pmid: "38184996"
title: "A betaína alivia o comprometimento cognitivo induzido pela homocisteína ao atenuar a piroptose microglial mediada por NLRP3 em um modelo de"
authors: "Yang ZJ, Huang SY, Zhong KY, Huang WG, Huang ZH, He TT, Yang MT, Wusiman M, Zhou DD, Chen S, Huang BX, Luo XL, Li HB, Zhu HL"
journal: "Redox biology"
pubdate: "2024 Feb"
doi: "10.1016/j.redox.2024.103026"
source: "PMC Full Text"

A betaína alivia o comprometimento cognitivo induzido pela homocisteína ao atenuar a piroptose microglial mediada por NLRP3 em um modelo de

Autores

Yang ZJ, Huang SY, Zhong KY, Huang WG, Huang ZH, He TT, Yang MT, Wusiman M, Zhou DD, Chen S, Huang BX, Luo XL, Li HB, Zhu HL

Periodico

Redox biology (2024 Feb)

Conteudo

A betaína alivia o comprometimento cognitivo induzido pela homocisteína ao atenuar a piroptose microglial mediada por NLRP3 de maneira dependente de m6A-YTHDF2☆

A demência, com a homocisteína (Hcy) como um importante fator de risco, é um grave problema de saúde pública na sociedade envelhecida. A betaína atua como doadora de metila e desempenha um papel importante na redução da Hcy. No entanto, os efeitos e mecanismos da betaína no comprometimento cognitivo induzido por Hcy permanecem obscuros. Primeiramente, ratos SD foram injetados com Hcy (400 μg/kg) através da veia caudal, e a betaína (2,5% p/v) foi suplementada via água de beber por 14 dias. A suplementação com betaína atenuou o comprometimento cognitivo induzido por Hcy nos testes de labirinto em Y e reconhecimento de novos objetos, reparando a lesão cerebral. Simultaneamente, a ativação microglial foi observada como inibida pela suplementação com betaína, utilizando imunofluorescência e análise de Sholl. Em segundo lugar, células HMC3 foram tratadas com betaína, que reduziu o nível de ROS, melhorou a ruptura da membrana celular, diminuiu a liberação de LDH, IL-18 e IL-1β, e atenuou o dano das microglias aos neurônios. Mecanisticamente, a betaína alivia o comprometimento cognitivo ao inibir a piroptose microglial, reduzindo as expressões de NLRP3, ASC, pro-caspase-1, caspase-1 clivada, GSDMD, GSDMD-N, IL-18 e IL-1β. O tratamento com betaína pode aumentar a razão SAM/SAH, confirmando seu aprimoramento na capacidade de metilação. Além disso, o tratamento com betaína aumentou a modificação N6-metiladenosina (m6A) do mRNA de NLRP3 e reduziu a estabilidade do mRNA de NLRP3 através do aumento da expressão do leitor de m6A, a proteína 2 de ligação ao RNA YTH N6-metiladenosina (YTHDF2). Finalmente, o silenciamento de YTHDF2 reverteu o efeito inibitório da betaína na piroptose. Nossos dados demonstraram que a betaína atenuou o comprometimento cognitivo induzido por Hcy ao suprimir a piroptose microglial, inibindo a via NLRP3/caspase-1/GSDMD de maneira dependente de m6A-YTHDF2.

Resumo gráfico
A betaína atenua a piroptose microglial induzida por Hcy ao inibir a via de sinalização NLRP3/caspase-1/GSDMD de maneira dependente de m6A-YTHDF2, exercendo assim efeitos neuroprotetores.

Destaques
A betaína aliviou o comprometimento cognitivo induzido pela homocisteína.
A betaína atenuou a ativação microglial e a piroptose induzidas pela homocisteína.
A betaína inibiu a piroptose microglial através da inibição da via NLRP3/caspase-1/GSDMD de maneira dependente de m6A-YTHDF2.

Introdução
A demência é um importante problema de saúde pública global, impondo uma carga social e econômica substancial para governos, comunidades, famílias e indivíduos. A prevalência global de demência excede 55 milhões de pessoas, com projeção de atingir 78 milhões até 2030. A prevenção e o controle precisos de fatores de risco importantes podem ser benéficos para prevenir ou atenuar a progressão da demência. Vários fatores de risco potenciais para declínio cognitivo ou demência foram identificados, como idade, traumatismo craniano, genes, depressão, obesidade, hipertensão e inatividade física. Além disso, evidências epidemiológicas descobriram que a elevação da homocisteína (Hcy) total no plasma é um fator de risco modificável para demência em idosos. Uma metanálise recente demonstrou um aumento de 9 % no risco de demência para cada aumento de 5 μmol/L nos níveis plasmáticos de Hcy, respectivamente. Assim, reduzir os níveis plasmáticos de Hcy e esclarecer seus mecanismos patogênicos pode ser uma estratégia promissora para prevenir e controlar a demência.
A patogênese da demência é complexa e diversa, entre os quais a ativação microglial é um evento precoce na demência. Estudos recentes demonstraram que a Hcy pode induzir a ativação microglial e a expressão de citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-6 (IL-6), fator de necrose tumoral α (TNF-α) e óxido nítrico sintase induzível (iNOS). A ativação microglial e a liberação de citocinas inflamatórias medeiam as respostas inflamatórias. A piroptose é uma morte celular programada inflamatória mediada pela família das caspases, resultando na expressão maciça de fatores inflamatórios, que são liberados no ambiente circundante. A montagem do inflamassoma do domínio pirina da família NLR contendo 3 (NLRP3) pode ser induzida por espécies reativas de oxigênio (ROS), e então medeia a ativação da protease 1 específica de aspartato cisteinil (caspase-1), que subsequentemente promove a maturação e liberação de interleucina-1β (IL-1β) e interleucina-18 (IL-18), e desencadeia a piroptose mediada por gasdermina D (GSDMD). Estudos descobriram que inibir a piroptose mediada por NLRP3 poderia melhorar o comprometimento cognitivo induzido por lipopolissacarídeo (LPS) ao suprimir a via NLRP3/GSDMD. Portanto, inibir a piroptose microglial mediada por NLRP3 pode ser um mecanismo potencial para melhorar o comprometimento cognitivo induzido por Hcy.
A regulação da expressão do NLRP3 é afetada pela N6-metiladenosina (m6A). A m6A é a modificação interna de mRNA mais prevalente. A S-adenosil metionina (SAM) atua como doadora de metila, regulando os níveis de m6A e influenciando a expressão gênica. O destino e as funções dos RNAs metilados pelo m6A são mediados principalmente por proteínas "leitoras" de m6A, como as proteínas da família de domínio de homologia YT521-B (YTHDF) e as proteínas de ligação ao mRNA do fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IGF2BP). Estudos descobriram que YTHDF1 poderia aumentar a tradução de NLRP3 e promover respostas inflamatórias. Além disso, IGF2BP2 regulou negativamente por feedback a ativação do inflamassoma NLRP3 na micróglia. No entanto, o mecanismo subjacente da modificação m6A no comprometimento cognitivo induzido por Hcy não foi investigado.

A betaína (N, N, N-trimetilglicina) é abundante em várias fontes, como beterraba sacarina, espinafre e frutos do mar, e é transportada para o cérebro pelo transportador de betaína-GABA (BGT-1). A principal ação fisiológica da betaína é servir como doadora de metila (transmetilação), o que leva a um aumento nos níveis de SAM. Evidências substanciais indicaram que a suplementação com betaína poderia diminuir efetivamente os níveis plasmáticos de Hcy. Além disso, o tratamento com betaína para pacientes com DA poderia melhorar a cognição e funcionalidade cerebral após 1 mês, e os níveis de Hcy, dos fatores inflamatórios IL-1β e TNF-α no sangue foram significativamente reduzidos. No entanto, se e como a betaína exerce efeitos neuroprotetores através da modificação m6A para mitigar o comprometimento cognitivo induzido por Hcy permanece incerto.

Este estudo teve como objetivo investigar o efeito e o mecanismo da betaína na atenuação do comprometimento cognitivo induzido por Hcy. Inicialmente, a função cognitiva foi avaliada através dos testes de labirinto em Y e reconhecimento de novos objetos. Em seguida, o dano histológico foi avaliado usando coloração de Nissl e coloração H&E. Além disso, a ativação microglial e a piroptose foram avaliadas por imunofluorescência e análise de sholl. A piroptose também foi observada por microscopia eletrônica de transmissão in vitro. Além disso, qRT-PCR e Western blot foram realizados para investigar mecanismos. Adicionalmente, os níveis de SAM e SAH foram detectados por HPLC-MS/MS. Além disso, o nível de m6A foi medido por Dot blot de m6A, e o nível de metilação do NLRP3 foi avaliado usando MeRIP-qPCR. Finalmente, foi explorado ainda que YTHDF2 era um fator chave na ação da betaína ao silenciar YTHDF2.

Materiais e métodos
Materiais
Homocisteína (H4628), betaína (B2629) e azul de metileno (M4159) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, EUA).
Animais e tratamentos
Betaine attenuated cognitive impairment and brain injury induced by Hcy. (A) Schematic outline of the experimental design. (B–C) Schematic diagram of the Y maze test and NOR test. (D) Heat maps of the Y maze test. (E) Impacts of different groups on time in the novel arm (n = 8). (F) The percentage of movement distance in the novel arm (n = 8). (G) The heat maps of the NOR test. (H) The exploration time for the familiar and novel objects in the NOR test (n = 8). (I) The discrimination index analysis in the NOR test (n = 8). (J) Representative Nissl staining of hippocampus CA1, CA3 and DG area in different groups (n = 4). Representative photomicrographs were shown at 40× magnification, scale bar = 50 or 10 μm. (K) Representative H&E staining of the hippocampal regions in different groups (n = 4), scale bar = 50 or 10 μm, 40× magnification. (L–O) ELISA analysis of S-100β, NSE, IL-1β and IL-18 levels in the serum among three groups (n = 4). Data were analyzed by one-way analysis of variance followed by multiple comparisons or two-tailed paired t-test. Data are presented as mean ± SEM. *p < 0.05, **p < 0.01.
Fig. 1
Nine-week-old male Sprague-Dawley rats were purchased from Zhuhai BesTest Bio-Tech Co., Ltd. (Zhuhai, China). The rats were divided into three groups, each consisting of eight animals. The groups were as follows: (1) Control group: the rats were injected with saline (0.9 %) through the vena caudalis for 14 days; (2) Hcy group: the rats were injected with Hcy (400 μg/kg/d) through the vena caudalis for 14 days; (3) Hcy + Bet groups: the rats were injected with Hcy (400 μg/kg/d) through the vena caudalis and simultaneously supplemented betaine (2.5 % w/v) via drinking water for 14 days (Fig. 1A). The SD rats were housed with 4 per cage, maintained under controlled conditions of humidity (50–60 %), temperature (25 ± 2 °C) and a 12:12 h reversed light-dark cycle, with feed-free access to food and water. The animal experiments and protocols were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Sun Yat-sen University.
Behavioral tests
Y maze test
O teste do labirinto em Y é utilizado para avaliar a memória espacial de curto prazo dependente do hipocampo em roedores, com base na sua tendência inata de explorar novos ambientes, e o teste foi realizado conforme descrito anteriormente. O labirinto em Y é composto por três braços (ângulos de 120°, comprimento × altura × largura do braço de 60 × 20 × 10 cm). O braço novo foi bloqueado na fase de treinamento, enquanto os outros dois braços foram abertos. Os ratos foram colocados de frente para a parede de um dos braços abertos (braço inicial) e autorizados a explorar o labirinto por 10 min. Uma hora após a fase de treinamento, cada animal foi recolocado no braço inicial e autorizado a explorar todos os três braços abertos por 5 min. A posição do braço inicial e do braço novo foi randomizada entre os ratos. Durante cada tentativa, o labirinto em Y foi limpo com álcool 75% para eliminar possíveis vieses devido ao odor deixado pelo rato anterior. Os comportamentos dos ratos foram rastreados por vídeo e analisados pelo software TopScan 3.0 (CleverSys, Inc.). O desempenho no labirinto em Y foi expresso como o tempo gasto no braço novo (Fig. 1E).

Teste de reconhecimento de objeto novo (NOR)
O teste NOR é comumente empregado para estudar aprendizado e memória em roedores, conforme relatado anteriormente. Durante a fase de habituação, os ratos foram colocados no centro de uma câmara (90 × 90 × 60 cm) sem objetos e autorizados a explorar a câmara por 10 min. Durante a fase de familiarização, os ratos foram posicionados no centro da câmara de frente para a parede oposta e autorizados a explorar os dois objetos semelhantes por 10 min. Uma hora depois (fase de teste), os ratos foram devolvidos à câmara e autorizados a explorar por 5 min, com um dos objetos familiares e um objeto novo presentes. Entre as tentativas, os objetos e a câmara foram limpos com álcool 75% para minimizar pistas baseadas em odor. Os comportamentos foram registrados por rastreamento de vídeo e analisados usando o software TopScan 3.0 (CleverSys, Inc.). A análise foi conduzida com base nos objetos para os quais os ratos orientavam seus narizes, dentro de um alcance de 2 cm. O índice de discriminação foi calculado dividindo o tempo gasto explorando o objeto novo pelo tempo total gasto explorando ambos os objetos (Fig. 1F).

Imunofluorescência
Secções congeladas de cérebro foram submetidas à recuperação antigênica utilizando citrato de sódio, em seguida permeabilizadas com Triton-X100 a 0,25% por 15 min. Após bloqueio com soro de jumento a 5% por 1 h à temperatura ambiente, as secções foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários: goat anti-Iba1 (1:500, 011–27991, Wako, Japão), rabbit anti-CD68 (1:100, ab283654, Abcam), rabbit anti-NLRP3 (1:100, 27458-1-AP, Proteintech, Wuhan, China), rabbit anti-GSDMD (1:100, 20770-1-AP, Proteintech, Wuhan, China). Após serem lavadas três vezes com PBS, as lâminas foram incubadas com anticorpo Alexa FluorTM Plus 488 (donkey anti-goat IgG (H + L), 1:500, A32814, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e anticorpo Alexa FluorTM Plus 647 (donkey anti-rabbit IgG (H + L), 1:500, A-31573, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) a 37 °C por 2 h, seguidas por mais três lavagens com PBS. Subsequentemente, as lâminas foram contracoradas com DAPI (Beyotime, China). Finalmente, as secções foram observadas e imagens de fluorescência foram capturadas utilizando um microscópio confocal LSM 900 (Carl Zeiss, Alemanha). A microglia no hipocampo foi quantificada utilizando o software ImageJ (National Institutes of Health, EUA). A densidade celular foi calculada como o número de células da microglia dividido pela área fluorescente total da área delineada.
Análise de Sholl
A morfologia da microglia foi avaliada utilizando o software Imaris v10.0.0 (Bitplane, Suíça) para reconstrução 3D de imagens confocais de varredura Z e análise de Sholl, conforme descrito em publicações anteriores. Para a análise de Sholl, círculos concêntricos foram desenhados a partir do soma, e medições incluindo volume do soma, número de pontos terminais, comprimento total dos processos e número de interseções por raio (aumentado em 5 μm) foram calculadas.
Análise de bioinformática
Os alvos relacionados à Hcy foram pesquisados utilizando o Comparative Toxicogenomics Database (http://ctdbase.org/) com "Homocisteína" como termo de busca. Os alvos associados à doença de Alzheimer (DA) foram obtidos pesquisando o banco de dados GeneCards (http://www.genecards.org/) utilizando o termo "Doença de Alzheimer". Genes sobrepostos entre Hcy e DA foram identificados utilizando o banco de dados Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/). Gráficos de bolhas representando as 10 principais vias KEGG relevantes foram gerados utilizando o pacote de software "ClusterProfiler (4.6.0)" no R (versão 4.2.2).
O conjunto de dados de microarray de expressão gênica de regiões do hipocampo humano na DA foi coletado do Gene Expression Omnibus (GSE36980). O conjunto de dados GSE36980 incluiu 7 amostras de hipocampo de pacientes com DA e 10 amostras de hipocampo de indivíduos controle saudáveis. O conjunto de dados foi analisado utilizando o pacote de software "limma (3.54.1)" do R (versão 4.2.2).
Ensaio de dot blot para m6A
Os experimentos foram conduzidos conforme relatado anteriormente. Amostras de mRNA de 50, 100 e 200 ng foram desnaturadas por aquecimento a 65 °C por 5 min. Em seguida, 2 μL das amostras de mRNA desnaturado foram aplicados em uma membrana Amersham Hybond N+ (GE Healthcare, EUA). As membranas foram reticuladas usando UV por 5 min, seguidas de bloqueio com BSA 5% por 1 h. Em seguida, foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpo anti-m6A de coelho (1:1000, Abcam, ab284130). Depois, as membranas foram incubadas com IgG anti-coelho de cabra conjugada com HRP (1:10000) por 1 h à temperatura ambiente. Os blots foram visualizados usando quimioluminescência intensificada. Adicionalmente, outra membrana foi corada com uma solução de azul de metileno a 0,02% em acetato de sódio 0,3 M (pH 5,2) por 1 h para garantir consistência entre os diferentes grupos.

Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado (MeRIP) qPCR

O ensaio MeRIP-qPCR foi realizado para detectar modificações de m6A em transcritos de genes individuais usando o Kit BersinBioTM de Imunoprecipitação de RNA Metilado (MeRIP) (BersinBio, #Bes5203), conforme recomendação do fabricante. Os RNAs totais foram fragmentados e, em seguida, incubados com anticorpo m6A por 2 h a 4 °C com rotação contínua. Posteriormente, foram incubados com Beads Magnéticas de Proteína A/G pré-lavadas por 1 h a 4 °C. Após a imunoprecipitação, o enriquecimento de mRNA contendo modificações m6A foi examinado usando qRT-PCR.

Ensaios de estabilidade de mRNA

A estabilidade do mRNA de NLRP3 foi avaliada tratando células HMC3 com actinomicina-D (10 μg/mL, Sigma, SBR00013) por 0, 2, 4, 6 ou 8 h, seguindo o método descrito anteriormente. Os RNAs totais foram extraídos e examinados por ensaio de qRT-PCR, com normalização para os valores do grupo de 0 h.

Construção e transfecção de lentivírus

O RNA de grampo curto lentiviral (shRNA) foi usado para silenciar de forma estável a expressão do YTHDF2 humano, que foi desenhado e adquirido da Genechem Co., Ltd. (Xangai, China). As células HMC3 foram transfectadas por partículas lentivirais de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, as células HMC3 foram selecionadas com meio contendo 2 μg/mL de puromicina. As células transduzidas foram validadas por qRT-PCR e western blotting.

Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o software SPSS 25.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). O teste t pareado bicaudal foi usado para comparar as médias de dois grupos, e uma análise de variância de uma via foi usada para comparações múltiplas entre diferentes grupos. A significância estatística foi considerada da seguinte forma: *p < 0,05, **p < 0,01.

Mais métodos foram descritos nas Informações Suplementares.

Resultados

A betaína aliviou o comprometimento cognitivo induzido por Hcy
Para investigar o efeito da betaína na função cognitiva, avaliamos as habilidades de aprendizagem e memória por meio do labirinto Y (Fig. 1B) e do teste NOR (Fig. 1C). Os mapas de calor revelaram diferenças no comportamento exploratório entre os grupos durante o teste do labirinto Y (Fig. 1D). O grupo Hcy apresentou tempo e porcentagem de distância de movimento reduzidos no braço novo, em oposição ao grupo controle. Por outro lado, o grupo betaína mostrou uma tendência significativa e definida para explorar o braço novo em comparação ao grupo Hcy, evidenciada pelo aumento tanto no tempo quanto na distância de movimento do braço novo (Fig. 1E–F). Além disso, o mapa de calor mostrou a preferência por objetos familiares e novos durante a fase de teste (Fig. 1G). O grupo Hcy diminuiu significativamente o tempo gasto explorando o objeto novo e o índice de discriminação em comparação ao grupo controle. Em contraste, a suplementação com betaína mostrou uma preferência significativa pelo objeto novo (Fig. 1H–I). Esses resultados indicaram que a betaína pode melhorar o comprometimento cognitivo induzido por Hcy.
A betaína atenuou a lesão cerebral
Para avaliar o efeito da betaína no dano neuronal, observamos adicionalmente as alterações patológicas nas regiões CA1, CA3 e DG do hipocampo por coloração de Nissl e coloração H&E. Os neurônios no grupo controle exibiram morfologia firmemente arranjada com estruturas intactas, nucléolos claros e nenhuma perda perceptível de neurônios. No grupo Hcy, observou-se uma diminuição no número de neurônios, acompanhada por um arranjo esparso, encolhimento celular, ruptura da membrana celular e coloração citoplasmática intensificada. A betaína exibiu efeitos neuroprotetores, resultando em um aumento no número de neurônios e melhorando seu arranjo e hierarquia (Fig. 1J). A estrutura e forma das regiões CA1, CA3 e DG no grupo controle apresentaram aparência normal, caracterizada por células neuronais bem arranjadas e núcleos claramente visíveis. No grupo Hcy, observou-se um aumento nos espaços intercelulares, acompanhado por morfologia celular desordenada, vacuolização e edema das células, e núcleos irregulares, murchos e condensados. A betaína pode melhorar o dano neuronal induzido por Hcy. A morfologia celular era basicamente regular e o número de neurônios estava aumentado (Fig. 1K). Esses resultados demonstraram que a betaína melhorou o dano patológico causado por Hcy.
Em seguida, a gravidade da lesão cerebral foi avaliada adicionalmente medindo os níveis de S-100β e NSE. O grupo Hcy exibiu um aumento significativo nos níveis de S-100β e NSE em comparação ao grupo controle, enquanto o grupo betaína mostrou uma diminuição nos níveis de S-100β e NSE (Fig. 1L-M). Além disso, após a administração, o tratamento com betaína reduziu significativamente os níveis de IL-1β e IL-18 (Fig. 1N-O). Esses resultados indicaram que a betaína tinha potencial para atenuar a lesão cerebral induzida por Hcy.
A betaína melhorou a ativação microglial
Betaina atenuou a ativação microglial. (A) Imagens representativas de Iba1 mostram o esqueleto da microglia no hipocampo entre três grupos, barra de escala = 20 μm, ampliação de 20× (n = 4). (B–D) Análise quantitativa do volume do soma, comprimento total dos processos e número total de pontos terminais (n = 4). (E–H) Quantificação do número de intersecções das projeções na análise de Sholl (n = 4). (I–K) Imagens confocais representativas de Iba1 e CD68 no hipocampo entre três grupos, barra de escala = 20 μm, ampliação de 20× (n = 4). (L–M) Análise quantitativa da área e densidade de células Iba1+ nos três grupos (n = 4). (N) Quantificação do número de células Iba1+CD68+ entre os diferentes grupos (n = 4). Os dados foram analisados por análise de variância de uma via seguida de comparações múltiplas. Os dados são apresentados como média ± EPM. *p < 0,05, **p < 0,01.
Fig. 2
A microglia monitora constantemente o microambiente e ativa-se rapidamente em resposta a alterações no ambiente cerebral. Consequentemente, nosso foco específico foi investigar o potencial da betaina em mitigar a ativação microglial induzida por Hcy. Conforme mostrado na Fig. 2A, a microglia no hipocampo sofreu alterações morfológicas no grupo Hcy, caracterizadas por processos mais curtos, mais espessos e com ramificações esparsas, e soma aumentado. Essas alterações foram atenuadas pela betaina. A betaina também apresentou uma tendência a reduzir o volume do soma em comparação com o grupo Hcy (Fig. 2B). Além disso, os resultados da análise de Sholl revelaram que a betaina aumentou efetivamente o comprimento total dos processos (Fig. 2C), o número total de pontos terminais (Fig. 2D) e o número de intersecções (Fig. 2E–H).
Além disso, microglias ativadas foram identificadas pela colocalização de Iba1 e CD68, um marcador fagocítico fortemente expresso em microglias ativadas. A dupla marcação imunofluorescente foi realizada para detectar a expressão de CD68 em microglias ativadas na região do hipocampo (Fig. 2I–K). Os resultados demonstraram que a betaina inibiu o aumento da área de células Iba1+ (Fig. 2L) e da densidade microglial induzido por Hcy (Fig. 2M), além de reduzir o número de células Iba1+CD68+ (Fig. 2N). Esses achados mostraram que a betaina suprimiu a ativação microglial induzida por Hcy.
Betaina atenuou a piroptose microglial ao suprimir a via NLRP3/caspase-1/GSDMD.
A betaína inibiu a piroptose microglial na região do hipocampo. (A) Os alvos sobrepostos de genes relacionados à Hcy na DA. (B) Análise de enriquecimento KEGG desses genes sobrepostos. (C–D) A expressão de NLRP3 e GSDMD no hipocampo de pacientes com DA dos conjuntos de dados GSE36980 (pacientes com DA, n = 7; pacientes sem DA, n = 10). (E–J) Imagens confocais representativas de Iba1 e NLRP3, Iba1 e GSDMD no hipocampo (regiões CA1, CA3 e DG) entre três grupos, barra de escala = 20 μm, ampliação de 20× (n = 4). (K–L) Quantificação do número de células Iba1+NLRP3+ ou Iba1+GSDMD+ no hipocampo (CA1, CA3 e DG) entre os diferentes grupos (n = 4). (M−U) A expressão proteica de NLRP3, ASC, pro-caspase-1, caspase-1 clivada, GSDMD, GSDMD-N, IL-18 e IL-1β no hipocampo entre três grupos foi detectada por western blot (n = 3). Os dados foram analisados pelo teste t pareado bicaudal ou análise de variância de uma via seguida de comparações múltiplas. Os dados são apresentados como média ± EPM. *p < 0,05, **p < 0,01.
Fig. 3
Para prever as vias pelas quais a Hcy causa comprometimento cognitivo, identificamos 196 genes-alvo associados tanto à Hcy quanto à DA (Tabelas S1–3) (Fig. 3A). A análise KEGG indicou que a via de sinalização do receptor do tipo NOD desempenha um papel importante na DA induzida por Hcy (Fig. 3B). Os receptores do tipo NOD (incluindo NLRP3) são considerados alvos regulatórios críticos em doenças inflamatórias. Além disso, nossa análise revelou que a expressão de NLRP3 estava aumentada no hipocampo de pacientes com DA do conjunto de dados GSE36980 (Fig. 3C). Esses achados sugeriram uma associação estreita entre a regulação positiva de NLRP3 e o comprometimento cognitivo induzido por Hcy.
O NLRP3 é predominantemente expresso em micróglias. O inflamassoma NLRP3 ativa a caspase-1, que cliva GSDMD, gerando o N-terminal da gasdermina D (GSDMD-N), que serve como molécula efetora na piroptose. No hipocampo de pacientes com DA (GSE36980), houve um aumento significativo no nível de GSDMD (Fig. 3D). A coloração por imunofluorescência revelou que o tratamento com betaína atenuou a piroptose microglial nas regiões CA1, CA3 e DG induzida por Hcy (Fig. 3E–J), evidenciado por uma redução no número de células duplamente marcadas Iba1+NLRP3+ (Fig. 3K) e células duplamente marcadas Iba1+GSDMD+ (Fig. 3L). Consistente com os resultados da imunocoloração, o tratamento com betaína suprimiu a expressão das proteínas NLRP3, ASC, pro-caspase-1, caspase-1 clivada, GSDMD, GSDMD-N, IL-18 e IL-1β (Fig. 3M−U). Os resultados indicaram que a betaína pode inibir a piroptose microglial induzida por Hcy ao inibir a via de sinalização NLRP3/caspase-1/GSDMD.
A betaina suprimiu a piroptose microglial em células HMC3. (A–D) Células HMC3 foram tratadas com diferentes concentrações de Hcy, betaina ou MCC950 e avaliadas quanto à viabilidade celular. (E–F) Imagens de fluorescência representativas e intensidade de ROS em células HMC3 sob diferentes grupos de tratamento, barra de escala = 50 μm, aumento de 10×. (G) Imagens representativas de MET mostrando alterações morfológicas das células HMC3 sob diferentes tratamentos. (H) Liberação de LDH em células HMC3 sob diferentes tratamentos. (I–J) Análise por citometria de fluxo da piroptose de células HMC3 em diferentes grupos de tratamento, coradas com Anexina V-FITC e PI. (K–L) Análise por ELISA dos níveis de IL-18 e IL-1β em células HMC3. (M) O mapa de calor mostrou as alterações de mRNA de NLRP3, ASC, pro-caspase-1, caspase-1 clivada, GSDMD, GSDMD-N, IL-18 e IL-1β em células HMC3. (N–V) Análise por Western blot dos níveis proteicos de NLRP3, ASC, pro-caspase-1, caspase-1 clivada, GSDMD, GSDMD-N, IL-18 e IL-1β em células HMC3. Os dados foram analisados por ANOVA de uma via seguida de comparações múltiplas. Os dados são apresentados como média ± EPM. *p < 0,05, **p < 0,01.
Fig. 4
Obteve-se confirmação adicional sobre o efeito inibitório da betaina na piroptose microglial induzida por Hcy. Utilizamos MCC950, que inibe especificamente a ativação de NLRP3. Conforme mostrado na Fig. 4A–C, os experimentos subsequentes foram desenhados da seguinte forma: células HMC3 foram pré-tratadas com betaina (10 mM) ou MCC950 (10 μM) por 4 h, seguidas de tratamento com Hcy (2 mM) por 24 h. O pré-tratamento com betaina aumentou a viabilidade celular em células HMC3 induzidas por Hcy (Fig. 4D). O pré-tratamento com betaina resultou em uma redução no nível de ROS em comparação ao grupo Hcy (Fig. 4E–F). Os resultados de MET revelaram que o tratamento com betaina mitigou efetivamente as típicas bolhas na membrana plasmática e rupturas de membrana associadas à piroptose induzida por Hcy (Fig. 4G). O pré-tratamento com betaina reverteu o aumento significativo nos níveis de liberação de LDH no sobrenadante da cultura (Fig. 4H), indicando inibição da ruptura e vazamento da membrana plasmática induzidos por Hcy. A betaina também conseguiu inibir a taxa de células em piroptose induzida por Hcy (Fig. 4I–J). Enquanto isso, a betaina reduziu as citocinas inflamatórias IL‑1β e IL-18 no sobrenadante da cultura (Fig. 4K-L). Além disso, os resultados de qRT-PCR e Western blot mostraram que o tratamento com betaina inibiu a via NLRP3/caspase-1/GSDMD (Fig. 4M–V). Simultaneamente, o pré-tratamento com MCC950 reverteu todos esses efeitos e suprimiu a piroptose induzida por Hcy. Portanto, a betaina inibiu a piroptose microglial induzida por Hcy ao suprimir a via NLRP3/caspase-1/GSDMD.
A betaina protegeu os neurônios de danos mediados por micróglia.
Betaina atenuou a neurotoxicidade mediada por micróglia. (A) Diagrama esquemático do meio condicionado de micróglia (CM). (B) Células SH-SY5Y foram tratadas com CM e examinadas quanto à viabilidade celular. (C) Liberação de LDH em células SH-SY5Y sob diferentes tratamentos. (D–E) A apoptose celular de diferentes grupos de tratamento foi examinada por citometria de fluxo em células SH-SY5Y. (F–G) Análise ELISA dos níveis de IL-18 e IL-1β em células SH-SY5Y. (H–I) As alterações de mRNA de IL-18 e IL-1β em células SH-SY5Y. (J–L) A expressão proteica de IL-18 e IL-1β foi medida por ensaio de western blot. Os dados foram analisados por análise de variância de uma via seguida de comparações múltiplas. Os dados são apresentados como média ± EPM. *p < 0,05, *p < 0,01.
Fig. 5
Foi relatado que as respostas inflamatórias mediadas pela ativação de micróglia levam a danos neuronais e doenças neurodegenerativas. Portanto, exploramos se o efeito protetor da betaina nos neurônios era mediado pela inibição da secreção de citocinas pró-inflamatórias pelas micróglias (Fig. 5A). O tratamento com Hcy-CM reduziu significativamente a viabilidade das células SH-SY5Y em comparação com Hcy sozinho ou o sobrenadante de células HMC3 não estimuladas. Em contraste, o grupo Hcy-betaine-CM apresentou maior viabilidade celular do que o grupo Hcy-CM (Fig. 5B). Os resultados da liberação de LDH foram semelhantes aos da viabilidade celular (Fig. 5C). A taxa de apoptose das células SH-SY5Y tratadas com Hcy-CM aumentou significativamente, enquanto o grupo Hcy-betaine-CM apresentou uma porcentagem menor de células apoptóticas em comparação com o grupo Hcy-CM (Fig. 5D–E). Além disso, o tratamento com betaina reduziu os níveis de IL-1β e IL-18 no sobrenadante da cultura (Fig. 5F–G). Além disso, tanto os níveis de mRNA quanto de proteína de IL-18 e IL-1β aumentaram nos grupos Hcy e Hcy-CM em comparação com o grupo controle, e esses efeitos foram ainda mais atenuados após a administração de Hcy-betaine-CM (Fig. 5H-L). Em conjunto, nossos resultados sugeriram que a betaina poderia atenuar a lesão neuronal ao inibir a liberação de mediadores tóxicos durante a ativação microglial.
Betaina aumentou a modificação m6A do mRNA de NLRP3 e reduziu a estabilidade do mRNA de NLRP3
A betaína reduziu a estabilidade do mRNA de NLRP3 de maneira dependente de m6A-YTHDF2. (A–D) Os níveis de SAH, SAM e a razão SAM/SAH no soro, fígado, hipocampo e células HMC3 foram medidos por HPLC-MS/MS (n = 4). (E–F) A expressão proteica de BHMT foi medida por ensaio de western blot no hipocampo e em células HMC3 (n = 3). (G) O nível de m6A do RNA total em células HMC3 de diferentes grupos de tratamento foi determinado por ensaio de dot blot de m6A, e a membrana corada com azul de metileno foi processada paralelamente (controle de carregamento). (H) Ensaios de MeRIP-qPCR mostraram a porcentagem relativa de mRNA de NLRP3 com metilação sob diferentes tratamentos. (I) A taxa de degradação de NLRP3 em células HMC3 tratadas com actinomicina D ao longo do tempo via ensaio de qRT-PCR. (J) Análise de qRT-PCR dos níveis de mRNA para YTHDF2 e YTHDF3 em células HMC3. (K) Análise de western blot dos níveis proteicos de YTHDF2 em células HMC3. (L) A expressão de YTHDF2 no hipocampo de pacientes com DA do conjunto de dados GSE36980 (pacientes com DA, n = 7; pacientes não-DA, n = 10). (M – N) Resultados dos ensaios de western blot e qRT-PCR mostraram a expressão de YTHDF2 em células HMC3 transfectadas com dois diferentes lentivírus expressando shRNA curto para YTHDF2 (sh-YTHDF2#1 e sh-YTHDF2#2) ou controles negativos (sh-NC). (O) Ensaios de MeRIP-qPCR mostraram a porcentagem relativa de mRNA de NLRP3 com metilação em células HMC3 sh-NC, sh-YTHDF2#1 e sh-YTHDF2#2. (P) A taxa de degradação de NLRP3 em células HMC3 sh-NC, sh-YTHDF2#1 e sh-YTHDF2#2 tratadas com actinomicina D ao longo do tempo via ensaio de qRT-PCR ( Grupo Controle vs grupo Hcy; # Grupo Hcy vs grupo Betaína). Os dados foram analisados pelo teste t pareado bicaudal ou análise de variância de uma via seguida de comparações múltiplas. Os dados são apresentados como média ± EPM. *,#p < 0,05, **,##p < 0,01.
Fig. 6
Em seguida, exploramos o efeito da betaína na capacidade de metilação. Os resultados revelaram que os níveis de SAH no soro, fígado e hipocampo foram significativamente aumentados no grupo Hcy, enquanto os níveis de SAM e o índice de capacidade de metilação (razão SAM/SAH) foram significativamente diminuídos. A administração de betaína diminuiu os níveis de SAH e aumentou os níveis de SAM e a razão SAM/SAH (Fig. 6A–C). Além disso, a suplementação com betaína restaurou os níveis de SAM e a razão SAM/SAH em células HMC3 induzidas por Hcy (Fig. 6D). Esse efeito pode ser atribuído à promoção da expressão da betaína homocisteína metiltransferase (BHMT) pela betaína em ratos SD e células HMC3, que remetila a Hcy (Fig. 6E–F). Essas descobertas sugeriram que a betaína poderia promover a metilação.
Em seguida, avaliamos os níveis globais de m6A. A análise de Dot blot mostrou uma diminuição significativa nos níveis de m6A no grupo Hcy em comparação com o grupo controle, que foi restaurada após o pré-tratamento com betaína (Fig. 6G). Posteriormente, ensaios de MeRIP-qPCR foram realizados para examinar o nível de m6A do NLRP3. O nível de m6A do NLRP3 foi reduzido no grupo Hcy, e essa redução foi revertida pelo pré-tratamento com betaína (Fig. 6H). Além disso, exploramos o impacto da modificação m6A na estabilidade do NLRP3. Para bloquear a nova síntese de RNA em células HMC3, tratamos com o inibidor transcricional actinomicina D e medimos a estabilidade do mRNA do NLRP3. A taxa de degradação do NLRP3 foi maior no grupo betaína em comparação com o grupo Hcy, sugerindo que a betaína poderia reduzir a estabilidade do mRNA do NLRP3 (Fig. 6I).

A betaína reduziu a estabilidade do mRNA do NLRP3 de forma dependente de m6A-YTHDF2

Considerando que a betaína aumentou a modificação m6A do NLRP3 enquanto reduziu a estabilidade do mRNA do NLRP3, levantamos a hipótese de que a betaína poderia exercer seu efeito protetor através de YTHDF2 ou YTHDF3. Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento com betaína elevou significativamente o nível de mRNA de YTHDF2 (Fig. 6J). Além disso, a expressão proteica de YTHDF2 foi regulada positivamente no grupo betaína (Fig. 6K). Curiosamente, observamos uma diminuição significativa na expressão de YTHDF2 no hipocampo de pacientes com DA (GSE36980) (Fig. 6L).

Além disso, nosso objetivo foi investigar se a betaína regulava a estabilidade do mRNA do NLRP3 através de YTHDF2. Empregamos lentivírus expressando shRNA para silenciar YTHDF2 (sh-YTHDF2) ou controles negativos shRNA (sh-NC) em células HMC3 (Fig. 6M − N). Nossos dados indicaram que o tratamento com betaína ainda poderia aumentar o nível de metilação m6A do NLRP3 em comparação com o tratamento com Hcy em células HMC3 transfectadas com sh-NC e sh-YTHDF2 (#1 e #2) (Fig. 6O). Além disso, a análise dos níveis de mRNA do NLRP3 na presença de pré-tratamento com betaína revelou que a betaína promoveu a degradação do NLRP3 em células HMC3 transfectadas com sh-NC, mas quando o YTHDF2 foi silenciado, o efeito promotor da betaína na degradação do NLRP3 foi inibido (Fig. 6P). Em conjunto, esses resultados demonstraram que a betaína atenuou a estabilidade do mRNA do NLRP3 de forma dependente de YTHDF2.

O silenciamento de YTHDF2 aboliu o efeito inibitório da betaína na piroptose
A betaina inibiu a piroptose microglial mediada por NLRP3 de maneira dependente de m6A-YTHDF2. (A–C) Imagens representativas de MET mostrando alterações morfológicas em células HMC3 sh-NC, sh-YTHDF2#1 e sh-YTHDF2#2. (D–I) Piroptose celular em células HMC3 sh-NC, sh-YTHDF2#1 e sh-YTHDF2#2, coradas com Anexina V-FITC e PI. (J–L) Liberação de LDH em células HMC3 sh-NC, sh-YTHDF2#1 e sh-YTHDF2#2. (M–R) Análise por ELISA dos níveis de IL-18 e IL-1β em células HMC3 sh-NC, sh-YTHDF2#1 e sh-YTHDF2#2. (S) O mapa de calor mostrou as alterações de mRNA de NLRP3, ASC, pro-caspase-1, caspase-1 clivada, GSDMD, GSDMD-N, IL-18 e IL-1β em células HMC3 sh-NC, sh-YTHDF2#1 e sh-YTHDF2#2. (T–W) Análise por Western blot dos níveis proteicos de NLRP3, ASC, pro-caspase-1, caspase-1 clivada, GSDMD, GSDMD-N, IL-18 e IL-1β em células HMC3 sh-NC, sh-YTHDF2#1 e sh-YTHDF2#2. Os dados foram analisados por análise de variância de uma via seguida de comparações múltiplas. Os dados são apresentados como média ± EPM. *p < 0,05, **p < 0,01.
Fig. 7
Além disso, investigamos se o silenciamento de YTHDF2 afetava os efeitos da betaina na atenuação da piroptose. O silenciamento de YTHDF2 não melhorou a formação de bolhas na membrana plasmática e rupturas de membrana após o tratamento com betaina (Fig. 7A–C). Além disso, o silenciamento de YTHDF2 não teve efeito inibitório significativo sobre a piroptose no grupo betaina (Fig. 7D–I). O acúmulo de LDH foi observado no grupo betaina após o silenciamento de YTHDF2 (Fig. 7J-L). Além disso, após o silenciamento de YTHDF2, os níveis de IL-18 e IL-1β no sobrenadante da cultura não foram significativamente reduzidos no grupo betaina (Fig. 7M-R). Ademais, o pré-tratamento com betaina não reduziu os níveis de mRNA e proteína de NLRP3, ASC, pro-caspase-1, caspase-1 clivada, GSDMD, IL-18 e IL-1β, que são alvos envolvidos na piroptose, após o silenciamento de YTHDF2 (Fig. 7S-W). A transfecção com sh-NC não afetou o efeito da betaina na inibição da piroptose induzida por Hcy. Esses resultados sugeriram que a betaina inibiu a piroptose induzida por Hcy através da metilação m6A mediada por YTHDF2.
Discussão
Ilustração esquemática mostrando os efeitos protetores e os mecanismos subjacentes da betaina no comprometimento cognitivo induzido por Hcy. A betaina poderia inibir a piroptose microglial ao suprimir a via NLRP3/caspase-1/GSDMD de maneira dependente de m6A-YTHDF2 e, por fim, aliviar o comprometimento cognitivo induzido por Hcy.
Fig. 8
A Hcy é amplamente reconhecida como um fator de risco para demência. Reduzir os níveis de Hcy representa uma estratégia promissora para prevenir e aliviar a demência. Embora a betaína tenha demonstrado reduzir os níveis de Hcy, os efeitos e mecanismos subjacentes aos seus efeitos protetores contra o comprometimento cognitivo induzido por Hcy permanecem em grande parte inexplorados. Este estudo revelou que a betaína atenuou efetivamente o comprometimento cognitivo induzido por Hcy ao inibir a piroptose microglial através da modificação m6A (Fig. 8). Neste estudo, a concentração de betaína foi de 2,5 % (p/v) e o tempo de intervenção foi de 14 dias, derivado da literatura publicada. A dosagem de betaína foi de aproximadamente 2000–2500 mg/kg de peso corporal. Nossos achados sugeriram que a suplementação com betaína poderia ser uma abordagem eficaz para aliviar o comprometimento cognitivo induzido por Hcy.

As micróglias são células imunes do sistema nervoso central, e sua ativação é caracterizada por alterações morfológicas, como aumento do soma e retração de processos. A ativação microglial desempenha um papel crucial no comprometimento cognitivo induzido por Hcy. Por exemplo, as micróglias exibiram uma morfologia hiper-ramificada após o tratamento com Hcy, e os níveis de mRNA e proteína Iba1 aumentaram no córtex e hipocampo do grupo Hcy, sugerindo que as micróglias foram ativadas. Além disso, a Hcy aumentou a expressão de IL-1β e TNF-α no hipocampo, acompanhada por ativação microglial evidente em camundongos CBS−/-. Nosso estudo demonstrou que o tratamento com betaína reduziu significativamente o volume microglial e aumentou a ramificação e complexidade microglial na região do hipocampo. Além disso, a betaína também diminuiu a área de Iba1, a densidade microglial e a expressão do marcador lisossomal fagocítico CD68, indicando que a betaína poderia suprimir a ativação microglial.
A ativação da microglia desencadeia a liberação de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, IL-18 e IL-6. Essas citocinas resultam em dano neuronal e potencialmente levam a lesão cerebral. Consequentemente, nossa investigação teve como objetivo determinar se a betaína poderia suprimir a inflamação microglial induzida por Hcy. A piroptose, uma forma inflamatória de morte celular programada, tem sido implicada na patogênese de várias doenças neurológicas, como AD, epilepsia e AVC. A via típica da piroptose é mediada por inflamassomas, como o NLRP3. O estresse oxidativo é o principal impulsionador da inflamação, e as ROS podem induzir a ativação do inflamassoma NLRP3. O NLRP3 recruta a proteína adaptadora do inflamassoma ASC, que subsequentemente ativa a caspase-1, levando à maturação de IL-1β e IL-18 e à clivagem de GSDMD. A GSDMD-N se liga ao folheto interno da membrana celular e oligomeriza, formando poros com 10–33 nm de diâmetro. Esse processo resulta em inchaço celular, ruptura da membrana e descarga de fatores inflamatórios. Por fim, desencadeia o recrutamento de células imunes e amplifica a cascata de respostas inflamatórias. A microglia pode exibir fortemente uma resposta piroptótica associada à ativação do inflamassoma NLRP3.

Neste estudo, realizamos uma análise de bioinformática e identificamos NLRP3 e GSDMD como genes altamente expressos no comprometimento cognitivo induzido por Hcy. Enquanto isso, foi descoberto que o inflamassoma NLRP3 é um alvo crucial na microglia. Além disso, a dupla imunofluorescência mostrou a expressão tanto de NLRP3 quanto de GSDMD na microglia induzida por Hcy. Ademais, o grupo Hcy exibiu alto nível de ROS, ruptura da membrana, expressão aumentada de NLRP3, ASC, pró-caspase-1, caspase-1 clivada, GSDMD, GSDMD-N, IL-18 e IL-1β, juntamente com elevação na liberação de IL-18, IL-1β e LDH. No entanto, esses efeitos foram atenuados pelo tratamento com betaína. Nossos achados são consistentes com estudos anteriores sobre o efeito inibitório da betaína na piroptose induzida por colite ulcerativa grave aguda. Adicionalmente, nossos experimentos de meio condicionado revelaram que a betaína poderia ainda atenuar o dano neuronal causado por respostas inflamatórias mediadas pela microglia, aliviar a apoptose neuronal e inibir a expressão de fatores inflamatórios. Este estudo demonstrou que a betaína preveniu a piroptose microglial induzida por Hcy e protegeu os neurônios do dano mediado pela microglia.
A betaína contém três grupos metila quimicamente reativos, e seu grupo metila é transferido para a Hcys pela BHMT para formar metionina. A metionina é subsequentemente convertida em SAM, que desempenha um papel crucial no ciclo da metionina. Estudos identificaram a expressão de BHMT no cérebro. A razão SAM/SAH serve como um indicador do potencial de transmetilação, e sua diminuição prediz um declínio no potencial de metilação celular. Níveis elevados de Hcys levaram ao aumento de SAH e à diminuição da razão SAM/SAH, o que é consistente com nossos achados in vivo e in vitro. A metilação aberrante afeta o desempenho cognitivo. No cérebro de ratos SD com declínio cognitivo induzido por estresse, a Hcys perturbou a metilação do DNA, resultando em hipermetilação do DNA do promotor do BDNF e redução dos níveis de BDNF. A hipometilação do DNA induzida por Hcys leva a danos irreversíveis ao DNA e citotoxicidade em micróglias. O presente estudo mostrou que a suplementação com betaína aumentou significativamente o nível de SAM, diminuiu o nível de SAH e reduziu a razão SAM/SAH em comparação com o grupo Hcys.
Nos últimos anos, a modificação m6A do RNA, um tema quente na regulação epigenética, tem sido envolvida em múltiplos processos celulares, como a maturação ou degradação do mRNA e a tradução de proteínas. Estudos recentes revelaram que a m6A é mais abundante no sistema nervoso central do que em outros órgãos. Além disso, a modificação m6A desempenha um papel fundamental em doenças neurológicas, como DA, doença de Parkinson e depressão. Relatos anteriores indicaram que a exposição ao chumbo resultou em declínio na capacidade de aprendizado e memória em ratos SD, acompanhado por uma diminuição no nível de m6A no hipocampo. Além disso, a memória de aprendizado e os níveis de m6A melhoraram após a intervenção com ácido fólico. A ativação de micróglias induzida por LPS e as respostas inflamatórias foram potencialmente mediadas pelo aumento da metilação m6A e da estabilidade dos mRNAs de Gbp11 e Cp através de IGF2BP1. A modificação m6A pode ser um regulador significativo na piroptose de micróglias.
Notavelmente, nossos achados demonstraram que a betaína aumentou significativamente os níveis gerais de m6A. Evidências crescentes indicam uma ligação entre a modificação m6A e NLRP3. Em células de astrocitoma humano 1321N1 induzidas por LPS, a emodina reduziu a expressão de NLRP3 ao regular a metilação m6A mediada por METTL3, e aliviou ainda mais a inflamação e a piroptose. A WTAP promoveu inflamação e piroptose dependentes de NLRP3 ao aumentar a metilação m6A do mRNA de NLRP3 em células epiteliais tubulares renais humanas. O presente estudo descobriu que a betaína aumentou efetivamente o nível de metilação m6A do mRNA de NLRP3 e reduziu a estabilidade do mRNA de NLRP3, o que possivelmente foi regulado pelo leitor de m6A YTHDF2.
O leitor de m6A é o executor do sinal de m6A, e o YTHDF2 reconhece diretamente o sítio de m6A por meio de seu domínio YTH para regular a estabilidade do mRNA. Em nosso estudo, observamos que a betaína poderia promover a expressão de YTHDF2. O silenciamento subsequente de YTHDF2 mostrou que o efeito da betaína na degradação do mRNA de NLRP3 foi enfraquecido, resultando em uma inibição atenuada da piroptose induzida por Hcy. Consistentes com nossos achados, estudos recentes mostraram que o silenciamento de YTHDF2 aumentou a expressão de IL-6, TNF-α, IL-1β e IL-12, aumentou a estabilidade de MAP2K4 e MAP4K4 e ativou as vias de sinalização MAPK e NF-κB, exacerbando assim a resposta inflamatória em células RAW 264.7 estimuladas com LPS. Em linhagens celulares de carcinoma hepatocelular humano SMMC7721 e MHCC97H, o silenciamento de YTHDF2 levou a uma inflamação grave. Portanto, especulamos que a betaína aliviou a inflamação e a piroptose induzidas por Hcy de maneira dependente de m6A-YTHDF2.
Conclusões
Em resumo, nosso estudo demonstrou que a betaína inibiu a via de sinalização NLRP3/caspase-1/GSDMD de maneira dependente de m6A-YTHDF2, inibindo ainda mais a piroptose microglial, aliviando, em última análise, o comprometimento cognitivo induzido por Hcy. A suplementação com betaína pode abrir uma nova janela terapêutica para o comprometimento cognitivo induzido por Hcy. Este estudo fornece base para a betaína no desenvolvimento e aplicação de alimentos funcionais/farmacêuticos para melhorar a capacidade cognitiva.
Financiamento
Este estudo foi apoiado pelo (No. 81973016), (No. 82204020), (No. 2022M713556).
Declaração de contribuição de autoria CRediT
Zhi-Jun Yang: Conceituação, Investigação, Metodologia, Redação – rascunho original. Si-Yu Huang: Metodologia. Kai-Yi Zhong: Investigação, Metodologia. Wen-Ge Huang: Metodologia. Zi-Hui Huang: Investigação. Tong-Tong He: Investigação. Meng-Tao Yang: Investigação. Maierhaba Wusiman: Investigação. Dan-Dan Zhou: Metodologia. Si Chen: Aquisição de financiamento, Recursos. Bi-Xia Huang: Recursos. Xiao-Lin Luo: Metodologia. Hua-Bin Li: Redação – revisão e edição. Hui-Lian Zhu: Conceituação, Aquisição de financiamento, Redação – revisão e edição.
Declaração de interesses concorrentes
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Prevenção, intervenção e cuidado da demência
Efeitos e mecanismos de produtos naturais na doença de Alzheimer
Prevenção, intervenção e cuidado da demência: relatório de 2020 da Comissão Lancet
Biomarcadores para comprometimento cognitivo e demência em idosos
Comprometimento cognitivo: demência e doença de Alzheimer
Homocisteína plasmática como fator de risco para demência e doença de Alzheimer
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Mecanismos moleculares e funções da piroptose, caspases inflamatórias e inflamassomas em doenças infecciosas
Inflamassomas no SNC
A betaína melhora a colite ulcerativa grave aguda ao inibir a piroptose inflamatória induzida pelo estresse oxidativo
A suplementação materna de colina melhora a patologia da doença de Alzheimer ao reduzir os níveis de homocisteína cerebral ao longo de múltiplas gerações
A betaína restaura o controle epigenético e apoia as mitocôndrias neuronais no modelo de camundongo cuprizona de esclerose múltipla
As concentrações intracelulares de S-adenosil-homocisteína predizem a hipometilação global do DNA em tecidos de camundongos heterozigotos para cistationina beta-sintase deficientes em metila
Metabolismo da S-adenosilmetionina e S-adenosil-homocisteína em fígado de rato isolado. Efeitos da L-metionina, L-homocisteína e adenosina
Elevação da S-adenosil-homocisteína e hipometilação do DNA: mecanismo epigenético potencial para a patologia relacionada à homocisteína
Perturbações da metilação do DNA induzidas pela homocisteína contribuem para o desenvolvimento do declínio cognitivo associado ao estresse em ratos
Efeitos da S-adenosil-homocisteína e homocisteína no dano ao DNA e na citotoxicidade celular em linhagens celulares hepáticas e de microglia murinas
Regulação da expressão gênica mediada pela metilação reversível m(6)A do RNA
O papel da modificação m6A nas funções biológicas e doenças
Dinâmica da N6-metiladenosina no neurodesenvolvimento e envelhecimento, e seu potencial papel na doença de Alzheimer
N6-metiladenosina e doenças neurológicas
Os efeitos do ácido fólico na metilação m6A do RNA no hipocampo, bem como na capacidade de aprendizado e memória de ratos com exposição aguda ao chumbo
O leitor de m6A Igf2bp1 regula as respostas inflamatórias da microglia ao estabilizar os mRNAs de Gbp11 e Cp
A emodina alivia a inflamação e a piroptose de células 1321N1 tratadas com lipopolissacarídeo ao regular a expressão da proteína 3 contendo o domínio pirina da família NLR mediada pela metiltransferase-like 3
Modificação N(6)-metiladenosina do mRNA de NLRP3 mediada por WTAP na lesão renal da nefropatia diabética
Regulação dependente de N6-metiladenosina da estabilidade do RNA mensageiro
Os papéis e implicações da modificação RNA m(6)A no câncer
O leitor de m6A YTHDF2 regula a resposta inflamatória induzida por LPS
A redução de YTHDF2 alimenta a inflamação e a anormalização vascular no carcinoma hepatocelular
Abreviaturas
AD
Doença de Alzheimer
ASC
Contendo domínio PYD e CARD
BDNF
Fator neurotrófico derivado do cérebro
caspase-1
Proteinase 1 específica de aspartato cisteinil
BHMT
Betina homocisteína metiltransferase
CCK‐8
Kit de contagem celular-8
CM
Meio condicionado
GSDMD
Gasdermina D
GSDMD-N
Gasdermina D N-terminal
LDH
Lactato desidrogenase
Hcy
Homocisteína
Coloração H&E
Coloração de Hematoxilina e Eosina
HPLC-MS/MS
Cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massas em tandem
IGF2
Fator de crescimento semelhante à insulina II
IGF2BP1
Proteína de ligação ao mRNA do fator de crescimento semelhante à insulina 2 1
iNOS
Óxido nítrico sintase induzível
IL-1β
Interleucina-1β
IL-18
Interleucina-18
IL-6
Interleucina-6
LPS
Lipopolissacarídeos
m6a
N6-metiladenosina
MAPK
Proteína quinase ativada por mitógeno
MeRIP
Imunoprecipitação de RNA metilado
METTL3
Metiltransferase 3
MyD88
Resposta primária de diferenciação mieloide 88
NLRP3
Proteína 3 contendo o domínio pirina da família NLR
NF-κB
Fator nuclear kappa-B
NOR
Reconhecimento de novo objeto
NSE
Enolase específica do neurônio
PBS
Solução salina tamponada com fosfato
PFA
Paraformaldeído
qRT-PCR
Reação em cadeia da polimerase transcrição reversa quantitativa
ROS
Espécies reativas de oxigênio
S-100β
Proteína de ligação ao cálcio S100 201 B
TEM
Microscopia eletrônica de transmissão
SAM
S-adenosil metionina
SAH
S-adenosil-l-homocisteína
TNF-α
Fator de necrose tumoral α
WTAP
Proteína associada a WT1
YTHDF2
Proteína de ligação ao RNA YTH N6-metiladenosina 2
Dados suplementares
Os seguintes são os Dados Suplementares para este artigo:
Disponibilidade de dados
Os dados serão disponibilizados mediante solicitação.
Alguns dos resultados de pesquisa em nosso manuscrito foram apresentados por meio de apresentações orais e pôsteres, bem como na forma de resumos de reuniões, no 14º Congresso Asiático de Nutrição realizado de 14 a 17 de setembro de 2023.
Os dados suplementares para este artigo podem ser encontrados online em https://doi.org/10.1016/j.redox.2024.103026.