pmid: "39187977"
title: "Betaina retarda a perda muscular relacionada à idade ao mitigar o comprometimento induzido por Mss51 na respiração mitocondrial através de Yin Yang1."
authors: "Chen S, He T, Chen J, Wen D, Wang C, Huang W, Yang Z, Yang M, Li M, Huang S, Huang Z, Zhu H"
journal: "Journal of cachexia, sarcopenia and muscle"
pubdate: "2024 Oct"
doi: "10.1002/jcsm.13558"
source: "PMC Full Text"

Betaina retarda a perda muscular relacionada à idade ao mitigar o comprometimento induzido por Mss51 na respiração mitocondrial através de Yin Yang1.

Autores

Chen S, He T, Chen J, Wen D, Wang C, Huang W, Yang Z, Yang M, Li M, Huang S, Huang Z, Zhu H

Periodico

Journal of cachexia, sarcopenia and muscle (2024 Oct)

Conteudo

Betaina retarda a perda muscular relacionada à idade ao mitigar o comprometimento da respiração mitocondrial induzido por Mss51 via Yin Yang1
Resumo
Contexto
A disfunção mitocondrial é uma das marcas do envelhecimento e um dos principais contribuintes para a sarcopenia. Nutrientes são essenciais para melhorar a função mitocondrial e a saúde do músculo esquelético durante o processo de envelhecimento. A betaina é um nutriente com potenciais propriedades de preservação muscular. No entanto, se e como a betaina poderia regular a função mitocondrial no músculo envelhecido é pouco compreendido. Nosso objetivo foi explorar o alvo molecular e o mecanismo subjacente da betaina na atenuação da disfunção mitocondrial relacionada à idade no músculo esquelético.
Métodos
Camundongos jovens (YOU, 2 meses), camundongos velhos (OLD, 15 meses) e camundongos velhos com tratamento com betaina (BET, 15 meses) foram alimentados por 12 semanas. Os efeitos da betaina na massa muscular, força, função e estrutura subcelular das fibras musculares foram avaliados. O sequenciamento de RNA (RNA-seq) foi conduzido para identificar o alvo molecular da betaina. Os impactos da betaina nas moléculas relacionadas à mitocôndria, acúmulo de superóxido e respiração oxidativa foram examinados usando western blotting (WB), imunofluorescência (IF) e ensaio seahorse. O mecanismo subjacente da regulação da betaina sobre o alvo molecular para manter a função mitocondrial foi investigado por ensaio de repórter da luciferase, imunoprecipitação da cromatina e ensaio de mobilidade eletroforética. A transfecção com vírus adenoassociado, coloração com succinato desidrogenase (SDH) e avaliação do gasto energético foram realizadas em camundongos de 20 meses de idade para validar o mecanismo in vivo.
Resultados
A intervenção com betaina demonstrou efeitos antienvelhecimento na massa muscular (P = 0,017), força (P = 0,010) e distância percorrida (P = 0,013). Os marcadores relacionados à mitocôndria (ATP5a, Sdha e Uqcrc2) foram 1,1 a 1,5 vez maiores no grupo BET do que no OLD (todos P ≤ 0,036) com menos vacúolos mitocondriais desperdiçados acumulados no sarcômero. A análise bioinformática do RNA-seq exibiu que as vias relacionadas à atividade de respiração mitocondrial foram mais enriquecidas no grupo BET (NES = −0,87, FDR = 0,10). A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) revelou que a betaina reduziu significativamente a expressão de um novo regulador mitocondrial, Mss51 (−24,9%, P = 0,002). Em células C2C12, a betaina reverteu a supressão mediada por Mss51 nas proteínas de respiração mitocondrial (todos P ≤ 0,041), atenuou o comprometimento do consumo de oxigênio e o acúmulo de superóxido (em 20,7%, P = 0,001). Mecanicamente, a betaina atenuou a repressão induzida pelo envelhecimento na expressão do mRNA de Yy1 (BET vs. OLD: 2,06 vs. 1,02, P = 0,009). Yy1 suprimiu transcricionalmente a expressão do mRNA de Mss51 tanto in vitro quanto in vivo. Isso contribuiu para a preservação da respiração mitocondrial, melhoria do gasto energético (P = 0,008) e retardo da perda muscular durante o processo de envelhecimento.
Conclusões
No geral, a betaína reprime transcricionalmente o Mss51 via Yy1, melhorando a respiração mitocondrial relacionada à idade no músculo esquelético. Essas descobertas sugerem que a betaína é promissora como um suplemento alimentar para retardar a degeneração do músculo esquelético e melhorar doenças mitocondriais relacionadas à idade.

Introdução
A sarcopenia é caracterizada pela perda progressiva de massa, força e função do músculo esquelético durante o processo de envelhecimento, resultando em redução da mobilidade, fragilidade e incapacidade nas populações idosas. A alta prevalência de sarcopenia em adultos mais velhos emergiu como uma preocupação significativa de saúde pública, e estratégias para combater a perda muscular são necessárias o mais cedo possível para promover o envelhecimento saudável na sociedade. O envelhecimento leva a uma redução tanto no número total de mitocôndrias quanto na expressão de proteínas relacionadas à respiração mitocondrial, o que é um dos principais contribuintes para a perda muscular. Durante o envelhecimento, há um declínio de aproximadamente 15% na expressão de proteínas relacionadas à respiração mitocondrial muscular (por exemplo, NDUFA9 e SDHA). Enquanto isso, a redução relacionada à idade na fosforilação oxidativa mitocondrial muscular (OXPHOS) leva ao acúmulo de vacúolos mitocondriais aberrantes e espécies reativas de oxigênio (ROS), subsequentemente prejudicando a estrutura do sarcômero e exacerbando a perda muscular. Além disso, a inibição da respiração mitocondrial resulta em diminuição do metabolismo energético, como evidenciado pela redução do VO2max e comprometimento substancial na força dos membros inferiores, impedindo, em última análise, a mobilidade em indivíduos idosos. Portanto, abordagens que mitigam a disfunção mitocondrial relacionada à idade são promissoras na prevenção da perda muscular relacionada à idade.
A betaína é um doador de metila dietético que pode ser obtido da beterraba, do trigo e das cascas de camarão. Estudos epidemiológicos mostraram associações positivas entre a ingestão dietética de betaína e a preservação da massa magra em adultos de meia-idade e idosos. Nosso estudo animal anterior demonstrou que a betaína promove a síntese proteica e preserva a massa e força do músculo esquelético. Esses resultados sugerem que a suplementação dietética de betaína é uma abordagem promissora para retardar a perda muscular relacionada à idade. Além disso, vários estudos in vitro ou in vivo indicaram que a betaína tem potencial para regular a função mitocondrial. Por exemplo, células H2.35 tratadas com betaína exibiram aumento da respiração mitocondrial e da atividade da citocromo c oxidase. Em um modelo de lesão hepática aguda, a betaína demonstrou efeitos protetores hepáticos ao aumentar a fusão mitocondrial e a sobrevivência celular. Além disso, a betaína pode aumentar o conteúdo mitocondrial e facilitar a beta oxidação de ácidos graxos hepáticos para regular o metabolismo lipídico. No entanto, os efeitos e mecanismos subjacentes da betaína na melhora da função mitocondrial no músculo esquelético durante o processo de envelhecimento permanecem obscuros.
Um regulador mitocondrial específico do músculo esquelético, Mss51, pode afetar de forma abrangente a montagem da cadeia de transporte de elétrons (ETC) mitocondrial, regular as ROS e controlar a biogênese mitocondrial. Essas descobertas indicam que a Mss51 pode ser um alvo promissor para regular a função mitocondrial no músculo envelhecido. Estudos recentes sugeriram que a Mss51 poderia ser controlada transcricionalmente. Além disso, um estudo de docking molecular e simulação sugere que a Mss51 pode ser um alvo para diabetes tipo 2 ao interagir com compostos naturais relacionados ao zinco. A betaína mostrou potencial na regulação da transcrição gênica. Adicionalmente, sua metiltransferase (BHMT) é uma metiltransferase dependente de zinco (Zn). Como um componente dietético natural, poucas evidências mostraram os efeitos da betaína na Mss51.
Diante dessas observações, exploramos os efeitos e o mecanismo da betaína na melhora da disfunção mitocondrial relacionada à idade. Nossos achados sugerirão que a betaína possui potencial como um novo tratamento antienvelhecimento, oferecendo uma alternativa promissora às tecnologias de reprogramação genética, evitando suas complexidades associadas.
Métodos
Camundongos e intervenção
Camundongos C57BL/6J machos com 2 meses e 15 meses de idade foram obtidos do Centro de Animais de Guangdong e alojados em um ciclo claro/escuro de 12 h. Os camundongos foram divididos em três grupos: grupo jovem (YOU, 2 meses), grupo velho (OLD, 15 meses) e grupo velho tratado com betaína (BET, 15 meses). Todos os camundongos foram alimentados ad libitum com uma dieta padrão por 12 semanas. Os camundongos nos grupos YOU e OLD receberam água destilada, enquanto os camundongos no grupo BET receberam água destilada com 2% (p/v) de betaína. O experimento animal foi aprovado pelo comitê de ética da escola de saúde pública da Universidade Sun Yat-sen (Permissão nº 2017-007).
Composição corporal
A análise da composição corporal foi realizada usando um Sistema de RM para Pequenos Animais (Niumag, NM21-060H-I, China) seguindo as instruções do fabricante.
Força de preensão
A força muscular foi avaliada usando um teste de preensão com um medidor de força de preensão (ZS-ZL, China). Os camundongos foram colocados em uma barra de metal com todos os quatro membros até se acalmarem. O pico de força de preensão foi registrado usando o sistema MiniTAR.
Teste de corrida
Os camundongos foram submetidos a um teste de corrida em uma esteira (ZS-PT-III, China) por 15 min, começando a uma velocidade de 10 m/min e aumentando para 25 m/min ao longo de 2 min. A intensidade da corrente elétrica foi ajustada para 0,5 mA. Os resultados do teste de corrida foram avaliados com base na distância percorrida, tempo gasto e velocidade alcançada pelos camundongos.
Análises histológicas musculares
Após avaliar a massa e a força muscular, os camundongos foram sacrificados, e seus músculos gastrocnêmios foram isolados para coloração com H&E e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Procedimentos detalhados estão descritos nos Dados S1 e S2.
Análise da expressão gênica
O RNA total foi extraído de aproximadamente 30 mg de músculo gastrocnêmio por homogeneização (TissueLyser II, QIAGEN) em TRIzol (Invitrogen, EUA) e transcrito reversamente usando o kit PrimeScript™ RT (TAKARA, Japão). A análise da expressão gênica foi realizada utilizando um sistema de qRT‐PCR com fluorescência SYBR green (TAKARA, Japão), com os dados normalizados para a expressão de 18s. As sequências dos iniciadores estão fornecidas na Tabela S1.
Western blotting
Os lisados totais de proteína foram extraídos do músculo gastrocnêmio ou de células em RIPA com coquetel completo de protease 2× (Beyotime, China). A proteína total foi quantificada pelo método do ácido bicinconínico (BCA, Soyotime). A amostra de proteína foi misturada com tampão de amostra (1:4, v:v) e desnaturada a uma temperatura de 100°C. Quantidades iguais de amostra de proteína foram resolvidas em um sistema de gel SDS‐PAGE (8%, 10% ou 12%, Bio‐Rad) e transferidas para membrana de PVDF (MilliporeSigma). Os anticorpos primários e secundários foram incubados sequencialmente. As proteínas foram finalmente visualizadas pelo sistema de imageamento TANON com o reagente Signal Fire ECL (Invitrogen). As semiquantificações foram então realizadas pelo software ImageJ (versão 1.52a, NIH, EUA) após normalização da quantidade total de proteína, expressão de Gapdh ou Vdac1. Os anticorpos primários foram Sdha (Abcam, ab137040), Vdac1 (Abcam, A19707), Ndufb8 (Abcam, ab192878), Atp5a (Abcam, ab176569), Uqcrc2 (Abcam, ab203832), MtCO1 (Abcam, ab203912) e Gapdh (CST, #2118).
Sequenciamento de RNA
Aproximadamente 100 mg de músculo gastrocnêmio de camundongos dos três grupos foram submetidos ao sequenciamento de RNA, realizado pela GENEWIZ™ (Azenta Life Sciences, Suzhou, China) seguindo procedimentos padrão para construção e anotação de bibliotecas.
Linhas celulares
As células C2C12 (National Collection of Authenticated Cell Cultures, China) foram cultivadas a 37°C com 5% de CO2 em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina‑estreptomicina. Quando a confluência da intensidade celular atingiu 85%, o meio foi trocado para DMEM suplementado com 3% de soro de cavalo por 3 dias para diferenciação.
Construção e transfecção de vetores lentivirais
Para a transdução estável de Mss51 em células C2C12, o vetor plasmídeo de superexpressão induzido por lentivírus (pSLenti‑EF1‑EGFP‑P2A‑Puro‑CMV‑3xFLAG‑WPRE) foi construído pela OBIO (Inc, Xangai, China). O detalhe foi descrito no Dado S1.
Produção de mito superóxido
O acúmulo de superóxido mitocondrial foi avaliado utilizando o reagente MitoSOX™ Red (Invitrogen) conforme instrução do fabricante em células C2C12.
Análise da taxa de consumo de oxigênio no Seahorse
A respiração celular foi avaliada utilizando o Analisador Seahorse XFe96 (Agilent, EUA) e o kit Seahorse Mitochondrial Stress Test conforme descrito no Dado S1.
Avaliação da interação entre fator de transcrição e sítio de início da transcrição
Ensaio repórter da luciferase
The 2‐kb region upstream of the Mss51 promoter region was predicted using UCSC database (http://genome.ucsc.edu) and JASPAR database. The detail for the luciferase assay was describe in Data S1.
A região de 2 kb a montante da região promotora do Mss51 foi prevista usando o banco de dados UCSC (http://genome.ucsc.edu) e o banco de dados JASPAR. O detalhe do ensaio de luciferase foi descrito no Dados S1.
Chromatin immunoprecipitation
Imunoprecipitação da cromatina
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) was performed following the protocol of Pierce Magnetic ChIP Kit (Thermo Scientific™, USA). The procedure is detailed in Data S1.
A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) foi realizada seguindo o protocolo do Pierce Magnetic ChIP Kit (Thermo Scientific™, EUA). O procedimento é detalhado no Dados S1.
Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
Ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA)
The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was conducted according to the LightShift™ EMSA kit manual (Thermo Scientific™, USA), with details in Data S1.
O ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) foi conduzido de acordo com o manual do kit LightShift™ EMSA (Thermo Scientific™, EUA), com detalhes no Dados S1.
Skeletal muscle specific transfection
Transfecção específica do músculo esquelético
Mice aged 16 months were purchased from Guangdong Yaokang (SYXK 2017‐0080) and divided into WT, 2%BET, Yy1SM‐OE, and Yy1SM‐KD groups. All mice were raised to 20 months. At the age of 19 months, the adenoassociated virus (AAV) of different expression of Yy1 vectors was transfected into the mice TA muscle (Figure 6A). The animal experiment has been approved for the ethics committee of school of public health, Sun Yat‐sen University (Permit No. 2022‐018).
Camundongos com 16 meses de idade foram adquiridos da Guangdong Yaokang (SYXK 2017‐0080) e divididos nos grupos WT, 2%BET, Yy1SM-OE e Yy1SM-KD. Todos os camundongos foram criados até 20 meses. Aos 19 meses de idade, o vírus adenoassociado (AAV) de diferentes expressões dos vetores Yy1 foi transfectado no músculo TA dos camundongos (Figura 6A). O experimento animal foi aprovado pelo comitê de ética da faculdade de saúde pública da Universidade Sun Yat-sen (Permissão Nº 2022-018).
Thermogenesis experiments
Experimentações de termogênese
At the age of 20 months, all mice underwent thermogenesis experiments as per the previous literature. The data were then analysed by a web‐based analysis tool, CalR (https://CalRapp.org/).
Aos 20 meses de idade, todos os camundongos foram submetidos a experimentos de termogênese conforme a literatura anterior. Os dados foram então analisados por uma ferramenta de análise baseada na web, CalR (https://CalRapp.org/).
Statistical analysis
Análise estatística
Statistical analyses were performed with R software (version 4.2.1) and SPSS 26.0 (IBM). Graphs were produced by Graphpad 8.0 and Adobe Illustrator CS6 (version 16.0.0). The details were described in Data S1.
As análises estatísticas foram realizadas com o software R (versão 4.2.1) e SPSS 26.0 (IBM). Os gráficos foram produzidos pelo Graphpad 8.0 e Adobe Illustrator CS6 (versão 16.0.0). Os detalhes foram descritos no Dados S1.
Results
Resultados
Betaine delayed muscle loss and improved mitochondrial function in aging
A betaína atrasou a perda muscular e melhorou a função mitocondrial no envelhecimento
To investigate the impact of betaine on muscle loss, mice of varying ages were raised for 12 weeks. The flow chart outlining the experimental procedures is depicted in Figure 1A. Aging could induce a decline in lean mass and an increase in fat mass (Figure S1A, B). Betaine demonstrated protective effects against the age‐related adverse body composition, and maintained muscle strength (BET vs. OLD: 74,8 ± 3,3 N/kg·PC vs. 63,7 ± 8,4 N/kg·PC, P = 0,010, Figure S1C). In the running test, old mice covered less distance in the given time compared with young mice. Following betaine treatment, aging mice were able to cover a longer distance in the running test (BET vs. OLD: 238,2 ± 6,7 m vs. 200,6 ± 20,5 m, P = 0,013, Figure S1D). H&E staining revealed that betaine treatment could mitigate age‐induced nucleus centralization and preserve muscle cross‐sectional area (Figure S1E, F), suggesting a potential protective role of betaine against age‐related muscle atrophy.
Para investigar o impacto da betaína na perda muscular, camundongos de diferentes idades foram criados por 12 semanas. O fluxograma delineando os procedimentos experimentais é representado na Figura 1A. O envelhecimento pode induzir um declínio na massa magra e um aumento na massa gorda (Figura S1A, B). A betaína demonstrou efeitos protetores contra a composição corporal adversa relacionada à idade e manteve a força muscular (BET vs. OLD: 74,8 ± 3,3 N/kg·PC vs. 63,7 ± 8,4 N/kg·PC, P = 0,010, Figura S1C). No teste de corrida, camundongos velhos percorreram menos distância no tempo dado em comparação com camundongos jovens. Após o tratamento com betaína, camundongos envelhecidos foram capazes de percorrer uma distância maior no teste de corrida (BET vs. OLD: 238,2 ± 6,7 m vs. 200,6 ± 20,5 m, P = 0,013, Figura S1D). A coloração H&E revelou que o tratamento com betaína poderia mitigar a centralização nuclear induzida pela idade e preservar a área de secção transversal muscular (Figura S1E, F), sugerindo um papel protetor potencial da betaína contra a atrofia muscular relacionada à idade.
Betaína retardou a perda muscular e melhorou a função mitocondrial no envelhecimento. (A) Camundongos foram divididos em grupos YOU (2 meses), OLD (15 meses) e BET (15 meses) e criados por 12 semanas. Os grupos YOU e OLD receberam água destilada, enquanto o grupo BET recebeu água destilada com 2% (p/v) de betaína. N = 6/grupo. (B) O experimento de qPCR mostrou que a betaína regulou positivamente as expressões de mRNA das moléculas da ETC mitocondrial (Sdha, Uqcrc2, MtCO e ATP5a) e do marcador de biogênese (PGC‐1α). Média ± DP, n = 4/grupo. (C) Imagens representativas de WB e quantificação mostraram que o tratamento com betaína preservou a expressão das proteínas relacionadas à ETC mitocondrial (Ndufb8, Sdha, Uqcrc2, MtCO e ATP5a). Média ± DP, n = 4/grupo. (D) Imagens representativas de MET demonstraram a estrutura subcelular do sarcômero e a morfologia mitocondrial entre os três grupos. A betaína aliviou os vacúolos mitocondriais desgastados induzidos pelo envelhecimento, com melhor arranjo no sarcômero. N = 4/grupo. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.

A perda muscular relacionada à idade pode ser atribuída em parte à função mitocondrial prejudicada (respiração, biogênese e morfologia). Diminuições significativas na expressão dos componentes da ETC mitocondrial (Sdha, Uqcrc2, MtCO e ATP5a) e do marcador de biogênese (PGC‐1α) nos níveis de mRNA e proteína foram observadas durante o processo de envelhecimento, sugerindo uma deterioração no metabolismo muscular (Figura 1B, C). Os sarcômeros, como unidades fundamentais da contração muscular, exibiram uma maior presença de vacúolos mitocondriais desgastados, juntamente com bandas claras e escuras desorganizadas no grupo OLD, indicando prejuízos na função e estrutura muscular durante o envelhecimento (Figura 1D). O tratamento com betaína foi observado como capaz de reverter parcialmente esses efeitos relacionados à idade na função mitocondrial no músculo esquelético.

A betaína afetou as vias relacionadas à função mitocondrial e regulou negativamente a expressão do gene Mss51 no músculo esquelético envelhecido

Para investigar o mecanismo subjacente da betaína na melhora da função mitocondrial, foi realizado o sequenciamento de RNA do músculo gastrocnêmio de camundongos. Comparando com o grupo OLD, 529 genes regulados positivamente e 770 genes regulados negativamente no grupo YOU foram identificados, assim como 320 genes regulados positivamente e 148 genes regulados negativamente no grupo BET (Figura 2A). Além disso, 172 genes compartilharam padrões de expressão semelhantes em ambos os grupos YOU e BET, conforme representado no diagrama de Venn (Figura 2A).
A betaína afetou as vias relacionadas à função mitocondrial e regulou negativamente a expressão do gene Mss51 no músculo esquelético envelhecido. (A) Os resultados do sequenciamento de RNA foram obtidos do gastrocnêmio. Em comparação com o grupo OLD, houve 1299 e 468 genes diferencialmente expressos nos grupos YOU e BET, respectivamente. N = 4–6/grupo. (B, C) Os resultados da GSEA mostraram que as vias relacionadas à beta-oxidação de ácidos graxos e à ETC estavam mais enriquecidas nos grupos YOU e BET em comparação com o grupo OLD. N = 4–6/grupo. (D, E) O mapa de calor e o gráfico de vulcão ilustraram que vários genes envolvidos na estrutura do músculo esquelético (Tnnt1 e Myh7) e no metabolismo mitocondrial (Atp2a2) foram regulados positivamente nos grupos BET e YOU, juntamente com a regulação negativa de Mss51. N = 4–6/grupo. (F) Os resultados de qPCR mostraram que a betaína regulou negativamente a expressão do mRNA de Mss51, que pode ser induzida pelo envelhecimento. Média ± DP, n = 4/grupo. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
Os resultados da análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) revelaram que o envelhecimento reduziu significativamente a atividade da via de beta-oxidação de ácidos graxos no grupo OLD em comparação com os grupos YOU (NES = −1,93, FDR = 0,069) e BET (NES = −1,96, FDR = 0,14) (Figura 2B). O envelhecimento também inibiu a atividade da cadeia de transporte de elétrons (ETC) no grupo OLD em relação aos grupos YOU (NES = −1,50, FDR = 0,084) e BET (NES = −0,87, FDR = 0,10) (Figura 2C). Da mesma forma, a análise de enriquecimento da Ontologia Gênica (GO) também indicou um maior enriquecimento de genes relacionados à atividade de transportadores de elétrons e à beta-oxidação de ácidos graxos nos grupos YOU ou BET (Figura S2A, B). Essas descobertas sugerem que o tratamento com betaína influencia reguladores associados à função mitocondrial da ETC e ao metabolismo energético do músculo esquelético durante o envelhecimento.
Para explorar o alvo potencial, foi realizada a análise de expressão gênica diferencial. O mapa de calor representou os 50 principais genes notavelmente expressos de forma diferencial. Entre eles, vários genes estavam relacionados à estrutura do músculo esquelético (Tnnt1 e Myh7) e ao metabolismo mitocondrial (Atp2a2) tanto no grupo BET quanto no grupo YOU (Figura 2D). Além disso, a GSEA revelou que esses principais genes poderiam se agrupar em vias relacionadas aos processos do sistema muscular nos grupos YOU e BET (Figura S2C, NES = −0,94 a −0,79, FDR = 0,10). Além disso, a expressão gênica do ativador traducional específico do mRNA mitocondrial COX1, Mss51, foi consistentemente regulada negativamente nos grupos BET e YOU. Consistente com o mapa de calor, o gráfico de vulcão demonstrou que Mss51 foi significativamente regulado negativamente tanto no grupo BET (Figura 2E) quanto no grupo YOU (Figura S2D). Mss51 foi relatado como um regulador da tradução mitocondrial. Esses resultados indicaram que Mss51 poderia ser induzido pela idade no músculo esquelético e poderia ser um alvo potencial para a regulação pela betaína. A validação adicional foi derivada de qRT-PCR após a exclusão de genes desconhecidos, não expressos no músculo ou não relacionados à mitocôndria (Figura 2F).
A betaína atenuou o comprometimento mediado por Mss51 na respiração mitocondrial
Embora Mss51 tenha sido relatada como importante para a função mitocondrial em leveduras, os efeitos da deleção de Mss51 no metabolismo celular, na respiração mitocondrial e no controle de qualidade no músculo esquelético são conflitantes. Para investigar melhor os efeitos da betaína sobre a Mss51, células C2C12 com superexpressão estável de Mss51 marcada com FLAG foram criadas (Figura S3A, B). Ambas as células controle (CON) e com superexpressão de Mss51 (Mss51OE) foram tratadas com betaína. Resultados de MET e WB confirmaram que a superexpressão de Mss51 reduziu a quantidade mitocondrial total nas células (Figura 3A) e suprimiu a expressão de proteínas relacionadas à ETC mitocondrial e à biogênese (Figura 3B), sugerindo prejuízo na respiração mitocondrial e no metabolismo energético celular. O tratamento com betaína reverteu apenas a inibição de Mss51 na expressão de proteínas relacionadas à ETC mitocondrial (Figura 3B), mas não o declínio no número de mitocôndrias (Figura 3A). A expressão consistente de PGC1α em células Mss51OE com ou sem tratamento com betaína confirmou ainda que a betaína não conseguiu neutralizar a deterioração da biogênese mitocondrial induzida por Mss51 (Figura 3B).
A betaína atenuou o prejuízo mediado por Mss51 na respiração mitocondrial. (A) Imagens representativas de MET demonstraram que Mss51 induziu uma redução geral na quantidade mitocondrial em células C2C12, que não pôde ser revertida pela betaína. N = 4/grupo. (B) Imagens representativas de WB mostraram que a betaína reverteu a inibição nas expressões de proteínas relacionadas à ETC mitocondrial. Média ± DP, n = 4/grupo. (C) O experimento Seahorse demonstrou que a supressão mediada por Mss51 na respiração mitocondrial foi atenuada pelo tratamento com betaína. Média ± DP, n = 5–6. (D) Gráficos representativos de microscopia confocal ilustraram que o tratamento com betaína diminuiu o acúmulo de superóxido mitocondrial elevado pela Mss51. Os painéis inferiores mostraram regiões maiores destacadas nos quadros amarelos. Média ± DP, n = 4/grupo. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
Inferimos que a regulação da Mss51 pela betaína teria um impacto maior na respiração mitocondrial do que na biogênese. Para testar isso, a taxa de consumo de oxigênio celular (OCR) de células C2C12 foi avaliada por um analisador Seahorse XFe96 (Figura 3C). Em comparação com as células CON, as células Mss51OE apresentaram taxas reduzidas de respiração basal, máxima, vazamento de prótons, produção de ATP e capacidade respiratória de reserva (Figura 3C). O tratamento com betaína reverteu o declínio na respiração basal, máxima e capacidade respiratória de reserva nas células Mss51OE e apresentou uma tendência potencial de aumentar a respiração basal, o vazamento de prótons e a produção de ATP (Figura 3C). A diminuição no OCR celular levaria a um acúmulo de superóxido mitocondrial. Imagens de microscopia confocal revelaram níveis mais elevados de superóxido mitocondrial em células Mss51OE, que puderam ser reduzidos pelo tratamento com betaína (Figura 3D, P = 0,001). Esses resultados indicaram que a betaína poderia atenuar profundamente a supressão mediada por Mss51 na respiração mitocondrial e melhorar o metabolismo energético muscular.

A betaína atenuou o declínio relacionado à idade de Yy1 e Yy1 regulou negativamente a transcrição de Mss51

Com base na regulação negativa da função de Mss51 pela betaína, potenciais regulações transcricionais relacionadas ao impacto da betaína na expressão do gene Mss51 foram exploradas. Utilizando JASPAR, Cistrome e o Banco de Dados de Promotores Eucarióticos, seis fatores de transcrição putativos (Yy1, Sp1, Smad3, Zfp384, Prdm9 e Tcf12) foram identificados (Figura 4A). Dois desses candidatos (Prdm9 e Tcf12) foram descartados devido aos seus níveis de expressão de mRNA insignificantes ou extremamente baixos no tecido muscular. Entre os candidatos restantes, apenas Yy1 foi expresso de forma consistente e significativamente maior nos grupos YOU e BET em comparação com o grupo OLD (Figura 4A). O WB também revelou que a expressão de Yy1 declinou com o envelhecimento e pôde ser preservada pelo tratamento com betaína (Figura 4B).

A betaína atenuou o declínio relacionado à idade de Yy1 e Yy1 regulou negativamente a transcrição de Mss51. (A) Seis candidatos potenciais foram identificados utilizando três bancos de dados. As expressões de mRNA de Yy1 foram significativamente maiores nos grupos YOU e BET. Média ± DP, n = 4/grupo. (B) O WB revelou que o nível da proteína Yy1 declinou com o envelhecimento e pôde ser preservado pelo tratamento com betaína. Média ± DP, n = 4/grupo. (C) O banco de dados GEPIA2 indica uma correlação negativa entre a expressão de Yy1 e Mss51. (D) O promotor de comprimento total (T-2000) e uma série de promotores truncados (T-1000, T-350 e T-200) em plasmídeos repórteres de luciferase pGL4.10 foram co-transfectados com o plasmídeo Yy1 em células C2C12. A intensidade de fluorescência relativa (RFI) do ensaio de luciferase foi comparada, mostrando a regulação negativa de Yy1 na transcrição de Mss51. aRFI significativamente diferente em comparação com o grupo vetor. bDiferença significativa por análise post-hoc para comparação entre os grupos T-2000, T-1000, T-350 e T-200.
c
Diferença significativa de RFI entre os grupos T‐350 e T‐200. Média ± DP, n = 4/grupo. (E) Os resultados de ChIP demonstraram que Yy1 podia se ligar à região (−350 pb a +100 pb) do promotor de Mss51. Média ± DP, n = 4/grupo. (F) O EMSA mostrou que Yy1 podia se ligar especificamente à região promotora de Mss51 com a sequência (5′ … CAAAATGG … 3′). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.

O banco de dados GEPIA2 demonstrou a correlação negativa entre a expressão de YY1 e Mss51 (Figura 4C). Para validar os papéis de Yy1 na regulação negativa da expressão de Mss51, foram realizados os ensaios de luciferase dupla, ChIP e EMSA. Sítios de ligação putativos das regiões promotoras de Mss51 foram gerados com base no banco de dados JASPAR (Figura 4D) e co‐superexpressos com o plasmídeo Yy1 nas células C2C12. A região de −350 a +100 pb a montante do sítio de início da transcrição (TSS) de Mss51 mostrou a diminuição mais significativa (~50%) na atividade do promotor de Mss51 (Figura 4D), enquanto o knockdown de Yy1 levou a um aumento de aproximadamente 90% na atividade (Figura 4D). Esses resultados sugeriram o papel de Yy1 na supressão da transcrição de Mss51. Subsequentemente, o ChIP usando desenho de primers do sítio de –256 pb a −248 pb confirmou ainda mais que o promotor de Mss51 podia interagir com Yy1 (Figura 4E), e o EMSA demonstrou ligação específica de Yy1 à sequência (5′ … CAAAATGG … 3′) (Figura 4F).

Yy1 é necessário para a betaína melhorar a atrição da respiração mitocondrial induzida por Mss51

Para avaliar o papel de Yy1 envolvido na melhora da betaína sobre o comprometimento da respiração mitocondrial induzido por Mss51, Yy1 foi superexpresso ou knockdown nas células C2C12 Mss51OE para exploração adicional (Figura S3C). Em comparação com as células C2C12 Mss51OE com tratamento com betaína, a superexpressão de Yy1 juntamente com células Mss51OE com tratamento com betaína mostrou aumento na expressão de proteínas da respiração mitocondrial. O knockdown de Yy1 em células Mss51OE reduziu o impacto positivo da betaína na expressão das proteínas da ETC mitocondrial (Figura 5A). Experimentos de Seahorse exibiram ainda que células Mss51OE com Yy1 knockdown tiveram os menores OCRs no basal, máximo e tempo de reserva, bem como menos vazamento de prótons e produção de ATP entre os grupos (Figura 5B). Por outro lado, a superexpressão de Yy1 em células Mss51OE tendeu a ter a maior taxa de consumo de oxigênio entre os grupos (Figura 5B). Esses resultados implicaram a necessidade de Yy1 para a betaína melhorar a atrição da respiração mitocondrial induzida por Mss51.

Yy1 envolvido na melhora da betaína para a respiração mitocondrial e metabolismo energético celular em células C2C12. (A) Imagens representativas do WB mostraram que Yy1 era necessário para a betaína melhorar a respiração mitocondrial. Média ± DP, n = 4/grupo. (B) Experimentos de Seahorse demonstraram que Yy1 era necessário para a betaína regular o metabolismo energético celular das C2C12. Média ± DP, n = 4/grupo. P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
Os resultados in vitro apresentados acima indicaram o papel essencial do Yy1 na mediação do efeito benéfico da betaína na respiração mitocondrial. Para corroborar ainda mais essas observações in vivo, camundongos de 16 meses de idade foram alocados em diferentes grupos (WT, BET, YY1SM-OE e YY1SM-KD). Exceto pelo grupo WT, os outros três grupos receberam água destilada contendo 2% de betaína (p/v). Os detalhes das intervenções estão descritos na Figura 6A. AAVs carregando plasmídeos para superexpressão ou depleção de Yy1 foram injetados no músculo TA após 12 semanas, enquanto os outros dois grupos receberam injeções de um volume equivalente de solução salina a 0,9%. As eficiências da superexpressão (~145 vezes) e do knockdown (redução de 82%) induzidos por AAV in vivo foram apresentadas na Figura S3D, E. Após a intervenção, o peso corporal foi comparável entre os quatro grupos (Figura 6B). A deleção de Yy1 atenuou os efeitos favoráveis da betaína na distância percorrida (Figura 6C, P = 0.046) e na composição corporal (Figura 6D). Além disso, o grupo YY1SM-KD apresentou uma redução no gasto energético em comparação com o grupo BET (Figura 6E, F, P = 0.015).

Yy1 envolvido na melhora da betaína para a perda muscular e o declínio do metabolismo energético. (A) O fluxograma da função de ganho-perda específica do esqueleto do Yy1 pela transfecção de AAV. Os camundongos foram divididos nos seguintes quatro grupos: WT, 2%BET, Yy1SM-OE, Yy1SM-KD, n = 10/grupo. (B) Alterações no peso corporal entre os quatro grupos durante a intervenção. Média ± DP, n = 7–9/grupo. (C) O knockdown de Yy1 no músculo esquelético diminuiu os efeitos favoráveis da betaína no desempenho físico (distância percorrida na gaiola). Média ± DP, n = 4/grupo. (D) A regulação negativa de Yy1 reduziu a % de massa magra e aumentou a % de massa gorda. Média ± DP, n = 7–9/grupo. (E, F) A depleção de Yy1 prejudicou a melhora da betaína no gasto energético diário. Média ± DP, n = 4/grupo. P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.
A respiração mitocondrial e a estrutura do sarcômero são importantes para a manutenção da força e função muscular. Os resultados do MET ilustrados em contraste com o grupo YY1SM‐KD; houve menos vacuolização mitocondrial desperdiçada e sarcômero melhor organizado nos grupos BET e YY1SM‐OE (Figura 7A). A coloração SDH foi realizada para avaliar a atividade de respiração mitocondrial, que indicou um declínio na respiração mitocondrial no grupo YY1SM‐KD exibido (Figura 7B). Resultados semelhantes foram observados no nível translacional para proteínas relacionadas à mitocôndria (Figura 7C). Finalmente, a expressão transcricional de Mss51 foi avaliada via qRT‐PCR. Consistentemente com o resultado do ensaio de luciferase, os resultados indicaram que Yy1 suprimiu a expressão do gene Mss51 in vivo, e a deficiência no músculo esquelético diminuiu significativamente a regulação negativa de Mss51 mediada por betaína (Figura 7D). A análise translacional de proteínas relacionadas à mitocôndria (Figura 7C) e qRT‐PCR da expressão de Mss51 (Figura 7D) apoiaram ainda mais o papel de Yy1 na mediação dos efeitos da betaína na melhora da respiração mitocondrial e do metabolismo energético do músculo esquelético para retardar a perda muscular relacionada à idade.
A betaína atenuou a inibição da respiração mitocondrial induzida pelo envelhecimento é dependente de Yy1. (A) Imagens representativas do MET exibiram a atenuação dos efeitos da betaína nos níveis morfológicos mitocondrial e do sarcômero após a perda de Yy1, n = 4/grupo. (B) A coloração SDH ilustrou que a perda de Yy1 impactou a ativação da betaína na respiração mitocondrial, n = 4/grupo. (C) Imagens representativas do WB e a quantificação demonstram que Yy1 é necessário para o aumento da betaína na respiração mitocondrial. Média ± DP, n = 3/grupo. (D) O resultado de qPCR ilustrou que a supressão da betaína na expressão de Mss51 foi dependente do fator de transcrição Yy1. Média ± DP, n = 4/grupo. P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
Discussão
Em nosso estudo, sugere-se que a suplementação com betaína pode aliviar a perda muscular relacionada à idade ao reduzir a expressão do mRNA de Mss51 via fator de transcrição Yy1. A modulação levou a uma melhora da respiração mitocondrial, aumento do gasto energético e distância percorrida, que foram estreitamente associados à preservação da massa muscular, força e desempenho físico no envelhecimento avançado.
As mitocôndrias desempenham funções diversas, porém interconectadas, atuando como o centro do metabolismo energético. Elas também são cruciais para a renovação de nutrientes, produção de ATP e síntese de vários intermediários. Ao participar de vias metabólicas essenciais, as mitocôndrias são integradas às redes de sinalização intracelular que regulam diversas funções celulares. Não é surpreendente que a disfunção mitocondrial tenha emergido como um fator-chave no envelhecimento e em inúmeras doenças, incluindo degeneração muscular, câncer e outras doenças. Consistentes com estudos anteriores, observamos vários fenótipos característicos de disfunção mitocondrial no músculo esquelético envelhecido, como expressão diminuída de proteínas de respiração mitocondrial, número reduzido de mitocôndrias e acúmulo de vacúolos mitocondriais disfuncionais (Figura 1D). Esses resultados sugerem que a disfunção mitocondrial relacionada à idade piora o metabolismo energético e o desempenho físico no músculo esquelético envelhecido. Portanto, estratégias direcionadas às mitocôndrias são urgentemente necessárias para enfrentar a crescente carga das populações envelhecidas em todo o mundo o mais cedo possível.

No presente estudo, utilizamos camundongos de diferentes idades para investigar os declínios relacionados à idade na saúde muscular e na função mitocondrial, particularmente na respiração mitocondrial. Descobrimos que a betaína poderia aliviar os declínios relacionados à idade na função mitocondrial, incluindo a regulação positiva da expressão de proteínas relacionadas à ETC mitocondrial e a melhora das alterações histopatológicas induzidas pela idade na estrutura mitocondrial (Figura 1). Embora estudos anteriores sobre os efeitos da betaína nas mitocôndrias do músculo esquelético envelhecido sejam limitados, sua capacidade de regular a função mitocondrial tem sido amplamente relatada no tecido hepático. Por exemplo, a betaína poderia promover a dinâmica mitocondrial ativando a expressão de MFN; a betaína poderia inibir a síntese de ácidos graxos para regular o metabolismo lipídico, melhorando os sintomas de DHGNA e EHNA. Nossa descoberta dos efeitos benéficos da betaína na respiração mitocondrial do músculo esquelético envelhecido fornece novas evidências para sua potencial aplicação no retardamento da perda muscular esquelética relacionada à idade. Esses resultados são promissores, dada a fácil disponibilidade e adesão da suplementação dietética com betaína.
Numerosos genes são essenciais para coordenar a função normal da respiração mitocondrial. Em comparação com o grupo OLD, houve uma regulação negativa significativa de Mss51 nos grupos BET e YOU. A análise bioinformática, juntamente com a validação por qRT-PCR, revelou um aumento induzido pela idade na expressão de Mss51 (Figura 2D–F, Figura S2D), que poderia ser reduzido após o tratamento com betaína. A partir dos nossos resultados de GSEA, descobrimos que, juntamente com a regulação negativa de Mss51, a betaína ativou a beta-oxidação de ácidos graxos e a atividade da ETC (Figura 2B, C, Figura S2B). Enquanto isso, o tratamento com betaína foi correlacionado com a via do processo do sistema muscular (Figura S2C). Embora Mss51 seja crucial para a montagem da COX1 na ETC mitocondrial em Saccharomyces cerevisiae, sua função em camundongos ou humanos difere devido à heterogeneidade genética. Resultados do estudo de Yoshioka et al. revelaram que Mss51 era um regulador específico do músculo esquelético essencial para o metabolismo celular. Em contrapartida, Wagner et al. demonstraram que Mss51 poderia ser induzida por estresse e regular negativamente a função mitocondrial. A deleção de Mss51 melhoraria a homeostase da glicose e a respiração mitocondrial, aumentaria a resistência ao exercício e melhoraria a histopatologia muscular. Notavelmente, um estudo humano recente demonstrou que Mss51 está associada à incidência de diabetes tipo 2, indicando seu papel adverso na regulação do metabolismo energético. De acordo com os resultados de Wagner et al., confirmamos os efeitos adversos de Mss51 na biogênese mitocondrial e no metabolismo energético mitocondrial (Figura 3). As diferenças nos mecanismos subjacentes e nos modelos animais podem explicar esses resultados conflitantes.

Ao suplementar células C2C12 com betaína, confirmamos que a betaína poderia resgatar significativamente a inibição da respiração mitocondrial causada por Mss51 (Figura 3). Estudos anteriores indicam que a função de Mss51 pode ser regulada transcricionalmente, levando-nos a considerar que o mecanismo subjacente da betaína na regulação da função de Mss51 pode estar relacionado a fatores de transcrição. Uma exploração adicional identificou seis candidatos que poderiam regular transcricionalmente a expressão de Mss51. Através de ensaios de luciferase, ChIP e EMSA, foi confirmado que o fator de transcrição Yy1 regula específica e negativamente a expressão de Mss51 (Figura 4D–F). Yy1 é bem documentado como um regulador crucial da homeostase metabólica. A literatura anterior mostrou que a deleção de Yy1 inibe significativamente a expressão de moléculas relacionadas à ETC mitocondrial, comprometendo assim a OXPHOS mitocondrial e prejudicando a função muscular. Além disso, Yy1 pode inibir a sinalização de TGF-β no núcleo. Sabe-se que a sinalização de TGF-β regula a ativação de Mss51 a montante, fornecendo uma explicação de como a regulação positiva de Yy1 pela betaína poderia inibir a expressão de Mss51 e aumentar a respiração mitocondrial.
Nossos resultados demonstram que a perda de Yy1 diminui os efeitos benéficos da betaina na respiração mitocondrial e na taxa de consumo de oxigênio em células C2C12 (Figura 5). Dessa forma, antecipamos que a regulação da betaina na respiração mitocondrial via supressão da Mss51 deveria ser dependente de Yy1. Portanto, levantamos a hipótese de que a regulação da respiração mitocondrial pela betaina, ao suprimir Mss51, é dependente de Yy1. Essa hipótese foi corroborada pelo nosso estudo in vivo usando camundongos de 16 meses de idade. Por meio de experimentos de ganho e perda de função de Yy1 no músculo TA, descobrimos que Yy1 é necessário para a regulação da respiração mitocondrial pela betaina. A perda de Yy1 resultou em um aumento na porcentagem de massa gorda e prejuízo na capacidade de exercício (Figura 6). Mecanisticamente, observamos uma regulação positiva significativa da expressão de Mss51 no músculo TA após a depleção de Yy1 (Figura 7), ilustrando ainda mais a dependência da inibição de Mss51 pela betaina em relação a Yy1. Dado nosso estudo anterior demonstrando que a betaina ativa a via de sinalização mTORC1, e Puigserver et al. confirmando que mTORC1 controla a OXPHOS mitocondrial através do complexo Yy1-PGC1α, suspeitamos que a via de sinalização mTORC1 pode ligar a betaina e Yy1 na regulação da expressão de Mss51. Mais estudos são necessários para explorar esse mecanismo no futuro.
Interessantemente, a superexpressão de Yy1 não levou a melhorias significativas na função mitocondrial ou do músculo esquelético in vivo ou in vitro, como esperado (Figuras 5, 6, 7). Especulamos que a ausência de Yy1 poderia comprometer grandemente o metabolismo energético e outros processos biológicos essenciais através de vias regulatórias transcricionais complexas, incluindo ativação de sinalização, proliferação e diferenciação celular. Todos esses processos comprometidos reduziriam significativamente os efeitos benéficos da betaina. É possível que o impacto da betaina na melhora mitocondrial já tenha atingido seu pico, tornando assim a melhora da superexpressão de Yy1 na respiração mitocondrial menos perceptível. Além disso, permanece desconhecido se existe uma janela de tempo mais longa para a transfecção por AAV de Yy1 exercer efeitos sobre a regulação da betaina, o que pode exigir exploração adicional no futuro.
Em conclusão, nosso estudo demonstra que a suplementação dietética com betaina pode aliviar a supressão relacionada à idade da respiração mitocondrial e mitigar a perda de músculo esquelético. Nossos achados sugerem que a aplicação da suplementação de betaina, isoladamente ou em combinação com outras intervenções, é promissora para a tradução clínica no atraso da perda muscular, melhora do metabolismo energético no músculo esquelético envelhecido e potencialmente na extensão do período de saúde.
Em conclusão, nosso estudo demonstra que a suplementação dietética com betaína pode aliviar a supressão da respiração mitocondrial relacionada à idade e mitigar a perda de massa muscular esquelética. Nossos achados sugerem que a aplicação da suplementação com betaína, isoladamente ou em combinação com outras intervenções, é promissora para a tradução clínica no retardo da perda muscular, na melhora do metabolismo energético no músculo esquelético envelhecido e, potencialmente, na extensão da saúde.
Conflito de interesses
Os autores declaram não haver conflitos de interesses.
Informações de suporte
Declaração de disponibilidade de dados
Os conjuntos de dados gerados durante o presente estudo estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.
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