pmid: "39394878"
title: "Dihydroartemisinina sensibiliza células de câncer de pulmão ao tratamento com cisplatina através da regulação positiva da expressão de ZIP14 e indução da ferroptose."
authors: "Yang Z, Zhou Z, Meng Q, Chen Z, Yun L, Jiang J, He Y, Dian M, Zhang R, Ge H, Yan T, Men B, Li Z, Wu X, He J, Rao S"
journal: "Cancer medicine"
pubdate: "2024 Oct"
doi: "10.1002/cam4.70271"
source: "PMC Full Text"

Dihydroartemisinina sensibiliza células de câncer de pulmão ao tratamento com cisplatina através da regulação positiva da expressão de ZIP14 e indução da ferroptose.

Autores

Yang Z, Zhou Z, Meng Q, Chen Z, Yun L, Jiang J, He Y, Dian M, Zhang R, Ge H, Yan T, Men B, Li Z, Wu X, He J, Rao S

Periodico

Cancer medicine (2024 Oct)

Conteudo

Dihydroartemisinina Sensibiliza Células de Câncer de Pulmão ao Tratamento com Cisplatina ao Aumentar a Expressão de ZIP14 e Induzir Ferroptose
RESUMO
Contexto
Apesar dos avanços significativos no tratamento do câncer de pulmão, a quimioterapia baseada em cisplatina (DDP) continua sendo um pilar no manejo da doença. No entanto, a prevalência de quimiorresistência apresenta um grande desafio, limitando sua eficácia e contribuindo para resultados ruins. Isso ressalta a necessidade urgente de novas estratégias terapêuticas para superar a quimiorresistência e melhorar a eficácia da quimioterapia em pacientes com câncer de pulmão. Explorar abordagens para sensibilizar tumores à cisplatina pode melhorar as respostas ao tratamento e as taxas de sobrevida global.
Métodos e Resultados
Nosso estudo utilizou uma variedade de modelos de câncer de pulmão, incluindo linhagens celulares, modelos murinos e organoides derivados de pacientes, para validar os efeitos citotóxicos sinérgicos da dihydroartemisinina (DHA) e da cisplatina (DDP). Quando combinada com DDP, demonstramos que a DHA é um agente terapêutico promissor que desencadeia efetivamente a ferroptose em células de câncer de pulmão, oferecendo uma estratégia potencial para superar a quimiorresistência. Mecanisticamente, a combinação de DHA e DDP aumenta sinergicamente a expressão de ZIP14, modulando a homeostase do ferro e regulando positivamente o estresse oxidativo, levando à ferroptose tanto in vitro quanto in vivo. Notavelmente, nossos achados revelaram que a administração sequencial de DDP seguida por DHA aumenta significativamente a expressão de ZIP14 e induz resultados terapêuticos superiores em comparação com a administração simultânea ou DHA seguida por DDP. Essa observação ressalta a importância da ordem de administração dos medicamentos na otimização da eficácia do tratamento, fornecendo novos insights para melhorar a resposta à quimioterapia no câncer de pulmão.
Conclusão
Nossos achados sugerem que a combinação de dihydroartemisinina (DHA) com cisplatina (DDP) apresenta uma estratégia promissora para superar a quimiorresistência em pacientes com câncer de pulmão. Importante, a administração de DHA durante os intervalos da quimioterapia pode otimizar ainda mais os resultados do tratamento, aumentando a eficácia geral da quimioterapia para câncer de pulmão.
A combinação de dihydroartemisinina com cisplatina aumenta o teor de ferro ferroso intracelular ao aumentar a expressão de ZIP14, perturbando o estresse oxidativo celular e aumentando a sensibilidade das células de câncer de pulmão à ferroptose. Além disso, o tratamento sequencial de DDP seguido por DHA oferece resultados terapêuticos superiores.
Abreviaturas
CCK‐8
Cell Counting Kit‐8
DCFH‐DA
2′,7′‐diclorofluoresceína diacetato
DDP
cisplatina
DFO
mesilato de deferoxamina
DHA
dihydroartemisinina
MDA
malondialdeído
Necro
necrosulfonamida
ZVAD
Z‐VAD‐FMK
Introdução
O câncer de pulmão é o câncer mais comumente diagnosticado e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Apesar do notável progresso nas abordagens diagnósticas e terapêuticas, como a terapia molecular alvo e a imunoterapia, o câncer de pulmão continua altamente letal, principalmente devido à sua resistência aos tratamentos anticancerígenos e à progressão da doença. A quimioterapia continua sendo um pilar no tratamento do câncer de pulmão, especialmente para pacientes que não apresentam resposta à terapia alvo ou à imunoterapia, bem como para aqueles em estágios avançados com metástase à distância. No entanto, a aplicação clínica da quimioterapia é dificultada por seus efeitos colaterais graves, resultando frequentemente na descontinuação do tratamento e no desenvolvimento de resistência adquirida aos medicamentos. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novas estratégias terapêuticas que sejam ao mesmo tempo mais eficazes e menos tóxicas, com a capacidade de sensibilizar as células cancerígenas aos agentes quimioterápicos.
A ferroptose, uma forma regulada de morte celular impulsionada por espécies reativas de oxigênio (ERO) e acúmulo de ferro, apresenta uma via intrigante para superar os mecanismos de resistência nas células de câncer de pulmão, oferecendo assim uma nova abordagem terapêutica. A regulação da ferroptose depende principalmente do transporte de íons ferrosos ligados à transferrina (TBI) mediado por TFRC. No entanto, em certas circunstâncias, o transporte de ferro não ligado à transferrina (NTBI) mediado por ZIP14 também pode desempenhar um papel importante, levando ao aumento dos níveis intracelulares de ferro e subsequente geração de ERO. Portanto, a modulação da expressão de ZIP14 pode desempenhar um papel crítico no aumento da ferroptose, particularmente no contexto da quimioterapia.
O reposicionamento de medicamentos, que envolve a identificação de novas aplicações para fármacos aprovados ou testados clinicamente, oferece uma estratégia eficiente que reduz os prazos e custos de desenvolvimento, ao mesmo tempo que aproveita os perfis de segurança estabelecidos de medicamentos existentes. A dihidroartemisinina (DHA), derivada da medicina tradicional chinesa Artemisia annua, serviu principalmente como agente antimalárico e tem demonstrado promissor potencial antitumoral em vários tipos de câncer, incluindo o câncer de pulmão. Importante, relatos anteriores sugeriram o efeito antitumoral sinérgico da DHA em combinação com a cisplatina (DDP) no tratamento de vários tipos de câncer. Este estudo tem como objetivo investigar se a DHA poderia aumentar a sensibilidade das células de câncer de pulmão à terapia com DDP, e buscamos elucidar os mecanismos detalhados, especificamente como a DHA sinergiza com a DDP para induzir a morte celular das células de câncer de pulmão.

Resultados
DHA Demonstra um Efeito Citotóxico Sinérgico com DDP em Vários Tipos de Câncer de Pulmão
Utilizando a ferramenta online 3D Finder Synergy, calculamos os escores de sinergia de Loewe para avaliar o potencial sinérgico de diferentes combinações de medicamentos. A combinação de DHA e DDP apresentou um escore de sinergia de Loewe significativamente alto de 26,389, indicando um potente efeito antitumoral (Figura 1A). Para avaliar os efeitos tóxicos do DHA e do DDP, inicialmente determinamos os valores de concentração inibitória metade máxima (IC50) para DHA e DDP em células A549 e H1975, respectivamente. Ambos os compostos inibiram o crescimento de células de câncer de pulmão de maneira dose-dependente (Figura 1B). Interessantemente, a combinação de DHA e DDP suprimiu significativamente o crescimento (Figura 1C) e a formação de colônias (Figura 1D) de células de câncer de pulmão em comparação com a monoterapia com DHA ou DDP isoladamente. Além disso, o tratamento combinado de DHA e DDP demonstrou efeitos antitumorais superiores em organoides de câncer de pulmão humano (Figura 1E,F). Para investigar a eficácia terapêutica da combinação de DHA e DDP in vivo, estabelecemos um modelo de tumor subcutâneo em camundongos portadores de células de câncer de pulmão de Lewis. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos e tratados com veículo controle, DHA, DDP ou a combinação de DHA e DDP. Consistentemente, o efeito supressor de tumor foi mais pronunciado no grupo tratado com a combinação de DHA e DDP em comparação ao grupo de monoterapia com DHA ou DDP, sem efeitos tóxicos observados (Figura 1G–I). Esses achados sugerem que o DHA exibe um efeito citotóxico sinérgico com o DDP em diversas células de câncer de pulmão.
Efeito antitumoral sinérgico do DHA em combinação com DDP. (A) Mapa de sinergia 3D Finder ilustrando os escores de sinergia de Loewe entre DHA e DDP escore < −10, efeito antagônico, −10 < escore < 10, efeito aditivo, 10 > escore, efeito sinérgico. (B) Valores de IC50 para células A549 ou H1975 tratadas com DHA ou DDP, média ± DP, n = 6. (C) Células A549 ou H1975 foram incubadas com DHA (20 μM para A549 ou 40 μM para H1975) e DDP (10 μM) por 48 h, e a viabilidade celular foi subsequentemente medida em diferentes pontos de tempo usando o kit de ensaio CCK-8, média ± DP, n = 6. (D) O ensaio de formação de colônias de células A549 e H1975 foi conduzido sob condição de tratamento mono ou combinado com DHA (20 μM para A549 ou 40 μM para H1975) e DDP (10 μM) por 5 dias. (E) Imagens representativas de organoides de câncer de pulmão humano após tratamento com DHA (50 μM) e DDP (15 μM), isoladamente ou em combinação por 72 h. Painel superior: Antes do tratamento (40×), painel inferior: Após o tratamento (40×). (F) Organoides de câncer de pulmão foram tratados com DHA (50 μM) e DDP (15 μM) por 72 h, e sua viabilidade foi avaliada usando ensaio de ATP. Média ± DP, n = 6. (G) Xenoenxertos de células de câncer de pulmão de Lewis foram estabelecidos em camundongos C57BL/6 e tratados com controle (PBS), DHA (20 mg/kg), DDP (10 mg/kg), DHA (20 mg/kg) e DDP (10 mg/kg), respectivamente. O volume tumoral foi medido a cada 3 dias, média ± EPM, n = 5. (H) Análise do volume tumoral de (G) no dia 12, média ± EPM, n = 5. (I) Coloração representativa de Ki67 de amostras de tumor subcutâneo dos grupos controle, DHA, DDP e combinação tratados de (G). Barras de escala: 25 μm. *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001.
Combinação de DHA e DDP induz ferroptose em células de câncer de pulmão
Para entender a base molecular de como DHA e DDP sinergicamente matam células tumorais, realizamos uma análise de transcriptoma que revelou genes anotados para apoptose, necroptose e ferroptose enriquecidos nas células A549 tratadas com a combinação de drogas (Figura 2A). Usando diferentes inibidores moleculares pequenos, incluindo Z-VAD-FMK (Z-VAD, inibidor de apoptose), Necrossulfonamida (Necro, inibidor de necroptose) e Deferoxamina (DFO, agente quelante de ferro e inibidor de ferroptose), comprovamos que a ferroptose foi o principal subtipo de morte celular induzido por DHA e DDP (Figura 2B), uma descoberta adicionalmente apoiada pela análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) com nossos dados de RNA-seq (Figura S1A). Em seguida, avaliamos o nível de ferroptose em células com diferentes tratamentos medindo ROS e ferroso, o que indicou que a combinação de DHA e DDP aumentou significativamente os níveis de ROS e ferro ferroso em células de câncer de pulmão (Figuras 2C,D e S1B); no entanto, nem apoptose nem autofagia foram desencadeadas pelo tratamento com DHA e DDP (Figura S1E,F). Subsequentemente, determinamos o nível de proteína de indicadores-chave de ferroptose, incluindo GPX4, FTH1, TFRC e ACSL4 por meio de western blot, sugerindo que a ferroptose foi de fato ativada em células tratadas com DHA e DDP (Figura 2E). Importante, ao pré-tratar células com o inibidor de ferroptose DFO por 12 h, mostramos que o DFO reverteu efetivamente vários fenótipos ferroptóticos induzidos pelo co-tratamento com DHA e DDP em células de câncer de pulmão (Figuras 2F,G e S1C,D). Além disso, a administração de DFO diminuiu significativamente os efeitos supressores de tumor de DHA e DDP in vivo ao inibir a ferroptose (Figuras 2H–J e S1G,H).
O co-tratamento com DHA e DDP ativa sinergicamente a ferroptose e pode ser resgatado por DFO. (A) Gráfico de bolhas representando o enriquecimento da via da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dos Genes Diferencialmente Expressos (DEGs) em células A549 tratadas com ambos DHA (20 μΜ) e DDP (10 μΜ). (B) Células A549 ou H1975 foram incubadas com DHA (20 μM para A549 ou 40 μM para H1975) e DDP (10 μM) por 48 h, com vários inibidores de morte celular adicionados simultaneamente para avaliar seus efeitos na viabilidade celular. Média ± DP, n = 6. (C) A intensidade média de fluorescência de ROS intracelular em células A549 e H1975 tratadas com DHA (20 μΜ para A549 ou 40 μΜ para H1975) e DDP (10 μΜ) isoladamente ou em combinação por 48 h. Média ± DP, n = 3. (D) A intensidade média de fluorescência de ferro ferroso intracelular em células A549 e H1975 tratadas com DHA (20 μΜ para A549 ou 40 μΜ para H1975) e DDP (10 μΜ) isoladamente ou em combinação por 48 h. Média ± DP, n = 3. (E) Western blot foi utilizado para detectar a expressão das proteínas associadas à ferroptose em células A549 e H1975 tratadas com DHA (20 μΜ para A549 ou 40 μΜ para H1975) e DDP (10 μΜ) isoladamente ou em combinação por 48 h. (F) Citometria de fluxo foi utilizada para avaliar os níveis de ferro ferroso intracelular em células A549 e H1975 tratadas com DHA (20 μΜ para A549 ou 40 μΜ para H1975) e DDP (10 μΜ) com ou sem DFO (50 μΜ) por 48 h, as células foram pré-tratadas com DFO (50 μΜ) por 12 h, Média ± DP, n = 3. (G) Western blot foi utilizado para detectar a expressão das proteínas associadas à ferroptose em células A549 e H1975 tratadas com DHA (20 μΜ para A549 ou 40 μΜ para H1975) e DDP (10 μΜ) com ou sem DFO (50 μΜ) por 48 h, as células foram pré-tratadas com DFO (50 μΜ) por 12 h. (H) Xenoenxertos de células de câncer de pulmão de Lewis foram estabelecidos em camundongos C57BL/6 e tratados com Controle (PBS), DHA (20 mg/kg), DDP (10 mg/kg), DHA (20 mg/kg) e DDP (10 mg/kg), e DHA e DDP mais DFO (100 mg/kg). O volume do tumor foi medido a cada 3 dias, média ± EPM, n = 6. (I) Western blot foi utilizado para detectar as proteínas associadas à ferroptose em lisados isolados dos xenoenxertos em (H). (J) O conteúdo de MDA em homogenatos de tecido tumoral dos camundongos em (H), apresentado como média ± DP, n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ns, estatisticamente não significativo.
A Via de Ligação do Ferro ao Receptor de Transferrina (TBI) Pode Não Ser a Principal Via a Jusante Responsável pelo Acúmulo de Ferro Induzido pelo Tratamento Combinado com DHA e DDP.
Para investigar como o tratamento combinado de DHA e DDP induz ferroptose em células de câncer de pulmão, primeiro avaliamos alterações na via de ligação de ferro ao receptor de transferrina (TBI) que foi mediada pelas Proteínas do Receptor de Transferrina (TFRC) e STEAP3 (Figura 3A). TFRC, uma proteína de membrana da superfície celular, desempenha um papel crucial no transporte de íons férricos. Usando a tecnologia siRNA, silenciamos com sucesso TFRC em células de câncer de pulmão (Figura 3B), o que levou a uma restauração significativa da viabilidade celular e da expressão de GPX4 em células com TFRC silenciado tratadas com DHA e DDP combinados (Figura 3C,D). Além disso, a inibição de TFRC atenuou o acúmulo de ROS e ferro ferroso induzido pelo co-tratamento com DHA e DDP (Figura 3E,F), e a deficiência de TFRC também aumentou a resistência das células de câncer de pulmão ao tratamento com DHA ou DDP, respectivamente (Figura 3G). O docking molecular é uma técnica computacional usada para prever a afinidade de ligação e o modo de ligação de complexos moleculares receptor–fármaco, nossos dados de docking molecular sugeriram o potencial do DHA de se ligar ao TFRC (Figura S2A).
A expressão reduzida de TFRC promove tolerância à ferroptose induzida por DHA e DDP. (A) Diagrama esquemático mostrando como o receptor de transferrina capta ferro do ambiente extracelular. (B) Western blot foi utilizado para verificar a eficiência do silenciamento de TFRC por siRNA em células A549. (C) Avaliação da viabilidade de células A549 tratadas com DHA (20 μM) e DDP (10 μM) por 48 h após o silenciamento de TFRC pelo ensaio CCK-8, média ± DP, n = 3. (D) Western blot foi utilizado para detectar a expressão da proteína GPX4 em células A549 tratadas com DHA (20 μM) e DDP (10 μM) por 48 h após o silenciamento de TFRC. (E,F) Citometria de fluxo foi utilizada para avaliar as mudanças nos níveis de ROS (esquerda) e ferro ferroso (direita) em células A549 tratadas com DHA (20 μM) e DDP (10 μM) por 48 h após o silenciamento de TFRC. (G) Valores de IC50 de células A549 e H1975 tratadas com DHA ou DDP por 48 h após o silenciamento de TFRC. (H) Western blot foi utilizado para detectar a expressão da proteína STEAP3 em células A549 tratadas com tratamento mono ou combinado de DHA (20 μM) e DDP (10 μM) em diferentes pontos de tempo. ***p < 0,001.
Curiosamente, apesar do acúmulo de ferro ferroso nas células, STEAP3, a enzima chave na via de transporte TBI responsável por converter ferro trivalente em divalente dentro das células, foi significativamente regulada negativamente tanto em células tratadas com DHA ou DDP isoladamente, quanto em células tratadas com DHA e DDP combinados (Figura 3H). Esses achados sugerem que, embora ocorra acúmulo de ferro ferroso, a via TBI mediada por TFRC/STEAP3 pode não ser a principal via downstream responsável pelo acúmulo de ferro ferroso induzido pelo tratamento combinado de DHA e DDP.
ZIP14 é o Alvo Fundamental para Mediar os Efeitos Supressores de Tumor Sinérgicos Induzidos por DHA e DDP
Em nossa busca por explorar outros alvos envolvidos no efeito sinérgico de DHA e DDP, avaliamos as alterações transcricionais de genes-chave de transportadores de metais divalentes. Entre eles, apenas o ZIP14 apresentou regulação positiva notável em células tratadas com DHA e DDP, enquanto ZIP8 ou DMT1 não mostraram alterações significativas (Figura 4A). A coloração por imunofluorescência confirmou ainda a expressão aumentada de ZIP14 em células tratadas com DHA e DDP (Figura 4B). Além disso, experimentos de docking molecular sugeriram que o DHA possui um forte potencial de ligação com o ZIP14 (Figura S2B), e confirmamos ainda que o DHA pode se ligar diretamente à proteína ZIP14 usando o Ensaio de Deslocamento Térmico Celular (CETSA) (Figura S2C). Para validar o papel mecanístico do ZIP14, estabelecemos células com knockdown estável de ZIP14 (shZIP14) em células A549 e H1975. Análises de qPCR e FACs demonstraram eficiência robusta de knockdown de ZIP14 em células shZIP14 (Figuras 4D–F e S2D–F). Investigações subsequentes revelaram que a inibição de ZIP14 reduziu marcadamente a sensibilidade celular à administração concomitante de DHA e DDP (Figuras 4G e S2G), impedindo a ferroptose (Figuras 4H e S2H). Além disso, o aumento dos níveis de ROS e ferro ferroso em células controle (shNC) induzido pelo tratamento com DHA e DDP foi completamente abolido em células deficientes em ZIP14 (Figuras 4I e S2I), indicando que o ZIP14 é de fato o alvo fundamental da combinação de DHA e DDP.
A expressão diminuída de ZIP14 contribuiu para a tolerância à ferroptose induzida por DHA e DDP. (A) Análise de qPCR dos níveis de ZIP14, ZIP8 e DMT1 em células A549 tratadas com DHA (20 μM) e DDP (10 μM) isoladamente ou em combinação por 48 h, média ± DP, n = 3. (B) Imagem de imunofluorescência de ZIP14 (vermelho) e DAPI (azul) sob tratamento único ou combinado de DHA (20 μM) e DDP (10 μM) em células A549 por 48 h. Barras de escala: 100 μm. (C) Western blot foi usado para detectar a expressão das proteínas ZIP14 em células A549 e H1975 tratadas com DHA (20 μM para A549 ou 40 μM para H1975) e DDP (10 μM) isoladamente ou em combinação por 48 h. (D) O nível de mRNA de ZIP14 foi medido por qPCR após interferência de RNA usando shRNA em células A549, média ± DP, n = 3. (E) Western blot foi usado para detectar a expressão das proteínas ZIP14 em células A549 tratadas com shZIP14. (F) Os níveis de proteína ZIP14 associada à membrana em células A549 shNC ou shZIP14 foram medidos usando citometria de fluxo. (G) A viabilidade de células A549 shNC ou shZIP14 tratadas com DHA (20 μM) e DDP (10 μM) por 48 h pelo ensaio CCK-8, média ± DP, n = 3. (H) Western blot foi usado para detectar a expressão das proteínas associadas à ferroptose em células A549 shNC ou shZIP14 tratadas com DHA (20 μM) e DDP (10 μM) por 48 h. (I) Citometria de fluxo foi usada para avaliar as alterações nos níveis de ROS (esquerda) e ferro ferroso (direita) em células A549 shNC ou shZIP14 tratadas com DHA (20 μM) e DDP (10 μM) por 48 h. ***p < 0,001.
Administração Sequencial de DDP e DHA Exerce Efeito Antitumoral Superior
Como a ferroptose é ativada pelo cotratamento com DDP e DHA, investigamos como essa via de morte celular é regulada de forma dependente do tempo. Interessantemente, tanto o DHA quanto o DDP isoladamente poderiam afetar a expressão de FTH1 e TFRC em curto prazo (Figura 5A,B), mas essas alterações desapareciam quando o tempo de exposição aumentava. Em contraste, quando as células foram cotratadas com DHA e DDP, observamos ativação constante da ferroptose, conforme indicado pela expressão de FTH1 e TFRC (Figura 5C); além disso, a expressão de ZIP14 aumentou de forma estável com o prolongamento do tempo de tratamento (Figuras 5D e S3A), sugerindo que o efeito antitumoral da combinação de DDP e DHA foi mediado pelo aumento da expressão de ZIP14.
A administração sequencial de DDP e DHA apresenta diferenças terapêuticas. (A–C) Western blot foi utilizado para detectar a expressão de FTH1 e TFRC em células A549 e H1975 tratadas com DHA (20 μΜ) e DDP (10 μΜ) isoladamente ou em combinação em diferentes pontos de tempo. (D) Citometria de fluxo foi utilizada para detectar a expressão de ZIP14 em células A549 e H1975 tratadas com DHA (20 μM) e DDP (10 μM) em diferentes pontos de tempo. (E) Análise de viabilidade celular de células A549 e H1975 com diferentes combinações de tratamento de DHA (20 μM) e DDP (10 μM) conforme descrito na (Figura S3B), média ± DP, n = 6. (F) Western blot foi utilizado para detectar a expressão das proteínas associadas à ferroptose em células A549 e H1975 tratadas com cotratamento ou tratamento sequencial de DHA (20 μΜ para A549 ou 40 μΜ para H1975) e DDP (10 μΜ). (G) O diagrama esquemático ilustra a administração de fármacos e o desenho experimental para o modelo in vivo de câncer de pulmão de Lewis. (H) Xenoenxertos de células de câncer de pulmão de Lewis foram estabelecidos em camundongos C57BL/6 e tratados com Controle (PBS), DHA (20 mg/kg) e DDP (10 mg/kg) simultaneamente, ou DHA (20 mg/kg) e DDP (10 mg/kg) sequencialmente. O volume tumoral foi medido a cada 3 dias e apresentado como média ± EPM, n = 5. (I) Imagem representativa das amostras de tumor em (G) com o tratamento indicado. (J) Avaliação de MDA em homogenatos de tecido tumoral dos camundongos em (G) com o tratamento indicado, média ± DP, n = 3. (K,L) Citometria de fluxo foi utilizada para avaliar o nível de ferro ferroso e a expressão de ZIP14 em tecidos tumorais de camundongos com o tratamento indicado em (G), média ± DP, n = 3. (M) A expressão de proteínas relacionadas à ferroptose em tecidos tumorais de camundongos em (G) com o tratamento indicado foi detectada por western blot. *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,005.
Quando examinamos a expressão de FTH1, notamos que DHA e DDP tiveram efeito oposto na expressão de FTH1 (Figura 5A,B), sugerindo que seu efeito na exportação de ferritina poderia estar comprometido, o que poderia afetar a ativação da ferroptose. Para otimizar o efeito terapêutico, projetamos múltiplos regimes de dosagem por coaplicação de DHA e DDP (denominado DHA&DHP daqui em diante), aplicação sequencial de DHA e DDP (denominado DHA-DDP daqui em diante) ou DDP e DHA (denominado DDP-DHA daqui em diante) (Figura S3B). Surpreendentemente, o tratamento com DHA-DDP teve um efeito leve de eliminação de células tumorais, enquanto o tratamento com DDP-DHA alcançou o melhor efeito antitumoral em comparação com outros tratamentos. De fato, o tratamento com DDP-DHA induziu ferroptose mais profunda, evidenciada pela menor expressão de GPX4 e FTH1, bem como pela maior expressão de TFRC e ZIP14 (Figuras 5F e S3C,D). Os níveis de ferro ferroso e ROS também confirmaram que a ativação da ferroptose foi mais significativa nas células tratadas com DDP-DHA (Figura S3E,F). Em seguida, projetamos um experimento in vivo para avaliar o resultado terapêutico de DHA&DHP e DDP-DHA (DDP foi administrado primeiro e, em seguida, DHA foi administrado com intervalo de 24 h a cada 3 dias) (Figura 5G). Em linha com o ensaio de viabilidade celular, o tratamento com DDP-DHA suprimiu dramaticamente a progressão tumoral (Figura 5H) e a carga tumoral (Figura 5I) em camundongos em comparação com camundongos tratados com DHA&DHP. Além disso, avaliamos o nível de MDA, ferro ferroso e expressão de ZIP14 nos tecidos tumorais; todos esses indicadores foram significativamente maiores em camundongos tratados com DDP-DHA (Figura 5J–L); além disso, outros marcadores de ferroptose, incluindo GPX4, FTH1, ACSL4 e NCOA4, tiveram alterações mais significativas em camundongos tratados com DDP-DHA (Figura 5M). Todos esses resultados demonstram que a administração sequencial de DDP e DHA pode alcançar efeitos anticancerígenos superiores ao desencadear mais ferroptose.
Discussão
A quimioterapia continua sendo uma opção de tratamento indispensável para muitos pacientes com câncer de pulmão, especialmente quando outras terapias, como imunoterapia ou terapia direcionada, falham, apesar dos desafios inevitáveis de quimiorresistência e efeitos colaterais graves. Um desafio fundamental é desenvolver estratégias mais eficazes para aumentar a quimiossensibilidade, como modular a resposta ao dano ao DNA e a captação de medicamentos, ou direcionar vias importantes de proliferação celular. Recentemente, muitos estudos revelaram o papel da ferroptose na regulação da resposta e resistência a várias quimioterapias. Por exemplo, a doxorrubicina pode regular negativamente a GPX4, levando à ferroptose dependente de mitocôndrias em cardiomiócitos; o etoposídeo induz reprogramação metabólica celular, levando ao acúmulo de lactato no microambiente e causando resistência à ferroptose no câncer de pulmão de não pequenas células; a inibição de METTL17 em células de câncer colorretal interrompe a função mitocondrial e o metabolismo energético, aumentando assim os níveis intracelulares e mitocondriais de peroxidação lipídica e ROS durante o estresse de ferroptose.
Estudos anteriores mostraram que a combinação de DHA e DDP pode induzir a expressão de TFRC, aumentar a via de captação de ferro não ligado à transferrina (NTBI) mediada por TFRC e facilitar a ferroptose no adenocarcinoma ductal pancreático. No entanto, nosso estudo descobriu que o DHA aumenta significativamente os efeitos antitumorais da cisplatina em células de câncer de pulmão através da via de captação de ferro não ligado à transferrina (NTBI) mediada por ZIP14, o que foi diferente de descobertas anteriores que focam principalmente na captação de ferro mediada por TFRC. Nosso estudo demonstrou que a combinação de DHA e DDP aumenta sinergicamente a expressão de ZIP14, elevando assim os níveis intracelulares de ferro livre, perturbando a homeostase oxidativa e, finalmente, induzindo ferroptose em células de câncer de pulmão, destacando o potencial de ZIP14 como um candidato para superar a quimiorresistência ao regular a ferroptose.

Outro aspecto intrigante de nossas descobertas é que a sequência de administração dos medicamentos influencia a eficácia terapêutica. Especificamente, a administração sequencial de DDP seguida por DHA resultou em efeitos mais profundos de destruição tumoral em comparação com o uso concomitante desses agentes. Observação semelhante também é relatada em um estudo que indica que o tratamento sequencial do inibidor da histona desacetilase ácido valproico com etoposídeo pode aumentar a eficácia do medicamento na destruição de células de melanoma.

Muitos estudos mostraram que derivados de artemisinina combinados com quimioterapia podem induzir diversas vias de morte celular. Por exemplo, artesunato combinado com cisplatina pode afetar a expressão de Bcl-2, Bax e Caspase3/7, e regular sinergicamente a atividade da via P38/JNL/ERK1/MAPK; a artemisinina B pode ativar a via MAPK e aumentar a eficácia da cisplatina ao aumentar a expressão de Cx43 e elevar os níveis intracelulares de Fe2+ em células NSCLC normais e resistentes à DDP. Além disso, o artesunato pode matar células resistentes à cisplatina ao induzir a parada na fase G0/G1, regular a expressão de proteínas reguladoras do ciclo celular e causar danos ao DNA. Nossa pesquisa ressalta que DHA e DDP podem promover a ferroptose através da regulação mediada por ZIP14 do metabolismo do ferro e do estresse oxidativo. Vale notar que os mecanismos de resistência à quimioterapia são complexos e diversos, incluindo redução na captação de medicamentos e aumento do efluxo, reparo aprimorado de danos ao DNA e defeitos apoptóticos; se o tratamento combinado com DHA e DDP pode superar a quimiorresistência regulando esses processos requer investigação adicional.

A implicação clínica do nosso estudo é que, para pacientes com câncer de pulmão submetidos à quimioterapia baseada em cisplatina, a diidroartemisinina pode ser um suplemento custo-efetivo e eficiente para melhorar os resultados da quimioterapia ao induzir ferroptose nas células tumorais. Nosso estudo fornece uma base teórica para redirecionar a diidroartemisinina como um potencial candidato a medicamento para o tratamento do câncer de pulmão.

Materiais e Métodos
As linhagens celulares humanas de NSCLC A549 e H1975, bem como a linhagem celular de câncer de pulmão de camundongo Lewis, foram todas obtidas do China Center for Type Culture Collection (CCTCC). Essas linhagens celulares foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Todas as células foram confirmadas como livres de contaminação por micoplasma. Além disso, todas as culturas celulares foram mantidas a 37°C em uma incubadora umidificada sob uma atmosfera de 5% de CO2.
Reagentes e Anticorpos
Dihidroartemisinina (> 98%) e Cisplatina (> 98%) foram adquiridos da Macklin (Macklin, China). Z‐VAD‐FMK (HY‐16658B), Necrosulfonamida (HY‐100573) e Mesilato de Deferoxamina (HY‐B0988) foram adquiridos da MCE (Med Chem Express, Princeton, EUA). Anticorpo contra GPX4 (ab125066), STEAP3 (ab151566) e ACSL4 (ab155282) foram obtidos da Abcam. Anticorpo contra FTH1 (sc‐376,594) e NCOA4 (sc‐373,739) foram obtidos da Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Texas, EUA). Anticorpo contra TFRC (Cell Signaling, #13113S), LC3B (Cell Signaling, # 2775S) e P62 (Cell Signaling, # 5114S) foram obtidos da Cell Signaling (Cell Signaling Technology, Massachusetts, EUA). Anticorpo contra ZIP14 (Affinity, DF14224) foi obtido da Affinity (Affinity Biosciences, Jiangsu, China) para citometria de fluxo e imunofluorescência, enquanto o anticorpo contra ZIP14 (Abclonal, A10413) foi obtido da Abclonal (Wuhan, China) para western blot.
Ensaios de Viabilidade Celular
As células A549 e H1975 foram semeadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de 4000 células por poço. Após o tratamento medicamentoso, o meio de cultura original foi substituído, e 100 μL de meio contendo 10% do reagente Cell Counting Kit‐8 (NCM biotech, Jiangsu, China) foi adicionado a cada poço. Em seguida, as células foram incubadas em ambiente protegido da luz a 37°C por 1 h. A absorbância a 450 nm foi então medida para cada poço usando um leitor de microplacas, com o grupo controle branco como referência, permitindo o cálculo da viabilidade celular relativa e da taxa de inibição relativa. Finalmente, o GraphPad Prism (versão 8.0) foi utilizado para determinar os valores de concentração inibitória metade máxima (IC50) para cada grupo de medicamento.
Cultura de Organoides de Câncer de Pulmão e Ensaio de Viabilidade
Tecido fresco de câncer de pulmão de pacientes foi lavado, centrifugado, digerido e submetido à lise de glóbulos vermelhos. Células imunes e fibroblastos foram removidos. As células foram ressuspensas em Matrigel, e 10 μL foram semeados em uma placa de 48 poços. Após solidificação em uma incubadora a 37°C, meio primário adicional foi adicionado, e a incubação foi continuada. Um Kit de Ensaio de Viabilidade Celular 3D (G9681, Promega, Beijing, China) para detectar a viabilidade dos organoides foi utilizado. Consulte a literatura para seu princípio de funcionamento detalhado.
Ensaios de Formação de Colônias
Para o ensaio de formação de colônias com cultura em monocamada, as células (1 × 10⁴/poço) foram plaqueadas em uma placa de 6 poços por 1 semana até que as colônias estivessem claramente formadas. Após as células serem tratadas com DHA e/ou DDP por 5 dias, a placa foi fixada com metanol, suavemente lavada e corada com violeta cristal por 10 min, e então as colônias foram fotografadas e contadas.

Medição de Espécies Reativas de Oxigênio

O diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) (Dojindo, Kumamoto, Japão) foi utilizado para detectar os níveis intracelulares de EROs. Inicialmente, dilua o DCFH-DA em um meio de cultura livre de soro na proporção de 1:1000 para atingir uma concentração final de 10 μmol/L. Posteriormente, após o tratamento medicamentoso, o meio de cultura original das células A549 e H1975 foi removido, um volume apropriado de DCFH-DA diluído foi adicionado e incubado em ambiente protegido da luz a 37°C por 30 min. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS gelado para garantir a remoção completa da sonda fluorescente que não entrou nas células. Finalmente, seguindo as instruções do fabricante, a intensidade da fluorescência no canal FITC foi medida usando um citômetro de fluxo.

Medição de Ferro Ferroso

Para avaliar os níveis intracelulares de ferro ferroso em células de NSCLC após o tratamento medicamentoso, a sonda fluorescente FerroOrange (Dojindo, Kumamoto, Japão) foi empregada. Após três lavagens com PBS, as células foram incubadas com uma solução de trabalho de FerroOrange a 1 μM em uma incubadora a 37°C, 5% CO₂ por 30 min. Subsequentemente, a intensidade da fluorescência no canal PE foi detectada usando um citômetro de fluxo de acordo com as instruções do fabricante.

Ensaios de Malondialdeído (MDA)

Para a determinação de MDA, o tampão de lise de tecido RIPA (Beyotime Biotechnology, Jiangsu, China) foi usado para extrair proteína do tecido tumoral lisado para obter o sobrenadante proteico. A solução de trabalho foi preparada de acordo com as instruções do Kit de Ensaio de MDA para Peroxidação Lipídica (Beyotime Biotechnology, Jiangsu, China) e, após mistura completa, a absorbância foi medida a 532 nm usando um leitor de microplacas. Após o cálculo do conteúdo de MDA na solução da amostra, os níveis de proteína foram medidos usando o Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA (Beyotime Biotechnology, Jiangsu, China) e o conteúdo de MDA por unidade de concentração de proteína na amostra foi expresso.

Western Blot
Os lisados celulares totais foram extraídos em tampão RIPA (Beyotime Biotechnology, Jiangsu, China) no gelo por 10 min. A concentração de proteínas foi quantificada usando o Kit de Ensaio de Proteína BCA (Beyotime Biotechnology, Jiangsu, China). Em seguida, quantidades iguais de proteínas foram separadas por SDS-PAGE a 8%, 10% e 12% e transferidas para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% por 1 h à temperatura ambiente e incubadas com os anticorpos primários a 4°C durante a noite. Após isso, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários à temperatura ambiente por 1 h e, em seguida, lavadas três vezes com TBST. As bandas de proteínas foram visualizadas usando um kit de detecção de quimioluminescência ECL-Plus.
Ensaio de Deslocamento Térmico Celular (CETSA)–Western Blot (WB)
O lisado de proteínas solúveis de células A549 e H1975 foi aliquotado em tubos de PCR e tratado com DHA (200 μmol/L) ou DMSO por 1 h à temperatura ambiente antes de passar pelo pulso de calor do CETSA. As amostras foram então aquecidas nas temperaturas indicadas (35°C–60°C) por 5 min, seguidas de resfriamento a 4°C por 3 min em um termociclador Thermo Scientific (Thermo Fisher Scientific, EUA). Após centrifugação a 12.000 rpm por 10 min a 4°C, o sobrenadante solúvel foi submetido à análise de western blot.
Extração de RNA e Análise por PCR em Tempo Real
O RNA total foi preparado a partir de células usando o reagente Trizol (Takara, Shiga, Japão), de acordo com um protocolo modificado fornecido pelo fabricante. A qualidade do RNA foi medida usando o espectrofotômetro NanoDrop ND-1000. Após a transcrição reversa, os níveis de expressão de RNA foram examinados por PCR quantitativa (qPCR) em triplicata no sistema LightCycler 480 Real Time PCR (Roche) usando o SYBR Green Real-Time PCR Master Mix (Takara, Shiga, Japão) (Tabela 1).
Os iniciadores usados para qPCR.
Iniciadores Sequência Primer forward ZIP8 CTGTCAGAAATAGGGACGA Primer reverse ZIP8 AAGTTGAATAGCAAGGCTT Primer forward DMT1 TCCTCTGTGGGGTGGCGTT Primer reverse DMT1 CCTGGCTCTGGCTGGGTTT Primer forward ZIP14 ACCCTCTACTCCAACGCCC Primer reverse ZIP14 CGCTGTTGAAGTGTGGGGA Primer forward Actina GTGACAGCAGTCGGTTGGA Primer reverse Actina AGTGGGGTGGCTTTTAGGA
Modelo Tumoral In Vivo
Selecionar camundongos C57BL/6 com idade média de aproximadamente 6 semanas (adquiridos do Centro de Animais Experimentais da Southern Medical University). Inicialmente, células Lewis adequadamente cultivadas são processadas, lavadas duas vezes com PBS gelado e, em seguida, suspensas em solução salina fisiológica para ajustar a densidade celular para 4 × 10⁶ células/mL. Posteriormente, 125 μL da suspensão celular são inoculados no abdômen direito de cada camundongo. Assim que o tamanho do tumor atinge cerca de 70 mm³, os camundongos são distribuídos aleatoriamente em grupos e recebem tratamentos: controle (PBS, i.p.), DHA (20 mg/kg, i.g.), DDP (2 mg/kg, i.p.), DHA combinado com DDP, e a combinação com DFO (100 mg/kg, i.p.).
Transfecção Celular
As sequências do siRNA direcionado ao TFRC e do shRNA direcionado ao ZIP14 estão listadas na Tabela 2. Todos os siRNA e shRNA foram sintetizados pela Tsingke Biotechnology (Tsingke Biotechnology, Pequim, China). Para obter um knockdown estável do ZIP14, utilizamos o sistema vetorial pLKO.1‐puro, um vetor lentiviral comumente usado para entrega de shRNA. Após a transdução com o lentivírus expressando shRNA, as células foram selecionadas com puromicina para estabelecer linhagens de knockdown estável. Para o knockdown transitório do TFRC, empregamos o Lipofectamine RNAiMAX como reagente de transfecção. O siRNA foi transfectado nas células a uma concentração final de 20 nM de acordo com as instruções do fabricante, e as células foram incubadas com a mistura de transfecção por 72 h para obter um silenciamento gênico eficaz.
As sequências de (siTFRC) direcionado ao TFRC e (shZIP14) direcionado ao ZIP14.
Nome Sequências siTFRC Sentido: 5′‐GGAUUCCUGAGUUGAACAA‐3′ Antissentido: 5′‐UUGUUCAACUCAGGAAUCC‐3′ shZIP14 Sentido: 5′‐GGAACCTCTCCACGTGCTTTA‐3′ Antissentido: 5′‐TAAAGCACGTGGAGAGGTTCC‐3′
Análise Estatística
Todos os cálculos estatísticos foram realizados utilizando GraphPad Prism (versão 8.0). Os dados quantitativos foram expressos como média ± DP ou média ± EPM. As diferenças entre dois grupos foram realizadas usando o teste t de Student. Comparações entre múltiplos grupos foram analisadas por ANOVA de uma via. A significância estatística foi definida em *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001.
Contribuições dos Autores
Zhuoying Yang: curadoria de dados (igual), redação – rascunho original (igual). Zehao Zhou: metodologia (igual). Qingyu Meng: aquisição de financiamento (igual). Zhijie Chen: metodologia (igual). Liang Yun: recursos (igual). Jianjun Jiang: software (igual). Yujing He: software (igual). Meijuan Dian: metodologia (igual). Ruihao Zhang: software (igual). Haotian Ge: metodologia (igual). Tianbao Yan: software (igual). Biying Men: metodologia (igual). Zichao Li: metodologia (igual). Xu Wu: aquisição de financiamento (igual). Junming He: aquisição de financiamento (igual), recursos (igual). Shuan Rao: conceituação (liderança), aquisição de financiamento (liderança), redação – rascunho original (liderança).
Declaração de Ética
Todos os procedimentos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê Interno de Cuidado e Uso de Animais do Comitê de Pesquisa Animal do Hospital Nanfang da Universidade Médica do Sul (números de aprovação para experimentos animais: IACUC‐LAC‐20220926‐001). O Comitê de Ética e o Comitê de Pesquisa Animal do Hospital Nanfang da Universidade Médica do Sul aprovaram este estudo (NFEC‐2021‐250). Todos os experimentos neste estudo estavam em conformidade ética. As amostras de tecido de câncer de pulmão derivadas de pacientes e os tecidos embebidos em parafina foram obtidos do departamento de Torácica do Hospital Nanfang com o consentimento informado por escrito dos pacientes.
Consentimento
Os autores não têm nada a relatar.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Informações de Apoio
Declaração de Disponibilidade de Dados
Todos os dados e materiais gerados durante este estudo estão incluídos neste artigo ou nos arquivos de informações suplementares.
Referências
A Carga Global do Câncer de Pulmão: Estado Atual e Tendências Futuras
Avanços e Desafios no Tratamento do Câncer de Pulmão
Rumo a Abordagens de Tratamento Personalizado para o Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas
Mecanismos de Resistência Adquirida a Drogas Tumorais
Impacto do Metabolismo do Câncer na Resistência à Terapia—Implicações Clínicas
Imunoterapia do Câncer de Pulmão: Progresso, Armadilhas e Promessas
Sistema de Codministração de Nano-Drogas de Ingredientes Ativos Naturais e Drogas Quimioterápicas para o Tratamento do Câncer: Uma Revisão
Ferroptose: Mecanismos e Implicações para o Desenvolvimento do Câncer e Resposta à Terapia
Mecanismos Moleculares da Quimiorresistência Induzida por Cisplatina na Terapia do Câncer de NSCLC
Ferroptose: Mecanismos, Biologia e Papel na Doença
Ferroptose: Mecanismos Moleculares e Implicações para a Saúde
Ferroptose na Terapia do Câncer: Uma Abordagem Inovadora para Reverter a Resistência a Drogas
Ferroptose, Uma Nova Forma de Morte Celular: Oportunidades e Desafios no Câncer
Transportadores de Ferro Não Ligados à Transferrina
O Transportador de Íons Metálicos da Membrana Plasmática ZIP14 Contribui para a Captação de Ferro Não Ligado à Transferrina por Células β Humanas
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Artesunato Prejudica o Crescimento em Células de Câncer de Bexiga Resistentes à Cisplatina por Parada do Ciclo Celular, Indução de Apoptose e Autofagia
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Fibroblastos Associados ao Câncer Promovem Trombose Venosa Através da Interação Podoplanina/CLEC‐2 em Modelo de Câncer de Pulmão com Podoplanina Negativa em Camundongos