pmid: "40787732"
title: "A eficácia da terapia multimodal baseada em hipertermia depende da proteína gatekeeper, BID."
authors: "Helmueller S, Song X, Kim DH, Lee YJ"
journal: "International journal of hyperthermia : the official journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group"
pubdate: "2025 Dec"
doi: "10.1080/02656736.2025.2544017"
source: "PMC Full Text"

A eficácia da terapia multimodal baseada em hipertermia depende da proteína gatekeeper, BID.

Autores

Helmueller S, Song X, Kim DH, Lee YJ

Periodico

International journal of hyperthermia : the official journal of European Society for Hyperthermic Oncology, North American Hyperthermia Group (2025 Dec)

Conteudo

A eficácia da terapia multimodal baseada em hipertermia é dependente da proteína gatekeeper, BID

Objetivos:
A combinação do agente ferroptótico artesunato (ART) e do agente apoptótico rhTRAIL (ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral humano recombinante) demonstrou aumentar sinergicamente a apoptose em várias linhagens de células cancerígenas por meio da interação entre a resposta ao estresse do retículo endoplasmático (RE), a via extrínseca do receptor de morte celular induzida por rhTRAIL e a via intrínseca de apoptose dependente de BID-Bax-mitocôndria. Essa interação sinérgica demonstrou ser eficaz em múltiplos tipos de linhagens de células cancerígenas, tornando o artesunato combinado com rhTRAIL uma promissora terapia de segunda linha para pacientes com câncer de cólon após cirurgia citorredutora e tratamentos quimioterápicos. Para aumentar ainda mais o efeito tumoricida da terapia de segunda linha, foi desenvolvida uma terapia multimodal combinando artesunato, rhTRAIL e condições hipertérmicas, onde as amostras foram tratadas a 42°C por 1h.
Métodos:
Os efeitos dessa terapia foram testados em modelos celulares de carcinoma de cólon humano HCT116 e adenocarcinoma pancreático BxPC-3. Os efeitos citotóxicos e sinérgicos foram analisados por microscopia de fluorescência, ensaios de sobrevivência celular e análise de proteínas por Western blotting.
Resultados:
Nossos achados demonstraram um aumento significativo da apoptose quando os tratamentos com artesunato e rhTRAIL foram combinados com exposição ao calor. O efeito sinérgico e apoptótico dos agentes foi efetivamente abolido em células deficientes em BID e do tipo mutante de BID, bem como em células deficientes em Bax, mas não em células deficientes em Bak.
Conclusões:
Os resultados sugerem que BID atua como uma molécula gatekeeper chave da apoptose durante o tratamento multimodal baseado em hipertermia. Essas descobertas levantam questões importantes sobre os mecanismos subjacentes da apoptose induzida pelo calor e seu envolvimento na orquestração de várias vias de estresse celular.
Introdução
A carcinomatose peritoneal colorretal (CPC) é a segunda doença cancerosa mais prevalente a afetar a cavidade peritoneal, após o câncer colorretal, e é considerada uma condição letal com prognóstico ruim. No passado, a CPC era considerada um estágio terminal da doença, para o qual o tratamento paliativo era a única opção. No entanto, a hipertermia tem sido usada com sucesso juntamente com a quimioterapia em pacientes com CPC após cirurgia citorredutora (CRS). O tratamento térmico, aplicado entre 40 e 44°C por 1–2 h, induz estresse celular in vivo, direcionando efetivamente os ambientes tumorais devido às suas características fisiológicas distintas, como baixo pH e hipóxia. Além disso, os tratamentos térmicos podem aumentar a atividade citotóxica e de espécies reativas de oxigênio (ERO), tornando as células cancerígenas mais vulneráveis a terapias de segunda linha com danos mínimos às células normais. Na clínica, métodos de hipertermia local, como a Quimioterapia Intraperitoneal Hipertérmica (HIPEC), são comumente usados para cânceres abdominais e de cólon, onde a quimioterapia aquecida é bombeada para a área alvo. Ensaios clínicos indicam que combinar hipertermia com radiação e quimioterapia produz melhores resultados do que qualquer tratamento isolado. No entanto, embora a CRS combinada com HIPEC tenha melhorado as taxas de resposta, as recuperações completas permanecem raras e a recorrência do câncer ainda é comum. Portanto, é necessária uma estratégia aprimorada para melhorar a eficácia da CRS e da HIPEC.
Com base nos sucessos da CRS e da HIPEC, exploramos uma terapia multimodal baseada em hipertermia (rhTRAIL + artesunato) como tratamento de segunda linha para eliminar tumores microscópicos após a CRS e reduzir as chances de recorrência do câncer. Nossa pesquisa anterior demonstrou os efeitos sinérgicos do artesunato (ART) e do rhTRAIL (ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral) no aumento da apoptose em linhagens celulares cancerígenas. O rhTRAIL induz apoptose ao se ligar aos receptores de morte 4 e 5 (DR4 e DR5) nas células cancerígenas sem afetar células normais in vivo. O artesunato, um medicamento antimalárico, atua como um forte agente ferroptótico, bem como um agente apoptótico fraco, gerando ERO e induzindo peroxidação lipídica dependente de ferro, o que ativa a resposta de estresse do retículo endoplasmático (RE) e promove a apoptose dependente de mitocôndrias. Em nossos estudos, o ART potencializou a apoptose induzida por rhTRAIL por meio da comunicação cruzada entre a via mitocondrial mediada pelo estresse do RE e a via apoptótica mitocondrial dependente de BID-Bax. Embora tivéssemos observado anteriormente uma eficácia tumoricida aumentada com a combinação de rhTRAIL e hipertermia, o efeito do aquecimento das células ao adicionar ART ao rhTRAIL não havia sido testado. Outros estudos destacaram o papel da hipertermia no aumento da apoptose induzida por rhTRAIL em células cancerígenas por meio da ativação de caspases e da via apoptótica dependente de mitocôndrias e BID-Bax. Da mesma forma, o calor combinado com cisplatina mostrou efeitos sinérgicos em células de câncer de próstata, e, em outro estudo, a Withaferina A potencializou a apoptose induzida por hipertermia. Com base em nossas descobertas anteriores e na literatura publicada, levantamos a hipótese de que os efeitos sinérgicos do ART e do rhTRAIL poderiam ser ainda mais potencializados sob condições hiperférmicas.
Neste estudo, observamos que um tratamento multimodal baseado em hipertermia com ART e rhTRAIL aumentou significativamente a apoptose em linhagens celulares cancerígenas em comparação com qualquer tratamento isolado. Curiosamente, o calor combinado com ART aumentou significativamente a citotoxicidade e a morte celular, um resultado não encontrado com o tratamento apenas com ART. Essas descobertas levantaram questões sobre os mecanismos subjacentes ao estresse celular e à citotoxicidade induzidos pela hipertermia. Primeiro, investigamos a apoptose como o mecanismo de morte celular durante o tratamento multimodal potencializado por hipertermia, Em seguida, exploramos os papéis que as proteínas de choque térmico e a Caspase-2 desempenham em um tratamento multimodal baseado em hipertermia. Por fim, identificamos que a via dependente de mitocôndrias associada a BID e Bax desempenha um papel crucial na regulação dos efeitos do tratamento multimodal baseado em hipertermia.
Materiais e métodos
Linhagens celulares e condições de cultivo celular
Células HCT116 de carcinoma colorretal humano e células BxPC-3 de câncer pancreático humano foram previamente obtidas da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Células HCT116 deficientes em BID (BID−/−) expressando de forma estável o vetor BID D60E ou G94E (BID−/−/D60E ou BID−/−/G94E) foram fornecidas pelo Dr. Luo (University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE). Células HCT116 deficientes em Bak (Bak−/−), deficientes em Bax (Bax−/−) e duplo nocaute Bax/Bak (Bax−/− Bak−/− DKO) foram fornecidas pelo Dr. B. Vogelstein (Johns Hopkins University, Baltimore, MD). As linhagens celulares foram mantidas nos meios listados: células HCT116 em McCoy’s 5 A e células BxPC-3 em Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 suplementado com 2mM de glutamina. Todas as linhagens celulares foram mantidas com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina e incubadas em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37°C.
Produtos químicos e reagentes
Para a produção de TRAIL recombinante humano (rhTRAIL), um fragmento de cDNA de TRAIL humano (aminoácidos 114–281) obtido por RT-PCR foi clonado em um plasmídeo pET-23d (Novagen, Madison, WI), e a proteína TRAIL marcada com His foi purificada usando o sistema de purificação de proteínas Qiagen express (Qiagen, Valencia, CA, EUA). Artesunato foi adquirido da Sigma-Aldrich (Cat#A3731–100MG).
Estudo de morfologia celular
Células HCT116 e BxPC-3 foram tratadas com ART e/ou calor e/ou rhTRAIL e observadas sob um microscópio de fase ECHO Revolve (ECHO, San Diego, CA, EUA) no modo de campo claro.
Ensaio de morte celular e viabilidade
A morte celular foi medida usando o ensaio de exclusão de azul de tripano para detectar a integridade da membrana plasmática das células. Após 20 h de tratamento com ART, as células HCT116 foram tratadas com rhTRAIL, algumas foram colocadas em banho-maria quente (42°C) por 1h, e depois na incubadora a 37°C por mais 3 horas. Para quantificar a porcentagem de morte celular, imediatamente após o tratamento, as células foram tripsinizadas e coradas com azul de tripano a 0,4%, seguidas de contagem usando o Contador Automatizado de Células LUNA™ (L10001, Logos Biosystem, Anyang, Gyeonggi-do, Coreia do Sul) de acordo com as instruções do fabricante. Os autores reconhecem as limitações deste método, particularmente em distinguir a permeabilidade precoce da membrana da perda de longo prazo da capacidade proliferativa. No entanto, este método foi selecionado devido à sua eficiência e viabilidade, dadas as múltiplas condições de tratamento, pontos de tempo e réplicas biológicas incluídas no estudo. As células foram analisadas imediatamente após o término do tratamento multimodal. Isso nos permitiu avaliar de forma consistente e rápida a viabilidade em uma ampla estrutura experimental. Continuamente, dada a natureza sensível ao tempo e comparativa dos experimentos deste artigo, essa abordagem nos permitiu avaliar eficientemente a citotoxicidade diferencial.
Western blotting e anticorpos
O immunoblotting foi realizado conforme descrito anteriormente. Os seguintes anticorpos foram utilizados neste estudo: anti-PARP-1 (#9532), anti-caspase-3 (#9668), anti-caspase-8 (#9746), anti-caspase-9 (#7237), anti-caspase-2 (#2224), anti-HSP70 (#4872), anti-HSP90 (#4877), anti-Bax (#2772), anti-Bak (#3814) e anti-BID (#2003) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); e anti-actina, IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano (HRP) e IgG de cabra anti-camundongo conjugado com HRP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA).

Análise estatística
A análise estatística foi realizada utilizando análise de variância (ANOVA) de uma e duas vias, seguidas pelo teste de comparações múltiplas de Sidak ou Tukey, conforme indicado, usando o software GraphPad Prism 8. Valores de P menores que 0,05 foram definidos como estatisticamente significativos. Os valores de P são indicados da seguinte forma: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Consulte a Tabela 1 para valores de P e dados de significância.

Análise do Índice de Combinação
A análise do índice de combinação (CI) foi realizada usando o software CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ, EUA). O CompuSyn é um software confiável e amplamente utilizado, desenvolvido pela Dra. Dorothy Chu em 2005 para calcular o Índice de Combinação (CI) para múltiplos tratamentos medicamentosos, doses e combinações; portanto, foi uma escolha ideal para nosso estudo que investiga tratamentos multimodais usando concentrações variáveis de ART e rhTRAIL, com ou sem calor. O software é baseado no princípio do efeito mediano da lei da ação das massas e na equação do índice de combinação, oferecendo uma abordagem simplificada para a análise farmacodinâmica. A equação do efeito mediano (MEE) quantifica as relações dose-efeito usando dois parâmetros-chave: a dose do efeito mediano (Dm), indicando potência, e a inclinação (m), refletindo a forma da curva dose-resposta. A equação do índice de combinação (CIE) estende este modelo para classificar as interações medicamentosas como sinérgicas (CI < 1), aditivas (CI = 1) ou antagônicas (CI > 1). Diferentemente dos métodos tradicionais que exigem dados extensos e ajuste de curvas, o CompuSyn usa uma abordagem "Top Down" que requer menos pontos de dose e aproveita parâmetros de referência internos para simulações preditivas. Em nosso estudo, a extensão do antagonismo/sinergismo foi determinada usando o software descrito acima, para calcular o valor de CI de cada combinação de tratamento. Um valor de CI acima de 1 sugere antagonismo entre os medicamentos, enquanto valores de CI abaixo de 1 indicam sinergia. Valores de CI na faixa de 0,9–1,10 indicam principalmente efeitos aditivos; aqueles entre 0,9–0,85 sugerem sinergia leve; aqueles na faixa de 0,7–0,3 indicam sinergia moderada; e aqueles menores que 0,3 sugerem sinergia forte. Consulte a Tabela 2 para um resumo dos dados de CI.

Análise densitométrica
A quantificação densitométrica das bandas de Western blot foi realizada usando o software de análise ImageJ. Para cada blot, o perfil de densidade das bandas individuais foi gerado e as áreas de pico foram medidas usando a ferramenta de análise de gel. Os valores de densidade integrada correspondentes à PARP-1 clivada e à PARP-1 de comprimento total foram usados para calcular sua razão relativa. Uma razão maior de PARP-1 clivada para PARP-1 de comprimento total foi interpretada como um indicador de aumento da atividade apoptótica. Todas as medidas densitométricas foram normalizadas em relação aos controles de carregamento correspondentes (ex: β-actina) calculando um fator de normalização e aplicando esse fator aos dados da PARP-1 para compensar possíveis variações no carregamento e transferência de proteínas.
Ensaio de anexina V
A anexina V detecta e se liga a um fosfolipídio localizado na membrana celular externa em células apoptóticas. Células HCT116 do tipo selvagem e BxPC-3 foram plaqueadas em placas de cultura de células de 12 poços. Após 20 h de tratamento com ART, as células foram tratadas com rhTRAIL; algumas foram colocadas em banho-maria a 42°C por 1 h e, em seguida, na incubadora a 37°C por mais 3 h. Após o tratamento, as células foram lavadas uma vez com PBS. Tampão de ligação, corante iodeto de propídio (PI) e misturas de reação de anexina V foram adicionados às amostras e incubados a 37°C por 20 min no escuro, usando o Kit de Detecção de Apoptose Anexina V-FITC/PI (MedChem Express, Cat#HY-K1073), seguindo as instruções do fabricante. Após a incubação, as células foram lavadas uma vez com PBS. O corante Hoechst foi então adicionado diluindo-se a solução estoque 1:2000 em PBS, seguido de incubação à temperatura ambiente por 10 min no escuro. Após lavar novamente com PBS, um microscópio de fluorescência ECHO foi usado para capturar imagens. A anexina V-FITC cora de verde sob um microscópio de fluorescência, indicando células em estágios iniciais de apoptose, enquanto o corante PI ilumina em vermelho sob um microscópio de fluorescência, indicando células em estágios tardios de apoptose.
Ensaio TUNEL
A detecção de apoptose foi realizada usando o método de marcação de terminais dUTP por desoxinucleotidil transferase (TUNEL). Células HCT116 do tipo selvagem foram plaqueadas em placas de 12 poços. Após 20 h de tratamento com ART, as células foram tratadas com rhTRAIL; metade das amostras foi colocada em banho-maria a 42°C por 1 h e, em seguida, na incubadora a 37°C por mais 3 h. Após o tratamento, as células foram lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS). A mistura de reação TUNEL foi adicionada às amostras e incubada a 37°C por 1 h no escuro, usando o Kit de Detecção de Morte Celular In Situ, Fluoresceína (Roche, Cat#11684795910), seguindo as instruções do fabricante. As células foram então lavadas uma vez com PBS; o corante Hoechst foi então adicionado diluindo-se a solução estoque 1:2000 em PBS, seguido de incubação à temperatura ambiente por 10 min no escuro. As células foram então lavadas novamente com PBS e examinadas sob um microscópio de fluorescência ECHO.
Ensaio JC-1
O corante JC-1 (sonda de potencial de membrana mitocondrial, ThermoFisher Scientific, Cat#T3168) foi utilizado para analisar o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) das células após o tratamento multimodal. Células HCT116 em uma placa de 12 poços foram tratadas por 20h com ART e, em seguida, tratadas com rhTRAIL. Imediatamente, algumas amostras foram colocadas em banho-maria aquecido (42°C) por 1h, e depois na incubadora a 37°C por mais 3 horas. Após o tratamento, as células foram coradas com corante JC-1 conforme as instruções do fabricante. Após a incubação com o corante JC-1, as células foram lavadas com PBS. O corante Hoechst foi então adicionado diluindo-se a solução estoque 1:2000 em PBS, seguido de incubação à temperatura ambiente por 10min no escuro. Após nova lavagem com PBS, um microscópio de fluorescência ECHO foi utilizado para capturar as imagens.

Análise da intensidade média de fluorescência
Para análise de citotoxicidade usando dados de imunofluorescência, a Intensidade Média de Fluorescência (MFI) das imagens capturadas durante a coloração com Anexina V, JC-1, TUNEL e Hoechst foi calculada usando o software ImageJ. Após usar a função “Image”<“Color”<”Split Channels”, as imagens originais foram divididas em canais RGB e analisadas em escala de cinza. Em seguida, os valores de MFI foram medidos em três campos selecionados aleatoriamente para cada condição experimental. Para a quantificação da MFI do JC-1, as MFIs do JC-1 Vermelho, JC-1 Verde e Hoechst foram quantificadas usando o software ImageJ. A razão JC-1/Hoechst foi obtida dividindo-se a MFI do JC-1 Vermelho ou Verde pela MFI do Hoechst em cada campo. Para os ensaios de TUNEL e Anexina V, a análise de MFI foi realizada da mesma maneira. Na análise do ensaio de Anexina V, a MFI da Anexina V (Canal Verde - apoptose precoce), da coloração PI (Canal Vermelho - apoptose tardia) e da coloração Hoechst foi quantificada usando ImageJ, e então a razão Anexina V/Hoechst ou a razão PI/Hoechst foram obtidas conforme descrito e calculadas a média sobre amostras em triplicata. Para o ensaio TUNEL, novamente, as MFIs das colorações TUNEL e Hoechst foram quantificadas usando o software ImageJ. A razão TUNEL/Hoechst foi obtida dividindo-se a MFI do TUNEL pela MFI do Hoechst e o valor resultante é a média de três amostras.

Resultados

A terapia combinada potencializa os efeitos citotóxicos e apoptóticos
Para avaliar os efeitos da hipertermia na interação sinérgica entre artesunato (ART) e rhTRAIL, primeiro examinamos as alterações morfológicas em células de carcinoma humano HCT116 e células de adenocarcinoma pancreático BxPC-3 tratadas. As células foram tratadas com 5 ou 10 μM de ART, com ou sem 1 ou 2 ng/mL de rhTRAIL, e metade das amostras foi aquecida a 42°C por 1h. A Figura 1(A) (morfologia) e 1B (citotoxicidade) mostra que o calor sozinho induz efeito mínimo, mas em combinação com ART e/ou rhTRAIL, ele potencializa a morte celular, evidenciada pelo aumento do blebbing e descolamento celular em ambas as células HCT116 e BxPC-3.
Para avaliar ainda mais os efeitos citotóxicos do tratamento multimodal, a coloração com Azul de Tripan foi realizada para avaliar a perda de integridade da membrana e quantificar a morte celular (Figura 1(C)). Além disso, a análise de immunoblot foi conduzida para examinar a apoptose através da detecção da clivagem de PARP-1 e da clivagem (ativação) de caspases, ambas características marcantes da morte celular apoptótica (Figura 1(D,E)). A porcentagem de morte celular e os resultados de Western Blot mostram que ART sozinha induz citotoxicidade mínima, mas quando combinada com calor, a citotoxicidade e a clivagem de PARP-1 são significativamente aumentadas. O mesmo efeito é observado com rhTRAIL, onde a adição de calor aumenta a citotoxicidade e a clivagem de PARP-1 em comparação com rhTRAIL sozinho (Figura 1). Além disso, o calor potencializa ainda mais a citotoxicidade e a apoptose no tratamento combinado de ART e rhTRAIL (Figura 1). Os efeitos de várias combinações de tratamento na citotoxicidade aumentada estão resumidos na Tabela 1, que apresenta valores de P calculados a partir dos dados de morte celular apresentados na Figura 1(C). A hipertermia aumentou significativamente a citotoxicidade induzida por diferentes concentrações de ART, rhTRAIL ou sua combinação. No entanto, a extensão do aumento diferiu dependendo das condições de tratamento.
Continuamente, usando os resultados de sobrevivência de múltiplos experimentos de dosagem, a análise do Índice de Combinação na Tabela 2 demonstra sinergia moderada a forte em todas as amostras tratadas com ART e rhTRAIL em combinação com calor, bem como ART e rhTRAIL juntos sem calor. Os valores de IC na Tabela 2 destacam interações chave entre ART, rhTRAIL e hipertermia. Notavelmente, o tratamento duplo de ART + rhTRAIL produziu sinergia forte (IC < 0,01), indicativo de uma resposta apoptótica potente. Em contraste, a combinação tripla com hipertermia exibiu sinergia moderada (IC ~0,5–0,7), sugerindo um efeito aditivo, porém benéfico.
Durante o tratamento multimodal baseado em hipertermia, as células HCT116 respondem ao estresse térmico elevando o nível de proteínas de choque térmico e reduzindo o nível de caspase-3.
Para avaliar melhor os mecanismos celulares durante a citotoxicidade e apoptose induzidas pelo tratamento multimodal baseado em hipertermia, examinamos proteínas potencialmente envolvidas no estresse celular gerado pela hipertermia. Investigamos o papel das proteínas de choque térmico, HSP70 e HSP90, bem como da caspase-2 iniciadora, em resposta ao tratamento térmico isolado e em combinação com ART e rhTRAIL. Para avaliar o impacto significativo do calor durante a apoptose induzida pelo tratamento multimodal, tratamos com doses mais baixas de rhTRAIL e ART, e a hipertermia foi aplicada por 1, 2, 3 ou 4 h. Os resultados do western blot demonstram aumento da clivagem de PARP-1 e da clivagem (ativação) de caspase com a adição de calor a ART + rhTRAIL, particularmente com tempos de aquecimento mais longos (Figura 2). A caspase-2 apresentou uma diminuição acentuada na proteína de comprimento completo (48 kDa) nas amostras tratadas multimodalmente aquecidas, indicando ativação da caspase-2 (Figura 2). Da mesma forma, a expressão de HSP70 aumentou nas condições de calor isolado, calor + rhTRAIL e tratamento multimodal em comparação com o controle, e a HSP90 apresentou a expressão mais forte durante o tratamento multimodal envolvendo calor (Figura 2).

A terapia multimodal baseada em hipertermia aumentou significativamente a apoptose, conforme confirmado pelos ensaios de imunofluorescência com Anexina V e TUNEL

A eficácia apoptótica do tratamento multimodal foi adicionalmente avaliada utilizando Anexina V-FITC, que distingue os estágios da apoptose: a coloração com Anexina V-FITC (verde) indica apoptose inicial, enquanto a coloração com iodeto de propídio (IP) (vermelho) marca células apoptóticas tardias. Tanto nas células HCT116 quanto nas BxPC-3, foi observada coloração mínima com Anexina V e IP nos grupos controle não tratado e 42°C (1 h), enquanto ART ou rhTRAIL isoladamente induziram coloração modesta em comparação com a coloração pronunciada com Anexina V e IP observada nos tratamentos combinados com calor (Figura 3(A–D)). Esses dados confirmam que o tratamento multimodal (ART + rhTRAIL + calor) aumenta acentuadamente a apoptose.

Posteriormente, realizamos o ensaio TUNEL (marcação de extremidades por dUTP mediada por desoxinucleotidil transferase terminal) para confirmar a fragmentação do DNA (uma característica da apoptose) em células submetidas ao tratamento multimodal (Figura 3(E,F)). O ensaio revelou fluorescência FITC (verde) aumentada no grupo tratado com ambos ART e rhTRAIL, que foi ainda mais intensificada pela adição de calor (Figura 3(E,F)). Esses achados demonstram consistentemente que o tratamento multimodal promove a apoptose de forma eficaz.

Uma vez que as mitocôndrias são alvos-chave dos agentes apoptóticos, avaliamos o impacto do tratamento multimodal na função mitocondrial. Realizamos o ensaio JC-1 para avaliar as alterações no potencial de membrana mitocondrial durante o tratamento multimodal (Figura 4(A,B)). Uma diminuição na fluorescência vermelha e aumento na fluorescência verde foi observada nas amostras tratadas com a combinação de calor, ART e rhTRAIL, indicando despolarização mitocondrial e estresse associados à atividade citotóxica durante o tratamento multimodal (Figura 4(A,B)).
BID atua como um guardião crítico na via apoptótica ativada pela terapia combinada potencializada por hipertermia com ART e rhTRAIL
Nossa pesquisa anterior demonstrou que a apoptose induzida por ART potencializada por rhTRAIL depende de BID funcional. BID, um membro da família de proteínas Bcl-2, facilita a apoptose oligomerizando as proteínas Bax e Bak, que permeabilizam a membrana mitocondrial externa, levando à ativação da caspase-9 e 3, culminando em apoptose. Para investigar se a apoptose induzida por hipertermia em células tratadas com ART e rhTRAIL depende de BID, tratamos células HCT116 do tipo selvagem, deficientes em BID (BID−/−) e mutantes para BID (BID−/−/D60E ou BID−/−/G94E) com ART, rhTRAIL e hipertermia, tanto isoladamente quanto em combinação (Figuras 5 e 6). O ensaio de morte celular usando azul de tripano revelou que, em células deficientes em BID e mutantes para BID, os tratamentos com ART, rhTRAIL e hipertermia não conseguiram induzir citotoxicidade (Figuras 5(A), 6(A,C)). A análise por Western blot da clivagem de PARP-1 confirmou que a apoptose foi bloqueada nas linhagens celulares deficientes em BID e mutantes para BID (Figuras 5(B), 6(B,D)).
A apoptose induzida pelo tratamento multimodal depende de Bax
Similar ao papel de BID, a proteína Bax da família Bcl-2 é essencial para o aumento da apoptose observado quando ART e rhTRAIL são combinados. Bak, que é a proteína contraparte de Bax, curiosamente, mostrou-se não desempenhar um papel importante nas interações sinérgicas. Investigamos se Bax ou Bak são críticos no tratamento multimodal potencializado por hipertermia usando linhagens celulares HCT116 deficientes em Bax (Bax−/−), deficientes em Bak (Bak−/−) e com duplo knockout de Bax/Bak (Bax−/− Bak−/− DKO) (Figura 7). Ensaios de viabilidade celular e Western blot para clivagem de PARP-1 mostraram que células deficientes em Bax e com duplo knockout apresentaram apoptose reduzida no tratamento potencializado por hipertermia, com baixas taxas de morte celular e clivagem mínima de PARP-1 (Figura 7(A,B,E,F)). No entanto, diferentemente das células deficientes em Bax, as células deficientes em Bak exibiram níveis de apoptose comparáveis às células do tipo selvagem, indicando que Bax, mas não Bak, é essencial na apoptose induzida pelo tratamento multimodal potencializado por hipertermia (Figura 7(C,D)). Nossas observações foram confirmadas na Figura 7(G). Notavelmente, o calor isolado não tem efeito significativo, pois não há clivagem de PARP-1 demonstrada (Figura 7(G)).
Representação esquemática das principais observações
A Figura 8 ilustra um diagrama geral que resume as observações experimentais. A citocina rhTRAIL induz a apoptose ao se ligar seletivamente a DR4 e DR5 em células cancerígenas e inicia a cascata de ativação das caspases, levando ao truncamento do BID. O Bid truncado (tBID) oligomeriza a Bax, que permeabiliza a MOM, liberando o citocromo c e ativando a caspase-9 iniciadora. A caspase-9 ativa a caspase-3, e então a caspase-3 ativa cliva proteínas alvo, incluindo PARP-1, levando à apoptose celular. O medicamento antimalárico, artesunato (ART), atua como um agente ferroptótico, causando ferritinofagia, gerando ERO e induzindo peroxidação lipídica dependente de ferro. O ART também inibe a glutationa S-transferase, levando à redução dos níveis de glutationa e ativação da resposta ao estresse do retículo endoplasmático (RE), que por sua vez promove a apoptose dependente de mitocôndria através de uma via dependente de BID-Bax. A hipertermia leve induz estresse térmico na célula, levando à geração de ERO e à regulação positiva das proteínas protetoras de choque térmico, HSP70 e HSP90. Sob condições de hipertermia leve, HSP70 e HSP90 atuam para prevenir a Resposta a Proteínas Mal Enroladas (UPR). No entanto, o estresse térmico em combinação com a apoptose mediada por ART e potencializada por rhTRAIL pode sobrecarregar a capacidade das HSP, prejudicando a proteostase e levando às respostas de UPR e estresse do RE. Além disso, a geração de ERO pela hipertermia tem sido sugerida para levar a pequenos níveis de ativação da caspase-2 iniciadora, que é significativamente aumentada durante o tratamento multimodal baseado em hipertermia. O diagrama ilustra a apoptose induzida por ART e rhTRAIL potencializada pela hipertermia através da produção de ERO e do crosstalk entre a via mitocondrial mediada por estresse do RE e a via apoptótica mitocondrial BID-Bax.
Discussão
Este estudo investigou o potencial de uma terapia multimodal baseada em hipertermia, combinando ART e rhTRAIL, para aumentar a apoptose em células de carcinoma colorretal HCT116 e células de adenocarcinoma pancreático BxPC-3. Em células tratadas com tratamento multimodal baseado em hipertermia, nossos resultados demonstram mudança na morfologia celular, aumento na citotoxicidade, proteínas alvo de caspase indicativas de apoptose, positividade para Anexina V/PI, marcação TUNEL de fragmentação de DNA e despolarização da membrana mitocondrial JC-1 (Figuras 1–4). Usando linhagens celulares deficientes em BID e Bax, descobrimos que a hipertermia potencializa significativamente a apoptose induzida por ART e rhTRAIL através da via mitocondrial dependente de BID-Bax. Esses resultados são consistentes com relatos anteriores mostrando que o calor aumenta a eficácia de rhTRAIL através da geração de ERO, ativação de caspase e disfunção mitocondrial.
No presente estudo, a hipertermia leve (42°C por 1 h) isoladamente não induz apoptose (Figura 1). Embora as proteínas de choque térmico, como HSP70 e HSP90, sejam reguladas positivamente sob condições hiperférmicas leves (Figura 2) para regular o dobramento de proteínas, prevenir a desnaturação e promover a homeostase celular e a tolerância térmica, a combinação de hipertermia leve com o agente ferropótico ART, o agente apoptótico rhTRAIL, ou ambos, leva ao aumento da apoptose. Esses achados sugerem que a apoptose induzida por rhTRAIL e potencializada por ART causa dano celular que excede a capacidade protetora de HSP70 e HSP90. Concepivelmente, a partir de nossos resultados, o estresse térmico prolongado em combinação com sinais apoptóticos induzidos por rhTRAIL e ferropóticos induzidos por ART poderia criar um desequilíbrio entre a necessidade celular de HSPs e sua capacidade disponível para desempenhar papéis cruciais na manutenção da proteostase. Teoricamente, se as funções protetoras das HSPs forem sobrecarregadas pela citotoxicidade induzida por ART e rhTRAIL, nossos resultados sugerem que as células sofrem apoptose induzida pelo tratamento combinado de ART-rhTRAIL potencializado por hipertermia. Hipoteticamente, a interrupção das HSPs ativa a resposta a proteínas não dobradas (UPR) e as vias de estresse do RE, incluindo CHOP e ATF4, que também são reguladas positivamente pelo tratamento com ART. O ART adicionalmente promove a geração de ROS e prejudica a homeostase redox através da via da ferroptose, contribuindo para a disfunção mitocondrial e sensibilizando as células à apoptose. Da mesma forma, como estabelecido, o rhTRAIL inicia a via extrínseca de morte celular e, através da caspase-8, promove a ativação de BID, levando à via intrínseca de apoptose dependente de BID-Bax-mitocondrial. Além disso, a caspase-2 iniciadora tem sido implicada em pequenos níveis de clivagem de BID sob condições de estresse térmico e ROS elevados, servindo assim como um mediador upstream crítico ligando a hipertermia à via de apoptose BID-Bax-mitocondrial. Os resultados na Figura 2 exibem ativação da caspase-2 durante o tratamento multimodal baseado em hipertermia. Mecanicamente, após ativação, a caspase-2 cliva BID em sua forma truncada, tBID, que se transloca para as mitocôndrias onde promove a permeabilização da membrana externa mitocondrial (MOMP) (Figura 8). Esse evento facilita a liberação de fatores pró-apoptóticos, como o citocromo c, para o citosol, levando à formação do apoptossomo e ativação de caspases a jusante (caspase-9 e caspase-3), impulsionando finalmente a morte celular.
Entretanto, embora a caspase-2 tenha a capacidade molecular de clivar BID em tBID, descobriu-se que ela é menos ativa do que outras caspases iniciadoras, como a caspase-8. Isso implica que, embora apenas o calor possa induzir alguns sinais de estresse que levam à ativação da caspase-2, pode não produzir tBID ativo suficiente sozinho para causar apoptose generalizada. Os resultados refletem essa hipótese, onde pouca clivagem de PARP-1 é observada após o tratamento térmico isolado, bem como poucos sinais de citotoxicidade (Figura 1(A–C)). Essas descobertas podem elucidar por que a incorporação da hipertermia com agentes apoptóticos e ferroptóticos adicionais aumenta marcadamente a apoptose, em relação à hipertermia isolada. Isso sugere uma interação sinérgica entre as vias de hipertermia, ferroptose e apoptose, com BID no centro.
Nossos dados dão suporte a esse mecanismo da BID como guardiã da apoptose sinérgica induzida pelo calor, pelo ART e pelo rhTRAIL. É importante destacar que células deficientes em BID ou mutantes não sofreram apoptose sob o tratamento combinado, ressaltando o papel da BID como mediadora-chave na apoptose induzida por modalidades múltiplas (Figuras 5 e 6). Nossos dados também revelaram que a Bax, mas não a Bak, é essencial para os efeitos citotóxicos observados, de acordo com descobertas anteriores que associam a Bax à apoptose mitocondrial induzida por ART e rhTRAIL (Figura 7). Como estabelecido, a tBID se transloca para as mitocôndrias, facilitando a ativação da Bax, a MOMP e a sinalização a jusante das caspases. O estresse oxidativo e do RE intensificam ainda mais esse processo ao prejudicar as proteínas antiapoptóticas da família Bcl-2 ou reduzir o limiar para a ativação da Bax. Esses achados demonstram que o tratamento multimodal potencializado por hipertermia depende da BID e da Bax funcionais (Figura 8). Portanto, uma melhor compreensão da via de integração BID-Bax tem potencial translacional, pois poderia orientar o agrupamento e a priorização de pacientes em ensaios clínicos, especialmente para pacientes diagnosticados com CPC. Pacientes cujos tumores apresentam maior expressão das proteínas BID e Bax podem ser mais responsivos a terapias dependentes da apoptose mitocondrial mediada por BID-Bax. Por exemplo, na prática clínica, biópsias tumorais pré-tratamento poderiam ser rastreadas quanto à expressão das proteínas BID-Bax a fim de identificar pacientes com CPC que provavelmente responderiam à terapia multimodal.

Por outro lado, pacientes com tumores deficientes em BID-Bax podem necessitar de estratégias terapêuticas alternativas, como o uso de outros agentes indutores de apoptose que não dependam da via BID-Bax. Temos dados preliminares sobre um fármaco chamado DZ-1-ART que induz apoptose associada à mitocôndria independente do eixo BID-Bax. O DZ-1-ART é a forma conjugada de DZ-1 e artesunato (ART). O DZ-1 é um tipo de corante cianina heptametina, que pode visar a superexpressão de polipeptídeos transportadores de ânions orgânicos (OATPs) em células cancerígenas para seletividade específica. Quando o DZ-1 é conjugado ao ART, observamos morte celular citotóxica e apoptose em múltiplos tipos de linhagens celulares cancerígenas (dados não publicados). Este fármaco é apenas um exemplo de opção de tratamento para pacientes com mutações na BID/Bax ou que apresentam tumores com baixa expressão das proteínas BID-Bax. Estudos futuros devem explorar se fármacos como o DZ-1-ART ou outras terapêuticas dependentes de BID-Bax podem ser potencializados pela adição de calor. Continuamente, estratégias para superar a resistência em tumores deficientes em BID-Bax, como abordagens destinadas a restaurar a funcionalidade do eixo BID-Bax em tumores, aumentar a expressão das proteínas BID-Bax nas células tumorais dos pacientes, ou regimes combinados alternativos que contornem essa dependência, podem ser exploradas.
Em resumo, o presente estudo revela que o BID atua como uma molécula-chave reguladora da apoptose durante o tratamento multimodal baseado em hipertermia (Figura 8). Nossa hipótese é que a hipertermia potencializa os efeitos apoptóticos e ferroptóticos do ART e do rhTRAIL ao promover estresse oxidativo e do RE, sensibilizando assim as células e amplificando os sinais tanto no eixo intrínseco BID-Bax-mitocôndria quanto na via apoptótica extrínseca mediada por receptores de morte. Essa interação fornece uma base mecanicista para direcionar tumores CPC com sinalização intacta de BID-Bax durante nosso tratamento multimodal proposto baseado em hipertermia, potencialmente melhorando a seleção de pacientes e os resultados do tratamento do CPC.

Declaração de divulgação
Declaramos que as informações divulgadas estão corretas e que não temos conhecimento de nenhuma outra situação de conflito de interesse real, potencial ou aparente. Os autores também declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Aprovação ética
Não aplicável.

Disponibilidade de dados e materiais
Os materiais de pesquisa gerados nos estudos, incluindo construções de DNA plasmidial, serão disponibilizados gratuitamente à comunidade científica assim que este manuscrito for documentado em uma publicação. Os dados brutos foram gerados no Cedars-Sinai Medical Center. Os dados derivados que apoiam as descobertas deste estudo estão disponíveis mediante solicitação ao autor correspondente, Dr. Yong J. Lee.

Referências
Incidência, prognóstico e possíveis estratégias de tratamento da carcinomatose peritoneal de origem pancreática: um estudo populacional
Metástase na parede abdominal como primeira manifestação clínica de adenocarcinoma pancreático: relato de caso
Cirurgia citorredutora e quimioterapia intraperitoneal hipertérmica em uma paciente com carcinomatose peritoneal de cistadenocarcinoma pancreático: relato de caso
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A hipertermia promove a citotoxicidade e a apoptose induzidas pelo tratamento multimodal (ART + TRAIL) em células de carcinoma colorretal humano HCT116 e células de adenocarcinoma pancreático BxPC-3. As células foram tratadas com 5 ou 10 μM de artesunato (ART) por 20h a 37°C e, em seguida, com ou sem 1 ou 2 ng/mL de rhTRAIL por mais 4h. Algumas amostras foram submetidas ao tratamento de hipertermia em banho-maria a 42°C por 1 h e, em seguida, recolocadas na incubadora a 37°C por mais 3h. (A, B) Após o tratamento, as características morfológicas das células HCT116 e BxPC-3 tratadas com 10 μM de ART e/ou 2 ng/mL de rhTRAIL e/ou 42°C foram analisadas sob um microscópio ECHO revolve. (C) Após o tratamento, a morte celular das HCT116 foi determinada por um ensaio de exclusão com azul de tripano. As barras de erro representam a média ± DP de experimentos em triplicata. As barras de erro representam a média ± DP de experimentos em triplicata. Os valores de P: *, 0,05; **, 0,01; ***, 0,001 estão representados na Tabela 1. (D) Extratos de células inteiras HCT116 foram analisados com um ensaio de immunoblotting utilizando os anticorpos indicados. (E) A razão de expressão proteica de PARP-1 clivado para PARP-1 de comprimento total a partir do Western blot na Figura 1D foi analisada usando o software ImageJ e calculada. As barras de erro representam a média ± DP de amostras replicadas.
Modulação dos níveis das proteínas caspase-2 e HSP na apoptose potencializada pela hipertermia durante o tratamento multimodal. Células HCT116 foram tratadas com 2 μM de ART por 20h a 37°C, seguidas de tratamento com ou sem 1 ng/mL de rhTRAIL por mais 4h. Em paralelo, algumas amostras foram expostas à hipertermia a 42°C por 1, 2, 3 ou 4h e, em seguida, retornadas a 37°C pelo restante do período de incubação, respectivamente. Extratos de células inteiras foram analisados com um ensaio de immunoblotting utilizando os anticorpos indicados.
Ensaios de imunofluorescência confirmam que o tratamento multimodal aumenta a apoptose nas linhagens celulares HCT116 e BxPC-3. Células HCT116 e BxPC-3 foram tratadas com 5μM e 10μM de ART, respectivamente, por 20h a 37°C, seguidas de tratamento com ou sem 2 ng/mL de rhTRAIL por mais 4h. Algumas amostras foram expostas à hipertermia a 42°C por 1 h, e então incubadas a 37°C pelas 3h restantes. (A, C) O ensaio de marcação com Anexina V foi realizado imediatamente após o término do tratamento multimodal, corando as células com Anexina V-FITC (verde), iodeto de propídio (PI) (vermelho) e hoechst (azul), e analisado usando um microscópio de fluorescência ECHO. Imagens representativas são mostradas (barra de escala: 100μm). (B, D) O programa ImageJ foi usado para analisar a intensidade de fluorescência relativa de cada uma das amostras, medindo a intensidade da coloração hoechst, a intensidade da coloração Anexina V (canal verde) e a intensidade da coloração PI (canal vermelho). O gráfico de barras representa a razão entre a intensidade de fluorescência da coloração Anexina V e a intensidade de fluorescência da coloração hoechst, bem como a intensidade da coloração PI e a intensidade de fluorescência da coloração hoechst, com barras de erro representando a média ± DP de experimentos em triplicata. (E) O ensaio de marcação TUNEL foi realizado em células HCT116 tratadas e as imagens fluorescentes foram examinadas em um microscópio de fluorescência ECHO. Imagens representativas são mostradas (barra de escala: 100μm). (F) O programa ImageJ foi usado para analisar a intensidade de fluorescência relativa de cada uma das amostras, medindo a intensidade da coloração hoechst e a intensidade da coloração TUNEL. O gráfico de barras representa a razão entre a intensidade de fluorescência da coloração TUNEL e a fluorescência da coloração hoechst, com barras de erro representando a média ± DP de experimentos em triplicata.

O tratamento multimodal de ART + calor + rhTRAIL causa despolarização no potencial da membrana mitocondrial. Células HCT116 foram tratadas com 5μM de ART por 20h a 37°C e, em seguida, com ou sem 2 ng/mL de rhTRAIL por mais 4h. Algumas amostras foram submetidas ao tratamento de hipertermia a 42°C por 1 h, e então incubadas a 37°C por mais 3h. (A) O ensaio de coloração JC-1 foi realizado e os resultados foram analisados usando um microscópio de fluorescência ECHO. Imagens representativas são mostradas (barra de escala: 100μm). (B) O programa ImageJ foi usado para analisar a intensidade de fluorescência relativa de cada uma das amostras, medindo a intensidade da coloração hoechst, a intensidade verde do JC-1 (canal verde) e a intensidade vermelha do JC-1 (canal vermelho). O gráfico de barras representa a razão entre a intensidade de fluorescência da coloração verde do JC-1 e a intensidade de fluorescência da coloração hoechst, bem como a intensidade da coloração vermelha do JC-1 e a intensidade de fluorescência da coloração hoechst, com barras de erro representando a média ± DP de experimentos em triplicata.
Papel do BID na apoptose induzida pelo tratamento multimodal sinérgico. Células HCT116 do tipo selvagem e BID−/− foram tratadas com 5μM de ART por 20h a 37°C e, em seguida, com ou sem 2 ng/mL de rhTRAIL por mais 4h. Algumas amostras foram submetidas a tratamento de hipertermia a 42°C por 1 h, e então incubadas a 37°C por mais 3h. (A) Imediatamente após o tratamento, a viabilidade celular foi avaliada usando o ensaio de exclusão por azul de tripano. As barras de erro representam a média ± DP de experimentos em triplicata. Valores de P: ****, 0,0001. (B) Os extratos celulares totais foram analisados com um ensaio de imunotransferência utilizando os anticorpos indicados.
O BID funcional é necessário para a apoptose induzida pelo tratamento multimodal sinérgico. Células HCT116 do tipo selvagem, BID−/−/D60E e BID−/−/G94E foram tratadas com 5μM de ART por 20h a 37°C e, em seguida, com ou sem 2 ng/mL de rhTRAIL por mais 4h. Algumas amostras foram submetidas a tratamento de hipertermia a 42°C por 1 h, e então incubadas a 37°C por mais 3h. (A, C) Imediatamente após o tratamento, a morte celular foi determinada por um ensaio de exclusão por azul de tripano. As barras de erro representam a média ± DP de experimentos em triplicata. Valores de P: ***, 0,001. (B, D) Para comparar os efeitos do tratamento em células HCT116 do tipo selvagem, BID−/−/D60E, BID−/−/G94E respectivamente, os extratos celulares totais foram analisados com um ensaio de imunotransferência.
Papel de Bax e Bak durante a apoptose induzida pelo tratamento multimodal. Células HCT116 do tipo selvagem, Bak −/−, Bax −/− e Bak−/−/Bax−/−-DKO foram tratadas com 5μM de ART por 20h a 37°C e, em seguida, com ou sem 2 ng/mL de rhTRAIL por mais 4h. Algumas amostras foram submetidas a tratamento de hipertermia a 42°C por 1 h, e então incubadas a 37°C por mais 3h. (A, C, E) Imediatamente após o tratamento, a morte celular foi determinada por um ensaio de exclusão por azul de tripano. As barras de erro representam a média ± DP de experimentos em triplicata. Valores de P: ***, 0,001. n.s., não significativo. (B, D, E, F) Os extratos celulares totais foram analisados com um ensaio de imunotransferência utilizando os anticorpos indicados para comparar os efeitos do tratamento em células HCT116 do tipo selvagem, células HCT116 Bax −/−, células HCT116 Bak −/− e células HCT116 Bak−/−/Bax−/−-DKO, respectivamente.
Diagrama ilustrando o BID como a molécula guardiã na terapia multimodal potencializada por hipertermia utilizando ART e rhTRAIL.
Análise estatística ANOVA de uma via, valores de P para ART, rhTRAIL e hipertermia.
Comparação de Fármacos Significância Estatística Calor vs 5 μM ART + Calor *** Calor vs 10 μM ART + Calor *** Calor vs 1 ng/mL rhTRAIL + Calor *** Calor vs 2 ng/mL rhTRAIL + Calor *** Calor vs 5 μM ART + 1 ng/mL rhTRAIL + Calor *** Calor vs 5 μM ART + 2 ng/mL rhTRAIL + Calor *** Calor vs 10 μM ART + 1 ng/mL rhTRAIL + Calor *** Calor vs 10 μM ART + 2 ng/mL rhTRAIL + Calor *** 5 μM ART vs 5 μM ART + Calor ** 10 μM ART vs 10 μM ART + Calor *** 1 ng/mL rhTRAIL vs 1 ng/mL rhTRAIL + Calor *** 2 ng/mL rhTRAIL vs 2 ng/mL rhTRAIL + Calor *** 5 μM ART + 1 ng/mL rhTRAIL vs 5 μM + 1 ng/mL rhTRAIL + Calor * 5 μM ART + 2 ng/mL rhTRAIL vs 5 μM + 2 ng/mL rhTRAIL + Calor * 10 μM ART + 1 ng/mL rhTRAIL vs 10 μM + 1 ng/mL rhTRAIL + Calor ** 10 μM ART + 2 ng/mL rhTRAIL vs 10 μM + 2 ng/mL rhTRAIL + Calor *
Dados de Índice de Combinação para ART, rhTRAIL e hipertermia.
Combinação de Fármacos Índice de Combinação (IC) Efeito 5 μM ART + Calor 0.72082 Sinergia Moderada 10 μM ART + Calor 0.67044 Sinergia Moderada 1 ng/mL rhTRAIL + Calor 0.69660 Sinergia Moderada 2 ng/mL rhTRAIL + Calor 0.67728 Sinergia Moderada 5 μM ART + 1 ng/mL rhTRAIL 0.00386 Sinergia Forte 5 μM ART + 2 ng/mL rhTRAIL 0.00651 Sinergia Forte 10 μM ART + 1 ng/mL rhTRAIL 0.00149 Sinergia Forte 10 μM ART + 2 ng/mL rhTRAIL 0.00127 Sinergia Forte 5 μM + 1 ng/mL rhTRAIL + Calor 0.57410 Sinergia Moderada 5 μM + 2 ng/mL rhTRAIL + Calor 0.56592 Sinergia Moderada 10 μM + 1 ng/mL rhTRAIL + Calor 0.52348 Sinergia Moderada 10 μM + 2 ng/mL rhTRAIL + Calor 0.50462 Sinergia Moderada