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pmid: "36859349"
title: "A berberina melhora comportamentos semelhantes à depressão em camundongos ao inibir a neuroinflamação mediada pelo inflamassoma NLRP3 e prevenir a ruptura da neuroplasticidade."
authors: "Qin Z, Shi DD, Li W, Cheng D, Zhang YD, Zhang S, Tsoi B, Zhao J, Wang Z, Zhang ZJ"
journal: "Journal of neuroinflammation"
pubdate: "2023 Mar 01"
doi: "10.1186/s12974-023-02744-7"
source: "PMC Full Text"

A berberina melhora comportamentos semelhantes à depressão em camundongos ao inibir a neuroinflamação mediada pelo inflamassoma NLRP3 e prevenir a ruptura da neuroplasticidade.

Autores

Qin Z, Shi DD, Li W, Cheng D, Zhang YD, Zhang S, Tsoi B, Zhao J, Wang Z, Zhang ZJ

Periodico

Journal of neuroinflammation (2023 Mar 01)

Conteudo

Berberina melhora comportamentos do tipo depressivo em camundongos através da inibição da inflamação neuroinflamatória mediada pelo inflamassoma NLRP3 e da prevenção da ruptura da neuroplasticidade

Objetivos

A neuroinflamação tem sido sugerida como um fator que afeta o processamento da depressão. Há um interesse renovado na berberina devido aos seus efeitos anti-inflamatórios. Neste estudo, investigamos se a berberina atenua comportamentos do tipo depressivo através da inibição da ativação do inflamassoma NLRP3 em um modelo de depressão em camundongos.

Métodos

Camundongos C57BL/6N machos adultos foram tratados com corticosterona (CORT, 20 mg/kg/dia) por 35 dias. Duas doses (100 mg/kg/dia e 200 mg/kg/dia) de berberina foram administradas por via oral do dia 7 ao dia 35. Testes comportamentais foram realizados para medir as alterações nos comportamentos do tipo depressivo. A análise de expressão diferencial de genes foi realizada para dados de sequenciamento de RNA no córtex pré-frontal. O inflamassoma NLRP3 foi medido por reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa, western blotting e imunofluorescência. A neuroplasticidade e a função sináptica foram medidas por imunofluorescência, coloração de Golgi–Cox, microscopia eletrônica de transmissão e registros de patch-clamp em célula inteira.

Resultados

Os resultados dos testes comportamentais demonstraram que a berberina atenuou os comportamentos do tipo depressivo induzidos pela CORT. O sequenciamento de RNA identificou que o NLRP3 estava significativamente regulado positivamente após exposição prolongada à CORT. A berberina reverteu as concentrações de citocinas periféricas e cerebrais; o inflamassoma NLRP3 desencadeado pela CORT no córtex pré-frontal e no hipocampo foi reduzido pela berberina. Além disso, a menor frequência de excitação neuronal, bem como a redução das espinhas dendríticas, foram revertidas pelo tratamento com berberina. Em conjunto, a berberina aumenta a neurogênese adulta no hipocampo e a plasticidade sináptica induzida pela CORT.

Conclusão

Os efeitos antidepressivos da berberina foram acompanhados pela redução da resposta neuroinflamatória através da inibição da ativação do inflamassoma NLRP3 e pelo resgate da deterioração neuronal através da supressão dos prejuízos na plasticidade sináptica e na neurogênese.

Informações Suplementares

A versão online contém material suplementar disponível em 10.1186/s12974-023-02744-7.

Introdução

A depressão foi identificada como uma doença psiquiátrica de alta incidência e grave. A carga de saúde da depressão, usando a estimativa de anos de vida ajustados por incapacidade (DALYs), representou 1,85% de todos os DALYs no mundo, o que aumentou 61,1% de 1990 a 2019. Sabe-se que aumenta significativamente o risco de suicídio para todas as idades, especialmente em adolescentes.
Embora a compreensão da patologia da depressão tenha se desenvolvido consideravelmente. Atualmente, nenhum mecanismo único pode explicar satisfatoriamente a fisiopatologia da depressão. Estudos têm se concentrado em muitos componentes do cérebro, incluindo córtex pré-frontal (PFC), hipocampo, amígdala, área tegmental ventral (VTA) e nucleus accumbens (NAc), levando às teorias da depressão, bem como à resposta antidepressiva, que têm sido envolvidas nos mecanismos de sinalização molecular e celular que medeiam a plasticidade sináptica, contribuindo para uma hipótese mais ampla de neuroplasticidade da depressão.
Até o momento, evidências crescentes indicam que respostas inflamatórias periféricas superexpressas podem prejudicar a integridade da barreira hematoencefálica (BBB) e resultar em neuroinflamação no cérebro. Consequentemente, os defeitos de neuroplasticidade e neurogênese mediados por neuroinflamação podem ser um processo vital sob o mecanismo em condições neuropsiquiátricas, incluindo a depressão.
Observou-se um excesso na produção de proteínas de fase aguda periféricas e citocinas pró-inflamatórias em pacientes com depressão, que foram identificadas como estando ligadas a alterações emocionais e gravidade dos sintomas psiquiátricos. Além disso, a remissão dos pacientes ocorre frequentemente após a normalização da resposta inflamatória, enquanto a falha na remissão é acompanhada pela resposta inflamatória persistentemente elevada.
Essa informação promove a hipótese de que as alterações emocionais em pacientes com depressão podem ser atribuídas a uma ligação anômala entre o sistema nervoso central (SNC) e a resposta imune inata.
Além disso, os dados agrupados de meta-análise também apoiaram que vários anti-inflamatórios têm efeitos antidepressivos significativos.
As interações entre o sistema imunológico e o SNC não estão apenas envolvidas na modelagem do comportamento, mas também na resposta a terapêuticas. O complexo do inflamassoma NLRP3 (família NLR, domínio pirina contendo 3) é um complexo multiproteico intracelular responsável por vários processos imunes inatos associados a infecção, inflamação e autoimunidade. Como um componente do sistema imune inato que funciona como um receptor de reconhecimento de padrões que reconhece padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados a perigo (DAMPs), o NLRP3 parece preencher a lacuna entre a ativação imune e os sinais de perigo metabólico ou exposição ao estresse, que podem ser fatores-chave na patogênese da depressão. Estimulada pelo NLRP3, a citocina pró-inflamatória IL-1β liberada em excesso pode atravessar a BHE e alterar a plasticidade sináptica ao agir diretamente nos neurônios ou estimular a ativação da microglia. Além disso, o eixo hipotálamo–pituitária–adrenal (HPA) pode ser estimulado por citocinas e resultar na superprodução de glicocorticoides, exacerbando a resposta ao estresse. Por outro lado, os efeitos neurotóxicos da neuroinflamação contribuem consequentemente para a remodelação sináptica, sugerindo que a plasticidade neural também desempenha um papel vital na fisiopatologia da depressão e na função antidepressiva. Níveis elevados de moléculas inflamatórias foram relatados como diminuindo uma ampla gama de marcadores de plasticidade neural, como transmissão sináptica, excitabilidade de membrana, plasticidade em neurônios piramidais, bem como neurogênese. A IL-1β maturada pelo NLRP3 desempenha papéis funcionais nos mecanismos de plasticidade sináptica e funções cognitivas. Em camundongos com depressão, a densidade de espinhas e as morfologias críticas foram significativamente diminuídas, especialmente em regiões cerebrais específicas relacionadas à depressão, como o córtex pré-frontal e o hipocampo.

A berberina é um alcaloide isoquinolínico natural e há um interesse renovado na berberina por seu papel potencial em distúrbios neurodegenerativos e neuropsiquiátricos devido ao seu efeito na neuroinflamação, regulação hormonal e neurotransmissores. Neste estudo, investigamos os genes expressos diferencialmente no modelo de camundongo com depressão induzida por corticosterona (CORT) usando um microarray de alto rendimento. A teoria de que a disrupção dos fatores neurotróficos e da conectividade sináptica no PFC e no hipocampo está relacionada aos mecanismos de neuroplasticidade é uma das principais hipóteses de neuroplasticidade da depressão. Descobrimos que o NLRP3 apresentou expressão significativamente diferencial no PFC do modelo de camundongo induzido por CORT em comparação com os controles de camundongos selvagens e camundongos tratados com berberina. Complementando esses achados, os camundongos CORT resultam em déficits de neuroplasticidade e danos à neurogênese e induzem comportamentos semelhantes à depressão. Assim, esses resultados fornecem insights sobre mecanismos envolvendo a regulação funcional da corticosterona na depressão e, especificamente, identificam a berberina como uma terapia potencial para a depressão.

Materiais e métodos

Modelos animais e tratamento medicamentoso
A berberina previne alterações comportamentais induzidas por CORT. a Esquema do paradigma experimental. CORT foi administrado consecutivamente do dia 1 ao dia 35. A partir do dia 7, 100 mg/kg/dia ou 200 mg/kg/dia de berberina foram administrados a camundongos nos grupos BBR100 ou BBR200, respectivamente, por administração intragástrica diária. Camundongos nos grupos controle e CORT receberam solução sem berberina. Camundongos receberam BrdU como injeções intraperitoneais diárias do dia 8 ao dia 12. Do dia 28 ao dia 31, uma série de testes comportamentais foram realizados nos camundongos. A administração de CORT e berberina foi mantida durante os testes comportamentais até o final do experimento (dia 35). b Mapa de calor da exploração dos camundongos durante o teste de campo aberto. c Duração na zona central no teste de campo aberto. Camundongos CORT passaram menos tempo na zona central do que os camundongos controle (ANOVA de uma via, F (3, 32) = 5,448, P = 0,0038; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0012, n = 9 em cada grupo). d Distância total no teste de campo aberto. Camundongos CORT se moveram menos no campo do que os camundongos controle e com berberina em alta dose (ANOVA de uma via, F (3, 32) = 4,203, P = 0,0129; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0077, CORT vs. BBR200, P = 0,0212, n = 9 em cada grupo). e Número de transições de zona no teste de campo aberto. A administração de CORT diminuiu o número de transições de zona em camundongos no teste de campo aberto em comparação com os camundongos controle e com berberina em alta dose (ANOVA de uma via, F (3, 32) = 5,711, P = 0,0030; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0008, CORT vs. BBR200, P = 0,0429, n = 9 em cada grupo). f Duração de imobilidade no teste de suspensão pela cauda. Camundongos CORT passaram mais tempo em imobilidade (ANOVA de uma via, F (3, 28) = 6,435, P = 0,0019; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0005, CORT vs. BBR100, P = 0,0425, CORT vs. BBR200, P = 0,0345, n = 8 em cada grupo). g Duração de imobilidade no teste de natação forçada. Camundongos CORT passaram mais tempo em imobilidade (ANOVA de uma via, F (3, 32) = 6,316, P = 0,0017; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0007, CORT vs. BBR100, P = 0,0145, CORT vs. BBR200, P = 0,0141, n = 9 em cada grupo). h Consumo de sacarose no teste de preferência por sacarose. O consumo de sacarose nos camundongos CORT foi significativamente menor do que nos camundongos dos grupos controle e berberina em alta dose (ANOVA de uma via, F (3, 32) = 4,638, P = 0,0084; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0070, CORT vs. BBR200, P = 0,0090, n = 16 em cada grupo). Os gráficos de barras mostram a média ± EPM; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. CORT corticosterona, BBR berberina, ANOVA análise de variância
Camundongos C57BL/6N machos adultos (idade 8–10 semanas) foram obtidos do Centro de Pesquisa em Medicina Comparativa (CCMR), da Universidade de Hong Kong. Todos os camundongos foram criados nas áreas experimentais de manutenção (ciclo claro/escuro de 12 h a 18–22 °C, com luzes acesas às 8:00 A.M., acesso ad libitum a ração seca em pellets e água) seguindo as normas éticas da HKU (CULATR No. 5582-20) no CCMR. O peso corporal foi registrado diariamente durante todo o período experimental. Os camundongos foram divididos em 4 grupos (n = 18 para cada grupo), incluindo: tratado com solução salina (controle), tratado com corticosterona (20 mg/kg/dia) (CORT), tratado com CORT + berberina (100 mg/kg/dia) (BBR100) e tratado com CORT + berberina (200 mg/kg/dia) (BBR200). A CORT foi administrada consecutivamente do dia 1 ao dia 35. A partir do dia 7, 100 mg/kg/dia ou 200 mg/kg/dia de berberina foram administrados aos camundongos dos grupos BBR100 ou BBR200, respectivamente, por gavagem intragástrica diária. Os camundongos dos grupos controle e CORT receberam solução sem berberina. Os camundongos receberam BrdU por injeções intraperitoneais diárias do dia 8 ao dia 12. Do dia 28 ao dia 31, uma série de testes comportamentais foram realizados nos camundongos; a administração de CORT e berberina foi mantida durante os testes comportamentais até o final do experimento (dia 35). A dose de CORT foi selecionada de acordo com um estudo anterior que induziu depressão em camundongos com sucesso no mesmo laboratório. A CORT e a berberina foram dissolvidas em uma solução aquosa de carboximetilcelulose sódica a 0,5% e administradas por gavagem oral. As soluções foram preparadas frescas antes do uso diário. A Figura 1a ilustra a linha do tempo do desenho experimental com o momento dos ensaios e manipulações.

Testes comportamentais

Teste de campo aberto (OFT)
Para avaliação da locomoção e do comportamento do tipo ansiedade em camundongos. O OFT foi realizado em um aparato de plástico branco (50 de altura × 50 de largura × 40 cm de profundidade) com uma zona central de 30 × 30 cm. A distância total e a velocidade percorrida, bem como a frequência de transferência entre a zona central e as zonas periféricas, foram registradas durante um período de teste de 10 min. Etanol a 95% foi pulverizado para limpar o aparato entre cada teste, a fim de evitar odores e resíduos deixados pelo último camundongo. Realizamos o teste para todos os camundongos no primeiro dia antes do experimento. O software de rastreamento de vídeo SMART (V.3.0, Panlab, EUA) foi usado para registrar e analisar os dados.

Teste de suspensão pela cauda (TST)

O TST foi realizado em uma câmara de plástico branco (55 de altura × 10 de largura × 10 cm de profundidade). Cada camundongo foi suspenso pela ponta da cauda com fita adesiva em posição de cabeça para baixo, com duração de 6 min. O tempo de imobilidade é definido como a cessação de qualquer movimento dos membros e do tronco. Para evitar o viés afetado pela resposta ao estresse, cada camundongo foi adaptado por 2 min após ser suspenso; apenas os 4 min restantes foram registrados e analisados. O software de rastreamento de vídeo SMART (V.3.0, Panlab, EUA) foi usado para registrar e analisar os dados.

Teste de nado forçado (FST)

Para avaliar um estado comportamental semelhante à depressão, o FST foi realizado em um cilindro de policarbonato transparente (30 cm de altura × 20 cm de diâmetro). Cada camundongo foi forçado a nadar em cada cilindro preenchido com água (23 a
O SPT foi realizado para avaliar a anedonia, um sintoma central da depressão. Primeiro, os camundongos foram expostos adaptativamente a duas garrafas contendo solução de sacarose a 1% (p/v) com acesso ad libitum por 24 h em grupos de 5 por gaiola. Em seguida, uma garrafa de solução de sacarose a 1% e outra garrafa de água da torneira foram administradas por 24 h. No último dia, a posição das duas garrafas foi trocada por 24 h para evitar preferência por lado. Ao final do período de adaptação, todos os camundongos foram privados de comida e água por 12 h antes do teste. Após isso, o SPT foi conduzido em um único camundongo alojado em uma gaiola com livre acesso a duas garrafas respectivas contendo solução de sacarose a 1% e água da torneira por 2 h. Para evitar preferências por lado no comportamento de beber, a posição das duas garrafas foi trocada no meio do teste. O consumo de água e sacarose foi medido como alterações no peso do fluido consumido. A preferência por sacarose foi calculada a partir da seguinte fórmula: preferência por sacarose (%) = consumo de sacarose (g) / [consumo de sacarose (g) + consumo de água (g)] × 100%.

Isolamento de RNA, qPCR e sequenciamento de RNA

O RNA total foi isolado do córtex pré-frontal dissecado usando o reagente de lise QIAzol e purificado usando o kit miRNAeasy mini (Qiagen). O cDNA foi obtido a partir do RNA total usando o kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Life Technologies). O qPCR foi realizado usando o kit Fast Start Universal SYBR Green Master (Takara, Japão) usando o sistema CFX96 Real-Time (Bio-Rad, EUA). Cada reação foi realizada em triplicata. A quantificação relativa foi determinada pelo método ΔΔCT. Os valores foram normalizados em relação ao mRNA de β-actina nas mesmas amostras de cDNA. O arquivo adicional 1: Tabela S1 resume as informações sobre os primers para qPCR. Os detalhes para preparação da biblioteca e sequenciamento do transcriptoma são mostrados nas informações suplementares.

Preparação de fatias cerebrais e registro eletrofisiológico

Após o término dos testes comportamentais, os camundongos foram anestesiados com um anestésico combinado (cetamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg i.p.) e depois perfundidos com tampão de dissecação gelado (110 mM de cloreto de colina, 25 mM de NaHCO3, 1,25 mM de NaH2PO4, 2,5 mM de KCl, 0,5 mM de CaCl2, 7 mM de MgCl2, 11,6 mM de ácido ascórbico, 3,1 mM de ácido pirúvico e 25 mM de D-glicose). Os cérebros foram imediatamente transferidos para tampão de dissecação gelado e oxigenado (95% O2 e 5% CO2) e fatias coronais do mPFC (300 µm) foram cortadas usando um vibratomo (VT1000s, Leica, Alemanha). Em seguida, as fatias foram incubadas em solução de líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) oxigenada (95% O2/5% CO2; 118 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 26,5 mM de NaHCO3, 1 mM de NaH2PO4, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2 e 20 mM de D-glicose) à temperatura ambiente por 60 min para recuperação do choque mecânico do corte.

As fatias cerebrais foram imersas na solução de líquido cefalorraquidiano artificial em fluxo de 5 mL/min na câmara de retenção da plataforma de registro eletrofisiológico. As pipetas de registro de vidro foram feitas por um puxador de pipetas (P-97, Sutter Instrument, EUA). As células foram localizadas por um micromanipulador de controle fino sob um microscópio óptico (Zeiss, Alemanha). A resistência variou entre 2 e 5 MΩ após polimento por fogo para melhorar a qualidade da vedação. Para registros em current-clamp, a solução intracelular continha (em mM) 130 de gluconato de K, 5 de KCl, 10 de HEPES, 2,5 de MgCl2, 4 de Na2ATP, 0,4 de Na3GTP, 10 de fosfocreatina de Na, 0,6 de EGTA. Para registros em voltage-clamp, a solução intracelular continha (em mM) 115 de CsMeCO3, 20 de CsCl, 10 de HEPES, 2,5 de MgCl2, 4 de Na2ATP, 0,4 de NaGTP, 10 de fosfocreatina de Na e 0,6 de EGTA. Os registros em current-clamp foram filtrados a 2,5 kHz e amostrados a 5 kHz. Os registros em voltage-clamp foram filtrados a 2,5 kHz e amostrados a 10 kHz. As correntes sequenciais de −50 a 400 pA em um passo de 50 pA por 500 ms foram injetadas. As correntes foram injetadas a cada 60 s no current-clamp. O registro eletrofisiológico foi realizado usando um amplificador de patch-clamp (EPC10USB, HEKA, Alemanha), e os eventos excitatórios espontâneos ou miniaturas foram analisados com o Mini Analysis Program (v.6.0.3, Synaptosoft Inc., EUA).

Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)

As concentrações séricas de citocinas, incluindo IL-1β (KE10003, Proteintech), IL-6 (KE00007, Proteintech), IL-10 (KE00170, Proteintech) e TNF-α (KE10002, Proteintech), foram medidas usando kits de ELISA quantitativos. Todas as medições foram realizadas em duplicata. A absorbância de cada poço para as reações foi detectada a 450 nm usando o Leitor de Microplacas CLARIOstar Plus (BMG LABTECH, Alemanha). As concentrações de citocinas foram determinadas pela curva padrão de cada citocina.

Western blotting

Para determinar a expressão da proteína, o tecido do hipocampo e do córtex pré-frontal foi extraído com tampão RIPA (Sigma-Aldrich, EUA) contendo 1% de coquetel inibidor de protease (MCE, EUA). As concentrações de proteína foram detectadas pelo ensaio de proteína de Bradford usando Azul brilhante de Coomassie G-250 (Bio-red Laboratories Inv., EUA). As proteínas foram separadas via géis de SDS-PAGE a 10% ou 12% de acordo com os diferentes tamanhos de proteína e transferidas para membranas de PVDF (0,45 μm, Bio-red Laboratories Inv., EUA). Os blots foram subsequentemente bloqueados por 1 h com 5% de BSA à temperatura ambiente. Após incubação com anticorpos primários a 4 ℃ durante a noite, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com fluorescência por 1 h à temperatura ambiente. As proteínas foram detectadas usando um kit ECL (GE Healthcare, Reino Unido) e quantificadas usando o software Image Lab (v.5.2.1, Bio-Rad, EUA). Os detalhes das informações dos anticorpos são mostrados no Arquivo adicional 1: Tabela S2.

Marcação por imunofluorescência

O BrdU foi injetado por 5 dias consecutivos do dia 8 ao dia 12, os camundongos foram sacrificados por perfusão cardíaca com 4% de paraformaldeído. Os cérebros foram coletados e pós-fixados em 4% de paraformaldeído a 4 ℃ durante a noite e então desidratados em solução de sacarose 30% em PBS por 2 dias em câmara fria a 4 ℃. Secções coronais do cérebro (25 μm) foram preparadas com um micrótomo de congelamento (Leica Inc., Alemanha). Para o estudo de imunofluorescência, as lâminas foram submetidas à recuperação antigênica com tampão de ácido cítrico em forno de micro-ondas por 30 min. Em seguida, as lâminas foram bloqueadas com BSA por 60 min à temperatura ambiente e então incubadas a 4 ℃ durante a noite com os anticorpos primários. Após lavagem com PBST, as lâminas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com corante fluorescente (DyLight 594-conjugado anti-cabra de burro, 1:200, Abcam; DyLight 488-conjugado anti-coelho de burro, 1:200, Abcam; DyLight 594-conjugado anti-coelho de burro, 1:200, Abcam) no escuro por 1 h à temperatura ambiente. Antes da montagem, as lâminas foram coradas com DAPI para corar o núcleo por 10 min. As imagens foram capturadas usando um microscópio confocal (LSM880, Zeiss, Alemanha). As análises das imagens foram realizadas usando o software ImageJ (v.1.53c, NIH, EUA). Os detalhes das informações dos anticorpos são mostrados no Arquivo adicional 1: Tabela S3.

Coloração de Golgi-Cox

A coloração de Golgi-Cox foi realizada usando o kit de coloração comercial (Hito Golgi-Cox OptimStain Kit, Hitobiotec Corp, EUA) para caracterizar possíveis alterações na densidade e nas características das espinhas dendríticas neuronais. O cérebro inteiro foi embebido na solução de coloração à temperatura ambiente por 14 dias, protegido da luz, de acordo com o manual de instruções. Os tecidos foram preparados como cortes de parafina de 60 μm. As imagens foram capturadas usando um microscópio confocal (LSM880, Zeiss, Alemanha). A reconstrução tridimensional foi realizada usando o software Imaris (v.9.0.1, Bitplane AG, Suíça) para detectar as categorias de espinhas dendríticas; as células com ramos terminais retos que apresentavam uma resolução clara das espinhas e tinham mais de 10 μm de comprimento foram selecionadas para contagem e análise das espinhas dendríticas.

Microscópio eletrônico de transmissão (MET)

Após perfusão com paraformaldeído a 4%, o hipocampo de camundongos foi cortado manualmente em tecido de 1 mm³ e imediatamente fixado em glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato 0,1 M durante a noite a 4 °C. Os tecidos foram transferidos para tetróxido de ósmio a 4% com ferrocianeto de potássio a 3% em tampão cacodilato 0,1 M por 1 h a 4 °C e protegidos da luz, em seguida, embebidos em Epon 812 após desidratação. As amostras foram seccionadas em cortes finos (0,4 μm) usando um ultramicrótomo (Ultracut UCT, Leica, EUA) e transferidas para grades de cobre. Após coloração com acetato de uranila aquoso a 2% e, em seguida, com citrato de chumbo de Reynold, as imagens foram capturadas usando um microscópio eletrônico de transmissão (CM100, Philips, Alemanha) a 100 kV, equipado com uma câmera de dispositivo de carga acoplada (SIS, Olympus, Japão).

Análise estatística

Os dados são expressos como média ± erro padrão da média, com p < 0,05 bicaudal considerado significativo. O PROC POWER do SAS (v.9.4, SAS Institute Inc, EUA) foi utilizado para determinar o tamanho amostral adequado para experimentos animais. Análise de variância (ANOVA) de uma ou duas vias foi apropriadamente utilizada para comparações entre múltiplos grupos em termos de testes comportamentais, qPCR, western blot, ELISA e imunofluorescência, seguidas pelo ajuste de comparações múltiplas post hoc de Dunnett ou Tukey. As análises de dados foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism (v.9.0.0, GraphPad Software, EUA). Para detectar a correlação entre parâmetros comportamentais como variáveis dependentes e o inflamassoma NLRP3 como variável independente, o coeficiente de correlação de Spearman foi calculado e a matriz de correlação mostrando os coeficientes de correlação entre as variáveis foi resumida. A análise quantitativa da coloração de imunofluorescência foi calculada de acordo com a análise de densidade celular. Uma em cada quatro secções de 25 μm de espessura foi analisada, representando assim toda a extensão rostrocaudal de diferentes regiões cerebrais com ampliação de × 20. Para análise de células NLRP3 + e Iba-1 + no CPF e hipocampo, as células positivas foram contadas e comparadas entre os grupos. Para análise de células PSD95 + , SYN + , BrdU + e DCX + no hipocampo, as células positivas foram contadas separadamente. As células foram contadas usando o plugin “Manual counting” (https://icy.bioimageanalysis.org/plugin/manual-counting/). Os detalhes da análise bioinformática para dados de RNA-seq são mostrados nas informações suplementares.

Resultados

A berberina atenua as disfunções emocionais em camundongos com depressão induzida por CORT
Duas doses de berberina (100 mg/kg/dia e 200 mg/kg/dia) foram administradas por via oral diariamente desde o meio da modelagem com CORT até o final dos testes comportamentais (Fig. 1a). A administração crônica de CORT em alta dose diminuiu significativamente o peso corporal dos camundongos, e uma dose alta de berberina reverteu os efeitos negativos do CORT no peso corporal (Arquivo adicional 1: Fig. S1). O CORT diminuiu acentuadamente o tempo de duração na zona central, a distância total e o número de transições de zona no OFT em camundongos (Fig. 1b–e). A dose alta (200 mg/kg/dia) de berberina reverteu significativamente as alterações comportamentais induzidas por CORT (Fig. 1c–e). No TST, o CORT aumentou significativamente a duração da imobilidade em comparação com outros grupos (Fig. 1f) e o mesmo padrão foi observado no FST (Fig. 1g). No SPT, os resultados mostraram um efeito significativo do CORT no consumo de solução de sacarose, e a dose alta (200 mg/kg/dia) de berberina reverteu as alterações comportamentais induzidas por CORT (Fig. 1h). Coletivamente, esses resultados sugerem que o tratamento com berberina, especialmente em doses altas (200 mg/kg), pode atenuar as alterações comportamentais associadas à depressão induzida por CORT.

A berberina reverte os níveis de citocinas periféricas e cerebrais

Efeitos da berberina sobre as citocinas séricas e respostas neuroinflamatórias no córtex pré-frontal e hipocampo. a Cronograma da administração de CORT, testes comportamentais e western blotting e ensaio de ELISA. b Efeitos da berberina sobre o nível sérico da citocina IL-6. A CORT aumentou significativamente a concentração de IL-6 em comparação com os camundongos dos grupos controle e berberina em alta dose (ANOVA unidirecional, F (3, 8) = 13,80, P = 0,0016; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0020, CORT vs. BBR200, P = 0,0021, n = 3 em cada grupo). c Efeitos da BBR sobre o nível sérico da citocina IL-1β. A CORT aumentou significativamente a concentração de IL-1β (ANOVA unidirecional, F (3, 8) = 147,1, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, todas as comparações P < 0,0001, n = 3 em cada grupo). d Efeitos da berberina sobre o nível sérico da citocina TNF-α. A CORT aumentou significativamente a concentração de TNF-α (ANOVA unidirecional, F (3, 8) = 46,96, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, todas as comparações P < 0,0001, n = 3 em cada grupo). e Efeitos da berberina sobre o nível sérico da citocina IL-10. A CORT diminuiu significativamente a concentração de IL-10 (ANOVA unidirecional, F (3, 8) = 253,1, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, todas as comparações P < 0,0001, n = 3 em cada grupo). f Os efeitos da berberina sobre o nível de citocinas no córtex pré-frontal medidos por western blot. Os camundongos CORT apresentaram diferença significativa em quatro citocinas (ANOVA bidirecional, fator de linha F (3, 41) = 26,78, P < 0,0001, fator de coluna F (3, 41) = 13,61, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P < 0,0001, CORT vs. BBR100, P < 0,0001, CORT vs. BBR200, P = 0,0003, n = 3 em cada grupo). g Os efeitos da berberina sobre o nível de citocinas no hipocampo medidos por western blot. Os camundongos CORT apresentaram diferença significativa em quatro citocinas (ANOVA bidirecional, fator de linha F (3, 41) = 18,07, P < 0,0001, fator de coluna F (3, 41) = 8,34, P = 0,0002; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0007, CORT vs. BBR100, P = 0,0010, CORT vs. BBR200, P = 0,0003, n = 3 em cada grupo). Os gráficos de barras mostram a média ± EPM; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. CORT corticosterona, BBR berberina, ANOVA análise de variância, ELISA ensaio imunoenzimático.

As citocinas TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10 foram avaliadas no sangue, córtex pré-frontal (CPF) e hipocampo usando ensaio de ELISA e western blotting (Fig. 2a). A análise ANOVA de uma via mostrou um efeito significativo do CORT tanto periférico quanto no CPF e hipocampo. A berberina preveniu efetivamente o aumento induzido por CORT nas citocinas pró-inflamatórias, enquanto aumentou a citocina anti-inflamatória IL-10 reduzida pelo CORT (Fig. 2b–e). Os resultados do western blotting no CPF e hipocampo mostraram um padrão semelhante ao ELISA, onde o tratamento com CORT aumentou significativamente os níveis de citocinas pró-inflamatórias, incluindo TNF-α, IL-1β e IL-6. Duas doses de berberina reverteram marcadamente os níveis de citocinas no CPF e hipocampo (Fig. 2f, g).

A análise bioinformática de RNA-seq e análise de qPCR identificou NLRP3 como um gene central em camundongos CORT

Análise de RNA-seq. a Representação dos genes diferencialmente expressos representados pelo diagrama de Venn. b Representação do heatmap representando os principais genes diferencialmente expressos entre os grupos CON e CORT, n = 3 em cada grupo. c Representação do heatmap representando os principais genes diferencialmente expressos entre os grupos CORT e BBR, n = 3 em cada grupo. d Os resultados da qPCR mostraram que a expressão de NLRP3 no CPF em CORT foi maior do que em camundongos CON e BBR (ANOVA de uma via, F (2, 6) = 44,11, P = 0,0003; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0002, CORT vs. BBR, P = 0,0012, n = 3 em cada grupo). e Os resultados da qPCR mostraram que a expressão de caspase-1 no CPF em CORT foi maior do que em camundongos CON e BBR (ANOVA de uma via, F (2, 6) = 28,61, P = 0,0009; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0006, CORT vs. BBR, P = 0,0049, n = 3 em cada grupo). f Os resultados da qPCR mostraram que a expressão de IL-1beta no CPF em CORT foi maior do que em camundongos CON e BBR (ANOVA de uma via, F (2, 6) = 17,86, P = 0,0030; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0018, CORT vs. BBR, P = 0,0397, n = 3 em cada grupo). g Representação dos principais termos de ontologia genética associados entre os grupos CON e CORT. h Representação dos principais termos de ontologia genética associados entre os grupos CORT e BBR. i Representação das principais vias de enriquecimento KEGG entre os grupos CON e CORT. j Representação das principais vias de enriquecimento KEGG entre os grupos CORT e BBR. CON controle, CORT corticosterona, BBR berberina, ANOVA análise de variância, NLRP3 proteína 3 do domínio térmico associada ao receptor NOD-like, qPCR reação em cadeia da polimerase quantitativa por transcrição reversa, CPF córtex pré-frontal

Para explorar as alterações em todo o transcriptoma após exposição crônica ao CORT no cérebro de camundongos, o gene diferencialmente expresso (DEG) dos dados de sequenciamento de RNA do córtex pré-frontal foi analisado para identificar um gene hub. O arquivo adicional 1: Tabela S4 mostra o controle de qualidade das leituras mapeadas para cada amostra de RNA-seq. A administração crônica de alta concentração de CORT alterou significativamente a expressão de 310 genes em comparação com o grupo controle, e a berberina (200 mg/kg/dia) alterou a expressão de 128 genes em comparação com o grupo CORT (Fig. 3a). Quarenta e quatro genes foram alterados nos critérios entre o grupo controle e o grupo CORT, e o heatmap das listas de DEGs revelou que os genes foram alterados na direção oposta. A análise de DEG identificou NLRP3 como um dos genes hub entre aqueles alterados em ambas as comparações de controle vs. CORT e CORT vs. berberina. A administração crônica de CORT potencialmente aumentou a expressão do inflamassoma NLRP3 no PFC em comparação com camundongos criados normalmente e camundongos tratados com berberina (Fig. 3b, c). A alteração da expressão de mRNA de NLRP3, caspase-1 e IL-1β no PFC foi confirmada por ensaio de qPCR (Fig. 3d–f). Os DEGs foram enriquecidos para vários termos relevantes de ontologia genética (GO). A análise de componente celular GO indicou que o CORT exibiu diferenças significativas em genes envolvidos nas vias de resposta à membrana sináptica, sinapse neurônio a neurônio e densidade pós-sináptica, que têm sido associadas à depressão e plasticidade neural, em comparação com o grupo controle BBR exibiu diferenças significativas em genes envolvidos nas vias de sinapse neurônio a neurônio, especialização pós-sináptica, membrana sináptica e densidade pós-sináptica em comparação com CORT (Fig. 3g, h). A análise de enriquecimento de vias KEGG dos DEGs entre o grupo controle e o grupo CORT encontrou a via de sinalização MAPK, orientação de axônios, via de sinalização HIF-1 e biossíntese de esteroides. Tanto MAPK quanto HIF-1 são sinais a montante para o inflamassoma NLRP3 através da ativação mediada de NF-κB (Fig. 3i, j). Juntos, esses resultados indicam que o CORT pode induzir neuroinflamação, bem como déficit de neuroplasticidade no PFC. Portanto, hipotetizamos que as anomalias neuronais resultantes da exposição ao estresse crônico induzido por CORT a longo prazo estão associadas ao inflamassoma NLRP3 e à disfunção sináptica nas redes cerebrais e resultam em alteração de episódios emocionais.

A berberina reverte a neuroinflamação no córtex pré-frontal e no hipocampo ao inibir a via de sinalização NLRP3.

Berberina reverte a neuroinflamação no córtex pré-frontal e hipocampo ao inibir o inflamassoma NLRP3. a Representação do tempo de injeção de BrdU e ilustração de uma imagem do alvo do CPF e hipocampo. b Imunofluorescência do inflamassoma NLRP3 na sub-região do giro denteado do hipocampo. Barra de escala, 100 µm. c Imunofluorescência do inflamassoma NLRP3 na sub-região CA1 do hipocampo. Barra de escala, 100 µm. d Imunofluorescência do inflamassoma NLRP3 no CPF. Barra de escala, 100 µm. e Células NLRP3+ (verde) e células Iba1+ (vermelho) no GD do hipocampo, CORT aumentou as células NLRP3+/Iba1+ no GD (ANOVA de uma via, F(3, 8) = 18,63, P = 0,0006; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0002, CORT vs. BBR100, P = 0,0112, CORT vs. BBR200, P = 0,0047, n = 3 em cada grupo). f Células NLRP3+ (verde) e células Iba1+ (vermelho) na CA1 do hipocampo, CORT aumentou as células NLRP3+/Iba1+ na CA1 (ANOVA de uma via, F(3, 8) = 12,28, P = 0,0023; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0021, CORT vs. BBR100, P = 0,7604, CORT vs. BBR200, P = 0,0115, n = 3 em cada grupo). g Células NLRP3+ (verde) e células Iba1+ (vermelho) no CPF, CORT aumentou as células NLRP3+/Iba1+ no CPF (ANOVA de uma via, F(3, 8) = 141,0, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, todas as comparações P < 0,0001, n = 3 em cada grupo). h Western blotting de NLRP3/Caspase-1/ASC no CPF, os camundongos CORT mostraram diferença significativa na via de sinalização NLRP3 (ANOVA de duas vias, fator de linha F(2, 36) = 10,30, P = 0,0003, fator de coluna F(3, 36) = 24,85, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, todas as comparações P < 0,0001, n = 3 em cada grupo). i Western blotting de NLRP3/Caspase-1/ASC no hipocampo, os camundongos CORT mostraram diferença significativa na via de sinalização NLRP3 (ANOVA de duas vias, fator de linha F(2, 41) = 25,79, P < 0,0001, fator de coluna F(3, 41) = 37,04, P < 0,0001; testes de comparações múltiplas de Dunnett, todas as comparações P < 0,0001, n = 3 em cada grupo). Os gráficos de barras mostram a média ± EPM; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. CON controle, CORT corticosterona, BBR berberina, ANOVA análise de variância, NLRP3 proteína 3 do domínio de pirina associada ao receptor NOD-like, qPCR reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real, CPF córtex pré-frontal.

A administração crônica de CORT ativa o inflamassoma via NLRP3 e suas moléculas de sinalização associadas, incluindo a regulação de caspase-1 e ASC, que subsequentemente desempenham um papel significativo na neuroinflamação e neurotoxicidade. Examinamos a expressão de NLRP3 no PFC e no hipocampo (Fig. 4a). A expressão aumentada de NLRP3 foi detectada nas sub-regiões DG e CA1 do hipocampo, bem como no córtex pré-frontal, em camundongos com depressão induzida por CORT (Fig. 4b–d). Tanto o tratamento com baixa quanto com alta dose de berberina reduziu significativamente a ativação do inflamassoma, demonstrado pela diminuição da expressão de NLRP3 (Fig. 4e–g). Os resultados do western blotting foram consistentes com a marcação por imunofluorescência, indicando que a administração crônica de CORT aumentou notavelmente os níveis de expressão de NLRP3, caspase-1 e ASC no hipocampo e no córtex pré-frontal do cérebro dos camundongos. O tratamento com berberina reverteu a ativação do inflamassoma NLRP3, demonstrado pela diminuição dos níveis de expressão de NLRP3, caspase-1 e ASC (Fig. 4h, i). Investigamos ainda se o nível do inflamassoma NLRP3 poderia estar correlacionado com características comportamentais chave dos camundongos, incluindo tempo na zona central do OFC, número de transições de zona do OFT, duração da imobilidade no FST, duração da imobilidade no TST e preferência por sacarose no SPT. Os dados do inflamassoma NLRP3 obtidos de 28 camundongos (n = 7 em cada grupo) foram agrupados para análise de correlação. Os componentes do inflamassoma NLRP3 mostraram alta correlação entre si. Um agrupamento do nível do inflamassoma NLRP3 no córtex pré-frontal correlacionou-se inversamente com o tempo na zona central, o número de transições de zona e a preferência por sacarose. No entanto, o nível do inflamassoma NLRP3 no PFC mostrou uma correlação positiva com a duração da imobilidade (Arquivo adicional 1: Fig. S3). Esses achados são consistentes com as conclusões gerais dos resultados apresentados em camundongos, indicando que a expressão de NLRP3 está elevada em camundongos deprimidos e diminuída em condições normais. Em conjunto, esses resultados identificam que o CORT induziu depressão em camundongos através de uma via de sinalização elevada de NLRP3, enquanto a berberina exibiu efeitos antidepressivos através de uma via de sinalização suprimida de NLRP3.

Efeitos da berberina na plasticidade neural e na neurogênese adulta do hipocampo

Berberina aumenta a plasticidade sináptica nas sub-regiões DG e CA1 do hipocampo e a neurogênese adulta induzidas por CORT. a Representação do cronograma dos experimentos e ilustração da imagem do alvo do PFC e do hipocampo. b Imagens do DG hipocampal mostram a diminuição da intensidade do sinal de PSD95 e SYN no grupo CORT, e tanto BBR100 quanto BBR200 aumentaram o número de células PSD95+ e SYN+ (ANOVA de uma via, F (3, 8) = 10,12, P = 0,0043; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0,0021, CORT vs. BBR100, P = 0,0251, CORT vs. BBR200, P = 0,0081, n = 3 em cada grupo). Barra de escala, 100 µm. c Representação da marcação por imunofluorescência do CA1 hipocampal, CORT diminuiu significativamente o número de células PSD95+ e SYN+ em comparação com BBR100 e BBR200 (ANOVA de uma via, F (3, 8) = 84,63, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, todas as comparações P < 0,0001, n = 3 em cada grupo). Barra de escala, 100 µm. d NeuN (vermelho) e BrdU (verde) em imagens do DG hipocampal (ANOVA de uma via, F (3, 8) = 155,0, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, todas as comparações P < 0,0001, n = 3 em cada grupo). Barra de escala, 50 µm. e DAPI (azul) e DCX (vermelho) em imagens do DG hipocampal (ANOVA de uma via, F (3, 8) = 220,0, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, todas as comparações P < 0,0001, n = 3 em cada grupo). Barra de escala, 100 µm. f Porcentagem da área de PSD95+/SYN+ no DG hipocampal. g Porcentagem da área de PSD95+/SYN+ no CA1 hipocampal. h Densidade de células BrdU+ no DG hipocampal. i Densidade de células DCX+ no DG hipocampal. j Ensaio de Western blotting para PSD95 e SYN, os camundongos CORT mostraram uma diferença significativa na expressão de PSD95 e SYN (ANOVA de duas vias, fator de linha F (1, 19) = 11,90, P = 0,0027, fator de coluna F (3, 19) = 30,06, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, todas as comparações P < 0,0001, n = 3 em cada grupo). Os gráficos de barras mostram a média ± EP; *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001. CORT corticosterona, BBR berberina, ANOVA análise de variância, DG giro denteado, DCX Dupla-cortina, BrdU Bromodesoxiuridina, PSD95 proteína de densidade pós-sináptica 95, SYN sinapsina
Combinado com as alterações comportamentais e nos níveis de citocinas, levantamos a hipótese de que a administração a longo prazo de CORT induziu neurotoxicidade via neuroinflamação associada ao inflamassoma NLRP3, resultando em déficits cognitivos, que interrompem a plasticidade sináptica e contribuem para a sinaptogênese desregulada. Para explorar melhor se os efeitos da berberina poderiam regular a neuroplasticidade e a neurogênese, detectamos a densidade de espinhas na plasticidade sináptica e na neurogênese no hipocampo de camundongos via western blotting, marcação por imunofluorescência, coloração de Golgi-Cox e TEM (Fig. 5a). Nas sub-regiões DG e CA1 do hipocampo dos camundongos CORT, os níveis de expressão de PSD95 e SYN foram significativamente diminuídos (Fig. 5b, c, f, g). Tanto o tratamento com baixa quanto com alta dose de berberina atenuou significativamente as alterações induzidas por CORT, indicando que a berberina reduziu os defeitos sinápticos gerados sob os resultados do estresse induzido por CORT (Fig. 5b, c, f, g). A marcação por imunofluorescência ilustrou que a administração a longo prazo de CORT resultou em uma redução significativa na densidade de neurônios imaturos recém-gerados marcados com BrdU e DCX no hipocampo de camundongos (Fig. 5d, e, h, i). O tratamento com berberina também aumentou as células positivas para BrdU e DCX (Fig. 5d, e, h, i).
A berberina aumenta a neurogênese adulta hipocampal induzida por CORT.
a Representação da coloração de Golgi-Cox do neurônio adulto hipocampal.
b Resultados da densidade de espinhas da coloração de Golgi (ANOVA de uma via, F (3, 8) = 17.10, P = 0.0008; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0.0005, CORT vs. BBR100, P = 0.0112, CORT vs. BBR200, P = 0.0010, n = 3 em cada grupo).
c Proporção de espinhas cogumelo (ANOVA de uma via, F (3, 8) = 6.068, P < 0.0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0.0117, CORT vs. BBR200, P = 0.0432, n = 3 em cada grupo).
d Proporção de espinhas finas (ANOVA de uma via, F (3, 8) = 52.74, P < 0.0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P = 0.0001, CORT vs. BBR100, P = 0.0054, CORT vs. BBR200, P < 0.0001, n = 3 em cada grupo).
e Micrografias eletrônicas representativas mostrando a estrutura sináptica e as densidades pós-sinápticas nos neurônios. Barra de escala, 200 µm.
f Profundidade dos dendritos pós-sinápticos (ANOVA de uma via, F (3, 8) = 38.93, P < 0.0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, CORT vs. Controle, P < 0.0001, CORT vs. BBR100, P = 0.0033, CORT vs. BBR200, P = 0.0001, n = 3 em cada grupo).
g Comprimento dos dendritos pós-sinápticos (ANOVA de uma via, F (3, 8) = 220.0, P < 0.0001; teste de comparações múltiplas de Dunnett, todas as comparações P < 0.0001, n = 3 em cada grupo).
Os gráficos de barras mostram a média ± EPM; *P < 0.05, **P < 0.01 e ***P < 0.001. CORT corticosterona, BBR berberina, ANOVA (análise de variância).
Para confirmar a função da morfologia e função dendrítica, a eliminação de espinhas dendríticas pós-sinápticas no hipocampo foi observada por coloração de Golgi-Cox. Os resultados mostraram uma perda significativa de densidade sináptica nos camundongos após exposição prolongada ao CORT (Fig. 6a, b). Para explorar como a exposição ao CORT se relaciona com as espinhas dendríticas, classificamos as espinhas dendríticas em duas categorias com base no diâmetro máximo da cabeça da espinha (diâmetro máximo das espinhas finas e em cogumelo < 0,6 µm) e no comprimento das espinhas (comprimento máximo das espinhas finas > 0,9 µm vs. comprimento máximo das espinhas em cogumelo < 0,9 µm). A administração prolongada de CORT diminuiu acentuadamente o número de espinhas dendríticas tanto em cogumelo quanto finas (Fig. 6a, c, d). Tanto a dose baixa (100 mg/kg/dia) quanto a dose alta (200 mg/kg/dia) de tratamento com berberina atenuaram a diminuição de várias espinhas em camundongos tratados com CORT (Fig. 6a, c, d). Os resultados da MET também sugeriram que a condição de estresse induzida por CORT diminui significativamente tanto a profundidade média quanto o comprimento das densidades pós-sinápticas em camundongos induzidos por CORT em comparação com os grupos controle e de tratamento com berberina (Fig. 6e–g).
Os efeitos da berberina na administração prolongada de CORT prejudicaram a função sináptica dos neurônios piramidais no mPFC.
Berberina previne a alteração de patch-clamp induzida por CORT. a Representação dos dados do neurônio excitatório do controle (preto), CORT (vermelho) e BBR 200 mg/kg/dia (verde), que foram estimulados por eletricidade de 50 a 350 pA, b representação dos dados do neurônio excitatório, que foram estimulados por eletricidade de 50 a 400 pA e registros do número de espículas (ANOVA two-way, fator linha F (7, 360) = 22,10, P < 0,0001, fator coluna F (2, 360) = 86,48, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Tukey, para 150 pA, CORT vs. controle, P = 0,0008, CORT vs. BBR, P = 0,0042; para 250 pA, CORT vs. controle, P < 0,0001, CORT vs. BBR, P = 0,0021; para 350 pA, CORT vs. controle, P < 0,0001, CORT vs. BBR, P = 0,0023, n = 3 em cada grupo). c Representação do mEPSC do controle (preto), CORT (vermelho) e BBR 200 mg/kg/dia (verde) d Representação da amplitude do mEPSC (ANOVA one-way, F (2, 31) = 1,038, P = 0,3662). e A frequência do mEPSC foi significativamente menor em CORT em comparação com CON e BBR 200 mg/kg/dia (ANOVA one-way, F (2, 31) = 6,972, P = 0,0032; teste de comparações múltiplas de Tukey, CORT vs. controle, P = 0,0046, CORT vs. BBR, P = 0,0388, n = 3 em cada grupo). f Representação do sEPSC do controle (preto), CORT (vermelho) e BBR 200 mg/kg/dia (verde) g Representação da amplitude do sEPSC (ANOVA one-way, F (2, 30) = 0,7402, P = 0,4855, n = 3 em cada grupo). h Representação da frequência do sEPSC foi significativamente menor em CORT em comparação com CON e BBR 200 mg/kg/dia (ANOVA one-way, F (2, 32) = 20,70, P < 0,0001; teste de comparações múltiplas de Tukey, CORT vs. controle, P = 0,0040, CORT vs. BBR, P < 0,0001, n = 3 em cada grupo). Os gráficos de barras mostram a média ± EPM; *P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001. CORT, corticosterona; BBR, berberina; ANOVA, análise de variância; mEPSC, corrente pós-sináptica excitatória miniatura; sEPSC, corrente pós-sináptica excitatória espontânea.
A ativação do inflamassoma NLRP3 induzindo uma resposta neuroinflamatória também pode afetar negativamente a neuroplasticidade, e a análise GO e KEGG dos resultados de RNA-seq sugeriu que a exposição prolongada ao CORT envolvia a função da sinapse. Para detectar se a exposição prolongada ao CORT altera a excitabilidade do mPFC, a frequência de potenciais de ação em resposta a passos de corrente despolarizante foi medida em neurônios piramidais do mPFC. O número de potenciais de ação eliciados (disparos induzidos) ao longo de 500 ms foi medido, enquanto a corrente variava em passos de 50 pA de −50 a 400 pA (Fig. 7a, b). Os neurônios piramidais foram caracterizados como células que apresentavam adaptação da frequência de disparo e potenciais de ação amplos, e não apresentavam descarga espontânea no potencial de membrana de repouso. Correntes despolarizantes evocaram disparos mais elevados nos camundongos do grupo controle e nos camundongos tratados com berberina (BBR200) do que no grupo CORT. Da mesma forma, foi necessária menos corrente para levar a célula a disparar potenciais em uma determinada frequência (Fig. 7a, b). Para examinar as consequências funcionais da exposição prolongada ao CORT na transmissão sináptica no mPFC, foi realizada uma gravação de patch-clamp de célula inteira de neurônios piramidais. Correntes excitatórias pós-sinápticas espontâneas (sEPSCs) e minicorrentes excitatórias pós-sinápticas (mEPSCs) foram registradas nas mesmas células por clampeamento alternado no potencial de reversão das correntes mediadas por receptores de glutamato e receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPAR), respectivamente (Fig. 7c, f). As amplitudes das sEPSCs e mEPSCs foram comparáveis entre os grupos (Fig. 7d, g), enquanto para a frequência das sEPSCs e mEPSCs, a administração de CORT inibiu significativamente tanto a frequência das sEPSCs quanto das mEPSCs em comparação com camundongos do grupo controle e do grupo berberina (200 mg/kg) (Fig. 7e, h), sugerindo que um déficit no CORT inibe a transmissão sináptica e a descarga anormal em neurônios piramidais do mPFC, o que pode então contribuir para os comportamentos do tipo depressivo observados em camundongos com administração de CORT.

Discussão

Apesar do crescente número de evidências sugerindo uma forte ligação entre transtornos neuropsiquiátricos e respostas imunes, até o momento, terapias farmacológicas com eficácia satisfatória ainda são elusivas. Os achados atuais indicam que, após exposição prolongada ao CORT, os comportamentos do tipo depressivo induzidos foram associados a respostas neuroinflamatórias notáveis relacionadas ao inflamassoma NLRP3 e citocinas, bem como à função eletrofisiológica no PFC e à estrutura neuronal no hipocampo de camundongos. Notavelmente, a berberina atenuou as alterações comportamentais e regulou a via de sinalização do NLRP3 com citocinas superexpressas, consequentemente, revertendo a deterioração da plasticidade neural induzida pelo CORT.
Neste estudo, análises de DEG foram inicialmente identificadas no PFC por meio da avaliação das funções dos genes usando sequenciamento de alto rendimento. O NLRP3 foi considerado superexpresso como um gene central no PFC de camundongos com depressão induzida por CORT, sugerindo que o NLRP3 pode desempenhar um papel fundamental e participar do desenvolvimento e da patogênese da depressão. Descobertas de estudos pré-clínicos e clínicos anteriores indicaram que as vias mediadas pelo inflamassoma NLRP3 podem estar envolvidas em diversos transtornos neuropsiquiátricos, incluindo a depressão induzida por neuroinflamação. Conforme revelado por western blotting e imunofluorescência, os dados atuais sugerem que a via de sinalização do NLRP3 foi ativada em camundongos com depressão induzida por CORT, enquanto a berberina reduziu a atividade da via de sinalização do NLRP3 no hipocampo e no PFC. A IL-1β é um dos principais mediadores da comunicação entre o sistema imunológico e o SNC. O inflamassoma NLRP3 processa a pró-IL-1β em interleucinas maduras e atua como um mediador pró-inflamatório; foi confirmado que a IL-1β estava elevada no soro de pacientes com depressão e associada aos escores de inventários de depressão. Em conjunto, esses resultados confirmaram que o NLRP3 estava envolvido no processo de neuroinflamação e atuou como um modulador no desenvolvimento da depressão. Enquanto isso, vários estudos demonstraram que a depressão é acompanhada por remodelação dendrítica em neurônios do PFC e do hipocampo. O RNA derivado do cérebro pode regular o desenvolvimento de espinhas dendríticas e, portanto, pode estar envolvido na regulação da plasticidade neural e do comportamento. As características estruturais e morfológicas dos neurônios obtidas por coloração de Golgi e MET mostraram que o CORT induziu alterações específicas na sinapse. Além disso, a administração de CORT diminuiu a função de transmissão sináptica excitatória, conforme revelado por registros eletrofisiológicos de mEPSCs e sEPSCs em neurônios piramidais do mPFC. Essas alterações podem ser atribuídas a funções neurobiológicas prejudicadas associadas à ativação do inflamassoma NLRP3.
É bem documentado que os glicocorticoides são anti-inflamatórios eficazes e têm sido frequentemente aplicados para condições inflamatórias, incluindo doenças autoimunes. No entanto, a hipersecreção de glicocorticoides estabelece uma base para a hipótese de neuroinflamação em relação à patogênese da depressão. As atividades imunossupressoras dos glicocorticoides regulam negativamente as vias relacionadas à pró-inflamação, incluindo a ativação mediada por glicocorticoides. Especificamente, os receptores Toll-like (TLRs) podem ser ativados por glicocorticoides, aumentando a expressão de vários membros da família TLRs, que é crítica para a resposta inflamatória. Como agonista do receptor de glicocorticoides, o CORT ativou o receptor de glicocorticoides, aumentando a expressão do receptor purinérgico e resultando na hipersecreção de IL-6. Enquanto isso, pode estimular a ativação do inflamassoma NLRP3, facilitando a indução de NLRP3 e a formação do inflamassoma, os glicocorticoides promovem a ativação da neuroinflamação e a liberação da citocina pró-inflamatória IL-1β. Os TLRs em monócitos circulantes podem ser ativados por DAMPs ou PAMPs, a transcrição do inflamassoma NLRP3 e combinar ASC e pro-caspase-1, então processa pro-IL-1β em IL-1β, levando à liberação de citocinas maduras no meio extracelular e resposta inflamatória. A superprodução de citocinas como IL-1β, TNF-α e IFN-γ resulta ainda na disfunção do metabolismo das monoaminas, incluindo a superexpressão da indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), levando à produção de metabólitos da quinurenina a partir do triptofano. Como um inibidor natural da IDO, a berberina diminuiu a produção de quinurenina, que é subsequentemente convertida em metabólitos com efeitos moduladores na neurotransmissão glutamatérgica. Esses achados ilustram que os potenciais efeitos antidepressivos da berberina são atribuídos à sua ação anti-inflamatória, especialmente por inibir a ativação do inflamassoma NLRP3. Deve-se notar que nossos resultados foram limitados ao PFC e hipocampo; algumas outras regiões cerebrais relacionadas à depressão, como hipotálamo, amígdala e locus coeruleus, não foram incluídas no presente estudo.

Conclusão

Em conclusão, os achados deste estudo ilustraram que a berberina, por meio da supressão da via de sinalização NLRP3/caspase-1/ASC/IL-1β, desempenha um papel fundamental na atenuação das anomalias neuronais acompanhadas por alteração emocional induzida pela administração prolongada de CORT. A berberina atenua o prejuízo da neuroplasticidade e neurogênese ao inibir a resposta neuroinflamatória no PFC e hipocampo.

Informações Suplementares

Abreviações
ANOVA
Análise de variância
BBB
Barreira hematoencefálica
BBR
Berberina
CCMR
Centro de Medicina Comparativa em Pesquisa
CNS
Sistema nervoso central
CORT
Corticosterona
CULATR
Comitê de Uso de Animais Vivos em Ensino e Pesquisa
DALYs
Anos de vida ajustados por incapacidade
DAMPS
Padrões moleculares associados a danos
DEG
Gene diferencialmente expresso
ELISA
Ensaio de imunoabsorção enzimática
FST
Teste de natação forçada
HPA
Hipotálamo–hipófise–adrenal
NLRP3
Proteína 3 associada ao domínio de proteína térmica do receptor tipo NOD
OFT
Teste de campo aberto
PAMPS
Padrões moleculares associados a patógenos
PFC
Córtex pré-frontal
qPCR
Reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa
SPT
Teste de preferência por sacarose
TEM
Microscópio eletrônico de transmissão
TST
Teste de suspensão pela cauda

Nota do Editor

A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Zongshi Qin e Dong-Dong Shi contribuíram igualmente para este estudo

Contribuições dos autores

ZQ e DDS projetaram a pesquisa. ZZ e ZW supervisionaram os experimentos e revisaram o manuscrito. ZQ, DDS, WL, DC, YDZ, SZ, JZ e TB realizaram os experimentos e coletaram os dados. ZQ e DDS analisaram os dados e construíram as figuras. ZQ redigiu o manuscrito e DDS o revisou. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Financiamento

Este estudo foi apoiado por bolsas da National Natural Science Foundation of China (31900730) e do Shanghai Science and Technology Committee (20XD1423100).

Disponibilidade de dados e materiais

Os dados brutos que suportam as conclusões deste artigo serão disponibilizados pelos autores, sem reservas indevidas, a qualquer pesquisador qualificado mediante solicitação.

Declarações

Aprovação ética e consentimento para participação
Este estudo animal foi revisado e aprovado pelo Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research (CULATR No. 5582-20), LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong.

Consentimento para publicação

Não aplicável.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Referências

Colaboradores de Doenças e Lesões: carga global, regional e nacional de 12 transtornos mentais em 204 países e territórios, 1990–2019: uma análise sistemática para o Estudo de Carga Global de Doenças 2019
Colaboradores de Doenças e Lesões: carga global de 369 doenças e lesões em 204 países e territórios, 1990–2019: uma análise sistemática para o Estudo de Carga Global de Doenças 2019
Depressão
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