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pmid: "26182429"
title: "Homocisteína alta induz depleção de betaína."
authors: "Imbard A, Benoist JF, Esse R, Gupta S, Lebon S, de Vriese AS, de Baulny HO, Kruger W, Schiff M, Blom HJ"
journal: "Bioscience reports"
pubdate: "2015 Apr 28"
doi: "10.1042/BSR20150094"
source: "PMC Full Text"

Homocisteína alta induz depleção de betaína.

Autores

Imbard A, Benoist JF, Esse R, Gupta S, Lebon S, de Vriese AS, de Baulny HO, Kruger W, Schiff M, Blom HJ

Periodico

Bioscience reports (2015 Apr 28)

Conteudo

A homocisteína elevada induz a depleção de betaína
Demonstramos no presente estudo que a betaína-homocisteína (Hcy) metiltransferase (BHMT) é uma via principal para a remoção de Hcy em todas as situações de hiper-homocisteinemia (HHcy). A hiper-homocisteinemia induz a depleção de betaína no plasma e nos tecidos, exceto nos rins, onde a betaína pode desempenhar um papel crucial como osmólito.
A betaína é o substrato da betaína-homocisteína (Hcy) metiltransferase (BHMT) específica do fígado e dos rins, uma via alternativa para a remetilação da Hcy. Nossa hipótese foi que a BHMT é uma via principal para a remoção da homocisteína em casos de hiper-homocisteinemia (HHcy). Portanto, medimos a betaína no plasma e nos tecidos de pacientes e modelos animais de HHcy de causa genética e adquirida. O plasma foi coletado de pacientes apresentando HHcy sem qualquer tratamento interferente na Hcy. O plasma e os tecidos foram coletados de modelos de ratos com HHcy induzida por dieta e de um modelo de camundongo com deficiência de cistationina β-sintase (CBS). S-adenosil-metionina (AdoMet), S-adenosil-homocisteína (AdoHcy), metionina, betaína e dimetilglicina (DMG) foram quantificados por ESI—LC–MS/MS. A expressão de mRNA foi quantificada usando PCR em tempo real quantitativo (QRT-PCR). Para todos os pacientes com diversas causas de HHcy, as concentrações plasmáticas de betaína estavam abaixo dos valores normais do nosso laboratório. No modelo de rato com HHcy induzida por dieta, a betaína diminuiu em todos os tecidos analisados (fígado, cérebro, coração). No modelo de camundongo com deficiência de CBS, a betaína diminuiu no plasma, fígado, coração e cérebro, mas foi conservada nos rins. Surpreendentemente, a expressão e a atividade da BHMT diminuíram no fígado. No entanto, nos rins, a expressão de BHMT e SLC6A12 aumentou em camundongos com deficiência de CBS. A HHcy crônica, independentemente de sua causa, induz a depleção de betaína no plasma e nos tecidos (fígado, cérebro e coração), indicando uma diminuição global no pool corporal de betaína. Nos rins, as concentrações de betaína não foram afetadas, possivelmente devido à superexpressão do transportador de betaína SLC6A12, onde a betaína pode ser conservada devido ao seu papel crucial como osmólito.
INTRODUÇÃO
Homocisteína (Hcy) é um composto tóxico envolvido na fisiopatologia de vários distúrbios. É produzida no ciclo de metilação, um processo celular essencial, incluindo metilação do DNA, metilação de proteínas, síntese de lipídios, síntese de neurotransmissores e desintoxicação através da doação do grupo metil da S-adenosil-metionina (AdoMet), também chamada de doador universal de metil (Figura 1). Após a transferência do grupo metil, a AdoMet é convertida em S-adenosil-homocisteína (AdoHcy), que é hidrolisada pela AdoHcy hidrolase em adenosina e Hcy. As concentrações celulares de Hcy são rigorosamente reguladas. A Hcy pode ser catabolizada pela via da trans-sulfuração ou remetilada em metionina. Essa remetilação em metionina pode ocorrer através de uma via ubíqua catalisada pela metionina sintase (MS), que utiliza 5-metiltetrahidrofolato como doador de metil, ou através da via alternativa tecido-específica da betaina-homocisteína metiltransferase (BHMT), usando betaina como doador de metil. A BHMT é expressa principalmente no fígado e nos rins. No entanto, apesar dessa expressão limitada, a BHMT converte uma grande parte da Hcy formada no corpo.
Metabolismo da remetilação e trans-sulfuração da Hcy e sua interconexão com o metabolismo da betaina
Enzimas são apresentadas em itálico
A betaina tem sido usada há muito tempo como componente da estratégia terapêutica, juntamente com restrição dietética e suplementação vitamínica, na homocistinúria clássica [deficiência de cistationina β-sintase (CBS)] para diminuir as concentrações de Hcy. A terapia com betaina isolada demonstrou reduzir as concentrações de Hcy e prevenir complicações vasculares, entre outros. A betaina também tem sido amplamente utilizada em distúrbios de remetilação [por exemplo, metabolismo intracelular da cobalamina e deficiências de metileno-tetrahidrofolato redutase (MTHFR)] para diminuir as concentrações de Hcy e aumentar as concentrações de metionina.
A betaina pode ser fornecida pela dieta ou produzida in vivo a partir de seu precursor colina, também fornecido pela dieta. A betaina é abundante em cereais, especialmente trigo, e em vegetais da família da beterraba, incluindo espinafre, acelga e beterraba. Há um consenso geral de que o aporte dietético de betaina está entre 100 e 300 mg/dia. A conversão de colina em betaina é uma via de duas etapas localizada nas mitocôndrias do fígado e dos rins (Figura 1). Não há estimativas quantitativas da importância relativa da síntese in vivo em comparação com a ingestão alimentar, mas a importância dessas fontes pode variar com os hábitos alimentares. A colina dietética pode, em princípio, suprir todas as necessidades de colina e betaina. O contrário não se aplica, embora a betaina tenha um efeito poupador de colina. A betaina é muito bem reabsorvida nos rins e a maior parte de sua eliminação ocorre através de seu metabolismo pela BHMT.
Além de seu papel como doador de metila para a remetilação da Hcy, a betaína desempenha outras funções essenciais nas células de mamíferos. É um pequeno composto zwitteriônico em pH neutro que se comporta como um osmolito essencial para manter o volume celular sob estresse osmótico. Essa função é particularmente importante na medula renal, onde a betaína está presente em concentrações mais altas do que em outros tecidos. A betaína também é uma 'chaperona química', fornecendo proteção contra a desnaturação de proteínas, o que pode contribuir para seu efeito terapêutico em pacientes com homocistinúria.
Nossa hipótese é que a BHMT é uma via principal para a remoção de Hcy especificamente em casos de hiper-homocisteinemia (HHcy). O objetivo deste estudo foi, portanto, avaliar o status da betaína em pacientes e modelos animais com HHcy de diversas causas antes de qualquer tratamento.
EXPERIMENTAL
Pacientes
Critérios de inclusão
Analisamos retrospectivamente os resultados biológicos de pacientes com várias formas de HHcy de causa identificada antes de qualquer tratamento, para os quais a Hcy plasmática total (tHcy), metionina, betaína e dimetilglicina (DMG) foram medidas em nosso laboratório entre 2011 e 2013, no contexto do manejo padrão do paciente.
Coleta de plasma
O sangue foi coletado em heparina de lítio e centrifugado por 10 min a 4°C, 3380 g. O plasma foi aliquotado e armazenado a −20°C até a medição (dentro de 1 mês após a coleta).
Animais
Modelo de HHcy induzida nutricionalmente em ratos
O estudo foi realizado em ratas Wistar com peso corporal de aproximadamente 250 g (Iffa Credo), de acordo com as prescrições locais e o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Durante 8 semanas, os animais foram mantidos em uma das seguintes dietas: ração padrão para roedores (controles); dieta enriquecida em metionina (HM); dieta deficiente em folato, vitamina B6 e vitamina B12 (folato: 0,08 mg/kg, vitamina B6: 0,01 mg/kg, vitamina B12: 10,4 μg/kg; LV); dieta enriquecida em metionina e deficiente em folato, vitamina B6 e vitamina B12 (HMLV). Em seguida, os animais foram anestesiados com tiobutabarbital [Inactin, RBI; 100 mg/kg por via intraperitoneal (IP)] e o sangue foi coletado por punção cardíaca. Amostras de fígado, coração e cérebro foram cortadas em pequenos pedaços usando uma lâmina cirúrgica, pesadas e armazenadas a −80°C até o uso.
Modelo de camundongo CBS
Utilizamos um modelo de camundongo com deficiência de CBS descrito anteriormente. Resumidamente, camundongos transgênicos no background da linhagem C57BL6 foram gerados, nos quais a construção gênica contém a CBS humana com a mutação de sentido trocado (missense) 833 T>C. Sua expressão está sob o controle do promotor da metalotioneína e é estimulada pela adição de zinco à água de beber, produzindo a CBS humana mutante I278T. Esses animais, denominados Tg-I278T Cbs+/+, foram então acasalados com heterozigotos Cbs+/− para obter descendentes Tg-I278T Cbs+/−. Camundongos Tg-I278T Cbs+/− foram então colocados em água contendo 25 mM de sulfato de zinco para induzir a expressão do transgene e retrocruzados uma segunda vez com animais Cbs+/− para gerar camundongos Tg-I278T Cbs−/−. A atividade residual da isoforma humana mutante resgata o fenótipo de letalidade neonatal de Cbs−/−. Após o desmame, a água com zinco foi substituída por água pura. Os animais foram alimentados com ração padrão para roedores (Teklad 2018SX; Harlan Teklad) ad libitum e sacrificados após 50–330 dias de nascimento. O cérebro, fígado, coração e rim foram então extraídos e armazenados a −80°C até análise posterior. Estes estudos foram aprovados pelo IACUC do Fox Chase Cancer Center.

Preparação dos tecidos
O homogeneizado de tecidos foi preparado em gelo em HCl 0,1 N (10 ml/g de peso úmido do tecido) com um homogeneizador OMNI-2000 (Omni 2000, OMNI International). Imediatamente após a homogeneização, uma parte do homogeneizado foi processada para determinação de AdoMet e AdoHcy, conforme descrito abaixo. O restante foi aliquotado e armazenado a −80°C até o uso.

Medição de metabólitos
Para quantificação de AdoMet e AdoHcy, o homogeneizado de tecido foi prontamente diluído 10 vezes em HCl 0,1 N sob gelo até um volume final de 250 μl, seguido pela adição de 156 μl de ácido perclórico a 10% para desproteinização. Após centrifugação por 10 min a 2000 g a 4°C, o sobrenadante foi submetido a um procedimento de extração em fase sólida de troca aniônica fraca usando uma coluna de extração Waters Oasis HLB 3cc (30 mg) (Waters) e analisado por LC-MS/MS com diluição de isótopos estáveis, conforme descrito anteriormente em detalhes.

As concentrações de tHcy e metionina foram medidas por um método ESI-LC-MS/MS descrito anteriormente.

Betaína e DMG foram analisados simultaneamente (em plasma e homogeneizados de tecidos) após desproteinização por um método LC-MS/MS descrito anteriormente.

Todas as medições de metabólitos realizadas em homogeneizados de tecidos foram normalizadas pelo conteúdo de proteína. A concentração de proteína foi determinada com o Kit de Ensaio de Proteína do Ácido Bicinconínico (Pierce) usando BSA como padrão.

Atividade da BHMT
Aproximadamente 20 mg de tecido foram triturados em homogeneizadores de vidro frios em 1 ml de tampão KH2PO4 50 mM, pH 8. Setecentos microlitros do homogeneizado foram misturados com 100 μl de DTT 35 mM e 100 μl de Hcy 10 mM e pré-incubados por 5 min a 37°C. A reação foi então iniciada pela adição de 100 μl de betaína 20 mM. A cada 10 min até 40 min, 50 μl da mistura de reação foram amostrados e adicionados a 450 μl de metanol para interromper a reação. Após centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um novo eppendorf com 5 μl de DTT 500 mM e 10 μl de metionina-d3 500 μM. Cada amostra foi seca sob fluxo de nitrogênio e derivatizada usando 200 μl de HCl/Butanol durante 15 min a 60°C. Finalmente, as amostras foram secas sob fluxo de nitrogênio e solubilizadas em 100 μl de tampão fosfato 200 mM, pH 7,4. Metionina e metionina-d3 foram medidas em cada amostra por ESI–LC–MS/MS no modo de monitoramento de reações múltiplas por um método de LC–MS/MS descrito anteriormente. Os resultados foram expressos em porcentagem em comparação com a média dos controles (Tg-I278T Cbs −/−) medidos no mesmo lote.
PCR quantitativo
O RNA total de tecidos hepáticos e renais foi extraído de 5 a 10 mg de tecido usando o kit RNeasy Lipid Tissue Mini Protocol da Qiagen de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). O RNA obtido foi quantificado usando um Nanodrop 2000 (Thermo scientific). A PCR em tempo real (RT-PCR) foi realizada usando 1 μg de RNA com o kit iScript cDNA Synthesis de acordo com as instruções do fabricante (Biorad Laboratories). Novos primers foram desenhados para colina desidrogenase (CHDH), betaína aldeído desidrogenase (BADH), BHMT, dimetilglicina desidrogenase (DMGDH), sarcosina desidrogenase (SARDH), SLC6A12 (primers disponíveis mediante solicitação). A PCR quantitativa (Q-PCR) foi realizada em um termociclador CFX384 Biorad C1000 (temperatura de anelamento 60°C e 40 ciclos) com SYBRgreen como fluoróforo. Uma curva de melting entre 65°C–95°C foi realizada para verificar a qualidade da amplificação. Cada amostra foi quantificada em duplicata. RPL13 foi usado como gene de referência.
Estatística
Diferenças entre vários grupos foram primeiramente buscadas pelo teste de Kruskal–Wallis. Se o teste mostrasse diferenças significativas (P<0,05), os grupos foram testados em pares pelo teste de Mann–Whitney. As análises estatísticas foram realizadas usando SPSS 17.0 para Windows (SPSS Inc.) e GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software).
Aprovação do estudo
Experimentos em ratos foram realizados de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Experimentos no modelo de camundongos CBs foram aprovados pelo IACUC do Fox Chase Cancer Center.
RESULTADOS
Pacientes
No total, incluímos 17 pacientes, dos quais oito apresentavam causa genética de HHc: três pacientes com homocistinúria clássica (deficiência de CBS), quatro pacientes com deficiência de cblC e um paciente com deficiência de MTHFR. Cinco pacientes apresentavam HHc adquirida: três bebês amamentados por mães com anemia de Biermer adquirida, um adolescente com dieta deficiente em B12 e um paciente com síndrome do intestino curto. Um paciente apresentava HHc devido ao consumo excessivo de óxido nitroso. Por fim, um paciente apresentava HHc induzida por dieta deficiente em folato e dois pacientes apresentavam HHc devido ao tratamento com metotrexato.

Concentrações de metabólitos plasmáticos nos pacientes

As concentrações de tHc, metionina, betaína e DMG dos pacientes são apresentadas na Tabela 1. As concentrações de betaína estavam abaixo dos intervalos normais do nosso laboratório (Figura 2) para todos os pacientes, independentemente da etiologia da HHc.

Concentrações plasmáticas de betaína em pacientes com HHc

As áreas cinzas representam o intervalo de referência das concentrações de betaína de acordo com a idade.

Parâmetros bioquímicos plasmáticos de pacientes com HHc

HHc genética	HHc adquirida	 	Patologia	Homocistinúria clássica	Def. cblc	Def. MTHFR	Def. B12	Óxido nitroso	Def. Folato	Metotrexato	 	Paciente N°	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	 	Idade na coleta	17 A	26 A	31 A	14 D	24 D	3 M	18 A	1 D	4 M	6 M	15 A	11 M	11 A	12 A	4 A	14 A	4 A	 	tHc (μM)	262*	631*	322*	127*	211*	154*	89*	155*	124*	90*	122*	125*	111*	155*	59*	40*	31*	 	Met (μM)	626*	322*	593*	2†	5†	7†	32	3†	7†	5†	20	9†	19†	11†	16†	11†	26	 	Betaína (μM)	11†	19†	12†	10†	10†	6†	14†	4†	8†	12†	7†	10†	13†	11†	14†	12†	15†	 	DMG (μM)	4,0	2,4	3,9	4,0	11,8	3,0	7,0	1,0†	8,0	9,0	22,2*	6,0	1,6	1,3	3,6	4,1	1,9	 	

*Concentração acima dos valores de referência do laboratório de acordo com a idade.
†Concentração abaixo dos valores de referência do laboratório de acordo com a idade.
D, dias; def., deficiência; M, meses; Met, metionina; N2O, óxido nitroso; tHc, homocisteína total; ttt, tratamento; A, anos.

Pacientes com HHc adquirida foram tratados com terapia vitamínica sem tratamento com betaína. Para esses pacientes, a evolução das concentrações de betaína e tHc durante o acompanhamento após o tratamento é mostrada na Tabela 2, quando disponível. A normalização das concentrações de tHc e betaína foi observada na primeira amostra de controle (dia 6) após o tratamento com vitamina B12 para os pacientes 9 e 12. A normalização da betaína foi atrasada em relação à tHc nos pacientes 10 e 11 (nos dias 10 e 16, respectivamente). As concentrações de tHc do paciente 14 atingiram tardiamente a faixa normal devido à persistência da administração de óxido nitroso, mas a betaína estava normal na primeira amostra coletada após o tratamento (no dia 24).

Evolução da tHc plasmática e betaína em pacientes com HHc adquirida após tratamento com vitamina B12
Número do paciente Patologia Tratamento ↓ 9 Deficiência de B12 Tempo após tratamento (dias) 0 6 9 13 tHcy (μM) 124 6 5 5 Betaína (μM) 8 38 25 28 10 Deficiência de B12 Tempo após tratamento (dias) 0 4 6 10 tHcy (μM) 90 10 3 3 Betaína (μM) 12 17 15 49 11 Deficiência de B12 Tempo após tratamento (dias) 0 5 16 tHcy (μM) 122 8 6 Betaína (μM) 7 8 30 12 Deficiência de B12 Tempo após tratamento (dias) 0 6 60 tHcy (μM) 125 6 6 Betaína (μM) 10 30 28 13 Deficiência de B12 Tempo após tratamento (dias) 0 5 tHcy (μM) 111 67 Betaína (μM) 13 14 14 HHcy induzida por N2O Tempo após tratamento (dias) 0 24 68 80 tHcy (μM) 155 66 23 6 Betaína (μM) 11 75 57 82 15 Deficiência de folato Tempo após tratamento (dias) 0 ND tHcy (μM) 59 Betaína (μM) 14 16 Tratamento com metotrexato Tempo após tratamento (dias) 0 ND tHcy (μM) 40 Betaína (μM) 12 17 Tratamento com metotrexato Tempo após tratamento (dias) 0 ND tHcy (μM) 31 Betaína (μM) 15
N2O, óxido nitroso
ND, sem dados
Concentrações de metabólitos plasmáticos em modelos animais
Modelo nutricional de HHcy em ratos
Em ratos com HHcy nutricional, todos os grupos apresentaram concentrações de tHcy significativamente aumentadas em comparação com os controles (Figura 3) e os ratos do grupo HMLV apresentaram concentrações de tHcy significativamente maiores do que os grupos HM e LV (P<0,001 e P=0,004, respectivamente). As concentrações de betaína foram diminuídas nos grupos HMLV e HM, mas não no grupo LV, em comparação com os controles.
Concentrações plasmáticas de tHcy e betaína em modelos nutricionais de HHcy em ratos
HM: Dieta rica em metionina; HMLV: Dieta rica em metionina e pobre em vitaminas B (B6, B9, B12); LV: Dieta pobre em vitaminas (B6, B9, B12); Controles: dieta padrão para roedores; As comparações foram feitas usando o teste de Mann–Whitney entre os controles e cada grupo de HHcy induzida por dieta (HMLV, HM e LV, respectivamente). Apenas as comparações significativas (P<0,05) usando o teste de Mann–Whitney são representadas nas figuras.
Modelo de camundongo com deficiência de CBS
No modelo de camundongo com deficiência de CBS, os camundongos Tg I278T Cbs-/- apresentaram concentrações plasmáticas de tHcy dramaticamente aumentadas em comparação com Tg I278T Cbs+/+ (Figura 4). Os camundongos Tg I278T Cbs+/- apresentaram um aumento mais moderado na concentração de tHcy. A metionina plasmática não foi diferente entre os três grupos (resultado não mostrado). As concentrações de betaína foram significativamente diminuídas nos camundongos Tg I278T Cbs-/- e uma tendência não significativa foi observada nos Tg I278T Cbs+/- em comparação com Tg I278T Cbs+/+.
Concentrações plasmáticas de tHcy e betaína no modelo de camundongo com deficiência de CBS
As comparações foram realizadas usando o teste de Mann–Whitney entre camundongos controle Tg I278T Cbs+/+ e camundongos deficientes homozigotos Tg I278T Cbs+/− ou camundongos deficientes heterozigotos Tg I278T Cbs−/−. Apenas as comparações significativas (P<0,05) usando o teste de Mann–Whitney estão representadas nas figuras.

Concentrações de metabólitos teciduais em modelos animais de hiper-homocisteinemia

Modelo nutricional de HHcy em ratos

Em homogenatos de fígado, os grupos HMLV e LV apresentaram diminuição da razão AdoMet/AdoHcy em comparação com os controles (Figura 5). Isso não foi encontrado no cérebro e no coração. Em homogenatos de fígado, cérebro e coração, todos os grupos de HHcy induzida nutricionalmente apresentaram concentrações diminuídas de betaína em comparação com os controles (Figura 5).

Concentrações de AdoMet, AdoHcy, razão AdoMet/AdoHcy e betaína em homogenatos de tecidos de fígado, cérebro e coração em modelos nutricionais de HHcy em ratos

HM: Dieta rica em metionina; HMLV: Dieta rica em metionina e pobre em vitaminas B (B6, B9, B12); LV: Dieta pobre em vitaminas (B6, B9, B12); Controles: Dieta padrão para roedores; As comparações foram realizadas usando o teste de Mann–Whitney entre controles e cada grupo de HHcy induzida por dieta (HMLV, HM e LV, respectivamente). Apenas as comparações significativas (P<0,05) usando o teste de Mann–Whitney estão representadas nas figuras.

Modelo de deficiência de CBS em camundongos

Camundongos Tg I278T Cbs−/− apresentaram concentrações aumentadas de AdoMet em homogenatos de fígado, cérebro e rim e um aumento de AdoHcy em todos os tecidos analisados em comparação com camundongos Tg I278T Cbs+/+. No total, camundongos Tg I278T Cbs−/− exibiram uma diminuição significativa da razão AdoMet/AdoHcy em todos os homogenatos de tecidos analisados (fígado, cérebro, coração e rim) em comparação com Tg I278T Cbs−/− (Figura 6). A metionina foi diminuída nos homogenatos de fígado de Tg I278T Cbs−/− em comparação com Tg I278T Cbs+/+ (P=0,001, resultado não mostrado). Camundongos Tg I278T Cbs−/− apresentaram concentrações de betaína diminuídas em homogenatos de fígado, cérebro e coração; também não foi significativo no cérebro. Essa diminuição não foi encontrada em homogenatos de rim, onde as concentrações de betaína são as mais altas. No fígado, camundongos Tg I278T Cbs+/− mostraram concentrações intermediárias de betaína significativamente diferentes tanto de camundongos Tg I278T Cbs−/− quanto de Tg I278T Cbs+/+.

Concentrações de AdoMet, AdoHcy, razão AdoMet/AdoHcy e em homogenatos de tecidos de fígado, cérebro e coração no modelo de deficiência de CBS em camundongos

As comparações foram realizadas usando o teste de Mann–Whitney entre camundongos controle Tg I278T Cbs+/+ e camundongos deficientes homozigotos Tg I278T Cbs+/− ou camundongos deficientes heterozigotos Tg I278T Cbs−/−. Apenas as comparações significativas (P<0,05) usando o teste de Mann–Whitney estão representadas nas figuras.

Expressão de mRNA tecidual de genes da via do metabolismo da betaína no modelo de camundongo deficiente em CBS
Quantificamos a expressão gênica dos genes envolvidos no transporte de betaína (transportador celular BGT1 codificado pelo gene SLC6A12), síntese (CHDH e BADH) e catabolismo (BHMT, DMGDH, SARDH; Figura 7). No fígado, a expressão de BHMT foi diminuída enquanto foi aumentada no rim de camundongos Tg I278T Cbs−/−. No rim, a expressão de DMGDH e BADH foi diminuída, enquanto a expressão de SLC6A12 foi aumentada em camundongos Tg I278T Cbs−/−.

Expressão de mRNA dos genes envolvidos no metabolismo da betaína em homogenatos de fígado e rim no modelo murino de deficiência de CBS
Cada amostra foi quantificada em duplicata. RPL13 foi usado como gene de referência. As comparações foram feitas usando o teste de Mann–Whitney e apenas as comparações significativas foram representadas na figura (P<0,05). *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

Atividade da BHMT na via de homogenatos de fígado do modelo murino deficiente em CBS
Em homogenatos de fígado, a expressão diminuída de BHMT nos camundongos Tg I278T Cbs−/− foi acompanhada por uma diminuição na atividade da BHMT (P=0,027; Figura 8). O aumento da expressão de BHMT em homogenatos de rim de camundongos Tg I278T Cbs−/− não pôde ser confirmado ao nível da atividade devido à atividade basal muito baixa da BHMT neste tecido.

Atividade da enzima BHMT em homogenatos de fígado no modelo murino de deficiência de CBS
Apenas as comparações significativas usando o teste de Mann–Whitney são apresentadas na figura. *P<0,05

DISCUSSÃO
No presente estudo, mostramos que a betaína está esgotada em pacientes e animais com HHcy, independentemente da etiologia da HHcy. Em modelos animais, a betaína também foi reduzida no fígado, cérebro e coração, mas não no rim. Apenas um estudo anterior relatou concentrações diminuídas de betaína na HHcy em relação ao plasma de três pacientes com homocistinúria clássica.
Como estudamos uma população pediátrica, adaptamos nosso intervalo de referência de acordo com a idade. Encontramos uma leve variação conforme a idade durante a infância (Figura 2), com maior dispersão em pacientes mais jovens. Nosso intervalo de referência para concentrações plasmáticas de betaína é comparável aos descritos na literatura. As concentrações plasmáticas de betaína foram descritas como variando de acordo com o sexo em pacientes adultos e apresentando muito pouca variação intraindividual, mas grande variação na população, o que explica o amplo intervalo de referência descrito. Em todos os pacientes com HHcy antes de qualquer tratamento, as concentrações plasmáticas de betaína estavam diminuídas (Tabela 1; Figura 2). As reduções na betaína foram bastante substanciais, em média 60% do valor normal inferior. A diminuição das concentrações de betaína em pacientes com defeitos de remetilação (p. ex., deficiência de MTHFR, MS) pode não ser surpreendente, pois, nesses pacientes, a BHMT permanece como a única enzima capaz de remetilar a Hcy em metionina. Além disso, em todas as causas de HHcy, pode ocorrer aumento do consumo de betaína devido ao acúmulo de Hcy, o substrato da BHMT. No entanto, há muito poucos dados sobre as concentrações de betaína em pacientes com HHcy, uma vez que essas doenças são relativamente raras e as concentrações de betaína ainda não são avaliadas no manejo desses pacientes.
O paciente 14 apresentou HHcy induzida por altas doses de óxido nitroso. A intoxicação por óxido nitroso foi previamente relatada como causa de degeneração combinada subaguda da medula espinhal associada a altas concentrações de tHcy plasmática. Acredita-se que esse efeito seja mediado pela ligação irreversível do óxido nitroso ao átomo de cobalto da vitamina B12, o cofator da MS, levando à oxidação da MS e, consequentemente, à remetilação prejudicada da Hcy.
Em pacientes com causas genéticas de HHcy, a betaína geralmente faz parte do tratamento. Portanto, avaliamos o efeito do tratamento nas concentrações plasmáticas de betaína e tHcy apenas em pacientes com HHcy adquirida, quando disponíveis (Tabela 2). Para esses pacientes, o tratamento consistiu em vitamina B12 por via oral ou intramuscular. Assim que a vitamina B12 é administrada, ela permite a remetilação da Hcy via MS (Figura 1). Isso deve poupar a betaína. De fato, as concentrações plasmáticas de betaína normalizaram em 6 a 16 dias, o que indica que apenas a ingestão alimentar de betaína e seu precursor, a colina, foi suficiente para corrigir a depleção de betaína.
Também estudamos as concentrações plasmáticas de tHcy e betaina em dois modelos animais de HHcy: um modelo de HHcy induzido por dieta em ratos e um modelo de causa genética de HHcy (modelo de camundongo deficiente em CBS). Em ratos, a HHcy foi induzida por deficiência de vitaminas B, sobrecarga de metionina ou uma combinação de ambas. Em todos os casos, foi observado um aumento na tHcy plasmática (Figura 3). Nos modelos nutricionais, há grandes variações interindividuais, provavelmente porque nem todas as condições biológicas podem ser controladas. Além disso, o modelo nutricional é um modelo de HHcy menos grave do que o modelo genético de camundongo com deficiência de CBS; as concentrações plasmáticas de tHcy no modelo nutricional aumentam entre três e 13 vezes em comparação com os controles e 60 vezes no modelo de camundongo deficiente em CBS. Assim como em pacientes, em ambos os modelos animais de HHcy observamos concentrações diminuídas de betaina, com exceção dos ratos com HHcy induzida por dieta pobre em vitaminas B, que apresentaram níveis mais baixos de betaina, mas sem diferença estatisticamente significativa. Em conjunto, esses dados sobre as concentrações plasmáticas de betaina sugerem que todas as situações crônicas de HHcy causarão diminuição das concentrações plasmáticas de betaina.

Como não foi possível investigar as concentrações teciduais de betaina em pacientes, medimos as concentrações de betaina nos tecidos de nossos dois modelos animais de HHcy. Optamos por medir as concentrações de betaina no fígado, pois é o órgão que apresenta a maior expressão de BHMT e no qual é uma das proteínas citosólicas mais abundantes. Já foi demonstrado anteriormente que o padrão de expressão de BHMT era semelhante em roedores e humanos. Além disso, o fígado é considerado o órgão-chave para o metabolismo da Hcy porque todas as enzimas do metabolismo da betaina, do ciclo de remetilação e da transsulfuração são expressas nele. Em um estudo anterior usando um modelo in vitro de fígado de rato, foi calculado que a remetilação da Hcy via BHMT ou via MS é quantitativamente equivalente e cada uma processa ~25% da Hcy celular, enquanto a via de transsulfuração degrada aproximadamente 50% da Hcy. Em ambos os modelos, as concentrações de betaina foram drasticamente reduzidas nos homogeneizados hepáticos dos animais com HHcy. Para o modelo nutricional de rato, a betaina foi reduzida em todas as dietas de HHcy, incluindo no grupo LV, que apresentou concentrações plasmáticas de betaina baixas, porém dentro da normalidade. No modelo de camundongo deficiente em CBS, houve uma diminuição na betaina nos camundongos Tg I278T Cbs−/− e também nos camundongos heterozigotos Tg I278T Cbs+/− em comparação com Tg I278T Cbs+/+. Isso é corroborado por um estudo anterior em um modelo animal de deficiência de MTHFR que relatou concentrações reduzidas de betaina hepática, apesar de concentrações plasmáticas de betaina conservadas.
A diminuição de betaína no fígado pode resultar de um maior consumo pela enzima BHMT, ou de uma menor síntese a partir da colina, ou de uma menor transferência celular. Para investigar isso, medimos a expressão dos genes envolvidos no metabolismo da betaína no modelo de deficiência de CBS e a atividade da BHMT. Ao contrário do que esperávamos, a expressão e a atividade da BHMT estavam reduzidas no fígado dos camundongos Tg I278T Cbs−/− (Figuras 7 e 8). Resultados semelhantes foram observados por Mclean et al. em um modelo de camundongo knockout para CBS coexpressando em nível muito baixo o transgene humano. Em contraste, um estudo anterior de Alberto et al. mostrou um aumento na expressão da BHMT contrastando com uma diminuição na atividade da BHMT no fígado de um modelo de camundongo nulo para CBS. Mas neste último modelo, Alberto e colaboradores usaram um modelo de camundongo knockout completo letal para CBS que requer suplementação de colina para ser viável. A colina, precursora da betaína, demonstrou induzir a expressão e a atividade da BHMT. Em nosso modelo de camundongo, a diminuição na expressão e atividade da BHMT pode ser induzida pelo aumento das concentrações de AdoMet. Foi demonstrado que AdoMet é um inibidor da expressão da BHMT. Gostaríamos de sugerir que, apesar da diminuição da expressão e atividade da BHMT, a redução no pool hepático de betaína poderia ser devida ao aumento do metabolismo da Hcy através da BHMT. Estudos de fluxo in vivo seriam necessários para confirmar esta hipótese.

Para avaliar melhor o pool de betaína, medimos a betaína no cérebro e no coração, dois tecidos onde a BHMT não é expressa. No cérebro, o transportador celular de betaína BGT1 está presente, mas as concentrações basais de betaína são muito baixas e uma função potencial da betaína não é conhecida. No coração, foi demonstrado que o acúmulo de betaína depende apenas das concentrações plasmáticas. Em nosso estudo, as concentrações de betaína estavam diminuídas em ambos os modelos animais nos homogenatos de cérebro e coração. A BHMT é a única enzima capaz de consumir betaína e não é expressa nesses tecidos. Nossos achados sugerem uma troca de betaína entre o plasma e os tecidos.
Em contraste com outros tecidos, as concentrações de betaína não diminuíram no rim dos camundongos Tg I278T Cbs−/−, apesar da presença da enzima BHMT e do aumento das concentrações de HHcy neste tecido. Vale ressaltar que as concentrações de betaína são as mais altas no rim em comparação com os outros tecidos. Para entender a preservação das concentrações de betaína no rim, estudamos a expressão de genes envolvidos na via de metabolismo da betaína. Encontramos um aumento na expressão de BHMT, o que é inesperado considerando as concentrações conservadas de betaína e o aumento das concentrações de AdoMet, que supostamente inibe a expressão de BHMT (Figura 5). Também encontramos um aumento na expressão gênica de SLC6A12, que codifica o transportador de betaína celular BGT1. De acordo com Kempson et al., a concentração de betaína é rigidamente regulada no rim, especialmente pelo BGT1, para neutralizar o estresse osmótico. Na HHcy, a existência de estresse osmótico no rim não foi descrita. O aumento da expressão de SLC6A12 poderia explicar as concentrações conservadas de betaína neste órgão, embora o mecanismo dessa regulação positiva na HHcy seja desconhecido.
No presente estudo, mostramos que a HHcy induzida tanto geneticamente quanto ambientalmente causa depleção de betaína, com exceção do rim. Os estoques teciduais de betaína poderiam ser redirecionados para o fígado e o rim para remetilar a Hcy. No rim, as concentrações de betaína são provavelmente críticas porque são estáveis, apesar da depleção global de betaína em outros tecidos. Isso pode ser devido ao papel osmótico da betaína, especialmente na medula renal. Devido aos múltiplos papéis da betaína como doador de metila, osmólito e molécula chaperona, a depleção de betaína poderia participar do fenótipo observado em pacientes com HHcy. Deve-se considerar tratar pacientes com HHcy inicialmente com betaína.
CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES
Apolline Imbard contribuiu para o delineamento do estudo, as medições laboratoriais e a preparação do manuscrito. Jean-François Benoist, Helene de Baulny, Manuel Schiff e Henk Blom contribuíram para o delineamento do estudo e a preparação do manuscrito. Ruben Esse, Sapna Gupta, Sophie Lebon, Warren Kruger e An de Vriese contribuíram para os procedimentos experimentais. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Abreviações
AdoHcy
S-adenosil-homocisteína
AdoMet
S-adenosil-metionina
BADH
betaína aldeído desidrogenase
BHMT
betaína-homocisteína metiltransferase
CBS
cistationina β-sintase
CHDH
colina desidrogenase
DMG
dimetilglicina
DMGDH
dimetilglicina desidrogenase
Hcy
homocisteína
HHcy
hiper-homocisteinemia
MS
metionina sintase
MTHFR
metileno-tetrahidrofolato redutase
Q
quantitativo
RT
tempo real
sarcosina desidrogenase
(SARDH)
tHcy
homocisteína plasmática total
Mecanismos da toxicidade da homocisteína em humanos
Demanda de metilação: um determinante chave do metabolismo da homocisteína
Homocisteinemia em camundongos com deficiência genética de betaína-homocisteína S-metiltransferase é independente da ingestão dietética de folato
Deleção da betaina-homocisteína S-metiltransferase em camundongos perturba o metabolismo da colina e de 1 carbono, resultando em fígado gorduroso e carcinomas hepatocelulares
Novas percepções sobre a regulação do metabolismo do grupo metila e da homocisteína
O uso de betaina para o tratamento da homocistinúria
O uso de betaina no tratamento da homocisteína elevada
Betaina no tratamento da homocistinúria devido à deficiência de 5,10-metilenotetra-hidrofolato redutase
Betaina na nutrição humana
O significado clínico da betaina, um osmólito com papel fundamental no metabolismo do grupo metila
A betaina pode poupar parcialmente a colina em pintinhos, mas apenas quando adicionada a dietas contendo um nível mínimo de colina
Regulação osmótica do transporte renal de betaina: transcrição e além
Restauração da montagem e atividade de mutantes da cistationina beta-sintase por ligantes e chaperonas químicas
A resposta vasodilatadora renal mediada pelo fator hiperpolarizante derivado do endotélio está prejudicada durante hiper-homocisteinemia aguda e crônica
Determinação de S-adenosilmetionina e S-adenosil-homocisteína em plasma e líquido cefalorraquidiano por espectrometria de massa em tandem com diluição de isótopos estáveis
Os metabólitos da metilação no líquido amniótico dependem da idade gestacional
A colina e a betaina plasmáticas correlacionam-se com o folato sérico, a S-adenosil-metionina e a S-adenosil-homocisteína plasmáticas em voluntários saudáveis
Farmacocinética da betaina oral em indivíduos saudáveis e pacientes com homocistinúria
Níveis séricos de betaina, N,N-dimetilglicina e N-metilglicina em pacientes com deficiência de cobalamina e folato e erros inatos do metabolismo relacionados
Betaina como determinante da homocisteína plasmática total após carga de metionina antes e após suplementação de vitamina B
O estado da betaina e do folato como determinantes cooperativos da homocisteína plasmática em humanos
Método simples para a determinação rotineira de betaina e N,N-dimetilglicina em sangue e urina
Variação de curto e longo prazo das concentrações plasmáticas de glicina betaina em humanos
Deficiência de vitamina B12 devido ao uso de óxido nitroso: causa não reconhecida de degeneração combinada da medula espinhal
Mieloneuropatia por abuso de óxido nitroso: níveis excepcionalmente altos de ácido metilmalônico e homocisteína
Efeitos biológicos do óxido nitroso: uma revisão mecanicista e toxicológica
A neurotoxicidade do óxido nitroso: os fatos e mecanismos "putativos"
Purificação, propriedades cinéticas e clonagem de cDNA da betaina-homocisteína metiltransferase de mamíferos
Betaina-homocisteína metiltransferase: distribuição orgânica no homem, porco e rato e distribuição subcelular no rato
Expressão da betaina-homocisteína metiltransferase em tecidos suínos e humanos e localização cromossômica do gene humano
Metabolismo da homocisteína
Metabolismo da metionina em mamíferos. Distribuição da homocisteína entre vias concorrentes
Interações betaina-homocisteína em um modelo murino de deficiência de 5,10-metilenotetra-hidrofolato redutase
Terapia de longo prazo com betaína em um modelo murino de homocistinúria por deficiência de cistationina beta-sintase: eficácia reduzida ao longo do tempo revela um efeito limiar significativo entre homocisteína elevada e risco trombótico
Camundongos deficientes em cistationina beta-sintase apresentam via de remetilação da homocisteína alterada
Interação entre metionina dietética e ingestão de doadores de metila na expressão gênica da betaína-homocisteína metiltransferase em fígado de rato e organização do gene humano
Propriedades regulatórias metabólicas da S-adenosilmetionina e S-adenosilhomocisteína
Inibição da expressão da betaína-homocisteína metiltransferase humana por S-adenosilmetionina e metiltioadenosina
O transportador de betaína/GABA e a betaína: papéis no cérebro, rim e fígado
Acúmulo de betaína dependente e independente do plasma em tecidos de ratos machos e fêmeas