pmid: "38196273"
title: "Tratamento profilático com"
authors: "Xu J, Xia Q, Wu T, Shao Y, Wang Y, Jin N, Tian P, Wu L, Lu X"
journal: "Gut microbes"
pubdate: "2024"
doi: "10.1080/19490976.2024.2302065"
source: "PMC Full Text"
Tratamento profilático com
Autores
Xu J, Xia Q, Wu T, Shao Y, Wang Y, Jin N, Tian P, Wu L, Lu X
Periodico
Gut microbes (2024)
Conteudo
Tratamento profilático com Bacteroides uniformis e Bifidobacterium bifidum neutraliza a tolerância imune das células NK hepáticas na esteato-hepatite não alcoólica induzida por dieta rica em gordura
RESUMO
A imunidade hepática é uma das forças motrizes para o desenvolvimento da esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), e acredita-se que o direcionamento da microbiota intestinal afete a constituição imune hepática. Aqui, nosso objetivo foi investigar o estado imunológico hepático na EHNA, com ênfase específica nas células natural killer (NK). Além disso, buscamos identificar as espécies contribuintes que visam a imunidade hepática para fornecer novas direções e apoiar a viabilidade da imunoterapia para EHNA. Uma possível população com EHNA foi determinada pela combinação de esteatose hepática grave de longo prazo, distúrbios metabólicos e aumento da CK18 sérica para detectar fatores imunes séricos e microbiota intestinal. A EHNA foi induzida em camundongos alimentados com dieta rica em gordura para verificar o efeito profilático das espécies funcionais na imunopatologia e no desenvolvimento da EHNA. O estado imunológico hepático foi examinado, e as funções efetoras das células NK foram detectadas. Foram realizados transcriptoma hepático, proteômica e metagenoma fecal. Observamos um aumento estatístico na IL-10 sérica (p < 0,001) e uma diminuição não estatística no interferon-γ e IL-6 na população com EHNA, sugerindo a possibilidade de tolerância imune. Bacteroides uniformis e Bifidobacterium bifidum fecais eram abundantes na população saudável, mas reduzidos em pacientes com EHNA. Em camundongos com EHNA, as células T CD8+ hepáticas, macrófagos e células dendríticas aumentaram (p < 0,01), e as células NK foram inibidas, identificadas pela diminuição da granzima B (p < 0,05). Bacteroides uniformis e Bifidobacterium bifidum melhoraram os sinais patológicos e metabólicos hepáticos, aumentaram as células NK hepáticas e reduziram os macrófagos (p < 0,05). Bacteroides uniformis também restaurou a função das células NK hepáticas, identificada pelo aumento de CD107a (p < 0,05). O perfil transcricional e translacional revelou que as espécies funcionais podem restaurar a função das células NK hepáticas por meio de múltiplas vias, como a redução de moléculas inibitórias nas células NK. Bacteroides uniformis e Bifidobacterium bifidum são novos profiláticos para EHNA que restauram a função prejudicada das células NK hepáticas.
Introdução
A humanidade enfrenta um aumento acentuado na incidência de doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA), representando um espectro de distúrbios que variam de esteatose simples a carcinoma hepatocelular (CHC) ao longo do tempo. A esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), caracterizada por esteatose hepatocitária, inflamação e balonização, é um estágio crucial da DHGNA e pode ser a causa mais comum do desenvolvimento de cirrose hepática e CHC no futuro. Atualmente, a patogênese da EHNA não é clara, e nenhum medicamento foi aprovado para aplicação clínica. Uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à EHNA é essencial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. Sabe-se que a desregulação de diferentes compartimentos de células imunes inatas e adaptativas desempenha um papel indispensável na patogênese da EHNA, como as células natural killer (NK).
As células NK, que eliminam patógenos, impulsionam respostas imunes antitumorais e estressam os hepatócitos por meio do reconhecimento imune inato. Citocinas como interferon-γ (IFN-γ), fator de necrose tumoral (TNF), quimiocinas e fatores de crescimento são componentes críticos do sistema imune inato hepático. Recentemente, atenção crescente tem sido dada ao papel das células NK na EHNA. Alguns pesquisadores descobriram que o IFN-γ derivado de células NK é crítico para a manutenção de um ambiente inflamatório equilibrado, que preserva a integridade do tecido hepático e retarda a progressão da fibrose. Consistentemente, um estudo clínico mostrou que a frequência de células NK circulantes em pessoas obesas era menor do que em pessoas não obesas, acompanhada por disfunção das células NK, especialmente um declínio na atividade citotóxica. Em contraste com esses achados, estudos em animais mostraram que as células NK hepáticas são excessivamente ativadas em camundongos com EHNA induzida por dieta deficiente em metionina e colina (MCD), dieta deficiente em colina e rica em gordura (CDHFD) e dieta rica em gordura (HFD) com injeção de estreptozotocina, exacerbando assim o dano hepatocelular. No entanto, a função das células NK hepáticas em um modelo de camundongo com EHNA induzida por HFD ainda não foi relatada. Portanto, é necessário esclarecer melhor o papel das células NK e revelar seus possíveis mecanismos em um modelo de EHNA induzido por HFD, que está mais próximo da patogênese de pacientes com EHNA. Atualmente, os pesquisadores confirmaram que a função das células NK pode ser comprometida por circunstâncias e fatores específicos, como o microambiente tumoral e o TGF-β. O microambiente tumoral pode induzir a expressão de receptores inibitórios e regular negativamente os receptores ativadores envolvidos no reconhecimento e eliminação de células tumorais, levando ao comprometimento da atividade antitumoral das células NK. O TGF-β converte células NK efetoras em linfócitos inatos do tipo 1, levando à evasão imune tumoral.
Há uma crescente apreciação de que a microbiota intestinal tem um impacto crucial na função das células NK. Estudos mostraram que o tratamento com antibióticos no início da vida pode atenuar a maturação funcional das células NK residentes no fígado mesmo na idade adulta. Os pós-bióticos aumentam a ativação das células NK e exercem proteção potente na manutenção do sistema microecológico intestinal. Além disso, uma meta-análise de ensaios clínicos randomizados descobriu que os probióticos revitalizaram substancialmente as células NK em idosos. Embora estudos existentes tenham sugerido o potencial da microbiota intestinal para modular a função imunológica das células NK, estudos práticos são escassos.
Para esclarecer o papel das células NK na NASH e determinar se a microbiota intestinal pode afetar a NASH ao regular as células NK, identificamos probióticos potenciais de voluntários e verificamos seus efeitos na NASH e na função imunológica das células NK por gavagem em camundongos com NASH induzida por dieta rica em gordura (HFD). Além disso, o metagenoma fecal, o transcriptoma hepático e o proteoma foram explorados para descobrir os mecanismos relevantes tanto para a ativação das células NK quanto para o alívio da NASH, na esperança de fornecer uma referência para o tratamento clínico da NASH.
Métodos
Populações do estudo
Com base na premissa de aprovação pelo Comitê de Ética do Departamento Biomédico do Centro Médico Pudong da Universidade de Fudan, recrutamos 20 pacientes com NASH de acordo com os seguintes critérios: (1) idade entre 25 e 65 anos; (2) histórico de esteatose hepática grave por mais de 10 anos; e (3) pelo menos dois tipos de distúrbios metabólicos, incluindo sobrepeso/obesidade, hiperglicemia, hipertensão, hiperlipidemia e hiperuricemia. Os critérios de exclusão foram os seguintes: (1) gravidez; (2) diagnóstico de outras causas de doença hepática crônica, incluindo hepatite viral, doença hepática autoimune e doença hepática gordurosa alcoólica (>20 g/dia para mulheres, >30 g/dia para homens); (3) uso de antibióticos nos últimos 6 meses; e (4) doenças terminais ou outras doenças malignas. Ao mesmo tempo, recrutamos 20 indivíduos saudáveis com idades entre 25 e 65 anos das mesmas comunidades como grupo saudável (par pareado). Todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito.
Medições de citocinas plasmáticas
Amostras de sangue foram coletadas e centrifugadas a 3000 rpm por 15 min antes da coleta do sobrenadante. O kit CK-18 (MM-1447H1) foi adquirido da Jiangsu Meimian Industrial Co. Ltd. Os kits ELISA para IFN-γ (EK106HS–01), IL-10 (EK110HS–01) e IL-6 (EK180HS–01) foram adquiridos da Hangzhou Lianke Biotechnology Co., Ltd. Os níveis dos indicadores relevantes foram determinados de acordo com as instruções do fabricante.
Coleta de fezes
Após obter o consentimento de cada sujeito de pesquisa, fornecemos um comadre descartável esterilizado e aguardamos desde as 4h da manhã. Após o sujeito acordar e defecar pela manhã, utilizamos uma colher de aço inoxidável esterilizada em alta temperatura e alta pressão para remover imediatamente a camada superior das fezes. As fezes foram coletadas em um tubo de armazenamento congelado estéril e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido. Todas as amostras foram coletadas em uma semana e armazenadas a −80°C antes do teste.
As fezes dos camundongos foram coletadas em uma mesa ultralimpa. Cada camundongo foi colocado sozinho sobre gaze estéril, e as fezes foram imediatamente coletadas em tubos congelados com pinças estéreis para congelamento rápido. As amostras foram armazenadas a −80°C antes do teste.
Sequenciamento do 16S rRNA fecal
O DNA genômico total da comunidade microbiana foi extraído usando um Kit Mag Bind DNA (M9636–02, Omega Bio Tek). Após qualificação e purificação, a amplificação por PCR foi realizada na região variável V3-V4, e gel de agarose a 2% foi usado para recuperar os produtos. Em seguida, os produtos recuperados foram purificados e quantificados, e um Kit NEXTFLEX Rapid DNA-Seq foi usado para construir uma biblioteca dos produtos de PCR purificados. Fastp (https://github.com/OpenGene/fastp) foi usado para controle de qualidade, FLASH (http://www.cbcb.umd.edu/software/flash) foi usado para emenda, e o agrupamento em unidades taxonômicas operacionais (OTU) foi realizado nas sequências emendadas com controle de qualidade com base em 97% de similaridade. Os dados foram depositados no banco de dados NCBI Sequence Read Archive (SRA) (Número de Acesso: PRJNA1034345).
Cultura bacteriana
Bacteroides uniformis (B. uniformis) (BNCC139204) e Bifidobacterium bifidum (B. bifidum) (BNCC186304) foram adquiridos da BeNa Culture Collection e cultivados anaerobicamente (anaeropack Mitsubishi e bolsa de cultura anaeróbica) com placas de sangue Columbia e meio de cultura líquido BBL a 37°C, respectivamente.
Animais
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Centro Médico Pudong da Universidade de Fudan. Camundongos C57BL/6 machos selvagens foram obtidos com quatro semanas de idade e divididos aleatoriamente em dois grupos: saudável e modelo NASH. Os animais foram mantidos em uma sala de animais SPF com temperatura e umidade constantes, com livre acesso a comida e água. O grupo saudável foi alimentado com dieta normal, enquanto o grupo modelo NASH foi alimentado com uma DHA de 60% (Changzhou SYSE Bio-Tech. Co., LTD.) por 45 semanas para estabelecer o modelo NASH. Com base nisso, 30 camundongos C57BL/6 de quatro semanas de idade foram adquiridos e divididos aleatoriamente em cinco grupos: dieta normal (NCD), Health-FMT, NASH-FMT, Bifi e Uni, com seis camundongos em cada grupo. Os camundongos do grupo NCD receberam uma dieta normal, enquanto os demais receberam uma DHA. Um coquetel de antibióticos (ABX) foi administrado aos camundongos por gavagem durante 2 semanas para eliminar a microbiota intestinal e construir um modelo de camundongo pseudo-estéril. A composição do ABX foi a seguinte: vancomicina (Sigma-Aldrich, 1404-93-9) 200 mg/kg, gentamicina (Sigma-Aldrich, 1405-41-0) 25 mg/kg, penicilina (Sigma-Aldrich, V900929) 625 mg/kg e anfotericina B (Sigma-Aldrich, 1397-89-3) 7,5 mg/kg. Os grupos Health-FMT e NASH-FMT receberam o transplante de bactérias fecais totais dos grupos saudável e modelo NASH, respectivamente. Os grupos Bifi e Uni receberam, por gavagem, 1 × 10⁸ UFC de B. uniformis e B. bifidum, respectivamente. Cada camundongo recebeu uma injeção intraperitoneal de omeprazol (Sigma-Aldrich 73.590-58-6) 10 mg/kg meia hora antes da gavagem para reduzir a letalidade do ácido gástrico sobre as bactérias. Todos os camundongos foram tratados em dias alternados por oito semanas e continuaram a ser alimentados com a dieta atual por 52 semanas. Ao final do experimento, os camundongos foram submetidos a jejum (12 horas), pesados e sacrificados com pentobarbital em excesso. Sangue, fígado, cólon e tecido adiposo branco do epidídimo (eWAT) foram coletados e armazenados a −80 °C para experimentos posteriores. O comprimento do corpo, comprimento do cólon, peso corporal, peso do eWAT e peso do fígado foram medidos. O índice de Lee foi calculado como (peso (g) × 1000) ^ (1/3)/comprimento do corpo (cm). O índice hepático foi calculado como peso do fígado/peso corporal.
Para explorar melhor se B. uniformis e B. bifidum podem restaurar a inibição das células NK hepáticas pela DHA de longo prazo, camundongos C57BL/6 de 5 semanas de idade foram alimentados com dieta normal (grupo Normal, n = 6) ou DHA por 46 semanas. Em seguida, os camundongos alimentados com DHA foram divididos aleatoriamente em três grupos: grupo NASH (n = 5, gavados com 0,2 ml de PBS em dias alternados), grupo Uni-tratamento (n = 5, gavados com 1 × 10⁸ UFC de B. uniformis em dias alternados) e grupo Bifi-tratamento (n = 5, gavados com 1 × 10⁸ UFC de B. bifidum em dias alternados). Após mais 8 semanas, os camundongos foram sacrificados e os tecidos hepáticos e fezes foram coletados conforme descrito acima.
Detecção de índice bioquímico
Alanina aminotransferase (ALT) (Leidu, S03030), aspartato aminotransferase (AST) (Leidu, S03040), γ-glutamil transpeptidase (γ-GT) (Leidu, S03031), glicemia de jejum (FBS) (Leidu, S03039), triglicerídeos (TG) (Leidu, S03027), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL) (Leidu, S03029), colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL) (Leidu, S03025) e proteína sérica glicada (GSP) (Leidu, C024) foram detectados usando um analisador bioquímico automático (Leidu, Chemray 800).
Histologia e imunoquímica
O tecido hepático foi fixado com paraformaldeído a 4%, incluído em parafina e depois cortado em fatias de 4 μm de espessura. Coloração com hematoxilina e eosina (H&E), coloração de fibras reticulares e coloração de Masson foram realizadas de acordo com o esquema de coloração padrão. A imuno-histoquímica foi utilizada para medir os níveis de CK18 hepática (Servicebio, GB11232), proteína de oclusão zonular 1 (ZO-1) colorretal (Abcam, ab190085) e ocludina (Abcam, ab216327).
Análise de citometria de fluxo multicolor
Fígados frescos foram triturados com um filtro de células de 70 mm para obter uma suspensão celular uniforme. A suspensão celular foi centrifugada a 350 g por 5 min antes de o sobrenadante ser descartado. O precipitado celular foi ressuspendido em Percoll a 40%, cuidadosamente depositado em camadas sobre um gradiente de Percoll a 70% e centrifugado a 1260 g por 30 min. Finalmente, as camadas celulares foram aspiradas, ressuspendidas e contadas.
Para a coloração das proteínas de superfície, as células isoladas dos fígados dos camundongos foram ajustadas para uma concentração de 1 × 107 células/mL e agitadas em vórtice após a coloração. Subsequentemente, as células foram incubadas no escuro por 15 min e centrifugadas a 350 g por 5 min antes de descartar o sobrenadante. Após a ressuspensão, o agente bloqueador e os anticorpos correspondentes foram adicionados (Tabela Suplementar S1). Após a coloração de superfície, um tampão de fixação foi adicionado. As células foram incubadas à temperatura ambiente no escuro por 20 min antes da centrifugação, e o sobrenadante foi descartado. Subsequentemente, as células foram ressuspendidas em tampão Perm, centrifugadas e ressuspendidas em Perm wash. Os anticorpos correspondentes (Tabela Suplementar S1) foram adicionados, e as células foram incubadas no escuro. Os dados foram adquiridos e analisados usando o software CytoFLEX.
Análise do transcriptoma
O RNA do tecido hepático foi isolado e purificado utilizando TRIzol (Invitrogen, CA). Após o controle de qualidade da quantidade e integridade do RNA total, o mRNA contendo PolyA foi capturado especificamente por meio de duas rodadas de purificação usando esferas magnéticas Oligo (dT) (25–61005, Thermo Fisher, EUA). O mRNA foi capturado sob condições de alta temperatura para fragmentação. O RNA fragmentado foi transcrito e foram sintetizadas fitas duplas de DNA marcadas com U, e digeridas com a enzima UDG (NEB, m0280, MA, EUA). A PCR foi realizada para formar uma biblioteca com tamanho de fragmento de 300 bp ± 50 bp e um Illumina Novaseq™ 6000 (LC Bio-Technology Co., Ltd., Hangzhou, China) foi utilizado para realizar o sequenciamento de extremidades pareadas de acordo com as operações padrão, com o modo de sequenciamento sendo PE150. O Fastp foi utilizado para realizar o controle de qualidade. O HISAT2 foi utilizado para comparar os dados de sequenciamento com o genoma. O StringTie foi utilizado para montar genes ou transcritos e quantificá-los usando FPKM. Os mRNAs diferencialmente expressos foram selecionados com fold change > 2 ou fold change < 0,5 e com teste F paramétrico comparando modelos lineares aninhados (p < 0,05) pelo pacote edgeR do R. Os dados foram depositados no banco de dados NCBI Sequence Read Archive (SRA) (Número de acesso: PRJNA1045022).
Sequenciamento metagenômico
O DNA foi extraído por um kit Mag Bind DNA (Omega Bio tek, EUA) e qualificado por eletroforese em gel de Agarose a 1%. O DNA extraído foi fragmentado por Covaris M220 (Gene Company Limited, China) e selecionado em fragmentos de aproximadamente 400 pb para a construção da biblioteca paired-end. O NEXTFLEX Rapid DNA-Seq (Bioo Scientific, EUA) foi utilizado para construir a biblioteca paired-end. A plataforma de sequenciamento Illumina NovaSeq (Illumina, EUA) foi usada para o sequenciamento metagenômico. O Fastp foi utilizado para realizar o corte de qualidade nas sequências adaptadoras das extremidades 3' e 5' das reads, preservando reads paired-end e single-end de alta qualidade. O BWA (http://bio-bwa.sourceforge.net) foi utilizado para construir as reads com a sequência de DNA do hospedeiro e remover reads contaminadas com alta similaridade de alinhamento. O MEGAHIT (https://github.com/voutcn/megahit) foi utilizado para emendar e montar a sequência otimizada. O SOAP aligner (http://soap.genomics.org.cn/) foi utilizado para comparar as reads de alta qualidade de cada amostra com o conjunto de genes não redundantes (95% de identidade) e calcular as informações de abundância dos genes nas amostras correspondentes. O Diamond (http://www.diamondsearch.org/index.php) foi utilizado para anotar a taxonomia de espécies, a função COG e a função KEGG. Os dados foram depositados no banco de dados NCBI Sequence Read Archive (SRA) (Número de acesso: PRJNA1035813).
Proteômica
O tecido foi cortado e uma quantidade adequada de lisado SDT foi adicionada. Um homogeneizador automatizado MP FastPrep-24 foi utilizado para triturar e homogeneizar o tecido hepático (24 × 2, 6,0 M/s, 60 s, duas vezes). Após fervura (10 minutos), o homogenato do tecido foi centrifugado a 14.000 × g por 15 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi retirado e filtrado usando um tubo de centrífuga de 0,22 µm para coletar o filtrado. Após quantificação e hidrólise enzimática, o segmento peptídico foi dessalinizado usando uma coluna C18. A mistura de peptídeos de todas as amostras foi retirada e submetida à classificação RP de alto pH usando o sistema HPLC Agilent 1260 infinity II. Os componentes foram coletados e cada um foi seco em um concentrador a vácuo. Após liofilização, a amostra foi redissolvida com solução aquosa de ácido fórmico a 0,1% e combinada em seis frações. Após a análise por espectrometria de massa em tandem, os dados originais da espectrometria de massa foram mesclados e analisados usando o Spectronaut Pulsar X (versão 12, Biognosys AG) para estabelecer um banco de dados de espectrogramas.
Eletroforese em gel de agarose
O DNA fecal foi extraído por um Kit TIAAmp Atool DNA (TIANGEN, DP328) de acordo com o manual do fabricante. Após detectar a concentração, 450 ng de DNA foi adicionado ao tubo octopus, e 25 µl de 2×Pro Taq master mix foi adicionado, com 1 µl de primer forward (B. uniformis: F-AGTAGAGGCAGGCGGAAT; B. bifidum: F-TGAAAGTCCATCGCTTAA) e primer backward (B. uniformis: R-CGAGCATCAGCGTCAGTT; B. bifidum: R-CTACACATTCCACCGTTA), respectivamente, e ddH2O foi adicionado para completar a mistura para 50 µl. Após a transcrição reversa ser concluída, 6×loading buffer foi adicionado e misturado bem para uso posterior. As amostras foram adicionadas a gel de agarose a 2% sob pressão constante de 120 V e exibidas no imageador de gel após a eletroforese.
Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 8.0 (GraphPad, La Jolla, CA, EUA). Dados com distribuição normal e distribuição assimétrica foram expressos como média ± desvio padrão e mediana ± intervalo interquartil, respectivamente. As comparações entre dois grupos foram analisadas usando o teste t de Student bicaudal e o teste U de Mann-Whitney, de acordo com a distribuição dos dados. As comparações entre grupos foram analisadas usando o teste ANOVA de uma via, e a diferença mínima significativa (LSD) foi usada no teste post hoc. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p < 0,05.
Resultados
A tolerância imunológica pode existir em pacientes com NASH, com depleção significativa de B. uniformis e B. bifidum nas fezes
Tolerância imunológica e alteração da microbiota intestinal no grupo NASH. (a) CK-18 sérico detectado por ELISA. Em comparação com o grupo saudável, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. (b) IFN-γ sérico detectado por ELISA. Em comparação com o grupo saudável, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. (c) IL-10 sérico detectado por ELISA. Em comparação com o grupo saudável, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. (d) IL-6 sérico detectado por ELISA. Em comparação com o grupo saudável, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. (e) Índice de Shannon no nível de OTU. (f) Análise de coordenadas principais do grupo saudável e do grupo NASH. O eixo X e o eixo Y representam os dois eixos principais selecionados, e a porcentagem representa o valor de interpretação dos eixos principais para a diferença na composição da amostra; a escala dos eixos X e Y é uma distância relativa e não tem significado prático; pontos de diferentes cores ou formas representam amostras de diferentes grupos. Quanto mais próximos os dois pontos da amostra estiverem, mais semelhante é a composição das espécies das duas amostras. (g) Gráfico de barras de comunidade no nível de filo. A abcissa é o nome da amostra, e a ordenada é a proporção do filo na amostra. As colunas de diferentes cores representam diferentes filos, e o comprimento das colunas representa a proporção do filo. (h) Gráfico de barras do teste de soma de postos de Wilcoxon no nível de espécie. As caixas de diferentes cores representam diferentes grupos, e o comprimento representa a abundância relativa média de uma espécie em diferentes grupos. (i) Gráfico de colunas de discriminação LDA no nível de espécie. O gráfico de colunas de discriminação LDA conta os grupos microbianos com efeitos significativos em diferentes grupos. Quanto maior a pontuação LDA, maior o impacto da abundância da espécie representativa no efeito da diferença.
Distúrbios metabólicos nos participantes.
Nº do participante Sexo Idade Dislipidemia Sobrepeso/Obesidade Hipertensão Hiperglicemia Hiperuricemia S1 feminino 52 TG 2,53 mmol/L IMC 29,97 Kg/㎡ 93/141 mmHg NÃO NÃO S2 feminino 57 TG 3,76 mmol/L IMC 27,89 Kg/㎡; circunferência da cintura 86 cm 95/185 mmHg NÃO NÃO S3 masculino 56 TC 5,88 mmol/L; TG 2,28 mmol/L; LDL 3,74 mmol/L IMC 26,26 Kg/㎡ NÃO NÃO NÃO S4 feminino 64 TG 3,26 mmol/L; LDL 3,26 mmol/L IMC 28,07 Kg/㎡ 96/158 mmHg HbA1c 6,5% NÃO S5 masculino 55 TG 2,20 mmol/L IMC 29,03 Kg/㎡; circunferência da cintura 98 cm 93/150 mmHg HbA1c 8,5%; GJ 9,62 mmol/L NÃO S6 masculino 52 TG 2,85 mmol/L; LDL 3,27 mmol/L IMC 24,51 Kg/㎡; 104/142 mmHg NÃO 570,5 μmol/L S7 feminino 62 TC 5,99 mmol/L; TG 3,00 mmol/L; LDL 3,71 mmol/L IMC 25,39 Kg/㎡ 84/175 mmHg NÃO NÃO S8 feminino 60 TG 1,97 mmol/L IMC 32,44 Kg/㎡; circunferência da cintura 94 cm 88/169 mmHg NÃO 380,3 μmol/L S9 masculino 53 TG 2,73 mmol/L IMC 26,89 Kg/㎡ NÃO HbA1c 6,8%; GJ 6,39 mmol/L NÃO S10 masculino 60 TG 2,25 mmol/L; LDL 3,14 mmol/L IMC 26,37 Kg/㎡; circunferência da cintura 91 cm NÃO NÃO NÃO S11 masculino 54 TC 5,89 mmol/L; TG 6,62 mmol/L IMC 25,71 Kg/㎡ NÃO NÃO NÃO S12 masculino 49 TG 6,29 mmol/L IMC 25,10 Kg/㎡; circunferência da cintura 100 cm 102/163 mmHg GJ 6,13 mmol/L NÃO S13 feminino 55 TG 3,84 mmol/L IMC 24,84 Kg/㎡ 91/153 mmHg NÃO NÃO S14 masculino 51 TC 6,60 mmol/L; TG 7,13 mmol/L; LDL 3,48 mmol/L IMC 28,09 Kg/㎡; circunferência da cintura 101 cm 91/147 mmHg HbA1c 7,6%; GJ 8,85 mmol/L NÃO S15 masculino 47 TC 5,80 mmol/L; TG 4,80 mmol/L; LDL 3,45 mmol/L IMC 29,39 Kg/㎡; circunferência da cintura 92 cm 102/162 mmHg GJ 7,38 mmol/L NÃO S16 masculino 50 TG 2,21 mmol/L IMC 31,60 Kg/㎡; circunferência da cintura 91 cm 109/167 mmHg NÃO NÃO S17 feminino 61 TC 6,51 mmol/L; TG 3,58 mmol/L; LDL 4,09 mmol/L IMC 33,33 Kg/㎡; circunferência da cintura 100 cm 87/163 mmHg NÃO 366,3 μmol/L S18 feminino 57 TG 1,58 mmol/L IMC 31,64 Kg/㎡; circunferência da cintura 95 cm 90/175 mmHg NÃO NÃO S19 feminino 55 TC 8,08 mmol/L; TG 2,15 mmol/L; LDL 5,16 mmol/L IMC 26,75 Kg/㎡ 104/190 mmHg NÃO NÃO S20 masculino 53 TC 6,35 mmol/L; LDL 4,22 mmol/L NÃO 98/167 mmHg HbA1c 8,0%; GJ 7,87 mmol/L NÃO C1 feminino 60 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C2 masculino 58 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C3 feminino 59 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C4 masculino 58 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C5 feminino 55 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C6 feminino 59 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C7 feminino 40 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C8 feminino 61 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C9 masculino 56 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C10 masculino 61 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C11 feminino 63 NÃO NÃO 84/145 mmHg NÃO NÃO C12 masculino 63 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C13 masculino 65 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C14 masculino 65 NÃO NÃO 77/150 mmHg NÃO NÃO C15 masculino 57 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C16 feminino 57 NÃO NÃO 96/149 mmHg NÃO NÃO C17 masculino 64 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C18 masculino 49 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C19 feminino 62 NÃO NÃO NÃO NÃO NÃO C20 feminino 30 NÃO IMC 24,7 Kg/㎡ NÃO NÃO NÃO
Doença hepática gordurosa não alcoólica nos participantes.
Número de identificação Anomalias na função hepática Histórico de tabagismo (média) Histórico de consumo de álcool Diagnóstico de esteatose hepática por ultrassom abdominal Hepatite viral ou outra doença hepática S1 TBil 46,0 μmol/L; ALT 41 U/L Nunca <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S2 NÃO Nunca <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S3 NÃO 40/dia 5 g/dia Esteatose hepática grave NÃO S4 NÃO Nunca <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S5 TBil 22,1 μmol/L 20/dia 2 g/dia Esteatose hepática grave NÃO S6 TBil 21,1 μmol/L; ALT 46 U/L 50/dia <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S7 TBil 21,8 μmol/L Nunca <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S8 NÃO Nunca <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S9 ALT 49 U/L 40/dia 2 g/dia Esteatose hepática grave NÃO S10 ALT 46 U/L Nunca <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S11 20/dia <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S12 ALT 43 U/L 40/dia 4 g/dia Esteatose hepática grave NÃO S13 TBil 31,0 μmol/L; AST 46 U/L Nunca <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S14 ALT 45 U/L 20/dia 2 g/dia Esteatose hepática grave NÃO S15 NÃO 30/dia 5 g/dia Esteatose hepática grave NÃO S16 NÃO Nunca <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S17 NÃO Nunca <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S18 TBil 20,3 μmol/L Nunca <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S19 NÃO Nunca <1/mês Esteatose hepática grave NÃO S20 TBil 21,2 μmol/L; AST 51 U/L 20/dia 4 g/dia Esteatose hepática grave NÃO C1 NÃO Nunca <1/mês NÃO NÃO C2 NÃO 10/dia 2 g/dia NÃO NÃO C3 NÃO Nunca <1/mês NÃO NÃO C4 NÃO 20/dia 2 g/dia NÃO NÃO C5 NÃO Nunca <1/mês NÃO NÃO C6 NÃO Nunca <1/mês NÃO NÃO C7 NÃO Nunca Menos de uma vez por mês NÃO NÃO C8 NÃO Nunca <1/mês NÃO NÃO C9 NÃO 5/dia 2 g/dia NÃO NÃO C10 NÃO 20/dia 2 g/dia NÃO NÃO C11 NÃO Nunca <1/mês NÃO NÃO C12 NÃO 40/dia 2 g/dia NÃO NÃO C13 NÃO 20/dia 2 g/dia NÃO NÃO C14 NÃO masculino 2 g/dia NÃO NÃO C15 NÃO 20/dia 5 g/dia NÃO NÃO C16 NÃO Nunca <1/mês NÃO NÃO C17 NÃO 10/dia 2 g/dia NÃO NÃO C18 NÃO Nunca <1/mês NÃO NÃO C19 NÃO Nunca <1/mês NÃO NÃO C20 NÃO Nunca <1/mês NÃO NÃO
Distúrbios metabólicos aceleram a progressão da esteatose hepática simples para NASH. Pacientes com mais de 10 anos de DHGNA grave e pelo menos dois tipos de distúrbios metabólicos, incluindo sobrepeso/obesidade, hiperglicemia, hipertensão, hiperlipidemia e hiperuricemia, foram designados para o grupo NASH (Tabela 1). Para excluir o impacto da dieta e da geografia na composição da microbiota intestinal, selecionamos indivíduos saudáveis da mesma comunidade do grupo saudável (as informações relevantes dos indivíduos são mostradas nas Tabelas 1 e 2). Como esperado, os níveis séricos de CK-18 aumentaram acentuadamente no grupo NASH (Figura 1a). No entanto, em comparação com o grupo saudável, o IFN-γ e a IL-6 séricos no grupo NASH não mostraram significância estatística, e a IL-10 foi estatisticamente maior, sugerindo uma tolerância imunológica no grupo NASH (Figura 1b–d).
Considerando o impacto crucial da microbiota intestinal no sistema imunológico hepático, há uma forte possibilidade de que a microbiota intestinal desempenhe um papel indispensável na tolerância imunológica da NASH. Portanto, foi realizado o sequenciamento do gene 16S rRNA para identificar as características do microbioma intestinal de ambos os grupos e selecionar as espécies contribuintes. O índice de Shannon não mostrou diferença estatística entre os grupos saudável e NASH (Figura 1e). Da mesma forma, a coenose microbiana apresentou apenas uma ligeira diferença entre os dois grupos, sendo quase indistinguível (Figura 1f), o que pode ser explicado pelos hábitos alimentares semelhantes decorrentes da mesma localização geográfica.
Em seguida, comparamos as diferenças nos níveis de filo e espécie entre os dois grupos (Figura 1g,h). No nível de filo, a abundância de Firmicutes e Proteobacteria foi substancialmente maior no grupo NASH. Em contraste, a abundância de Bacteroides diminuiu acentuadamente no grupo NASH. No nível de espécie, a abundância de B. uniformis, Bifidobacterium longum, Parabacteroides distasonis, Bilophila, B. bifidum foi significativamente maior no grupo saudável do que no grupo NASH. As espécies que melhor interpretaram os grupos saudável e NASH são mostradas na Figura 1i. B. uniformis e B. bifidum foram enriquecidas no grupo saudável.
Para identificar melhor a microbiota intestinal contribuinte, escolhemos duas espécies com diferenças máximas entre os grupos NASH e saudável, B. uniformis e B. bifidum, para experimentos adicionais. Cepas adquiridas foram cultivadas e verificadas por sequenciamento do gene 16S rRNA (Figura Suplementar S1a,b). As funções COG previstas de B. uniformis e B. bifidum são mostradas na Figura Suplementar S1c. A previsão de funções KEGG associadas a distúrbios metabólicos e imunidade de B. uniformis e B. bifidum é mostrada na Tabela Suplementar S2.
B. uniformis e B. bifidum evitaram disfunção hepática e distúrbios metabólicos em camundongos NASH induzidos por HFD
B. uniformis e B. bifidum mostraram efeitos anti-obesidade em camundongos NASH induzidos por HFD. (a) Diagrama esquemático mostrando o desenho experimental e a linha do tempo do modelo animal. (b) Peso dos camundongos em diferentes grupos. (c) Comprimento corporal dos camundongos em diferentes grupos. (d) Índice de Lee dos camundongos em diferentes grupos. (e) Peso do fígado dos camundongos em diferentes grupos. (f) Índice hepático dos camundongos em diferentes grupos. (g) Comprimento do cólon e reto dos camundongos em diferentes grupos. (h) Peso do eWAT dos camundongos em diferentes grupos. Comparado com o grupo NCD, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; comparado com o grupo NASH-FMT, #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001.
Após estabelecer um modelo de camundongos pseudoestéril usando uma combinação de antibióticos, bactérias fecais derivadas de camundongos com NASH induzida por HFD e camundongos alimentados com NCD da mesma idade, B. uniformis e B. bifidum, foram transplantadas (Figura 2a). Em comparação com o grupo NCD, os camundongos apresentaram obesidade evidente após 52 semanas de HFD, refletida pelo peso corporal substancialmente elevado (Figura 2b), e o grupo NASH-FMT mostrou um aumento no comprimento corporal em comparação com o grupo NCD (Figura 2c). Além disso, em comparação com o grupo NCD, o índice de Lee e o peso do fígado nos camundongos do grupo NASH-FMT aumentaram, e a administração de B. uniformis e B. bifidum reverteu essas alterações (Figura 2d–f). Em comparação com o grupo NCD, o comprimento colorretal e o peso do eWAT de cada grupo alimentado com dieta rica em gordura mostraram uma tendência decrescente e crescente, respectivamente (Figura 2g,h).
B. uniformis e B. bifidum melhoraram os danos hepáticos e a dislipidemia em camundongos com NASH induzida por HFD. (a) AST de camundongos em diferentes grupos. (b) ALT de camundongos em diferentes grupos. (c) γ-GT de camundongos em diferentes grupos. (d) Glicemia de jejum de camundongos em diferentes grupos. (e) Proteína sérica glicada de camundongos em diferentes grupos. (f) Triglicerídeos de camundongos em diferentes grupos. (g) LDL de camundongos em diferentes grupos. (h) HDL de camundongos em diferentes grupos. Em comparação com o grupo NCD, *p < .05, **p < 0.01, ***p < .001; em comparação com o grupo NASH-FMT, #p < .05, # #p < .01, # # #p < .001.
Posteriormente, examinamos os perfis bioquímicos do sangue em cada grupo (Figura 3). Uma HFD de longo prazo causou disfunção hepática e distúrbio do metabolismo da glicose e lipídios, refletido pelo aumento da AST sérica, ALT, FBS, TG e LDL, e foi mais pronunciado nos grupos Healthy-FMT e NASH-FMT. Tanto o transplante de B. uniformis quanto de B. bifidum reduziu significativamente os níveis elevados de AST, ALT e TG séricos no grupo NASH-FMT, e o transplante de B. uniformis adicionalmente reduziu o LDL sérico.
B. uniformis e B. bifidum atenuaram as lesões hepáticas enquanto mantinham a integridade da barreira da mucosa intestinal em camundongos com NASH induzida por HFD
B. uniformis e B. bifidum melhoraram a histopatologia hepática e a barreira da mucosa intestinal em camundongos com NASH induzida por HFD. (a) Imagens representativas da morfologia hepática, coloração H&E, fibra reticular e Masson de camundongos em diferentes grupos. Barra: 50 μm. (b) Imagens representativas de imuno-histoquímica de CK-18 hepática. Barra: 50 μm. (c) Imagens representativas de imuno-histoquímica de ocludina colorretal e ZO-1. Barra: 50 μm.
Após HFD de longo prazo, os camundongos no grupo NASH-FMT desenvolveram NASH e até câncer hepático (Figura 4a,b). A coloração H&E revelou alterações perceptíveis nos hepatócitos, incluindo balonização, esteatose, inflamação e fibrose, nos grupos NASH-FMT e Healthy-FMT (Figura 4b). Conforme esperado, B. uniformis e B. bifidum atenuaram significativamente todas essas alterações patológicas, particularmente B. uniformis (Figura 4a,b). Para elucidar o impacto da HFD de longo prazo e do tratamento probiótico na barreira da mucosa intestinal, detectamos ZO-1 e ocludina, duas proteínas típicas de junção oclusiva intestinal, em cada grupo por meio de imuno-histoquímica. Os resultados mostraram que, em comparação com o grupo NASH-FMT, B. uniformis e B. bifidum reverteram a inflamação colorretal e os níveis reduzidos de ocludina (Figura 4c).
Existe disfunção imune no modelo de NASH induzido por dieta rica em gordura, com B. uniformis e B. bifidum revertendo a tolerância imune mediada por células NK hepáticas
A intolerância imune das células NK hepáticas foi melhorada por B. uniformis e B. bifidum em camundongos com NASH induzida por HFD. (a) Estratégia de gating para análise da infiltração de células imunes hepáticas. (b) Microambiente imune hepático por citometria de fluxo. (c) Marcadores moleculares funcionais em células NK hepáticas por citometria de fluxo. Em comparação com o grupo NCD, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; Em comparação com o grupo NASH-FMT, #p<0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001.
Para explorar melhor o estado imune hepático em camundongos com NASH e esclarecer a importância funcional de B. uniformis e B. bifidum na manutenção da homeostase imune hepática, examinamos a proporção de células imunes e a função das células NK hepáticas usando citometria de fluxo (Figura 5a). Embora as diminuições nas células T CD4+, células NKT e células NK não tenham mostrado diferença estatística entre os grupos NCD e NASH-FMT, os números de células T CD8+ e células dendríticas (DCs) aumentaram significativamente no grupo NASH-FMT (Figura 5b). A infiltração de macrófagos também aumentou no grupo NASH-FMT, indicando inflamação hepática agravada. Em comparação com o grupo NASH-FMT, o transplante de B. uniformis e B. bifidum resultou em um aumento no número de células T CD4+ hepáticas e células NK, e uma diminuição no número de macrófagos (Figura 5b).
Considerando o papel crítico das células NK na ocorrência e progressão da NASH, examinamos marcadores de superfície das células NK hepáticas. A expressão do receptor inibitório NKG2A não foi estatisticamente diferente entre os cinco grupos. No entanto, em comparação com o grupo NCD, os receptores ativadores NKG2D e Granzima B foram estatisticamente diminuídos no grupo Healthy-FMT, e a granzima B foi estatisticamente diminuída no grupo NASH-FMT (Figura 5c). Para o outro receptor ativador, IFN-γ, embora tenha havido uma tendência de queda nos grupos Healthy-FMT e NASH-FMT, não houve diferença estatística (Figura 5c). Tanto o transplante de B. uniformis quanto de B. bifidum mostraram uma tendência de aumento no número de CD107a, Granzima B e IFN-γ. Infelizmente, apenas o transplante de B. uniformis aumentou estatisticamente o CD107a, como resultado do tamanho amostral insuficiente e das diferenças individuais excessivas em cada grupo.
Para esclarecer melhor se a tolerância imunológica hepática das células NK foi estabelecida em camundongos com NASH, redetectamos a proporção de células imunes e os fatores efetores das células NK hepáticas em camundongos alimentados com NCD, camundongos com NASH induzida por HFD, camundongos com NASH tratados com B. uniformis e tratados com B. bifidum (Figura Suplementar S2). Notavelmente, esse resultado foi ainda mais confirmado pela diminuição estatisticamente significativa no número de células NK, NKG2D e CD107a no grupo NASH. Como esperado, o aumento da colonização de B. uniformis e B. bifidum por 8 semanas de suplementação exógena (Figura Suplementar S3) melhorou a citotoxicidade das células NK ao aumentar estatisticamente o NKG2D e o número de células NK, respectivamente.
B. uniformis e B. bifidum regulam sinais ativadores e inibitórios das células NK para resistir à tolerância imunológica hepática
Sinais de potencialização e inibição hepática das células NK em camundongos com NASH induzida por HFD. (a) Il2 hepática de camundongos em diferentes grupos. (b) Il12a hepática de camundongos em diferentes grupos. (c) Il12b hepática de camundongos em diferentes grupos. (d) Il15 hepática de camundongos em diferentes grupos. (e) Cxcl9 hepática de camundongos em diferentes grupos. (f) Cxcl10 hepática de camundongos em diferentes grupos. (g) Tgfb1 hepática de camundongos em diferentes grupos. (h) Il10 hepática de camundongos em diferentes grupos. (H) Il10 hepática de camundongos em diferentes grupos. (i) Ido2 hepática de camundongos em diferentes grupos. Em comparação com o grupo NCD, *p < .05, **p < .01, ***p < .001; em comparação com o grupo NASH-FMT, #p < .05, # #p < .01, # # #p < .001.
Recentemente, a interação entre o microambiente dinâmico e as células NK tem recebido atenção crescente, e o microambiente hepático especializado influenciado pela HFD resultou em disfunção das células NK e infiltração insuficiente. Para explorar o mecanismo pelo qual as células NK se comunicam com o microambiente hepático, foi realizada a análise do transcriptoma hepático. Produzimos scanners KEGG e gráficos de vulcão contendo os 20 principais genes (Figura Suplementar S4). Em comparação ao grupo NCD, 75 genes na via de adesão focal (KO 04510), incluindo Spp1, Col6a2, Rac2, Vav1, Pak1 e Thbs4, aumentaram no grupo NASH-FMT, enquanto Mylk3 diminuiu no grupo NASH-FMT. Notavelmente, os genes acima foram revertidos pelo transplante de B. uniformis e B. bifidum em comparação ao grupo NASH-FMT. Apesar de estatísticas indiferenciadas, Ptk2 (Fak), um dos genes centrais na via de adesão focal, apresentou uma tendência de queda nos grupos Uni e Bifi em comparação ao grupo NASH-FMT. Em seguida, quantificamos os fatores de sinalização biologicamente ativadores e inibitórios que regulam as células NK (Figura 6). Embora os fatores ativadores Il2, Il12b, Il15, Cxcl9 e Cxcl10 das células NK tenham mostrado tendência de aumento no grupo NASH-FMT (Figura 6a–f), os fatores inibitórios Tgfb1, Il10 e Ido2 também mostraram tendência de aumento (Figura 6g–i), o que pode ser uma das razões que leva à tolerância imunológica das células NK. B. uniformis e B. bifidum reverteram a ativação dos receptores inibitórios das células NK pelo NASH, o que foi consistente com a restauração da função das células NK.
Para entender melhor o mecanismo de tolerância imunológica das células NK hepáticas em camundongos NASH induzidos por HFD, foi realizada a análise do proteoma hepático, e os 20 principais enriquecimentos de vias KEGG com regulação positiva e negativa são mostrados na Figura Suplementar S5. Em comparação com o grupo NCD, a via de adesão focal e a via de sinalização TNF foram significativamente alteradas, e a via NAFLD foi significativamente regulada positivamente no grupo NASH-FMT e foi estatisticamente revertida pelo transplante de B. uniformis e B. bifidum (não entre as 20 principais vias) (Figura Suplementar S5). Além disso, os perfis de expressão proteica na via de citotoxicidade mediada por células natural killer também sugeriram a atividade reduzida das células NK hepáticas no grupo NASH-FMT, incluindo a regulação negativa de NKG2AB, NKGP46, NKG2DL, IFN-γ, granzima, TNF-α e perforina (Figura Suplementar S6).
Enriquecimentos de vias KEGG e diagramas de Venn por co-análise de proteômica hepática e sequenciamento de RNA. (a) Gráfico de dispersão de enriquecimento KEGG e diagrama de Venn entre o grupo NASH-FMT e o grupo NCD. (b) Gráfico de dispersão de enriquecimento KEGG e diagrama de Venn entre o grupo NASH-FMT e o grupo Healthy-FMT. (c) Gráfico de dispersão de enriquecimento KEGG e diagrama de Venn entre o grupo NASH-FMT e o grupo uni. (d) Gráfico de dispersão de enriquecimento KEGG e diagrama de Venn entre o grupo NASH-FMT e o grupo Bifi. Os detalhes do enriquecimento KEGG são mostrados nos materiais suplementares.
Em seguida, foi realizada uma análise abrangente do transcriptoma e da proteômica, e as alterações tanto em proteínas quanto em genes e os enriquecimentos das vias KEGG são exibidos na Figura 7. Em comparação com o grupo NCD, a via de adesão focal foi significativamente ativada no grupo NASH-FMT (Figura 7a). A atividade excessiva da via de adesão focal foi atenuada tanto nos grupos Healthy-FMT quanto Uni (Figura 7b,c). Além disso, a via de interação ECM-receptor foi ativada no grupo NASH-FMT e restaurada pelo transplante de B. uniformis (Figura 7b,c). Notavelmente, em comparação com o grupo NCD, tanto os níveis de genes quanto de proteínas de Cd44 e Cd93 foram significativamente aumentados no grupo NASH-FMT e restaurados no grupo Uni. Esses resultados indicaram coletivamente que havia múltiplas perspectivas pelas quais B. uniformis atenuou a tolerância imune hepática.
Análise do metagenoma fecal em diferentes grupos
Para esclarecer melhor as alterações na microbiota intestinal entre os diferentes grupos e confirmar a colonização de B. uniformis e B. bifidum (Figura Suplementar S7), realizamos análise metagenômica da microbiota intestinal em cada grupo de camundongos. Os resultados não mostraram diferença no índice de Shannon ao nível de espécie entre os grupos (Figura Suplementar S8a). O diagrama de Venn ilustra ainda o número de bactérias comuns e diferenciais em cada grupo (Figura Suplementar S8b). Além disso, na análise de coordenadas principais, em comparação com os grupos NASH-FMT e Healthy-FMT, a similaridade da distribuição de espécies entre os grupos Uni e NCD foi maior, e entre os grupos Bifi e NCD foi a mais alta (Figura Suplementar S8c). Comparamos também os seis filos diferenciais com maior abundância e 10 espécies bacterianas com maior abundância nas fezes dos camundongos de cada grupo (Figura Suplementar S8d,e). Os resultados mostraram que, em comparação com o grupo controle saudável, a proporção de Firmicutes para Bacteroidetes no grupo NASH-FMT diminuiu significativamente. Em contraste, a razão de Firmicutes para Bacteroidetes na microbiota intestinal dos grupos B. uniformis e B. bifidum foi maior do que no grupo NASH-FMT. Posteriormente, analisamos alterações na via KEGG (NÍVEL 3) (Figura Suplementar S8f). Os resultados mostraram que o metabolismo do carbono, a degradação de glicosaminoglicanos e a fosforilação oxidativa foram enriquecidos no grupo NASH-FMT. A montagem flagelar, quimiotaxia bacteriana, Legionetaxia e via de sinalização do receptor semelhante a NOD foram abundantes no grupo Bifi, enquanto o metabolismo de falsificação, o metabolismo do fosfato de inositol e o sistema de retransmissão de enxofre foram enriquecidos no grupo Uni. Além disso, construímos histogramas LDA ao nível de espécie e uma análise de rede de correlação de especificações e funções KEGG (Figura Suplementar S8g,h), mostrando os tipos de microrganismos (como Mucispirillum schaedleri e Siphoviridae sp.) com impacto significativo em cada grupo e a correlação entre microbiota intestinal e vias metabólicas. Intriguantemente, descobrimos que Lichtheimia ramosa, um fungo patogênico oportunista que ocorre principalmente em organismos imunocomprometidos, aumentou significativamente no grupo NASH-FMT em comparação com o grupo NCD e a aplicação de B. uniformis e B. bifidum reduziu significativamente seu nível em comparação com o grupo NASH-FMT (Figura Suplementar S9). Discussão.
A NASH é um precursor da fibrose hepática e cirrose, representando um ônus significativo para a saúde. As células NK desempenham um papel fundamental na progressão contínua da NASH. No entanto, o papel das células NK na NASH permanece controverso. Em nosso estudo, pacientes com mais de 10 anos de NAFLD grave, bem como aqueles com pelo menos dois tipos de distúrbios metabólicos, foram incluídos no grupo NASH. Estudos anteriores mostraram que a CK18 é uma ferramenta potente para o diagnóstico não invasivo da NASH, e a especificidade da cCK18 para a predição de NASH é maior do que a do M2BPGi, índice FIB4, APRI e outros indicadores diagnósticos. Assim, examinamos os níveis séricos de CK-18 em ambos os grupos, e nossos resultados foram consistentes com os de estudos publicados, manifestando-se como um nível significativamente aumentado de CK18 sérica no grupo NASH.
Embora uma vasta gama de estudos tenha sido acumulada sobre a imunopatogênese da NASH, houve um aumento de IL-6 e IFN-γ devido à superativação das células imunológicas hepáticas, acompanhado pela regulação negativa de IL-10. Curiosamente, em nosso estudo, observamos um aumento estatisticamente significativo nos níveis séricos de IL-10 e diminuições não estatísticas nos níveis séricos de IFN-γ e IL-6 no grupo NASH. Embora tenha havido falta de análise por citometria de fluxo, essas alterações atípicas potencialmente apoiaram o conceito e a possibilidade de tolerância imunológica periférica, e até mesmo sugeriram tolerância imunológica no fígado. Nosso estudo de acompanhamento mostrou que camundongos alimentados com uma HFD para induzir NASH acumularam um número estatisticamente maior de DCs, macrófagos e células CD8+T, e um número não estatisticamente menor de células NK (particularmente células NK ativadas), células CD4+T e células NKT no fígado. Embora não tenha havido redução estatística em cd107a e IFN-γ no grupo NASH-FMT, presumivelmente devido à discrepância excessiva dentro do grupo e ao tamanho amostral insuficiente, a redução em Granzima B mostrou uma diferença estatística. Como medida corretiva, o resultado foi posteriormente confirmado pelo número estatisticamente diminuído de células NK, NKG2D e CD107a no grupo NASH. Nossos resultados são inconsistentes com os de camundongos com NASH induzida por MCD, CDHFD e aqueles injetados com estreptozotocina. Assim, especulamos que a imunopatogênese da NASH induzida por diferentes dietas pode ser distinta.
A microbiota intestinal desempenha um papel fundamental na infiltração e ativação das células NK. Algumas delas aumentam a infiltração e atividade das células NK ao promover a secreção de fatores inflamatórios, como a Lactobacillus plantarum, e outras diminuem a infiltração e atividade das células NK. Para esclarecer melhor se a microbiota intestinal poderia intervir na progressão da NASH e regular as células NK, selecionamos dois probióticos potenciais que estavam reduzidos em pacientes com NASH e os transplantamos para um modelo de NASH induzido por dieta rica em gordura (HFD). Os resultados mostraram que B. uniformis e B. bifidum não apenas melhoraram as alterações patológicas e bioquímicas, mas também aumentaram a infiltração e ativação das células NK hepáticas, sugerindo ainda que B. uniformis e B. bifidum podem melhorar a tolerância imunológica das células NK no fígado, melhorando assim a progressão da NASH. Portanto, esclarecer os mecanismos subjacentes pode fornecer novas direções para terapias baseadas em células imunológicas para a NASH.
Estudos demonstraram que a função das células NK é afetada por vários microambientes, incluindo o microambiente imunológico, o microambiente microbiano e o microambiente metabólico, e a transformação funcional das células NK depende do equilíbrio entre sinais de ativação e inibição. Analisamos as moléculas de ativação, incluindo IL-15, CXCL-9, CXCL-10, IL-2 e IL-12, e as moléculas inibitórias, incluindo IL-10, TGF-β e IDO, e descobrimos que tanto as moléculas ativadoras quanto as inibitórias das células NK apresentaram tendências de aumento em camundongos com NASH induzida por HFD, e tanto B. uniformis quanto B. bifidum reduziram a IL-10 hepática e o TGF-β1. Notavelmente, B. uniformis e B. bifidum pareceram ser agentes ativadores surpreendentes das células NK hepáticas, manifestando-se como aumento da infiltração de células NK e regulação positiva estatística da Granzima B pelo uso profilático de B. uniformis, bem como aumento estatístico de NKG2D e infiltração de células NK pela suplementação posterior de B. uniformis e B. bifidum, respectivamente. Esses resultados indicam coletivamente que B. uniformis e B. bifidum poderiam resistir à disfunção das células NK hepáticas na NASH, pelo menos reduzindo as moléculas inibitórias das células NK.
Além dos sinais funcionais das células NK, o tratamento profilático com B. uniformis e B. bifidum também restaurou alterações transcricionais na via de adesão focal. Em comparação com o grupo NCD, múltiplos genes na via de adesão focal foram estatisticamente upregulados no grupo NASH-FMT, incluindo genes mediados pelo sistema imunológico, como Spp1, Col6a2 e Rac2. Col6a2 está relacionado ao microambiente tumoral imune e está negativamente correlacionado com células NK ativadas. Rac2, uma molécula funcional que participa da maturação e migração das células NK, também é um regulador negativo das células NK, manifestando-se pela redução do receptor citotóxico natural (NCR) NKp 46, NKp 30 e do receptor ativado CD16, além de aumentar o receptor inibitório NKG 2A e seu correspondente receptor ativado NKG 2C. Todos os genes mencionados foram estatisticamente reduzidos por B. uniformis e B. bifidum, o que pode explicar parcialmente como B. uniformis e B. bifidum atenuam a redução na infiltração e ativação de células NK hepáticas. Fak, um dos genes centrais na via de adesão focal, demonstrou regular negativamente o ligante primário MICA dos receptores imunes NKG2D através da via Fak/Src, enfraquecendo assim a suscetibilidade à morte mediada por células NK. Em nosso estudo, apresentou um aumento não estatístico no grupo NASH-FMT e uma redução não estatística nos grupos Uni-FMT e Bifi-FMT.
Além disso, os níveis hepáticos de CD44 (gene na via de interação ECM-receptor) e CD93 foram maiores no grupo NASH-FMT do que no grupo NCD, sugerindo outro mecanismo possível para a tolerância imunológica das células NK na NASH. CD44 pode antagonizar a adesão por internalização das células NK, reduzindo a adesão intercelular mediada por N-caderina, inibindo a formação celular e enfraquecendo a citotoxicidade das células NK contra tumores. Tanto o anticorpo anti-CD44 quanto a deficiência de CD44 em camundongos atenuaram a esteatose hepática, reduziram a inflamação do tecido adiposo e melhoraram a tolerância à glicose em camundongos obesos induzidos por dieta. CD93 também está envolvido na tolerância imunológica das células NK e está negativamente correlacionado com as células NK, e anticorpos anti-CD93 podem aumentar a infiltração de células NK. Em nosso estudo, o transplante de B. uniformis reduziu estatisticamente a expressão de CD44 e CD93 hepáticos, oferecendo outro mecanismo considerável pelo qual ele aumenta a infiltração e ativação de células NK.
Fungos também podem desempenhar funções biológicas essenciais nas respostas imunes. Em particular, a suplementação com Monascus purpureus melhora a DHGNA (doença hepática gordurosa não alcoólica) induzida por dieta rica em gordura, frutose e colesterol, e o Monascus purpureus estimulado por genisteína pode aumentar bactérias benéficas, como Lactobacillus, mostrando correlação positiva com a maioria dos indicadores imunológicos. Lichtheimia ramosa, um fungo patogênico oportunista da ordem Mucorales, foi encontrada como superproliferação na maioria dos pacientes com baixa função imune. Em nosso estudo, Lichtheimia ramosa fecal foi substancialmente aumentada em camundongos com NASH, e foi amplamente eliminada por B. uniformis e B. bifidum. Como a maioria das infecções por Lichtheimia ramosa ocorre em organismos imunocomprometidos, nossos resultados sugeriram a possibilidade de tolerância imunológica em camundongos com NASH.
A inflamação é um importante impulsionador da resposta imune. Estudos relataram que a inflamação progressivamente acumulada leva à imunidade inata e adaptativa prejudicada e exaurida. Os macrófagos, que desencadeiam a inflamação, desempenham um papel proeminente no início e desenvolvimento da NASH e também são inibidores das células NK. Perfis fenotípicos semelhantes foram observados em nosso estudo, manifestando-se como infiltração incremental de macrófagos e consequente inibição de células NK no grupo NASH-FMT (em comparação com o grupo NCD). Com base nisso, é mais convincente explicar como B. uniformis e B. bifidum revigoraram as células NK. O uso profilático de B. uniformis e B. bifidum melhorou todas essas alterações adversas e proporcionou curativos diversos de acordo com a etiologia anterior na evolução da NASH.
A NASH se desenvolve principalmente devido à disfunção imunológica e inflamação crônica. Isso resultou na conscientização de que a imunoterapia ideal será um tratamento curativo para a NASH. Independentemente de nossas limitações (ausência de exame histológico e citometria de fluxo nos participantes, tamanho amostral insuficiente em estudos com animais e mecanismo e justificativa não verificados para a tolerância imunológica das células NK na NASH), nossos dados revelaram um perfil funcional não relatado de células NK hepáticas na NASH induzida por HFD, possivelmente devido à interação entre inflamação, microecologia intestinal e microambiente hepático, destacando que a recuperação da função das células NK pode servir como um alvo candidato para imunoterapia para NASH. Nossas descobertas também implicam que direcionar a microecologia intestinal (transplante de B. uniformis e B. bifidum) pode trazer benefícios terapêuticos substanciais para a NASH, especialmente ao revigorar a função imunológica das células NK hepáticas, e apoiam fortemente a aplicação pré-clínica de B. uniformis e B. bifidum para aproveitar plenamente seu potencial de direcionar a função imunológica para o tratamento da NASH.
Material Suplementar
Declaração de divulgação
Nenhum potencial conflito de interesse foi relatado pelo(s) autor(es).
Contribuições dos autores
Jingyuan Xu, Yatao Wang e Xiaolan Lu conceberam e projetaram este estudo. Jingyuan Xu, Ting Wu, Yong Shao, Qiaoyun Xia, Yatao Wang, Nuyun Jin, Peiying Tian, Longyun Wu e Xiaolan Lu conduziram os experimentos. Jingyuan Xu e Qiaoyun Xia analisaram os dados. Jingyuan Xu e Qiaoyun Xia escreveram este manuscrito. Xiaolan Lu revisou o manuscrito de acordo. Todos os autores revisaram os resultados e aprovaram a versão final do manuscrito.
Declaração de disponibilidade de dados
• Este estudo não relatou o código original.
• Os autores confirmam que os dados que apoiam os achados deste estudo estão disponíveis no artigo e em seu material suplementar.
• Qualquer informação adicional necessária para reanalisar os dados relatados neste artigo está disponível com o contato principal mediante solicitação.
Material suplementar
Os dados suplementares para este artigo podem ser acessados online em https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2302065
Referências
O papel das hepatocinas na DHGNA
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