) para selecionar uma população de células resistentes. As células transfectadas de forma estável foram isoladas por classificação de GFP e foram denominadas DMT1-KD MCF-7R. A sequência do shRNA de DMT1 era 5′-GCTTTCTCATCACTATTATGG-3′, e a sequência codificadora do shRNA de controle era 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′.
Construção de esferoides de células cancerígenas
Células 4T1-R (1 × 10⁶ células) foram misturadas com 1 mL de alginato de sódio a 1,5% (p/v) dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9%. As microesferas encapsulando células 4T1-R foram preparadas injetando a mistura em um banho de gelificação de solução de cloreto de cálcio a 100 μM a uma velocidade de fluxo de 8,2 mL/h através de uma agulha de 0,5 mm, com o auxílio de um campo eletrostático produzido por um Sistema de Fabricação de Microesferas de Tecido/Célula (Bio-leader Incorporation, Ganzhou, Jiangxi, China), com uma voltagem de 4,5 kV. Após gelificação por 30 min, as microesferas foram coletadas por sedimentação natural e cultivadas em meio RPMI 1640. Esferoides maduros de células cancerígenas foram obtidos após 5–7 dias de cultura, uma vez que o tamanho dos aglomerados celulares em cada microesfera era >50 μm.
Teste de viabilidade celular
MCF-7R (5 × 10³ células/poço), 4T1-R (4 × 10³ células/poço), outras células cancerígenas resistentes (5 × 10³ células/poço) ou esferoides celulares maduros (500/poço) foram incubados em placas de 96 poços durante a noite a 37 °C. Em seguida, os meios celulares foram substituídos por 100 μL de meio fresco contendo 0–5 mM de dacarbazina, 0–100 μM de doxorrubicina, 0–200 μg/mL de cisplatina, 0–500 µM de vemurafenibe, 0–100 µM de sorafenibe e 0–100 µM de genfitinibe, 0–200 µM de lipossomas (DG, PC ou PS), LIPPCPO, LIPDGPO ou LIPPSPO. Após 24–72 h de incubação a 37 °C, os sobrenadantes de cada poço foram removidos e substituídos por 120 μL de solução de trabalho MTS a 5 mg/mL em meio sem vermelho de fenol. Após incubação por 2 h a 37 °C, 100 μL dos sobrenadantes cultivados foram transferidos para uma nova placa para leitura da absorbância a 490 nm usando um leitor de microplacas. A viabilidade celular foi calculada usando a Eq. 3: onde At, Ac e Ab foram as absorbâncias do substrato MTS a 490 nm nas amostras tratadas, não tratadas e em branco, respectivamente.

Teste de evolução da resistência adquirida
Testes de evolução foram realizados para determinar os efeitos do DTX e do LIPPCPO nas células 4T1-R por exposição sequencial das células a 0,25 × IC50 por 60 dias. Resumidamente, alíquotas de suspensões de células 4T1-R (1 × 10⁵) foram adicionadas a cada poço de placas de 6 poços (2 mL/poço) ou placas de 24 poços (0,5 mL/poço) e incubadas a 37 °C por 24 h. As células foram então expostas a 0,25 × IC50 de DTX e LIPPCPO. Após 24 h, a densidade celular foi avaliada usando um microscópio invertido (Olympus, CKX53, Tóquio, Japão). Quando as células se adaptaram às concentrações testadas e apresentaram >80% de confluência celular, a dose de exposição de DTX ou LIPPCPO foi aumentada. Caso contrário, a concentração de exposição foi mantida por mais 24 h. Após 60 dias de exposição, as células evoluídas foram obtidas. Detalhes sobre as condições de cultura, o recipiente, os meios de cultura, a densidade celular e as doses de LIPPCPO/DTX utilizadas a cada dia estão listados na Tabela Suplementar S9.

Coloração de Perl
Alíquotas de suspensões de MCF-7R (5 × 10⁵ células/poço) foram adicionadas a cada poço de placas de seis poços e cultivadas a 37 °C por 24 h. Em seguida, os sobrenadantes foram substituídos por meio RPMI 1640 fresco (2 mL) ou meio RPMI 1640 contendo 100 μM de LIPPCPO. Após 12 h de cultura, as células foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% (2 mL) por 20 min. Em seguida, as células foram lavadas com água DI (2 mL) e coradas com solução de coloração de Perl seguindo o protocolo específico. As células coradas foram imageadas por um microscópio (Olympus, CX41, Tóquio, Japão).

Detecção por ICP-OES
Para quantificar os teores de ferro, alíquotas de 2 mL de suspensões de MCF-7R foram adicionadas a placas de seis poços a 5 × 10⁵ células/poço e incubadas durante a noite a 37 °C. Os sobrenadantes foram então substituídos por 2 mL de meio RPMI 1640 fresco ou 2 mL de meio RPMI 1640 contendo 100 μM de LIPPCPO para as células MCF-7R. Após cultivo por 12 h, as células foram lavadas com 2 mL de PBS. As amostras tumorais frescas (~50 mg) foram pesadas e lavadas com PBS gelado para remover qualquer sangue ou detritos residuais e cortadas em pequenos pedaços com uma tesoura estéril. Tanto as amostras celulares quanto as tumorais foram homogeneizadas em 1 mL de tampão RIPA gelado para congelamento e descongelamento. Os lisados foram centrifugados a 20.000 × g por 10 min a 4 °C para remover os detritos insolúveis e coletar os sobrenadantes. As concentrações de proteína nos sobrenadantes foram detectadas por um kit de ensaio de proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante. Após isso, os lisados foram colocados em um frasco de 25 mL e incubados com 5 mL de solução de digestão composta por 10 M de H₂O₂ e 14,4 M de HNO₃ por 12 h à temperatura ambiente. As amostras foram então digeridas a 300 °C por 4 h usando um aquecedor (Lichen, Xangai, China) com adição contínua de água DI. Os sobrenadantes das soluções digeridas foram coletados por centrifugação a 10.000 × g por 10 min e submetidos a análise por ICP-OES (Thermo Fisher, ICAP 7200). Soluções padrão de Fe também foram detectadas para adquirir uma curva padrão.

Imagens de microscopia confocal

Imagens de microscopia confocal foram usadas para visualizar a distribuição de Fe²⁺, óxido lipídico e lipossomas marcados com FITC em células ou esferoides celulares. Alíquotas de 200 μL de suspensões de MCF-7R (2 × 10⁵ células/poço), DMT1-KD MCF-7R (2 × 10⁵ células/poço), 4T1-R (1,5 × 10⁵ células/poço) ou esferoides maduros de células 4T1-R (1 × 10³ esferoides/poço) foram adicionadas a cada poço de câmaras de oito poços (155411, Lab-Tek, EUA) e cultivadas a 37 °C durante a noite. Os sobrenadantes foram então substituídos por 200 μL de meio RPMI 1640 contendo 100 μM de FITC-LIPPO para células MCF-7R e esferoides de células 4T1-R, 100 μM de LIPPCPO para células MCF-7R ou 150 μM de LIPPCPO para células 4T1-R.

Para avaliar a distribuição de Fe²⁺ nas células, células MCF-7R tratadas com LIPPCPO foram incubadas por 12 h, lavadas com PBS e coradas com 10 μg/mL de Hoechst 33342 por 20 min e FeRhoNox-1 (10 μg/mL) por 1 h. Após lavar três vezes com PBS, as células coradas foram imageadas usando microscopia confocal (FV1200, Olympus, Japão) com uma lente objetiva de imersão em óleo 60× a 405 nm ou 559 nm de excitação. Controles positivos foram células tratadas com 100 μM de Fe(NH₄)₂(SO₄)₂.

Para avaliar o acúmulo de peróxidos lipídicos nas células, células MCF-7R ou 4T1-R tratadas com LIPPCPO foram incubadas por 12 h, lavadas com PBS e coradas com 10 μg/mL de Hoechst 33342 por 20 min e reagente C11-BODIPY (581/591) (10 μM) por 1 h. Após lavar três vezes com PBS, as células coradas foram imageadas usando microscopia confocal com uma lente objetiva 20× a 405 nm, 488 nm ou 559 nm de excitação. Controles positivos foram células tratadas com 25 μM de RSL3.
Para detectar a localização dos lipossomos FITC dentro de células ou esferoides celulares, incubamos células MCF-7R ou esferoides celulares 4T1-R tratados com FITC-LIPPCPO por 2-12 ou 72 h. As células foram então lavadas com PBS e coradas com Hoechst 33342 (10 μg/mL) por 20 min e aglutinina do germe de trigo (WGA) marcada com Alexa Fluor 594 (20 μg/mL) por 1 h, ou anticorpo anti-LAMP-1 (1:100, Abcam, ab278043) por 12 h, seguindo o protocolo do fabricante. Após lavar três vezes com PBS, imaginamos as células coradas usando um microscópio confocal com lente objetiva de imersão em óleo de 4× ou 60×, com excitação a 405 nm, 488 nm ou 559 nm.
Para visualizar a interação dos lipossomos FITC com a proteína DMT1 nas células, incubamos células MCF-7R tratadas com FITC-LIPPCPO por 12 h. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e fixadas em paraformaldeído a 4%, seguidas de tratamento por 15 min em Triton X-100 a 0,05% para permeabilização da membrana. As células fixadas foram incubadas com anticorpo anti-DMT1 (1:100, Abcam, ab62562) por 12 h, seguindo o protocolo do fabricante. Após lavar três vezes com PBS, coramos as células com Hoechst 33342 (10 μg/mL) por 20 min e um segundo anticorpo fluorescente Alexa Fluor 594 (20 μg/mL). Após cinco lavagens com PBS, as células coradas foram visualizadas com lente objetiva de imersão em óleo de 60×, com excitação a 405 nm, 488 nm ou 559 nm.
Ensaio de GSH
Células MCF-7R e 4T1-R (5 × 10⁵ células/poço) foram inoculadas em placas de 6 poços e incubadas durante a noite a 37 °C. O meio de cultura de cada poço foi substituído por 2 mL de meio RPMI 1640 fresco contendo 25 μM de RSL3 ou 100–150 μM de LIPPCPO. Após 12 h de incubação, os conteúdos de GSH nas células foram detectados usando um kit de ensaio GSH/GSSG seguindo o protocolo do fabricante.
Ensaio de Western blotting
MCF-7R e 4T1-R (5 × 105 células/poço) foram inoculadas em placas de 6 poços e incubadas durante a noite a 37 °C. As células foram então tratadas com alíquotas de 2 mL de meio RPMI 1640 fresco contendo 25 μM de RSL3 ou 100–150 μM de LIPPCPO por 12 h. Amostras de câncer de mama que receberam diferentes tratamentos foram coletadas no 10º dia pós-injeção e trituradas em nitrogênio líquido. As células tratadas e as amostras de tumor foram lisadas em tampão RIPA contendo 5% de inibidor de protease (Cat: P5147, Sigma) e 2% de inibidor de fosfatase coquetel (Cat: P5726, Sigma). Os sobrenadantes dos lisados de proteína foram centrifugados a 14.000 × g por 10 min para remover detritos celulares. As concentrações de proteína nos sobrenadantes foram medidas e ajustadas usando o ensaio de Bradford. As amostras de proteína foram separadas por carregamento em gel de SDS-PAGE a 12% (Beyotime, Xangai, China) usando um sistema Mini-PROTEAN Tetra (Bio-Rad, CA, EUA) a 100 V em tampão tris-glicina-SDS. As proteínas separadas foram então transferidas para uma membrana de nitrocelulose a 300 mA. As membranas foram lavadas três vezes com 0,1% de Tween 20/TBS (v/v, TBST), bloqueadas com 5% (p/v) de leite (Biofrox, Einhausen, Alemanha) em solução TBST à temperatura ambiente por 2 h, e então incubadas com anticorpos β-actina (1:1000) e GPX4 (1:500) no tampão de bloqueio por 16 h a 4 °C. Após lavar as membranas com solução TBST três vezes, elas foram incubadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP (1:1000) à temperatura ambiente por 2 h, seguidas de lavagem suficiente com TBST. As membranas foram coradas usando uma solução de quimioluminescência hipersensível ECL e detectadas em um sistema de imageamento de quimioluminescência por fluorescência (FluorChem M, Alpha, EUA).
Tratamento animal
Camundongos fêmeas Balb/c (6–8 semanas de idade) foram obtidos da Cavens Biological Technology (Changzhou, Jiangsu, China) e alojados em um biotério sob condições controladas de 60% de umidade relativa, ar filtrado, ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, água acidificada, comida autoclavada e maravalha para cama. Os camundongos foram anestesiados usando injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (40 mg/kg) antes de células 4T1-R suspensas em 80 μL de PBS a 5 × 105 células serem injetadas no 4º coxim adiposo mamário de cada camundongo. Os volumes tumorais foram medidos usando um paquímetro digital e calculados usando a fórmula 4:
Quando o tamanho do tumor atingiu ∼50 mm³, os camundongos qualificados foram divididos aleatoriamente em três grupos por meio de sorteio para tratamentos subsequentes, incluindo injeção intravenosa de 100 μL de solução salina (n = 8), DTX (36 mg/kg, n = 3), raios X (6 Grays, n = 5), LIPPCPO (100 mg/kg, n = 8) ou LIPPCPO + raios X (100 mg/kg + 6 Gray, n = 5) três vezes por semana. Os camundongos foram sacrificados no 10º dia para coleta de amostras de tumor nos grupos Ctrl, DTX e LIPPCPO para exame de biomarcadores de ferroptose. As secções tumorais foram coradas com anticorpos contra 4-HNE (1:50), caspase-3 clivada (1:200) e RPI3 (1:200) e imageadas usando um microscópio (Olympus, CX41, Tóquio, Japão). O tamanho do tumor, o peso corporal e a taxa de sobrevivência dos animais nos grupos Ctrl (n = 5), raios X (n = 5), LIPPCPO (n = 5) e LIPPCPO + raios X foram registrados.

Quando o tamanho do tumor atingiu ∼150 mm³, os camundongos qualificados foram divididos aleatoriamente em quatro grupos por meio de sorteio para os seguintes tratamentos, incluindo injeção intravenosa de 100 μL de solução salina (Controle, n = 5), artesunato (11,7 mg/kg, n = 5), LIPPCPO (100 mg/kg, n = 5) ou artesunato@LIPPCPO (111,7 mg/kg, n = 5) três vezes por semana. Os tamanhos dos tumores foram registrados a cada 3 dias. Pontos finais humanitários foram aplicados aos camundongos portadores de tumor assim que eles atendessem a um dos seguintes critérios: (i) volume tumoral ∼2000 mm³ ou (ii) efeitos graves na alimentação, ingestão de água ou locomoção. Os camundongos e os tecidos pulmonares ex vivo foram imageados usando uma câmera Canon (Japão) e um sistema de imageamento por espectroscopia IVIS (PerkinElmer, ME, EUA).

Avaliação de biossegurança in vivo

Camundongos BALB/c fêmeas saudáveis com idade entre 6 e 8 semanas foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos. Os camundongos receberam injeção intravenosa de 100 μL de solução salina ou LIPPCPO (20 mg/mL) pela veia da cauda. Após a administração, a aparência e o comportamento dos camundongos foram monitorados periodicamente por 3 dias. Sangue e órgãos (coração, fígado, pulmão, rim, cérebro e baço) foram coletados dos camundongos tratados para testes de biossegurança. Amostras de sangue (∼600 μL) de cada camundongo foram analisadas para medir indicadores sanguíneos de rotina usando um analisador hematológico Mindray BC-2800Vet (Mindray Global, China).

Análise por espectrometria de massas
Um total de 12 amostras de proteínas foram analisadas por espectrometria de massas, incluindo 3 amostras de bandas de gel DMT1 tratadas com LIPPCPO, 3 amostras controle de DMT1 e 6 amostras de soro de camundongos portadores de tumor e saudáveis. As amostras de soro foram inicialmente centrifugadas a 40.000 × g por 1 h para remover organelas subcelulares, como exossomos e microssomos. O LIPPCPO foi então disperso em 400 μL de amostras de soro de camundongo a uma concentração de 1 mg/mL. Após incubação por 1 h a 37 °C e 200 rpm, os LIPPCPO foram recuperados por ultracentrifugação a 40.000 × g por 1 h, seguido por uma lavagem suave em PBS. Os LIPPCPO coletados foram então submetidos à extração de proteínas, digestão e análise dos constituintes proteicos nas coronas de superfície, com base em um método de proteômica estabelecido. As amostras de gel DMT1 foram cortadas em pedaços de 1 mm³ e incubadas com 300 µL de acetonitrila (ACN) por 5 min com agitação. Após liofilização, as amostras foram incubadas com solução de NaHCO₃ (80 µL, 50 mM) contendo 2 µg de tripsina a 37 °C por 12 h. As amostras de peptídeos digeridos foram dissolvidas em 100 µL de ACN a 10% contendo 0,1% de ácido fórmico (FA) e analisadas usando um espectrômetro de massas Easy nLC1200/Q Exactive+ (Thermo Fisher Scientific, EUA). A separação foi realizada em uma coluna C18 (0,15 mm × 150 mm, Column Technology Inc.) com 0,1% de FA em H₂O como fase móvel A e 0,1% de FA em ACN-H₂O (v/v, 84/16) como fase móvel B. A vazão da fase móvel foi ajustada para 300 nL/min, com um gradiente de 4% B a 50% B em 50 min, seguido de 50% B a 100% B em 4 min, e mantendo em 100% B por 6 min. As configurações de detecção por espectrometria de massas foram as seguintes: tensão do spray a 2,1 kV, temperatura do capilar a 275 °C, faixa de massa de 300–2000 m/z para MS e 200–2000 m/z para MS/MS. Os dados brutos de espectrometria de massas foram processados usando o Proteome Discoverer versão 2.4 (Thermo Fisher Scientific, EUA) e pesquisados no banco de dados de proteínas humanas UniProt (uniprotkb_Mus_musculus_55086_2023_12_19) usando o Mascot versão 1.5.5.1 (Matrix Science, Londres, Reino Unido). Os parâmetros de busca no banco de dados foram: Enzima: Tripsina, com no máximo 2 clivagens perdidas; Tolerância de massa do precursor: ±20 ppm; Tolerância de massa do fragmento: ±0,1 Da; Taxa de Falso Descobrimento (FDR) <1%.

Análise estatística
Todos os animais foram aleatoriamente atribuídos a cada grupo usando um método de randomização por lançamento de dados. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes, e nenhum dado foi excluído. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (DP) de pelo menos três réplicas. O teste t de Student bicaudal foi usado para analisar os dados, e as diferenças entre os grupos foram consideradas significativas se p < 0,05.

Sumário de relato
Informações adicionais sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Portfolio Reporting Summary vinculado a este artigo.

Informações suplementares
Dados de origem

Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Estes autores contribuíram igualmente: Jun Jiang, Lili Yang.

Informações suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41467-024-52312-7.
Contribuições dos autores
R.L. e S.L. conceituaram o projeto e projetaram os experimentos. Jun Jiang e L.Y. projetaram e realizaram a maioria dos experimentos. Q.X. construiu os lipossomos. X.L. construiu os lipossomos marcados com 125I e detectou a distribuição dos lipossomos marcados com 125I in vivo. J.Z. e S.Z. contribuíram para a detecção de ferro. Jie Jiang conduziu os experimentos de detecção de GSH. H.Z. construiu os organoides celulares. W.L. extraiu as células dos tecidos. X.C. realizou os experimentos de LC-MS. A redação do manuscrito foi liderada por R.L. com a participação de Jun Jiang.
Revisão por pares
Informações de revisão por pares
Nature Communications agradece a Morteza Mahmoudi e aos outros revisores anônimos por sua contribuição à revisão por pares deste trabalho. Um arquivo de revisão por pares está disponível.
Disponibilidade de dados
Os dados que suportam este manuscrito estão disponíveis no Harvard Dataverse (10.7910/DVN/Q7RHE7). Os dados de origem são fornecidos com este artigo.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Referências
Ferroptose: um nexo de morte celular regulada que liga metabolismo, biologia redox e doença
Ferroptose: morte por peroxidação lipídica
Ferroptose induzida por nanopartículas: métodos de detecção, mecanismos e aplicações
Direcionamento da ferroptose como uma vulnerabilidade no câncer
Engenharia de micro fábricas de oxigênio para retardar a progressão tumoral por meio de microambientes hiperóxicos
Bactérias comensais e fungos regulam diferencialmente as respostas tumorais à radioterapia
Dependência de um estado resistente à terapia de células cancerígenas em uma via de peroxidase lipídica
Células T CD8(+) regulam a ferroptose tumoral durante a imunoterapia do câncer
Células cancerígenas persistentes tolerantes a medicamentos são vulneráveis à inibição de GPX4
Ferroptose: uma forma de morte celular não apoptótica dependente de ferro
Pembrolizumabe com ou sem radioterapia para carcinoma de células não pequenas metastático: um ensaio randomizado de fase I/II
Ferroptose induzida por poluentes: um mecanismo emergente em toxicologia ambiental
A utilização de selênio pela GPX4 é necessária para prevenir a ferroptose induzida por hidroperóxido
FSP1 é um supressor de ferroptose independente de glutationa
Um eixo CoQ-FSP1 alvo dirige a ferroptose e a resistência à radiação em KEAP1
Radiação e bloqueio duplo de checkpoint ativam mecanismos imunes não redundantes no câncer
Nivolumabe em pacientes com carcinoma hepatocelular avançado (CheckMate 040): um ensaio aberto, não comparativo, de fase 1/2 de escalonamento e expansão de dose
Os mecanismos de resistência ao sorafenibe no carcinoma hepatocelular: base teórica e aspectos terapêuticos
A ferroptose induzida por erastina causa alterações fisiológicas e patológicas em tecidos saudáveis de camundongos
O agonista do receptor Toll-like 5, entolimode, suprime a metástase e induz imunidade ao estimular um eixo NK-dendrítico-célula T CD8+
Radioterapia externa para cânceres hepáticos primários: uma diretriz de prática clínica da ASTRO
HIV-1 gp120-induced endolysosome de-acidification leads to efflux of endolysosome iron, and increases in mitochondrial iron and reactive oxygen species
Radiotherapy for hepatocellular carcinoma results in comparable survival to radiofrequency ablation: a propensity score analysis
Vacancies on 2D transition metal dichalcogenides elicit ferroptotic cell death
Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance
Radiation therapy enhances immunotherapy response in microsatellite stable colorectal and pancreatic adenocarcinoma in a phase II trial
Brachytherapy in a single dose of 10Gy as an “in situ” vaccination
Application of radiotherapy before or during immunotherapy to enhance its efficacy in metastatic and recurrent liver cancer: a pilot study from the real-world data
Nano-enabled photosynthesis in tumours to activate lipid peroxidation for overcoming cancer resistances
Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease
Iron metabolism: an emerging therapeutic target underlying the anti-cancer effect
Radiotherapy combined with immunotherapy: the dawn of cancer treatment
Oral administration of ginger-derived lipid nanoparticles and Dmt1 siRNA potentiates the effect of dietary iron restriction and mitigates pre-existing iron overload in Hamp KO mice
Lysosomal iron recycling in mouse macrophages is dependent upon both LcytB and Steap3 reductases
Targeting iron metabolism in drug discovery and delivery
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A novel method to establish glucocorticoid resistant acute lymphoblastic leukemia cell lines
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