pmid: "39897540"
title: "Betaina inibe as propriedades semelhantes a células-tronco do carcinoma hepatocelular ao ativar a autofagia via SAM/m"
authors: "Wang C, Li MC, Huang WG, Huang SY, Wusiman M, Liu ZY, Zhu HL"
journal: "Theranostics"
pubdate: "2025"
doi: "10.7150/thno.102682"
source: "PMC Full Text"

Betaina inibe as propriedades semelhantes a células-tronco do carcinoma hepatocelular ao ativar a autofagia via SAM/m

Autores

Wang C, Li MC, Huang WG, Huang SY, Wusiman M, Liu ZY, Zhu HL

Periodico

Theranostics (2025)

Conteudo

Betaina inibe as propriedades semelhantes a células-tronco do carcinoma hepatocelular ao ativar a autofagia via aumento mediado por SAM/m6A/YTHDF1 na estabilidade do ATG3

Background: Sabe-se que as propriedades semelhantes a células-tronco promovem a recorrência e metástase do carcinoma hepatocelular (CHC), contribuindo para um mau prognóstico em pacientes com CHC. A betaina, um importante fitoquímico e uma substância relacionada à doação de metila, demonstrou efeitos protetores contra doenças hepáticas. No entanto, seu efeito sobre as propriedades semelhantes a células-tronco do CHC e os mecanismos subjacentes ainda não foi investigado.

Methods: Avaliamos os efeitos da betaina nas propriedades semelhantes a células-tronco e na progressão maligna do CHC usando xenoenxertos derivados de pacientes, xenoenxertos derivados de células, modelos de metástase pulmonar por veia da cauda, diluição limitante in vitro, formação de esferas tumorais, formação de colônias e ensaios de transwell. A exploração mecanicista foi conduzida usando western blots, dot blots, imunoprecipitação de RNA metilado seguida de qPCR, ensaios de estabilidade de RNA, imunoprecipitação de RNA seguida de qPCR, pull-down de RNA e ensaios de mutação gênica.

Results: Um estudo de coorte de CHC descobriu que uma concentração sérica mais elevada de betaina estava associada a níveis reduzidos de marcadores relacionados à pluripotência. Além disso, em células de CHC e camundongos com xenoenxertos, a betaina suprimiu as propriedades semelhantes a células-tronco do CHC ao ativar a autofagia. Mecanisticamente, a betaina aumentou a modificação m6A no CHC ao produzir S-adenosilmetionina (SAM) via betaina-homocisteína S-metiltransferase (BHMT). Esse aumento de SAM subsequentemente desencadeou a autofagia ao aumentar a estabilidade da proteína 3 relacionada à autofagia (ATG3) via YTHDF1 de maneira dependente de m6A, inibindo assim as propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC.

Conclusions: Essas descobertas indicam que a betaina inibe as propriedades semelhantes a células-tronco do CHC através da via SAM/m6A/YTHDF1/ATG3. Este estudo ressalta os potenciais efeitos antitumorais da betaina no CHC e oferece novas perspectivas terapêuticas para pacientes com CHC.

Introduction
O carcinoma hepatocelular (CHC) é a terceira principal causa de mortalidade relacionada ao câncer globalmente e impõe uma carga substancial à saúde. Os principais contribuintes para esse mau prognóstico são a recorrência tumoral e a metástase. Estudos anteriores revelaram que as propriedades semelhantes a células-tronco conferem às células de CHC capacidades de autorrenovação e metástase. Além disso, pacientes com CHC com índices de pluripotência mais elevados consistentemente apresentam uma duração de sobrevida mais curta. Assim, investigar os mecanismos subjacentes a essas propriedades semelhantes a células-tronco e desenvolver novas estratégias terapêuticas pode melhorar o prognóstico para pacientes com CHC.
Autofagia é um processo celular fundamental e conservado que é regulado por uma série de genes relacionados à autofagia (ATGs) e desempenha um papel crucial na modulação das propriedades semelhantes a células-tronco do câncer. Estudos recentes relataram que a ativação da autofagia com produtos naturais pode impedir as propriedades semelhantes a células-tronco de células cancerígenas, incluindo capsaicina, curcumina e resveratrol. A betaína, um fitoquímico importante na beterraba e no espinafre, desempenha papéis protetores significativos contra várias doenças, incluindo transtornos mentais, perda muscular, distúrbios reprodutivos e doenças hepáticas. Investigações experimentais descobriram que esses efeitos benéficos estão associados a vários mecanismos, como modular a diferenciação microglial M1/M2, estimular a autofagia dependente de METTL21C/p97/VCP em mioblastos e mitigar a senescência e apoptose em células reprodutivas. Mais importante, estudos recentes demonstraram que os efeitos protetores da betaína em doenças hepáticas estão associados à autofagia ativada. No entanto, se a autofagia ativada pela betaína poderia inibir as propriedades semelhantes a células-tronco de células de CHC, e os mecanismos por trás da ativação da autofagia pela betaína permanecem obscuros.
N6-metiladenosina (m6A) é uma modificação epitranscriptômica em RNAs e é fundamental para a ativação da autofagia. Mecanicamente, os "escritores" de m6A transferem um grupo metila da S-adenosilmetionina (SAM) para os RNAs, enquanto os "apagadores" o removem. Os "leitores", como YTHDFs, YTHDCs, IGF2BPs e HNRNPs, reconhecem m6A em RNAs e regulam processos de RNA, incluindo maturação, splicing, estabilidade e tradução. Notavelmente, a betaína serve como um doador crucial de grupos metila ao gerar SAM e desempenha um papel importante na modulação da modificação m6A. Portanto, levantamos a hipótese de que a betaína pode inibir as propriedades semelhantes a células-tronco de células de CHC ao ativar a autofagia via modificação m6A dependente de SAM em ATGs.
No presente estudo, nosso objetivo foi investigar os efeitos inibitórios da betaína nas propriedades semelhantes a células-tronco do CHC e elucidar os mecanismos subjacentes. Nossas descobertas podem fornecer mais insights sobre os efeitos antitumorais da betaína e expandir a gama de opções terapêuticas para pacientes com câncer.
Materiais e Métodos
Coleta de soro e tecidos
O soro e os tecidos de pacientes utilizados neste estudo foram derivados do contínuo "Guangdong Liver Cancer Cohort (GLCC)" (NCT03297255), que foi estabelecido em 2013. Os critérios para recrutamento de pacientes foram os seguintes: 1) diagnosticados recentemente no último mês, 2) sem histórico de outros cânceres, 3) sem tratamento anticâncer anterior e 4) disponibilidade de amostras de sangue em jejum e tecidos cirúrgicos de CHC.
Medição de betaína sérica
A betaína sérica foi medida por cromatografia líquida de alta eficiência com espectrometria de massa em tandem com ionização por electrospray online, seguindo os métodos descritos anteriormente.
Formação de esferas tumorais
Para avaliar as propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC, foi realizado um ensaio de formação de esferas tumorais. Resumidamente, cerca de 400 células foram semeadas em uma placa de 6 poços de ultrabaixa aderência contendo 4 mL de meio livre de soro. Este meio era constituído principalmente de meio DMEM-F/12, suplementado com 1% de B27, 1% de N2, 25 ng/mL de EGF e 25 ng/mL de FGF. As células foram então incubadas por um período de 14 dias. Posteriormente, as esferas tumorais formadas foram visualizadas e fotografadas usando um microscópio invertido.

Ensaio de diluição limitante in vitro
Após serem diluídas, as células de CHC foram adicionadas a uma placa de 96 poços de ultrabaixa aderência na densidade de 2, 5, 10, 25, 50 células/poço (n = 18 poços) e incubadas com meio livre de soro por 14 dias. Em seguida, o número de poços com esferas foi contado. A capacidade de formação de esferas foi calculada usando o software online ELDA de acordo com as instruções.

Medição de autofagossomos
Após as células de CHC serem tratadas com betaína por 24 h, as células foram lavadas com PBS gelado e coletadas. Em seguida, as células foram fixadas com glutaraldeído a 2,5% por 24 h e coradas com ácido fosfotúngstico. Finalmente, os autofagossomos celulares foram capturados e contados usando um microscópio eletrônico de transmissão (MET).

Avaliação do fluxo autofágico
As células de CHC foram semeadas em uma placa de seis poços para atingir 40% de confluência. Em seguida, Ad-mCherry-GFP-LC3 (Beyotime, Xangai, China) foi adicionado a cada poço e incubado por 48 h. Subsequentemente, as células foram semeadas em uma placa de confocal e cultivadas por 24 h. Depois disso, as células foram submetidas ao tratamento com betaína por 24 h e os pontos de LC3 foram capturados usando um microscópio confocal. O número de pontos de LC3 celulares foi analisado pelo software ImageJ.

Ensaio de dot blot
Após a extração, o RNA total foi diluído para uma concentração final de 25 ng/μL e desnaturado a 95 °C por 6 min. Em seguida, diferentes concentrações de RNA desnaturado (50, 100, 200 ng) foram adicionadas a uma membrana de nitrocelulose e reticuladas sob uma lâmpada ultravioleta por 16 min. Posteriormente, a membrana foi lavada com TBST e incubada com leite desnatado a 5% por 30 min. Os procedimentos restantes seguiram o ensaio de Western blot (WB). A coloração com azul de metileno (MB) foi usada como controle de carregamento.

Quantificação da metilação do RNA m6A
O nível de RNA contendo modificação m6A nas células de CHC foi detectado usando o kit de quantificação de metilação m6A EpiQuik (Epigentek, Farmingdale, EUA). Após o RNA total ser extraído e o mRNA purificado, o nível de m6A em 100 ng de mRNA foi medido de acordo com as instruções do fabricante.

Imunoprecipitação de RNA metilado-qPCR
O nível de ATG3 modificado por m6A nas células de CHC foi detectado usando o método de Imunoprecipitação de RNA Metilado-qPCR (MeRIP-qPCR). Após o RNA total ser extraído e purificado, a extração do RNA modificado por m6A foi realizada usando o kit MeRIP (BersinBio, Guangzhou, China) de acordo com as diretrizes do fabricante. Em seguida, o RNA isolado foi submetido ao ensaio de qPCR para detectar o nível de ATG3 modificado por m6A.

Ensaio de estabilidade do RNA
Células HCC foram semeadas em uma placa de 6 poços e submetidas ao tratamento com betaína por 24 h. Em seguida, o meio foi removido, e meio fresco contendo 5 μg/mL de Actinomicina D (MCE, Xangai, China) foi adicionado a cada poço. As células foram coletadas após diferentes tempos de cultura (0, 3, 6 h). Os procedimentos restantes seguiram o isolamento de RNA e o ensaio de qPCR.
Imunoprecipitação de RNA-qPCR
O kit de imunoprecipitação de RNA-qPCR (RIP-qPCR) (BersinBio) foi utilizado para detectar a interação entre o mRNA de ATG3 e a proteína YTHDF1. Resumidamente, as células HCC foram lisadas com tampão de lise RIP a 4 °C por 30 min. Enquanto isso, 7,5 μg do anticorpo primário YTHDF1 foram pré-ligados a beads magnéticas de Proteína A/G em tampão de imunoprecipitação por 1,5 h. Em seguida, os lisados celulares foram adicionados e incubados sob rotação a 4 °C durante a noite. Posteriormente, o RNA foi eluído com tampão de eluição e extraído com reagente TransZOL. O enriquecimento do mRNA de ATG3 foi detectado por ensaio de qPCR. O anticorpo IgG foi utilizado como controle negativo.
Ensaio de RNA pull-down
O kit de RNA pull-down (BersinBio) foi utilizado para validar a interação entre o mRNA de ATG3 e a proteína YTHDF1. A sonda sense de ATG3 marcada com biotina e a sonda antisense foram desenhadas e sintetizadas pela GenePharm. Resumidamente, a sonda de ATG3 marcada com biotina foi adicionada a beads magnéticas de estreptavidina e pré-revestida por 60 min. Em seguida, os lisados celulares foram misturados com as beads magnéticas pré-revestidas e incubados a 4 °C por 150 min. Finalmente, as proteínas foram eluídas e submetidas ao ensaio de WB.
Construção de células do tipo selvagem e mutante com sítio de reconhecimento m6A de YTHDF1
Para validar que a ligação da proteína YTHDF1 e do mRNA de ATG3 era dependente de m6A, o lentivírus mutante do sítio de reconhecimento m6A específico de YTHDF1 foi construído pela GenePharm (YTHDF1-MUT), e o tipo selvagem de YTHDF1 (YTHDF1-WT) foi utilizado como controle (Tabela S1). Após a construção, os procedimentos seguintes seguiram o processo descrito na seção de métodos suplementares referente à construção de linhagens celulares com transfecção estável.
Aquisição e alimentação de animais
Camundongos BALB/c nude e NCG de quatro semanas (machos) foram adquiridos do Centro de Animais de Laboratório da Universidade Sun Yat-sen e da Gempharmatech (Jiangsu, China), respectivamente. Os camundongos foram mantidos em gaiolas individualmente ventiladas em uma instalação animal livre de patógenos específicos (SPF). Todos os estudos com animais receberam permissão do comitê de ética em experimentação animal (Nº 2019-020) e foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais. Após uma semana de aclimatação, os camundongos foram aleatoriamente designados para diferentes grupos para realizar os seguintes ensaios com animais.
Ensaio de diluição limitante in vivo
Para detectar as propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC, foi realizado um ensaio de diluição limitante in vivo. Resumidamente, esferas de CHC submetidas a diferentes tratamentos foram dissociadas usando accutase e suspensas em PBS a uma densidade final de 2×105, 2×106 e 2×107 células/mL, respectivamente. Em seguida, diferentes concentrações de células de CHC (100 μL) foram injetadas por via subcutânea em camundongos (n = 5). Após 30 dias, os camundongos foram eutanasiados de forma humanitária e os tumores foram extraídos. A capacidade de formação de tumores foi calculada usando o software ELDA online de acordo com as instruções.
Ensaio de metástase pulmonar por veia da cauda
Para investigar a capacidade metastática, foi realizado o ensaio de metástase pulmonar por veia da cauda. Resumidamente, as células de CHC foram submetidas a diferentes tratamentos para a geração de células esféricas. Em seguida, as células esféricas de diferentes grupos foram dissociadas com accutase e diluídas em PBS até atingir uma densidade final de 5×107 células/mL. Posteriormente, 100 μL da mistura de células foram injetados na veia lateral da cauda de camundongos (n = 8). O tempo de sobrevivência de cada camundongo foi registrado. A eutanásia foi realizada 66 dias após a injeção, e as amostras de tecido pulmonar foram obtidas. A análise de sobrevivência foi realizada para comparar a diferença no tempo de sobrevivência entre diferentes grupos.
Estabelecimento do modelo de xenoenxerto derivado de paciente
O modelo de xenoenxerto derivado de paciente (PDX) foi estabelecido para detectar o efeito da betaína nas propriedades semelhantes a células-tronco, autofagia e modificação m6A em tecidos de CHC. Resumidamente, após a cirurgia, os tecidos frescos de CHC foram preservados em Solução Salina Balanceada de Hanks gelada contendo 5% de antibiótico-antimicótico e transportados para o laboratório animal em gelo dentro de 2 horas. Em seguida, os tecidos de CHC foram seccionados em fragmentos de 1 mm³ e transplantados para camundongos NCG no lado subcutâneo. Após 90 dias de crescimento da primeira geração (G1), os tecidos tumorais de CHC dos camundongos G1 foram extraídos e transplantados para camundongos NCG para crescimento da segunda geração (G2). Após mais 60 dias de crescimento, os tecidos tumorais G2 foram isolados para o experimento de intervenção subsequente.
Em suma, camundongos NCG foram submetidos a água potável normal e contendo 3% de betaína por 7 dias antes do transplante da terceira geração (G3). Após o transplante G3, os camundongos dos grupos de água normal e água com 3% de betaína foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: 1) Grupo Controle: recebeu água potável normal e injeção intraperitoneal de 100 µL de água a cada quatro dias; 2) Grupo HCQ (Hidroxicloroquina): injeção intraperitoneal de 100 µL de HCQ a 60 mg/kg a cada quatro dias; 3) Grupo Betaína: recebeu água potável contendo 3% de betaína e injeção intraperitoneal de 100 µL de água a cada quatro dias; 4) Grupo Betaína + HCQ: recebeu água potável contendo 3% de betaína e injeção intraperitoneal de 100 µL de HCQ a 60 mg/kg a cada quatro dias. Os camundongos foram alimentados continuamente por 60 dias. Posteriormente, os camundongos foram eutanasiados de forma humanitária e os tecidos tumorais de CHC dos camundongos G3 foram coletados para os ensaios subsequentes.
Análise estatística
Todos os dados são apresentados como média ± DP. A diferença entre dois grupos foi calculada pelo teste t de Student usando o software SPSS 22.0 (IBM, Armonk, EUA). A análise de sobrevivência foi realizada usando o teste de Log-rank. Todos os gráficos e figuras estatísticos foram gerados usando os softwares GraphPad Prism 8.0 (San Diego, EUA) e Adobe Illustrator CS6 (Adobe, San Jose, EUA), respectivamente. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos 3 vezes. Um valor de P inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
A betaína inibe as propriedades semelhantes a células-tronco das células de HCC
Para obter uma compreensão abrangente do impacto da betaína nas propriedades semelhantes a células-tronco do HCC, foram avaliados tanto os níveis séricos de betaína quanto a expressão de marcadores relacionados à stemness em 70 pacientes com HCC. Os resultados indicaram que pacientes com níveis séricos mais elevados de betaína apresentaram expressão reduzida de marcadores relacionados à stemness (Figura 1A-E e Tabela S2), sugerindo que a betaína pode suprimir as propriedades semelhantes a células-tronco das células de HCC. Em seguida, um modelo PDX de HCC foi estabelecido e tratado com betaína (Figura S1A). Os achados revelaram que a betaína inibiu significativamente o crescimento tumoral, bem como o volume e o peso dos tumores de HCC (Figura 1F-H). Histologicamente, em comparação com o grupo controle (Ctrl), houve uma redução na atipia nuclear, figuras mitóticas e na relação núcleo-citoplasma após a intervenção com betaína (Bet). Além disso, observou-se aumento da picnose das células tumorais e dissolução dos núcleos (Figura 1I). Isso foi acompanhado por uma regulação negativa dos marcadores relacionados à stemness no grupo tratado com betaína (Figura 1J e Figura S1B).
Posteriormente, as células de HCC foram tratadas com 200 mM de betaína para investigar seu impacto nas propriedades semelhantes a células-tronco (Figura S1C-F). Ensaios in vitro demonstraram que o tratamento com betaína atenuou significativamente as propriedades semelhantes a células-tronco das células de HCC, manifestado pela regulação negativa dos marcadores relacionados à stemness, diminuição no número de esferas e redução na capacidade de formação de esferas (Figura 1K-L e Figura S1G). Além disso, o ensaio de diluição limitante in vivo confirmou que a betaína suprimiu marcadamente as habilidades tumorigênicas das células de esfera de HCC (Figura 1M). Em resumo, esses resultados demonstram coletivamente que a betaína inibe efetivamente as propriedades semelhantes a células-tronco do HCC.
Melhora da progressão maligna do HCC após supressão das propriedades semelhantes a células-tronco pela betaína
As propriedades semelhantes às de células-tronco das células cancerosas estão associadas a comportamentos celulares malignos, incluindo aumento do crescimento, metástase e transição epitélio-mesenquimal (TEM). Portanto, avaliamos a alteração do crescimento e da metástase de células de CHC após a inibição das propriedades semelhantes às de células-tronco pela betaína. Ensaios de WB e IHC indicaram que a betaína suprimiu notavelmente a expressão dos marcadores proteicos associados ao crescimento e à metástase e inibiu a TEM em tecidos de PDX (Figura 2A e Figura S2A). Além disso, as células esferoides derivadas de células de CHC tratadas com betaína apresentaram viabilidade e motilidade reduzidas, evidenciadas pela inibição da formação de colônias, migração e invasão (Figura 2B-D e Figura S2B-C). Similarmente, a expressão de marcadores proteicos associados ao crescimento, metástase e TEM foi reduzida nas células esferoides tratadas com betaína (Figura S2D). Por fim, em um modelo de metástase por injeção na veia da cauda de camundongos, aqueles injetados com células esferoides tratadas com betaína exibiram metástase reduzida e maior tempo de sobrevida (Figura 2E-G e Figura S2E). Assim, nossos dados demonstram que a betaína atenua a progressão maligna do CHC.
A betaína inibe as propriedades semelhantes às de células-tronco do CHC ao ativar a autofagia
Estudos anteriores indicaram que o efeito protetor da betaína na doença hepática está ligado ao aumento da autofagia. Portanto, investigamos o impacto da betaína na autofagia em células de CHC. Nossos achados revelaram que o tratamento com betaína elevou significativamente os níveis de LC3 II em células de CHC e tecidos de PDX (Figura 3A, e Figura S3A-B). O aumento observado nos níveis de LC3 II pode ser devido à ativação da autofagia ou à inibição da degradação do autofagossomo. Para esclarecer isso, examinamos o fluxo autofágico em células de CHC tratadas com betaína. Os resultados de MET e da transfecção com mCherry-GFP-LC3 demonstraram que o tratamento com betaína promoveu significativamente a formação de autofagossomos e contribuiu para uma maior proporção de pontos vermelhos/amarelos (Figura 3B-C e Figura S3C-D), sugerindo a ativação da autofagia pela betaína em células de CHC.
Para investigar se os efeitos inibitórios da betaína nas propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC estão ligados à ativação da autofagia, primeiro examinamos a alteração nos marcadores relacionados à stemness e à autofagia em células de CHC tratadas com betaína. O ensaio de IF mostrou que a expressão de Nanog foi regulada negativamente, enquanto a LC3B foi regulada positivamente em células de CHC após o tratamento com betaína (Figura 3D e Figura S3E), indicando a correlação negativa entre as propriedades semelhantes a células-tronco e a autofagia em células de CHC sob tratamento com betaína. Em seguida, utilizamos HCQ (um inibidor terminal da autofagia) para inibir a autofagia em tumores PDX e descobrimos que a inibição da autofagia prejudicou os efeitos antitumorais da betaína no CHC (Figura 1F-H). Histologicamente, em comparação com o grupo betaína, observou-se um aumento na atipia nuclear, figuras mitóticas, razão núcleo-citoplasmática e redução da picnose das células tumorais e dissolução dos núcleos no grupo Bet+HCQ (Figura 3E). Além disso, um marcador relacionado à stemness significativamente elevado foi detectado no grupo Bet+HCQ em comparação ao grupo Bet (Figura 3F e Figura S3F-H). Subsequentemente, a autofagia foi inibida em células de CHC usando tratamentos com HCQ e shRNA/siRNA de ATG5, e as alterações nas propriedades semelhantes a células-tronco foram observadas (Figura S4A-B, S4G-H e S5A-H). Os resultados revelaram que a inibição da autofagia reduziu significativamente os efeitos inibitórios da betaína nas propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC, conforme demonstrado pela regulação positiva dos marcadores de stemness e pela capacidade de formação de esferas (Figura 3G-H e Figura S6A-D).

Em seguida, medimos a alteração dos fenótipos celulares malignos do CHC após a regulação positiva da stemness. Os resultados mostraram que a inibição da EMT, metástase e marcadores relacionados ao crescimento pelo tratamento com betaína foi revertida quando a autofagia foi suprimida em tumores PDX e células de CHC (Figura 4A-C e Figura S7A-C). Enquanto isso, ensaios de formação de esferas, formação de colônias, transwell e crescimento tumoral in vivo mostraram que tanto o tratamento com HCQ quanto o silenciamento de ATG5 atenuaram significativamente os efeitos inibitórios da betaína nesses fenótipos celulares (Figura 4D-K e Figura S7D-M). Além disso, um ensaio de metástase in vivo mostrou que a inibição da autofagia aumentou marcadamente a capacidade metastática e encurtou o tempo de sobrevivência dos camundongos em comparação ao grupo Bet (Figura 4L-N). Portanto, nossos achados demonstram que a inibição da autofagia atenua os efeitos da betaína nas propriedades semelhantes a células-tronco e nos fenótipos malignos do CHC.

A betaína promove a autofagia por meio da modificação m6A mediada por SAM
Como uma das modificações epigenéticas cruciais em eucariotos, a metilação m6A tem sido relatada por desempenhar um papel na ativação da autofagia. Curiosamente, demonstrou-se que a betaína atua como uma importante fonte de doadores de metila para a geração de SAM. Consequentemente, exploramos se a betaína poderia promover a autofagia em células de CHC via modificação m6A mediada por SAM. Na coorte GLCC, descobrimos que pacientes com CHC com alto nível de betaína sérica apresentavam um teor aumentado de m6A em tecidos de CHC (Figura 5A). Da mesma forma, o tratamento com betaína elevou significativamente o teor de m6A em células de CHC e tumores PDX (Figura 5B-E), enquanto a inibição da autofagia, seja por tratamento com HCQ ou transfecção com shATG5, não teve efeito sobre a modificação m6A (Figura S8A-F).
Posteriormente, investigamos o papel do SAM na modificação m6A induzida por betaína no CHC. Descobrimos que o tratamento com betaína aumentou marcadamente os níveis de SAM em células de CHC e tecidos PDX (Figura 5F-G), mas nenhuma alteração foi observada ao suprimir a autofagia (Figura S8G-I). Além disso, o SAM promoveu a modificação m6A de forma dose-dependente em células de CHC (Figura 5H-J). No entanto, o silenciamento da BHMT não apenas diminuiu a produção de SAM, mas também inibiu a modificação m6A em células de CHC, enquanto a suplementação adicional de SAM neutralizou o efeito de regulação negativa da BHMT (Figura 5K-M, Figura S4C e S4I). Além disso, nossos resultados demonstraram que o knockdown da BHMT inibiu a expressão de LC3 II, reduziu o número de autofagossomos e diminuiu os pontos de LC3, enquanto o tratamento com SAM reverteu significativamente esses efeitos (Figura 5N e Figura S9A-D). Portanto, nossos resultados sugerem que a betaína ativa a autofagia no CHC via modificação m6A mediada por SAM.
A betaína ativa a autofagia promovendo a expressão de ATG3 de maneira dependente de SAM/m6A
O processo de ativação da autofagia é estritamente regulado por uma classe de genes relacionados à autofagia (ATGs). Para esclarecer os genes-alvo da betaína, medimos a modificação m6A de ATGs em células de CHC tratadas com betaína. Inicialmente, os resultados de qPCR indicaram que, entre 13 ATGs-chave, apenas os mRNAs de ATG3 e ATG5 foram consistentemente regulados positivamente, enquanto SQSTM1 e BECN1 foram regulados negativamente nas linhagens celulares HUH-7 e Hep3B após exposição à betaína (Figura 6A). Os resultados de MeRIP-qPCR demonstraram que o tratamento com betaína aumentou a modificação m6A nos mRNAs de ATG3 e BECN1 nas duas linhagens celulares (Figura 6B), sugerindo que a modificação m6A mediada por betaína pode ativar a autofagia via ATG3. Enquanto isso, o MeRIP-qPCR confirmou ainda que a modificação m6A no sítio 2 previsto do mRNA de ATG3 foi significativamente elevada no grupo Bet, enquanto nenhuma alteração significativa foi observada no sítio 1 (Figura 6C-D). Além disso, ensaios de WB e IHC ilustraram que a exposição à betaína aumentou marcadamente a expressão da proteína ATG3 (Figura 6E-F).
Em seguida, exploramos se o aumento da expressão de ATG3 induzido pela betaína era atribuído à modificação m6A mediada por SAM. Os resultados mostraram que o silenciamento de BHMT não apenas inibiu a modificação m6A no mRNA de ATG3, mas também atenuou a expressão do mRNA e da proteína ATG3 em células de CHC, enquanto a suplementação com SAM reverteu esses efeitos (Figura 6G-I). Além disso, o silenciamento de ATG3 prejudicou a ativação da autofagia pela betaína em células de CHC (Figura 6J, Figura S4D-E, S4J-K e S10A-D). Assim, nossos resultados demonstram que a betaína ativa a autofagia ao regular positivamente ATG3 por meio da modificação m6A mediada por SAM.

A betaína aumenta a estabilidade do mRNA de ATG3 de forma dependente de SAM/m6A/YTHDF1

Foi relatado que a modificação m6A pode influenciar a estabilidade, tradução, splicing, degradação e transporte de RNAs por meio de proteínas leitoras específicas. Para elucidar qual leitor media a regulação positiva de ATG3 sob tratamento com betaína de forma dependente de m6A, focamos inicialmente na estabilidade do mRNA de ATG3, dado o aumento observado nos níveis de mRNA de ATG3 sob tratamento com betaína. Ensaios de qPCR revelaram que a betaína restaurou significativamente o nível de mRNA de ATG3 após o tratamento com Act D em comparação ao grupo controle (Ctrl) (Figura 7A), e o silenciamento de BHMT atenuou a regulação positiva do nível de mRNA de ATG3 sob tratamento com betaína (Figura 7B). No entanto, a suplementação adicional com SAM reverteu significativamente o efeito do knockdown de BHMT na estabilidade do mRNA de ATG3 aumentada pela betaína (Figura 7B), sugerindo que a betaína pode aumentar a estabilidade do mRNA de ATG3 por meio da modificação m6A mediada por SAM. Em seguida, a análise bioinformática descobriu que, entre os leitores relacionados à m6A que medeiam a estabilidade dos RNAs, o YTHDF1 estava significativamente correlacionado positivamente com a expressão de ATG3 em tecidos de CHC (Figura 7C). Portanto, investigamos ainda mais o papel do YTHDF1 na mediação da estabilidade do mRNA de ATG3. Os resultados de RIP-qPCR e pull-down de RNA demonstraram que o YTHDF1 poderia interagir diretamente com o mRNA de ATG3 (Figura 7D-E).
Para confirmar que a interação entre a proteína YTHDF1 e o mRNA de ATG3 era dependente de m6A, prejudicamos geneticamente as bolsas de ligação de m6A da YTHDF1 através da mutação dos resíduos K395 e Y397 dentro do domínio YTH (Figura 7F). Os resultados de RIP-qPCR indicaram que o mRNA de ATG3 foi significativamente imunoprecipitado a partir de células de HCC transfectadas com YTHDF1-WT, enquanto a interação entre YTHDF1-MUT e o mRNA de ATG3 foi significativamente reduzida, implicando o papel fundamental da bolsa de ligação de m6A da YTHDF1 em sua interação com o mRNA de ATG3 (Figura 7G). Além disso, descobrimos que YTHDF1-WT, mas não YTHDF1-MUT, aumentou significativamente os níveis de mRNA e proteína de ATG3 (Figura 7H-I). Finalmente, constatamos que o knockdown de YTHDF1 não apenas reduziu os níveis de mRNA e proteína de ATG3, mas também prejudicou o efeito potencializador da betaína sobre os níveis de mRNA e proteína de ATG3, bem como sobre a estabilidade do mRNA de ATG3 (Figura 7J-N e Figura S4F). Portanto, nossos dados demonstram que a betaína poderia promover a estabilidade do mRNA de ATG3 através de um mecanismo dependente de SAM/m6A/YTHDF1.

O silenciamento de ATG3 prejudica os efeitos da betaína nas propriedades semelhantes a células-tronco das células de HCC
Considerando o papel crucial de ATG3 na autofagia ativada pela betaína, realizamos ensaios de resgate para investigar o efeito de ATG3 na supressão das propriedades semelhantes a células-tronco em células de HCC induzida pela betaína. Os resultados de ensaios de formação de esferas, diluição limitante in vitro e in vivo revelaram que o silenciamento de ATG3 prejudicou significativamente os efeitos inibitórios da betaína sobre as propriedades semelhantes a células-tronco das células de HCC (Figura 8A-B e Figura S11A-D). Além disso, o knockdown de ATG3 atenuou marcadamente a regulação negativa dos marcadores relacionados à pluripotência induzida pelo tratamento com betaína (Figura 8C e Figura S11E).

Ademais, ensaios de formação de colônias, transwell, WB e metástase in vivo demonstraram que o silenciamento de ATG3 atenuou os efeitos da betaína sobre fenótipos celulares malignos, conforme evidenciado pelo aumento da formação de colônias, migração e invasão intensificadas, marcadores proteicos regulados positivamente e nódulos metastáticos elevados (Figura 8D-H e Figura S11F-I). Embora não tenha havido diferença significativa na duração da sobrevida entre o grupo betaína e o grupo betaína+shATG3, ainda podemos observar uma tendência de diminuição do tempo de sobrevida no grupo betaína+shATG3 (Figura 8I). Em resumo, nossos achados ilustram que a betaína inibe as propriedades semelhantes a células-tronco das células de HCC por meio da regulação positiva de ATG3 de maneira dependente de SAM/m6A/YTHDF1.
Discussão
Embora alguns estudos tenham relatado os efeitos protetores da betaína em doenças hepáticas, seus papéis na progressão do CHC, particularmente no contexto de propriedades semelhantes a células-tronco, permanecem desconhecidos. Além disso, o mecanismo subjacente de como a betaína exerce seus efeitos antitumorais foi pouco investigado. Neste estudo, descobrimos que a betaína inibiu significativamente as propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC, bem como suprimiu o crescimento e a metástase de células esferoides de CHC tanto in vitro quanto in vivo. Além disso, os efeitos antitumorais da betaína foram acentuadamente atenuados pela inibição da autofagia. Mecanisticamente, a betaína promoveu a modificação m6A no mRNA de ATG3 ao gerar SAM, enquanto YTHDF1 reconheceu e se ligou ao mRNA de ATG3 para aumentar sua estabilidade. Coletivamente, a betaína inibiu as propriedades semelhantes a células-tronco do CHC ao ativar a autofagia por meio do aumento da estabilidade de ATG3 mediado por SAM/m6A/YTHDF1.
Apesar dos grandes avanços no diagnóstico e tratamento, o CHC continua sendo a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Estudos recentes têm mostrado consistentemente que os principais contribuintes para o mau prognóstico em pacientes com CHC são a recidiva e a metástase à distância, resultando em uma redução significativa no tempo de sobrevida global e específica para o câncer.

Portanto, direcionar os fatores de risco associados à recidiva e metástase oferece uma oportunidade para melhorar o prognóstico do CHC. As células-tronco cancerígenas (CTCs) são uma pequena população de células cancerígenas com alta capacidade de autorrenovação, diferenciação e potencial carcinogênico. Elas têm sido implicadas na recidiva e metástase do câncer. Pacientes com níveis elevados de genes relacionados a CTCs tendem a apresentar pior prognóstico, enquanto a supressão das propriedades semelhantes a células-tronco pode inibir a recidiva e a metástase.

Recentemente, alguns fitoquímicos foram relatados como possuidores da capacidade de dificultar as propriedades semelhantes a células-tronco das células cancerígenas. Por exemplo, a curcumina demonstrou sua capacidade de inibir a metástase de células de câncer de mama ao suprimir propriedades semelhantes a células-tronco. Da mesma forma, o ascorbato farmacológico demonstrou reduzir essas propriedades, prevenindo assim a recidiva e a metástase sistêmica após a cirurgia.

A betaína, um composto natural presente em muitos alimentos, tem demonstrado papéis protetores contra o câncer de fígado. Por exemplo, nossos estudos anteriores descobriram que a alta ingestão dietética de betaína está associada a um risco reduzido de câncer hepático primário, e o tratamento com betaína atenuou o câncer de fígado induzido por DEN em ratos. Enquanto isso, Oliva et al. relataram que a administração de betaína inibiu o crescimento de células de CHC murino.

No entanto, o impacto da betaína no fenótipo relacionado ao estágio tardio do CHC, que influencia significativamente o prognóstico de pacientes com CHC, e os mecanismos por trás de seus efeitos antitumorais permanecem não investigados.

Neste estudo, descobrimos que pacientes com CHC com níveis séricos mais elevados de betaína apresentaram menor expressão de genes relacionados à staminalidade. Experimentos in vitro e in vivo demonstraram ainda que o tratamento com betaína atenuou significativamente as propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC. Além disso, camundongos tratados com betaína apresentaram nódulos metastáticos pulmonares reduzidos e tempos de sobrevida prolongados.
A autofagia é um processo catabólico altamente conservado em eucariotos, crucial para a manutenção da homeostase celular. O processo, conhecido como fluxo autofágico, envolve uma série de ATGs orquestrando a formação de autofagossomos de membrana dupla para sequestrar componentes celulares. Esses autofagossomos então se fundem com lisossomos para degradar e reciclar o conteúdo, sustentando assim a sobrevivência das células cancerígenas. Numerosos estudos demonstraram que a ativação da autofagia contribui para a aquisição de propriedades semelhantes a células-tronco em células cancerígenas, por meio da regulação de genes relacionados à "stemness" ou da modulação dos microambientes tumorais. Consequentemente, a autofagia desempenha um papel significativo nas propriedades semelhantes a células-tronco das células cancerígenas. No entanto, pesquisas recentes revelaram um papel contrastante da autofagia ativada por fitoquímicos nas propriedades semelhantes a células-tronco. Por exemplo, a curcumina inibe as células-tronco do câncer colorretal ao ativar a autofagia por meio da supressão da via TFAP2A/ECM. Da mesma forma, o posaconazol atenua as propriedades semelhantes a células-tronco ao induzir a autofagia no glioblastoma. Embora a betaína tenha sido relatada por exercer efeitos protetores contra doenças hepáticas ao ativar a autofagia, seu impacto nas propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC permanece desconhecido. No presente estudo, demonstramos que a betaína ativa o fluxo autofágico para inibir as propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC tanto in vitro quanto in vivo, enquanto a inibição da autofagia não apenas acelera o crescimento e a metástase das células de CHC, mas também encurta o tempo de sobrevivência dos camundongos. Em geral, nossos achados indicam que a betaína inibe as propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC ao ativar o fluxo autofágico.
Como um importante fitoquímico, os papéis protetores da betaína têm sido bem demonstrados em várias doenças hepáticas, mas os mecanismos subjacentes permanecem pouco compreendidos. A betaína desempenha duas funções biológicas primárias. Primeiramente, como um osmólito eficaz, ela regula a pressão osmótica intercelular, de forma semelhante a outros eletrólitos. Em segundo lugar, a betaína atua como um doador crucial de metila, produzindo SAM via BHMT, regulando assim a metilação genômica. Por exemplo, vários estudos associaram os efeitos protetores da betaína à sua modulação da metilação do DNA em modelos de ratos. Além disso, a atenção recente tem se concentrado na regulação da metilação do RNA pela betaína, particularmente a modificação m6A. A modificação m6A é uma alteração epi-transcricional prevalente no mRNA que governa vários processos do mRNA, incluindo splicing, transporte nuclear, degradação, estabilidade e tradução, por meio de leitores específicos. Evidências crescentes destacam o papel crucial da modulação de m6A na ativação da autofagia, particularmente em sua regulação direta de ATGs. Por exemplo, YTHDF1 ativa a autofagia ao estabilizar BECN1, levando à ferroptose das células estreladas hepáticas e melhorando a fibrose hepática em modelos murinos. METTL14 suprime o desenvolvimento de carcinoma de células escamosas orais ao ativar a autofagia via modificação m6A/IGF2BP2-dependente na estabilidade de FIP200. Nosso estudo demonstra que o tratamento com betaína aumenta a modificação total de m6A em células de CHC de forma dependente de BHMT/SAM, enquanto a inibição de SAM pelo silenciamento de BHMT atenua significativamente o fluxo autofágico induzido pela betaína. Investigação adicional revelou que a betaína ativa o fluxo autofágico ao promover a modificação m6A no mRNA de ATG3, aumentando assim sua expressão de mRNA e proteína. Por outro lado, o silenciamento de ATG3 prejudica os efeitos inibitórios da betaína sobre as propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC. Esses dados indicam que a betaína inibe as propriedades semelhantes a células-tronco das células de CHC ao ativar a autofagia dependente de ATG3 via modificação m6A.
Após a modificação m6A, leitores específicos governam o destino dos mRNAs. Dado o aumento da modificação m6A no mRNA de ATG3 e a regulação positiva de seu nível de mRNA, investigamos a estabilidade do mRNA sob tratamento com betaína. O ensaio de estabilidade de RNA descobriu que a betaína aumentou significativamente a estabilidade do mRNA de ATG3. O silenciamento de BHMT atenuou o efeito da betaína na estabilidade do mRNA de ATG3, enquanto o tratamento adicional com SAM reverteu esse efeito, indicando que a betaína promoveu a expressão de ATG3 ao aumentar sua estabilidade via modificação m6A. Até o momento, vários leitores relacionados a m6A, como YTHDF1 e IGF2BP1/2/3, são conhecidos por aumentar a estabilidade dos mRNAs. No presente estudo, descobrimos que YTHDF1 estava positivamente correlacionado com a expressão de ATG3 em CHC. RIP-qPCR e pull-down de RNA confirmaram a interação entre a proteína YTHDF1 e o mRNA de ATG3. Estudo anterior demonstrou que YTHDF1 reconhece e se liga ao sítio m6A do mRNA alvo através de bolsas de ligação a m6A. Para investigar melhor se a interação entre YTHDF1 e ATG3 era dependente de m6A, mutamos geneticamente YTHDF1 nos resíduos K395 e Y397. Em concordância com achados anteriores, descobrimos que YTHDF1 aumentou a estabilidade do mRNA de ATG3 de maneira dependente de m6A.

Este estudo utilizou diferentes linhagens de CHC e modelos animais para investigar os efeitos da betaína nas propriedades semelhantes às de células-tronco do CHC. A consistência dos resultados forneceu uma compreensão confiável, generalizada e abrangente do nosso estudo. No entanto, há uma limitação neste estudo. Embora nosso estudo examine os efeitos do tratamento com betaína no crescimento de tumores PDX e nas alterações de características histológicas específicas, como atipia nuclear, mitose e relação núcleo-citoplasma, não observamos diferenças significativas no grau tumoral, categorizando os tumores em graus bem, moderadamente e pouco diferenciados.

Conclusão
Neste estudo, descobrimos que a betaína aumentou a modificação m6A no mRNA de ATG3 ao produzir SAM via BHMT. Posteriormente, descobriu-se que YTHDF1 reconhece e se liga ao mRNA de ATG3, aumentando sua estabilidade de maneira dependente de m6A. Consequentemente, o ATG3 regulado positivamente ativou a autofagia, inibindo assim as propriedades semelhantes às de células-tronco das células CHC. Nossos achados fornecem uma nova compreensão dos efeitos antitumorais da betaína no CHC e seu mecanismo subjacente, potencialmente expandindo as opções terapêuticas para pacientes com CHC.

Material Suplementar
Abreviações
ATGs
genes relacionados à autofagia
BHMT
betaína-homocisteína metiltransferase
CCK-8
kit de contagem celular-8
ELISA
ensaio de imunoabsorção enzimática
EMT
transição epitélio-mesenquimal
GLCC
coorte de câncer de fígado de Guangdong
HCC
carcinoma hepatocelular
HE
hematoxilina & eosina
IF
imunofluorescência
IHC
imuno-histoquímica
MeRIP-qPCR
Imunoprecipitação de RNA Metilado-qPCR
m6A
N6-metiladenosina
PDX
xenoenxertos derivados de pacientes
RIP-qPCR
Imunoprecipitação de RNA-qPCR
SAM
S-adenosilmetionina
TEM
microscopia eletrônica de transmissão
Estatísticas Globais de Câncer 2020: Estimativas GLOBOCAN de Incidência e Mortalidade em Todo o Mundo para 36 Cânceres em 185 Países
Carcinoma Hepatocelular
Análise de Correlação e Sobrevida do Sítio de Metástase à Distância e Prognóstico em Pacientes com Carcinoma Hepatocelular
Recorrência extra-hepática precoce como fator crucial para a sobrevida após ressecção de carcinoma hepatocelular: Um estudo observacional de 15 anos
O papel das células-tronco do câncer hepático na metástase do carcinoma hepatocelular
NUSAP1, uma nova proteína relacionada à stemness, promove a recorrência precoce do carcinoma hepatocelular
Dissecção profunda das hierarquias relacionadas à stemness no carcinoma hepatocelular
A integração de scRNA-seq e bulk RNA-seq constrói uma assinatura relacionada à stemness para predizer prognóstico e respostas à imunoterapia no carcinoma hepatocelular
Identificação e Validação de um Potencial Biomarcador Associado à Stemness no Carcinoma Hepatocelular
Autofagia e vias relacionadas à autofagia no câncer
Genes da autofagia em biologia e doença
Insights Moleculares sobre o Potencial Terapêutico da Modulação da Autofagia por Produtos Naturais para Células-Tronco do Câncer
A capsaicina inibe a stemness de células de carcinoma anaplásico da tireoide ao desencadear a degradação de OCT4A mediada pelo lisossomo-autofágico
Betaína como Ingrediente Funcional: Metabolismo, Atributos Promotores da Saúde, Fontes Alimentares, Aplicações e Métodos de Análise
A Betaína Inibe a Hiperativação do Inflamassoma NLRP3 e Regula a Diferenciação Fenotípica M1/M2 da Microglia, Atenuando assim o Comportamento Semelhante à Depressão Induzido por Lipopolissacarídeo
A betaína atenua a supressão da autofagia relacionada à idade através do eixo Mettl21c/p97/VCP para retardar a perda muscular
A betaína adia a senescência relacionada à hiperglicemia em células ovarianas e testiculares: Envolvimento de RAGE e beta-galactosidase
A betaína alivia a apoptose de células espermatogênicas em modelo de rato com oligoastenozoospermia ao regular positivamente metiltransferases e afetar a metilação do DNA
Efeitos da betaína na doença hepática não alcoólica
Ingestões dietéticas mais elevadas de colina e betaína estão associadas a um menor risco de câncer hepático primário: um estudo caso-controle
A lesão hepática aguda induzida por etanol é prevenida pela administração de betaína
A fibrose hepática induzida por dieta rica em gordura mais tetracloreto de carbono é aliviada pelo tratamento com betaína em ratos
Avaliação do efeito da betaína na metilação do DNA e expressão de mRNA de p16 e c-myc em um modelo químico de câncer hepático em ratos
Papel da autofagia na hepatoproteção promovida pela betaína contra a doença hepática gordurosa não alcoólica em camundongos
A betaína modula o estresse oxidativo, inflamação, apoptose, autofagia e sinalização Akt/mTOR na doença hepática gordurosa induzida por deficiência de metionina-colina
Regulação da expressão gênica mediada pela metilação reversível do RNA m(6)A
Papéis emergentes da modificação do RNA: m(6)A e U-tail
A expressão do leitor de m6A YTHDF1 induzida por HIF-1alpha impulsiona a autofagia induzida por hipóxia e a malignidade do carcinoma hepatocelular ao promover a tradução de ATG2A e ATG14
Indução de autofagia promovida pelo leitor de m(6)A YTHDF3 através da regulação positiva da tradução do mRNA de FOXO3
METTL14 Regula a Osteogênese de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea via Indução de Autofagia Através do Eixo de Sinalização m6A/IGF2BPs/Beclin-1
Metilação de m6A do RNA em todo o transcriptoma
Os papéis e implicações da modificação de RNA m(6)A no câncer
Modificação de RNA N6-metiladenosina na regulação de células-tronco cancerígenas e microambiente tumoral imune e sua implicação para a terapia do câncer
Efeitos Benéficos da Betaína: Uma Revisão Abrangente
A função dependente de FTO da N6-metiladenosina está envolvida nos efeitos hepatoprotetores da betaína em camundongos adolescentes
Níveis séricos biodisponíveis, em vez de totais, de 25-hidroxivitamina D estão associados à sobrevida no carcinoma hepatocelular
A colina sérica está associada à sobrevida no carcinoma hepatocelular: um estudo de coorte prospectivo
O Leitor de m(6)A YTHDF1 Acelera a Osteogênese de Células-Tronco Mesenquimais da Medula Óssea Parcialmente via Ativação da Via de Sinalização da Autofagia
As Proteínas da Modificação de mRNA: Escritores, Leitores e Apagadores
Recorrência de carcinoma hepatocelular após transplante de fígado: padrões e prognóstico
Padrões, tratamentos e prognóstico da recorrência tumoral após ressecção de carcinoma hepatocelular com invasão microvascular: um estudo multicêntrico da China
Éteres difenílicos polibromados e novos retardantes de chama bromados em poeira interna de diferentes microambientes em Pequim, China
Cetonas e lactato aumentam a "troncidade" das células cancerígenas, impulsionando recorrência, metástase e mau resultado clínico no câncer de mama: alcançando medicina personalizada via Metabolo-Genômica
Posaconazol inibe a troncidade de células-tronco cancerígenas induzindo autofagia e suprimindo a via de sinalização Wnt/beta-catenina/survivina em glioblastoma
Atividade antimetastática da curcumina contra o câncer de mama via inibição de propriedades semelhantes a células-tronco e EMT
Ascorbato farmacológico potencializa nanomedicamentos combinados e reduz a troncidade de células cancerígenas para prevenir recorrência pós-cirúrgica e metástase sistêmica
O efeito de SAMe e betaína na sobrevivência de células hepáticas Hepa 1-6, C34 e E47 in vitro
Diretrizes para o uso e interpretação de ensaios para monitoramento de autofagia (4ª edição)(1)
A autofagia regula o fenótipo de célula-tronco cancerígena do carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço através do eixo não canônico FOXO3/SOX2
Autofagia e células-tronco cancerígenas: mecanismos moleculares e aplicações terapêuticas
Curcumina suprime células-tronco cancerígenas LGR5(+) de câncer colorretal induzindo autofagia e via repressão da via ECM mediada por TFAP2A
Betaína materna protege a prole de ratos da ativação induzida por glicocorticoide de genes lipolíticos no tecido adiposo através da modificação da metilação do DNA
Suplementação materna com betaína em ratos induz alterações intergeracionais na expressão de IGF-1 hepático e metilação do DNA
A suplementação de betaína na avó materna aumenta a expressão hepática de IGF2 em descendentes de ratos F2 através da modificação da metilação do DNA promotor
Modificação Mitoticamente Estável da Metilação do DNA na Região de Controle de Impressão Genômica IGF2/H19 está Associada à Expressão Hepática Ativada de IGF2 em Ratos Descendentes de Mães Suplementadas com Betaína
A metilação do RNA m(6)A mediada por AHR contribui para malformações cardíacas induzidas por PM(2,5) em larvas de zebrafish
A desmetilase m(6)A FTO regula CTNNB1 para promover adipogênese de pré-adipócitos de frango
A expressão anormal de miR-30b induzida por triclosan regula o nível de metilação m(6)A mediado por fto para causar distúrbio do metabolismo lipídico em zebrafish
A modificação N(6)-metiladenosina regula a ferroptose através da via de sinalização da autofagia em células estreladas hepáticas
METTL14 inibe a progressão maligna do carcinoma espinocelular oral visando o gene relacionado à autofagia RB1CC1 de maneira dependente de m6A-IGF2BP2
A betaína inibe a capacidade de células-tronco das células de CHC. (A-D) A correlação entre as concentrações séricas de betaína e os níveis de expressão de marcadores relacionados à capacidade de células-tronco em tecidos de CHC da coorte GLCC (n = 70) foi analisada usando o coeficiente de correlação de Pearson. (E) Os tecidos de CHC foram divididos em quatro grupos com base nos níveis séricos de betaína usando o método dos quartis, sete tecidos de CHC foram escolhidos aleatoriamente do grupo do quartil mais baixo para representar o grupo de baixo nível sérico de betaína, e outros sete tecidos de CHC foram selecionados aleatoriamente do grupo do quartil mais alto para representar o grupo de alto nível sérico de betaína. Os níveis de expressão das proteínas CD133, CD44, SOX2, Nanog e EpCAM foram analisados por ensaio de WB. (F) Os efeitos da betaína (Bet), HCQ e Bet+HCQ no crescimento do CHC foram avaliados por meio de um modelo PDX (n = 5/grupo). Vista da entidade tumoral. (G-H) Análise estatística do volume tumoral e peso tumoral no modelo PDX entre diferentes grupos. (I) Coloração HE de tecidos tumorais PDX (barras de escala = 100 μm para o painel esquerdo e 40 μm para o painel direito). (J) Análise IHC de CD133, CD44 e Nanog em tecidos tumorais PDX com ou sem tratamento com betaína (barras de escala = 100 μm). (K) Os efeitos da betaína na capacidade de formação de esferas das células de CHC foram avaliados (barras de escala = 100 μm). Um gráfico estatístico é mostrado. (L) Os efeitos da betaína na capacidade de células-tronco das células de CHC foram medidos por ensaio de diluição limitante in vitro (n = 18/grupo). (M) As células de CHC foram tratadas com betaína e submetidas à formação de células esferoides. Em seguida, as células esferoides foram diluídas em gradiente e injetadas subcutaneamente em camundongos nus. O número de tumores em cada grupo foi contado após 30 dias. A quantidade de células injetadas e a frequência de formação de tumores (n = 5 por grupo) foram mostradas. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
A betaina inibe a progressão maligna do CHC. (A) Análise IHC de E-caderina, N-caderina e Ki-67 em tecidos tumorais de PDX com ou sem tratamento com betaina (barras de escala = 100 μm). (B-D) Células de CHC foram tratadas com betaina e submetidas à formação de esferas; em seguida, as células das esferas foram dissociadas e submetidas a ensaios de formação de colônias e transwell para detectar suas capacidades clonogênica, migratória e invasiva. Gráficos estatísticos são mostrados. (E) Células de CHC foram tratadas com betaina e submetidas à formação de esferas; em seguida, as células das esferas foram dissociadas e 5×106 de células foram injetadas na veia da cauda de camundongos nus. Após 66 dias da injeção, os camundongos foram eutanasiados de forma humanitária. Imagens de nódulos metastáticos pulmonares e coloração H&E são mostradas (barra de escala = 1 mm para o painel esquerdo e 200 μm para o painel direito). (F) Resultados quantitativos dos nódulos metastáticos pulmonares para os grupos Bet e Ctrl. (G) Análise da curva de sobrevivência de Kaplan-Meier de camundongos nus injetados com células de esferas de CHC (n = 8/grupo). HR: Razão de Risco. **P < 0,01, ***P < 0,001.
A betaina inibe as propriedades semelhantes a células-tronco do CHC ao ativar a autofagia. (A) Após o tratamento com betaina, os níveis de expressão da proteína LC3 I/II em células HUH-7 e tecidos tumorais de PDX foram analisados por ensaio de WB. (B) Células HUH-7 foram tratadas com betaina, e os autofagossomos intracelulares foram capturados via MET (barra de escala = 2 μm para o painel esquerdo e 1 μm para o painel direito). Um gráfico estatístico é mostrado. (C) Células HUH-7 foram pré-transfectadas com mCherry-GFP-LC3B e, em seguida, submetidas ao tratamento com betaina. Os pontos vermelhos e amarelos foram capturados por um microscópio confocal e quantificados (barra de escala = 20 μm). Um gráfico estatístico é mostrado. (D) Células HUH-7 foram tratadas com betaina, os níveis de expressão das proteínas Nanog e LC3B nas mesmas células foram detectados por ensaio de IF (barra de escala = 20 μm). (E) Coloração HE de tecidos tumorais de PDX (barra de escala = 100 μm para o painel superior, 40 μm para o painel inferior). (F) Após serem expostas a tratamentos com betaina, HCQ ou betaina e HCQ combinados, análise IHC de CD133, CD44, Nanog e LC3B em tumores PDX (barras de escala = 100 μm). (G) Células HUH-7 foram pré-transfectadas com shATG5 e, em seguida, submetidas ao tratamento com betaina. Os níveis de expressão das proteínas CD133, CD44, SOX2, Nanog, EpCAM e LC3B foram analisados por ensaio de WB. (H) Células HUH-7 foram submetidas a tratamentos com betaina, HCQ ou betaina e HCQ combinados, e os níveis de expressão das proteínas CD133, CD44, SOX2, Nanog, EpCAM e LC3B foram analisados por ensaio de WB. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
A inibição da autofagia prejudica os efeitos antitumorais da betaína no CHC. (A) Resultados de IHC de E-caderina, N-caderina e Ki-67 em tecidos tumorais de PDX (barras de escala = 100 μm). (B-C) Análise por WB dos níveis de expressão das proteínas E-caderina, N-caderina, Vimentina, MMP2, Ki-67 e PCNA em células esféricas HUH-7. (D) Células HUH-7 foram pré-transfectadas com shATG5 e, em seguida, submetidas ao tratamento com betaína. A capacidade de formação de esferas tumorais das células HUH-7 sob diferentes tratamentos foi medida (barras de escala = 100 μm). (E) Células HUH-7 foram submetidas a tratamentos com betaína, HCQ ou betaína e HCQ combinados, e a capacidade de formação de esferas tumorais das células HUH-7 sob diferentes tratamentos foi medida (barras de escala = 100 μm). (F-G) Células HUH-7 foram pré-transfectadas com shATG5 e submetidas ao tratamento com betaína para geração de células esféricas. Em seguida, as células esféricas HUH-7 foram diluídas em gradiente e injetadas subcutaneamente em camundongos nus. O número de tumores em cada grupo foi contado após 30 dias. A quantidade de células injetadas e a frequência de formação de tumores (n = 5 por grupo) foram mostradas. (H-K) Células HUH-7 foram pré-transfectadas com shATG5 ou tratadas com HCQ, em seguida submetidas ao tratamento com betaína para geração de células esféricas. Após dissociação e diluição, as células esféricas foram submetidas a ensaios de formação de colônias, migração e invasão em transwell. Gráficos estatísticos são mostrados. (L) Células HUH-7 foram pré-transfectadas com shATG5 e submetidas ao tratamento com betaína para geração de células esféricas. Após dissociação e diluição, 5×106 de células foram injetadas na veia da cauda de camundongos nus. Após 66 dias da injeção, os camundongos foram eutanasiados humanitariamente. Imagens de nódulos metastáticos pulmonares e coloração H&E foram mostradas (barra de escala = 1 mm para o painel superior e 200 μm para o painel inferior). (M) Resultados quantitativos de nódulos metastáticos pulmonares em diferentes grupos. (N) Análise da curva de sobrevida de Kaplan-Meier de camundongos nus injetados com células de CHC em diferentes grupos (n = 8/grupo). HR: Razão de Risco. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
A betaina ativa a autofagia via modificação m6A mediada por SAM. (A) Amostras de CHC da coorte GLCC (n = 70) foram divididas em quatro grupos com base nos níveis séricos de betaina usando o método dos quartis, e os níveis de modificação m6A nos tecidos de CHC desses quatro grupos (Q1 para grupo quartil 1, Q2 para grupo quartil 2, Q3 para grupo quartil 3, Q4 para grupo quartil 4) foram detectados. (B-E) Os efeitos da exposição à betaina na modificação m6A em células de CHC e tecidos tumorais de PDX foram detectados usando dot blot e quantificados usando o kit de quantificação de metilação EpiQuik m6A, respectivamente. (F-G) Após exposição à betaina, a concentração de SAM em células de CHC e tecidos tumorais de PDX foi detectada por um kit ELISA de SAM. (H) Células de CHC foram tratadas com várias concentrações de SAM (0, 25, 50 e 100 μM), e a concentração de SAM nas células de CHC foi detectada por um kit ELISA de SAM. (I-J) Células de CHC foram tratadas com várias concentrações de SAM, e a modificação m6A nas células de CHC foi detectada usando dot blot e quantificada usando o kit de quantificação de metilação EpiQuik m6A, respectivamente. (K-N) Células de CHC foram pré-transfectadas com siBHMT e, em seguida, submetidas a tratamentos com betaina ou betaina combinada com SAM. Os níveis de SAM, modificação m6A e níveis de proteína LC3 I/II em células de CHC foram detectados via kit ELISA de SAM, dot blot, kit de quantificação de metilação EpiQuik m6A e ensaio de WB, respectivamente. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

A betaina ativa a autofagia via modificação m6A mediada por SAM no mRNA de ATG3. (A) Os efeitos da exposição à betaina nos níveis de expressão de genes relacionados à autofagia em células de CHC foram detectados por análise de qPCR. (B) Após tratamento com betaina, o ensaio de MeRIP-qPCR foi realizado para medir o nível de ATGs modificados por m6A em células de CHC. (C) Sítios de modificação m6A no mRNA de ATG3 foram previstos via banco de dados SRAMP e aqueles com alta confiança foram selecionados para investigação adicional. (D) Após tratamento com betaina, o nível de modificação m6A nesses dois sítios do mRNA de ATG3 em células de CHC foi detectado usando ensaio de MeRIP-qPCR. (E-F) Após tratamento com betaina, os níveis de expressão da proteína ATG3 em células de CHC e tecidos tumorais de PDX foram medidos usando ensaios de WB e IHC (Barra de escala = 100 μm), respectivamente. (G-I) Células de CHC foram pré-transfectadas com siBHMT e, em seguida, submetidas a tratamentos com betaina ou betaina combinada com SAM. O nível de modificação m6A no mRNA de ATG3, bem como os níveis de expressão de mRNA e proteína ATG3, foram detectados usando ensaios de MeRIP-qPCR, qPCR e WB, respectivamente. (J) Células de CHC foram pré-transfectadas com shATG3 e, em seguida, submetidas a tratamento com betaina, os níveis de expressão das proteínas LC3 I/II foram detectados usando ensaio de WB. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
A betaína promove a estabilidade do mRNA de ATG3 via mecanismo dependente de SAM/m6A/YTHDF1. (A) Após tratamento com betaína, as células de CHC foram tratadas com 5 μg/mL de Act D por 0, 3 e 6 h, respectivamente. Os níveis de expressão do mRNA de ATG3 nesses diferentes pontos de tempo foram detectados usando ensaio de qPCR. (B) Após pré-transfecção com siBHMT, as células de CHC foram submetidas a tratamento com betaína ou tratamento combinado de betaína e SAM. Em seguida, 5 μg/mL de Act D foram adicionados para tratamento adicional por 0, 3 e 6 h, respectivamente. Os níveis de expressão do mRNA de ATG3 nesses diferentes pontos de tempo foram detectados usando ensaio de qPCR. (C) A correlação entre ATG3 e YTHDF1 em tecidos de CHC foi avaliada usando o banco de dados online GEPIA 2. (D) A interação entre o mRNA de ATG3 e a proteína YTHDF1 foi analisada usando ensaio de RIP-qPCR, e a proteína derivada do RIP e o mRNA de ATG3 em células de CHC foram detectados por ensaios de WB e qPCR, respectivamente. (E) A interação entre o mRNA de ATG3 e a proteína YTHDF1 foi confirmada por ensaio de RNA pull-down, e a proteína derivada do ensaio de RNA pull-down em células de CHC foi detectada usando ensaio de WB. (F) Gráfico esquemático da construção do tipo selvagem de YTHDF1 (YTHDF1-WT) e do mutante do bolsão de ligação de m6A de YTHDF1 (YTHDF1-MUT). (G) Células de CHC foram pré-transfectadas com plasmídeos de superexpressão de YTHDF1-WT e YTHDF1-MUT, e a interação entre o mRNA de ATG3 e YTHDF1 foi analisada via ensaio de RIP-qPCR. (H e I) Células de CHC foram transfectadas com plasmídeos de superexpressão de YTHDF1-WT e YTHDF1-MUT, e os níveis de expressão do mRNA de ATG3, bem como os níveis das proteínas ATG3 e YTHDF1, foram detectados usando ensaios de qPCR e WB, respectivamente. (J e K) Células de CHC foram transfectadas com siYTHDF1, e os níveis de expressão do mRNA de ATG3, bem como os níveis das proteínas ATG3 e YTHDF1, foram detectados usando ensaios de qPCR e WB, respectivamente. (L-M) Células de CHC foram pré-transfectadas com siYTHDF1 e, em seguida, submetidas a tratamento com betaína. Os níveis de expressão do mRNA e da proteína ATG3 foram detectados usando ensaios de qPCR e WB, respectivamente. (N) Após pré-transfecção com siYTHDF1, as células de CHC foram submetidas a tratamento com betaína. Em seguida, 5 μg/mL de Act D foram adicionados para tratamento adicional por 0, 3 e 6 h, respectivamente. Os níveis de expressão do mRNA de ATG3 nesses diferentes pontos de tempo foram detectados usando ensaio de qPCR. **P < 0,01, ***P < 0,001.
a betaina inibe as propriedades semelhantes a células-tronco do CHC via ATG3. (A) Células HUH-7 foram pré-transfectadas com shATG3 e submetidas ao tratamento com betaina. A capacidade de formação de esferas tumorais das células HUH-7 sob diferentes tratamentos foi medida. Um gráfico estatístico é mostrado. (B) Células HUH-7 foram pré-transfectadas com shATG3 e submetidas ao tratamento com betaina para geração de células esféricas. Em seguida, as células esféricas HUH-7 foram diluídas em gradiente e injetadas subcutaneamente em camundongos nus. O número de tumores em cada grupo foi contado após 30 dias. A quantidade de células injetadas e a frequência de formação de tumores (n = 5 por grupo) foram mostradas. (C) Células HUH-7 foram pré-transfectadas com shATG3 e, em seguida, submetidas ao tratamento com betaina. Os níveis de expressão das proteínas CD133, CD44, SOX2, Nanog e EpCAM nas células HUH-7 foram detectados usando ensaio de WB. (D-E) Células HUH-7 foram pré-transfectadas com shATG3 e submetidas ao tratamento com betaina para geração de células esféricas. Após serem dissociadas e diluídas, as células esféricas foram submetidas a ensaios de formação de colônias, migração transwell e invasão. Gráficos estatísticos são mostrados. (F) Análise de WB dos níveis de expressão das proteínas E-caderina, N-caderina, Vimentina, MMP2, Ki-67 e PCNA em células esféricas HUH-7 sob diferentes tratamentos. (G) Células HUH-7 foram pré-transfectadas com shATG3 e submetidas ao tratamento com betaina para geração de células esféricas. Após serem dissociadas e diluídas, 5×10⁶ de células foram injetadas na veia da cauda de camundongos nus. Após 66 dias da injeção, os camundongos foram eutanasiados de forma humanitária. Imagens de nódulos metastáticos pulmonares e coloração H&E foram mostradas (barra de escala = 1 mm para o painel superior e 200 μm para o painel inferior). (H) Resultados quantitativos dos nódulos metastáticos pulmonares em diferentes grupos. (I) Análise da curva de sobrevivência de Kaplan-Meier de camundongos nus injetados com células de CHC em diferentes grupos (n = 8/grupo). HR: Razão de Risco; ns: não significativo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.