pmid: "38299316"
title: "Compostos indólicos derivados da microbiota intestinal atenuam a doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica melhorando o metabolismo de gordura e a inflamação."
authors: "Min BH, Devi S, Kwon GH, Gupta H, Jeong JJ, Sharma SP, Won SM, Oh KK, Yoon SJ, Park HJ, Eom JA, Jeong MK, Hyun JY, Stalin N, Park TS, Choi J, Lee DY, Han SH, Kim DJ, Suk KT"
journal: "Gut microbes"
pubdate: "2024"
doi: "10.1080/19490976.2024.2307568"
source: "PMC Full Text"

Compostos indólicos derivados da microbiota intestinal atenuam a doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica melhorando o metabolismo de gordura e a inflamação.

Autores

Min BH, Devi S, Kwon GH, Gupta H, Jeong JJ, Sharma SP, Won SM, Oh KK, Yoon SJ, Park HJ, Eom JA, Jeong MK, Hyun JY, Stalin N, Park TS, Choi J, Lee DY, Han SH, Kim DJ, Suk KT

Periodico

Gut microbes (2024)

Conteudo

Compostos indólicos derivados da microbiota intestinal atenuam a doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica melhorando o metabolismo de gorduras e a inflamação
RESUMO
A doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) é a doença hepática crônica mais comum, e sua prevalência aumentou mundialmente nos últimos anos. Além disso, existe uma relação estreita entre a MASLD e os metabólitos derivados da microbiota intestinal. No entanto, os mecanismos da MASLD e seus metabólitos ainda não são claros. Demonstramos níveis diminuídos de ácido indol-3-propiônico (IPA) e ácido indol-3-acético (IAA) nas fezes de pacientes com esteatose hepática em comparação com controles saudáveis. Aqui, a administração de IPA e IAA melhorou a esteatose hepática e a inflamação em um modelo animal de MASLD induzida por WD ao suprimir a via de sinalização NF-κB por meio de uma redução nos níveis de endotoxina e inativação de macrófagos. O Bifidobacterium bifidum metaboliza o triptofano para produzir IAA, e o B. bifidum previne efetivamente a esteatose hepática e a inflamação por meio da produção de IAA. Nosso estudo demonstra que o IPA e o IAA derivados da microbiota intestinal têm potencial preventivo ou terapêutico inovador para o tratamento da MASLD.
RESUMO GRÁFICO
Introdução
A doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica (MASLD) é reconhecida como a doença hepática crônica mais comum, e a prevalência da MASLD aumentou recentemente na região Ásia-Pacífico. Recentemente, três painéis de especialistas internacionais propuseram uma nova terminologia, MASLD. A definição de MASLD exige a presença de doença hepática esteatótica e pelo menos um fator de risco cardiometabólico, mantendo os critérios de exclusão de álcool e doença hepática concomitante da MASLD. A cirrose relacionada à MASLD pode subsequentemente levar ao carcinoma hepatocelular.
Existem trilhões de micróbios em nossos intestinos, que são coletivamente chamados de microbiota intestinal. A composição e a função da microbiota intestinal podem ser afetadas por diversos fatores, incluindo idade, sexo, fatores genéticos, estilo de vida, medicação ou diferenças dietéticas. A microbiota intestinal consiste em um grande número de cepas que pertencem a filos como Firmicutes, Bacteroides, Actinobacteria, Proteobacteria e Verrucomicrobia. Aproximadamente 99% da microbiota intestinal existe como bactérias comensais, incluindo Lactobacilos e Bifidobactérias. O desequilíbrio da microbiota intestinal contribui para o desenvolvimento de doenças relacionadas à obesidade, incluindo síndrome metabólica e MASLD.
Triptofano (Trp) é um aminoácido essencial necessário para a síntese proteica, que não é produzido pelo corpo humano e deve ser consumido através da alimentação. O Trp atua como precursor de várias substâncias e é metabolizado em substâncias indólicas, incluindo indol, triptamina, etanol indólico, ácido indol-3-propiônico (IPA), ácido indol-3-acético (IAA), ácido indol-3-láctico, escatol, aldeído indólico e ácido indol-3-acrílico, através de várias vias. De acordo com evidências recentes, metabólitos indólicos são conhecidos por serem eficazes na proteção hepática. Assim, a disponibilidade de Trp é um fator importante no controle da biossíntese proteica. Em nosso estudo anterior, identificamos um padrão de diminuição de IPA e IAA nos metabólitos fecais de pacientes com MASLD e metabólitos relacionados ao Trp, incluindo IPA e IAA, demonstraram ter uma variedade de efeitos no fígado. No entanto, os mecanismos específicos de IPA e IAA na prevenção da MASLD não são bem compreendidos. Também é necessário identificar metabólitos específicos de acordo com as mudanças na comunidade microbiana.
Portanto, neste estudo, nosso objetivo foi investigar os mecanismos subjacentes de IPA e IAA em um modelo de camundongo induzido por dieta ocidental (DO) para prevenção de MASLD com base em dados humanos que mostram uma diminuição de IPA e IAA conforme a MASLD progride.
Materiais e métodos
Dados humanos
Um estudo de coorte prospectivo foi realizado entre abril de 2017 e março de 2020 (ClinicalTrials.gov NCT04339725). Este estudo envolveu pacientes com doenças hepáticas que foram acompanhados pelo Departamento de Doenças Hepáticas do Hospital Universitário. Os grupos foram 19 controles saudáveis, 16 pacientes com MASLD sem hepatite e 26 pacientes com MASLD com hepatite. Este projeto seguiu a ética da Declaração de Helsinque de 1975, conforme refletido pela aprovação prévia do conselho de revisão institucional para pesquisa humana em hospitais (2016–134). O consentimento informado foi obtido de todos os participantes. Todos os autores tiveram acesso aos dados do estudo e revisaram e aprovaram o manuscrito final.
MASLD é definida como esteatose hepática e um ou mais dos cinco fatores de risco cardiometabólicos. MASLD foi diagnosticada usando química sanguínea, parâmetros clínicos, biópsia hepática ou exame de imagem (ultrassonografia ou tomografia computadorizada). Pacientes com enzimas hepáticas elevadas aminotransferase (AST) ou aspartato aminotransferase (ALT) ≥ 50 UI/L ou hepatite na patologia hepática foram incluídos no grupo de hepatite. Pacientes inscritos com MASLD que não consumiam álcool em excesso (homens >60 e mulheres >40 g/semana). Pacientes com doença hepática autoimune, transtorno por uso de álcool, pancreatite, hemocromatose, doença hepática viral, gravidez, doença de Wilson, lesão hepática induzida por medicamentos e outros tipos de câncer foram excluídos. No momento da inscrição, pacientes que tomavam medicamentos que afetam o microbioma intestinal foram excluídos. Como grupo controle, pessoas normais que visitavam o hospital para exame de saúde foram recrutadas. A doença do paciente foi tratada independentemente do estudo.
Animais e dietas
Os animais estavam sob cuidados humanos, e todos os procedimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Gestão de Experimentação Animal (2020–40, 2021–53) da Faculdade de Medicina da Universidade Hallym. Camundongos C57BL/6J machos, livres de patógenos específicos, com seis semanas de idade, foram adquiridos da Dooyeol Biotech (Seul, Coreia). Todos os camundongos foram alojados individualmente em gaiolas de microisolamento de aço a 22 ± 2°C com ciclo claro/escuro de 12/12 h. Os camundongos tiveram acesso ad libitum a água e comida durante todo o experimento e foram monitorados diariamente. O experimento incluiu um período de aclimatação para todos os grupos, durante o qual os camundongos de todos os grupos tiveram um período de aclimatação à dieta normal por 1 semana. O IPA e o IAA foram administrados a 0,1 mg/ml diluídos em água. Como experimento animal adicional, Bifidobacterium bifidum foi administrado por via oral na concentração de 10 UFC/100ul diariamente durante 12 semanas. A WD (TD88137, Seul, Coreia) foi adquirida, e a composição nutricional era 42% de gordura, 42,7% de carboidratos e 15% de proteína.
Análise histológica do fígado
Os espécimes foram fixados com formalina a 10% e rotineiramente embebidos em parafina, e as seções de tecido foram processadas com hematoxilina e eosina. Para graduar o fígado gorduroso, foi avaliado o escore de atividade da doença hepática gordurosa não alcoólica (NAS), um índice objetivo composto por esteatose, inflamação lobular e balonização. Todas as amostras de biópsia foram analisadas por um único patologista hepático. O fígado gorduroso foi classificado como grau 0 a 3 de acordo com o sistema de pontuação da Rede de Pesquisa Clínica (0: <5%, 1: 5%–33%, 2: 34%–66% e 3: >66%). de esteatose). A inflamação foi graduada de 0 a 3 (0: nenhuma, 1: 1–2 focos por × 20 campo, 2: 2–4 focos por × 20 campo, 3: >4 focos por × 20 campo). De acordo com as diretrizes baseadas no NAS, pode ser útil reconhecer a pontuação histológica de sistemas que abrangem todo o espectro da MASLD.
Análise de fezes para sequenciamento de amplicons do gene 16S rRNA
Fezes humanas foram armazenadas a −20°C assim que o paciente recebeu 2–3 g de fezes usando o kit (papel higiênico e coletor de fezes) e transferidas para −80°C dentro de 1 dia. Para fezes de camundongos, o intestino inteiro foi coletado durante a eutanásia e congelado a −80°C e armazenado. O DNA genômico para sequenciamento metagenômico foi extraído com um kit QIAamp stool (Qiagen, Alemanha) e a biblioteca foi preparada com um kit NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep para Illumina (New England BioLabs, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A quantificação das bibliotecas foi verificada usando um kit Qubit dsDNA HS assay (ThermoFisher Scientific, EUA) e confirmada por qPCR com o kit KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (Kapa Biosystems, EUA). A qualidade das bibliotecas foi avaliada em um Bioanalyzer 2100 (Agilent, EUA) usando um chip DNA 12.000. Todas as bibliotecas foram sequenciadas na plataforma NovaSeq 6000 (Illumina, EUA) com leituras paired end (PE) de 150 pb. Os ensaios foram realizados de acordo com métodos anteriores. Em resumo, o DNA foi extraído com um kit QIAamp stool, e a amplificação da região V3-V4 do gene 16S rRNA bacteriano foi conduzida usando primers de fusão com código de barras. O primer de fusão direto continha adaptador p5, índice i5 e primer específico do gene 341F (5′-AATGATACGGCGACCACCG AGATCTACAC-XXXXXXXX-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGAC AG – CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; o sublinhado indica o primer da região alvo e X indica a região do código de barras), e o primer de fusão reverso continha adaptador p7, índice i7 e primer específico do gene 805 R (5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-XXXXXXXXGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHV GGGTATCTAATCC-3′), que incluía adaptadores de sequenciamento e códigos de barras de índice duplo do kit Nextera XT (Illumina, San Diego, CA, EUA). A amplificação foi realizada no sistema de reação em cadeia da polimerase C1000 touch thermal cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc., EUA) com as seguintes condições: desnaturação inicial de 3 min a 95°C; seguida por 25 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 s, anelamento a 55°C por 30 s, extensão a 72°C por 30 s e extensão final a 72°C por 5 min. Cada produto de PCR amplificado foi confirmado com eletroforese em gel de agarose a 1% e visualizado em um sistema de imagem Gel Doc XR+ (Bio-Rad laboratories, Inc., EUA). Os produtos amplificados foram purificados e selecionados por tamanho usando beads Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, EUA).
A biblioteca foi construída com produtos de PCR agrupados e a qualidade da biblioteca foi avaliada em um Bioanalyzer 2100 (Agilent, EUA) usando um chip DNA 12.000 e quantificada por qPCR com o kit KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (Kapa Biosystems, EUA). O sequenciamento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante na CJ Bioscience, Inc. (Seul, República da Coreia) com a plataforma Illumina MiSeq usando o kit de reagentes V3 no modo PE 250 bp. O perfil taxonômico do microbioma foi conduzido com a plataforma EZBioCloud (CJ Bioscience Inc., República da Coreia) usando a versão do banco de dados PKSSU4.0. Após o perfil taxonômico de cada amostra, o analisador comparativo MTP do EZBioCloud foi utilizado para a análise comparativa das amostras. A seleção do número de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) foi realizada com UCLUST e CDHIT com 97% de corte de similaridade. Subsequentemente, foram calculados a cobertura de Good, a rarefação e os índices de diversidade alfa, incluindo Simpson, Jackknife, ACE, Chao1, Shannon e NPShannon. A diversidade beta foi demonstrada por agrupamento usando o método de grupo de pares não ponderados com média aritmética (UPGMA) e análise de coordenadas principais (PCoA).
Análise de metabólitos de amostras de fezes humanas
Perfis metabólicos no ceco de camundongos foram obtidos utilizando uma combinação de métodos de cromatografia gasosa-espectrometria de massas (GC-MS) e cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS). Amostras cecais foram descongeladas a 4°C e misturadas com 1,1 ml de solvente de extração I frio (acetonitrila/água 1:1, v/v). A mistura foi vortexada por 1 min, sonicada por 5 min sob gelo e centrifugada a 13.200 rpm por 5 min a 4°C. Cada sobrenadante (500 μl) foi transferido para um novo tubo de 2 ml para análise de SCFA. O sobrenadante restante foi misturado com 600 μl de solvente de extração II frio (acetonitrila/metanol, 1:3, v/v). Para a segunda etapa de extração, a mistura foi vortexada por 1 min e centrifugada a 13.200 rpm por 5 min a 4°C. O sobrenadante (500 μl) foi aliquotado e transferido para novos tubos de 1,5 ml para cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas por tempo de voo e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas Orbitrap. As alíquotas foram concentradas até secura completa usando um concentrador a vácuo de alta velocidade (SCANVAC, Coreia). Análises detalhadas foram realizadas de acordo com métodos de pesquisa anteriores.

Preparação das cepas
Lactobacilos utilizados no estudo preliminar foram isolados de várias fontes, incluindo leite azedo, queijo, fezes de adultos coreanos saudáveis e fezes de recém-nascidos. B. bifidum é uma cepa de lactobacilo isolada das fezes de recém-nascidos. B. bifidum foi inoculada em frascos contendo meio de Man, Rogosa e Sharpe (BD/Difco). As cepas foram incubadas em condições anaeróbicas a 37°C por 24 h. Estoques de cada cepa foram preparados misturando a cultura com uma solução equivalente de leite desnatado a 20% e, em seguida, armazenando a mistura a −80°C.

Medição da produção de IAA pelo reagente de Salkowski
Culturas de cada cepa foram previamente cultivadas em condições anaeróbicas em cultura líquida a 35°C com ou sem Trp. Após 24 h, as culturas amostrais foram separadas por centrifugação a 4000 rpm por 10 min a 4°C. Preparado diluindo 50:1 do reagente de Salkowski, HClO4 a 35% (ácido perclórico) e FeCl3 0,5 M, reagiu 1:1 com o meio de cultura bacteriano e incubou no escuro a 30°C por 30 min. A absorbância é então medida a 530 nm. Calcule a concentração comparando a densidade óptica da amostra de teste com uma curva padrão de IAA (10–100 μg/ml).

Análise de Western blot, ensaio de ELISA para LBP, ensaio de TEER, Microarray Quant-Seq, métodos relacionados a células e RT-PCR: arquivo suplementar

Análise estatística
Todos os valores foram expressos como média ± EPM, e a análise foi realizada entre dois ou mais grupos por ANOVA de uma via. Um valor de p < 0,05 foi considerado indicativo de significância estatística. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism versão 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA).

Resultados
IPA e IAA estão diminuídos nas fezes de pacientes com MASLD
Dados humanos.
Para estudar como os metabólitos derivados da microbiota intestinal são alterados à medida que a MASLD progride, analisamos a microbiota por sequenciamento do gene 16S rRNA e os níveis de metabólitos específicos derivados da microbiota em amostras de fezes de 19 controles saudáveis (HCs) e 42 pacientes com MASLD (Figura 1a, Figura Suplementar S1 e Figura S2, e Tabela Suplementar S1). Na análise de composição, composição de filos e a razão Firmicutes/Bacteroidetes (F/B), diferenças estatisticamente significativas foram observadas entre os grupos (Figura 1b, c). A abundância de Bifidobacterium aumentou à medida que a doença hepática progrediu (Figura 1d). No nível de espécie, B. bifidum aumentou significativamente na MASLD. B. longum aumentou na MASLD. No entanto, estatisticamente, não houve diferença. Os níveis de B. adolescentis, B. catenulatum e B. breve aumentaram à medida que a doença hepática progrediu (Figura Suplementar S1e).

Analisamos os metabólitos do Trp, incluindo derivados do indol e quinurenina (Kyn), nas fezes dos pacientes. O Trp estava significativamente aumentado em pacientes com MASLD. Por outro lado, na MASLD, o IPA diminuiu significativamente em pacientes com MASLD. Os níveis de AA diminuíram em pacientes com MASLD, mas isso não foi estatisticamente significativo. (Figura 1e). No entanto, houve uma diminuição significativa nas alterações de acordo com a progressão da doença (Figura Suplementar S2a). No gráfico de vulcão (volcano plot), o nível de IPA foi o composto mais significativamente diminuído em pacientes com MASLD (Figura 1f). Outros derivados do indol não revelaram diferença entre controles saudáveis e pacientes com MASLD (Figura 1e). O nível de Kyn não foi significativamente diferente entre os grupos (dados não mostrados).

Observou-se que amostras fecais de pacientes com MASLD apresentavam níveis mais baixos de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) principais do que amostras de fezes de HCs (Figura Suplementar S2b). Em contraste, os níveis de ácido cólico e ácido quenodesoxicólico estavam significativamente aumentados (Figura Suplementar S2c). Além disso, os níveis dos marcadores de função hepática AST e ALT estavam aumentados no sangue de pacientes com MASLD (Tabela Suplementar S1). No geral, esses dados clínicos indicam que o IPA e o IAA são metabólitos candidatos com valor preventivo e sugerem um papel potencial na patogênese da esteatose hepática.

IPA e IAA atenuam a progressão da MASLD induzida por WD

IPA e IAA melhoram a esteatose hepática induzida por WD.
Primeiramente, dividimos os camundongos em quatro grupos para estudar os efeitos do IPA e do IAA no metabolismo lipídico hepático na MASLD: controle normal (NC), WD e grupos suplementados com IPA e IAA sob condições de WD (Figura 2a). O tratamento com IPA e IAA melhorou a relação fígado/corpo (L/B) em comparação ao grupo WD, e a relação L/B foi significativamente melhorada com o tratamento com IPA (Figura 2b). A coloração com hematoxilina e eosina na histopatologia hepática mostrou gotículas lipídicas anormais e inflamação em camundongos alimentados com WD, as quais foram reduzidas pelo tratamento com IPA e IAA; o grau de inflamação e o grau de balonização foram bastante reduzidos. O NAS melhorou com o tratamento com IPA e IAA, especialmente o tratamento com IAA, que resultou em uma melhora significativa (Figura 2c).
Além disso, em comparação ao grupo NC, os níveis dos indicadores de função hepática AST e ALT estavam significativamente aumentados nos camundongos alimentados com WD, e a função hepática foi significativamente melhorada pela suplementação com IPA e IAA. Por outro lado, não houve diferença entre os níveis de triglicerídeos (TG) e colesterol (CHOL) (Figura 2d). Esses dados demonstraram melhora tanto nas alterações histológicas quanto sorológicas com a administração de IPA e IAA por 12 semanas, sugerindo um papel protetor do IPA e do IAA na esteatose hepática induzida por WD.
A administração de IPA e IAA melhora a esteatose hepática e inflamação induzidas por WD em camundongos.
A administração de IPA e IAA alivia a esteatose hepática e inflamação induzidas por WD em camundongos.
Para avaliar a inflamação hepática e o metabolismo lipídico em camundongos alimentados com WD, detectamos alterações na expressão de mRNA de marcadores relacionados à inflamação e ao metabolismo lipídico no tecido hepático. Primeiro, a expressão do fator de necrose tumoral (Tnf)-α, uma citocina pró-inflamatória, estava significativamente aumentada em camundongos alimentados com WD, o que foi significativamente melhorado pela administração de IPA e IAA. No entanto, não houve diferença significativa na expressão de interleucina 1 beta (Il-1β) e Il-6 entre o grupo WD e os grupos IPA e IAA (Figura 3a). Também avaliamos a expressão de mRNA de quimiocinas que ativam tecidos inflamados e desempenham um papel fundamental na patogênese da MASLD. O nível do ligante 10 da quimiocina do motivo C-X-C (Cxcl10) foi significativamente diminuído nos grupos IPA e IAA em comparação ao grupo WD (Figura 3b). Em seguida, a expressão gênica da carnitina palmitoiltransferase-1a (Cpt1a), do receptor ativado por proliferador de peroxissomo-α (Ppar-α) e da acil-CoA oxidase 1 (Acox1), genes envolvidos na β-oxidação de ácidos graxos, foi significativamente aumentada pela administração de IPA e IAA (Figura 3c). A sintase de ácidos graxos (Fasn), a acetil-CoA carboxilase 1 (Acc1), o cluster de diferenciação 36 (Cd36) e genes envolvidos na adipogênese e no transporte foram induzidos no grupo WD, enquanto foram significativamente suprimidos nos grupos IPA e IAA (Figura 3d).
Os metabólitos do triptofano, compostos indólicos, são conhecidos como ligantes do receptor de hidrocarboneto arílico (AHR), e o IAA é um ligante representativo do AHR. Assim, os níveis do membro 1 da subfamília B da família 1 do citocromo P450 (Cyp1b1) e do membro 2 da subfamília A da família 1 do citocromo P450 (Cyp1a2), que são genes regulados pelo AHR no íleo, foram significativamente aumentados pela administração de IAA, sugerindo que o AHR foi ativado no íleo (Figura 3e). Em contraste, a expressão do AHR no tecido hepático não foi ativada (Figura Suplementar S3a). A expressão aumentada de citocinas pró-inflamatórias foi reduzida pelo IPA e IAA (Figura Suplementar S3b). No geral, esses resultados sugerem que a administração de IPA e IAA a camundongos alimentados com WD melhora a esteatose hepática ao regular a resposta inflamatória e a síntese de ácidos graxos e β-oxidação no fígado.

O tratamento das células Caco-2 com IPA e IAA aumentou os valores de resistência elétrica transepitelial (TEER) em 1,2 vez e 1,6 vez, respectivamente, em comparação com os controles não tratados (Figura 3f).

O tratamento com IPA e IAA reduziu a resposta à endotoxina, inibindo assim a ativação de macrófagos e a sinalização de NF-κB.

A administração de IPA e IAA suprime o aumento da endotoxina e da resposta inflamatória causada pela WD.

Avaliamos se o tratamento com IPA e IAA melhorou a inflamação hepática ao reduzir a endotoxina derivada do intestino, reduzir a atividade dos macrófagos hepáticos e, finalmente, inibir a sinalização de NF-κB. Primeiro, avaliamos o nível de mRNA do receptor Toll-like 4 (TLR4), que é ativado pelo reconhecimento do lipopolissacarídeo (LPS), nos fígados de camundongos induzidos por WD. Como resultado, o nível de Tlr4 aumentou no grupo de camundongos induzidos por WD, enquanto o tratamento com IPA e IAA mostrou uma diminuição em seus níveis para níveis semelhantes aos do grupo NC, mas não apresentou significância estatística (Figura 4a). Na análise de Western blot, o tratamento com IAA diminuiu significativamente a expressão de Tlr4 (Figura 4b). Níveis elevados da proteína de ligação ao LPS (LBP), uma proteína que se liga à endotoxina sérica induzida por uma WD, foram significativamente reduzidos no grupo tratado com IAA (Figura 4c). Em seguida, avaliamos os níveis de mRNA do ligante 2 do motivo C-C (Ccl2) e do ligante 5 do motivo C-C (Ccl5), que são quimiocinas representativas que atraem monócitos e macrófagos para o local da inflamação. Os níveis de Ccl2 e Ccl5 foram significativamente aumentados em camundongos alimentados com WD, mas esses níveis foram significativamente diminuídos com o tratamento com IPA e IAA (Figura 4d). Com base nessa descoberta, investigamos o efeito do tratamento com IPA e IAA no nível da proteína do fator nuclear kappa-potenciador da cadeia leve de células B ativadas (NF-κB), um complexo proteico envolvido na produção de citocinas e na sobrevivência celular em macrófagos. Curiosamente, os níveis de proteína fosforilada de p65 e IκBα foram aumentados em camundongos alimentados com WD, mas foram restaurados pelo tratamento com IPA e IAA, e a mudança com o tratamento com IAA foi significativa (Figura 4e).
Para avaliar os efeitos anti-inflamatórios do IPA e do IAA, medimos os níveis de citocinas e quimiocinas em macrófagos estimulados por LPS. Células RAW264.7 foram pré-tratadas com IPA e IAA de forma dose-dependente e, em seguida, tratadas com LPS. O IPA e o IAA reduziram significativamente Tnf-α e Ccl2 em células Raw264.7 estimuladas por LPS (Figura 4f, g). Os níveis de mRNA de Ahr com o tratamento com IPA e IAA em células Raw264.7 e células CaCo2 aumentaram (Figura 4h, i). Esses resultados sugerem que o tratamento com IPA e IAA aumenta a expressão de Ahr e suprime a expressão de Tlr4 estimulada por endotoxina, inibindo assim a ativação de macrófagos e a sinalização de NF-κB e, por fim, melhorando a inflamação.
O IPA e o IAA aumentaram a expressão de Acox1 e Cpt1, marcadores de oxidação de ácidos graxos, em células AML12 (Figuras Suplementares S4a e S4b). Citocinas relacionadas à inflamação foram reduzidas pelo tratamento com IPA e IAA em células RAW264.7 (Figuras Suplementares S4c e S4d). Esses resultados sugerem que o IPA e o IAA desempenham um papel no controle do metabolismo da gordura e da inflamação.
O IPA e o IAA modulam a alteração da transcrição de RNA no fígado
O tratamento com IPA e IAA alterou o transcriptoma no fígado.
Para investigar como o IPA e o IAA contribuem para a proteção hepática contra a redução da inflamação e acúmulo de lipídios em camundongos induzidos por WD, realizamos RNA-seq dos fígados coletados dos camundongos NC, WD, IPA e IAA e traçamos o perfil dos transcritos hepáticos. Todas as descobertas significativas tiveram fold change > 2, dados normalizados (log2) > 1, p < 0,05, e foram comparados WD/NC, IPA/WD e IAA/WD. Os valores de p foram ajustados para FDR (False Discovery Rate). A análise de heatmap de agrupamento de genes diferencialmente expressos (DEG) mostrou regulação positiva e negativa significativa no tratamento com IPA e IAA em comparação com camundongos induzidos por WD, e dendrogramas indicando similaridade de expressão entre as amostras foram relativamente semelhantes nos grupos IPA e IAA, ao contrário do grupo WD (Figura 5a). A análise de agrupamento com DEGs significativos revelou um perfil de expressão único para os tecidos em cada grupo.
Analisamos o grupo WD vs. IPA e IAA na categoria de processo biológico da Gene Ontology (GO). Primeiro, no grupo IPA, a regulação da produção de Il-6 e a ativação de leucócitos, que contribuem para a inflamação, foram reguladas negativamente, e a oxidação biológica, uma resposta geradora de energia em células vivas, foi regulada positivamente. Em seguida, no grupo IAA, a regulação negativa da fosforilação de proteínas foi regulada negativamente, e o metabolismo de lipídios e os processos catabólicos de lipídios envolvidos no metabolismo lipídico foram regulados positivamente (Figura 5b). A análise de componentes principais (PCA) mostrou uma separação distinta entre os quatro grupos de acordo com o tipo de grupo (Figura 5c). Em seguida, realizamos a análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) para identificar vias reguladas por IPA e IAA em camundongos induzidos por WD. Não surpreendentemente, encontramos regulação positiva significativa da via do metabolismo do Trp em camundongos tratados com IPA e IAA, que são metabólitos do Trp (Figura 5d). Genes diferencialmente expressos no fígado foram identificados comparando os grupos de camundongos tratados com IPA e IAA com o grupo WD.
A administração de IPA regulou positivamente 34 genes e regulou negativamente 55 genes, e a administração de IAA resultou em 37 genes regulados positivamente e 48 genes regulados negativamente. Genes com alterações comuns em IPA/WD e IAA/WD foram 26 genes regulados positivamente e 27 genes regulados negativamente. Curiosamente, de acordo com estudos anteriores, a expressão gênica de Ccl2, uma quimiocina que atrai monócitos e macrófagos para o local da inflamação, foi significativamente regulada negativamente, e a expressão gênica de Cyp1a2, um gene associado ao AHR, foi significativamente aumentada.
A correlação dos genes foi analisada e visualizada estatisticamente (Figura 5e–g). Um total de 53 genes comumente regulados por IPA/IAA (Figura 5e). A análise comparativa revelou 43 genes regulados que cruzaram WD/NC, IPA/WD e IAA/WD, satisfazendo as três condições de fold change > 2, dados normalizados (log2) >1 e p < 0,05 (Figura 5f e Tabela Suplementar S3). A Figura 5g mostra um total de 43 genes regulados analisados e visualizados estatisticamente quanto à correlação com base no banco de dados de interação proteína-proteína. Ccl2, marcador de inflamação, está diminuído nos grupos IPA e IAA. Mup (proteína urinária principal), que inibe a resistência à insulina e a tolerância à glicose, e genes relacionados ao citocromo P450 estavam intimamente relacionados e aumentados nos grupos IPA e IAA (Figura 5g). Esses estudos de RNA-seq indicam que a administração de IPA e IAA ativa a via metabólica do Trp e que essa ativação é atribuível à regulação da transcrição relacionada à inflamação e ao metabolismo lipídico. Esm1 (molécula 1 específica de células endoteliais) e antígenos linfocitários 6 (Ly6d), marcadores de inflamação, foram diminuídos nos grupos IPA e IAA. Além disso, o nível de Cyp1a2 foi aumentado nos grupos IPA e IAA, conforme mostrado na Figura 3e.
O desequilíbrio da microbiota intestinal induzido por WD é melhorado pela administração de IPA e IAA, e B. bifidum é uma cepa potente produtora de IAA.
Modulando a abundância taxonômica microbiana de IPA e IAA nas alterações induzidas por WD.
Realizamos o perfil taxonômico microbiano intestinal baseado em rRNA 16S para investigar a relevância potencial da administração de IPA e IAA nas alterações da composição microbiana intestinal e nas bactérias específicas que produzem compostos indólicos. Entre os indicadores de diversidade α, os índices de Simpson e Shannon não mostraram diferença significativa em todos os grupos (Figura 6a). Por outro lado, a diversidade β, que indica a diferença na composição da microbiota intestinal entre amostras e grupos, mostrou uma diferença distinta em todos os grupos com base na análise de coordenadas principais (PCoA) e mostrou uma grande alteração na composição microbiana devido ao fornecimento de WD, e os grupos IPA e IAA foram parcialmente separados (Figura 6b). A análise de agrupamento também mostrou que havia diferenças entre o grupo WD e os grupos de indóis que foram administrados concomitantemente com WD (Figura 6c). Vários estudos mostraram que a razão F/B está associada à obesidade e a várias doenças. A razão F/B diminuiu nos grupos IPA e IAA em comparação com o grupo WD, mas não foi estatisticamente significativa (Figura 6d). A abundância de Bifidobacterium aumentou significativamente nos grupos IPA e IAA (Figura 6e). Cada grupo apresentou uma composição de gênero diferente (Figura Suplementar S5).

Testamos a capacidade de produzir IAA adicionando Trp, um precursor de IAA, através de um ensaio de Salkowski usando 13 cepas, que são cepas representativas aprovadas para uso como probióticos na Coreia do Sul. As cepas controle E. coli e B. bifidum mostraram resultados positivos, sugerindo que B. bifidum pode metabolizar IAA usando Trp (Figura 6f). Portanto, foram realizadas medições de 0 h a 72 h para determinar a correlação entre o crescimento de B. bifidum e a produção de IAA. O crescimento de B. bifidum atingiu o pico em 24 h com e sem Trp, mas a concentração de IAA aumentou até 24 h apenas no meio contendo Trp (Figura 6g).

B. bifidum atenua a progressão da MASLD induzida por WD
B. bifidum melhora a esteatose hepática induzida por WD.
Nossas descobertas anteriores revelaram que B. bifidum é uma bactéria nova capaz de produzir AIA. Portanto, levantamos a hipótese de que B. bifidum produtora de AIA poderia proteger contra a disfunção hepática em um modelo de camundongo com DHGNA induzida por DOD. Para comprovar essa hipótese, dividimos os camundongos no grupo CN e no grupo DOD. Para avaliar se B. bifidum metaboliza o Trp, um precursor do AIA, sob condições de DOD, B. bifidum com ou sem TRP foi administrada por gavagem. Além disso, L. plantarum Q180 e Trp foram incluídos como controles (Figura 7a). Como se sabe que a administração de Trp induz esteatose hepática, avaliamos se a esteatose hepática foi atenuada pela capacidade metabólica de B. bifidum. A razão F/B aumentou no grupo DOD e no grupo TRP, mas a suplementação com B. bifidum e L. plantarum melhorou a razão F/B e, em particular, o grupo tratado com TRP e B. bifidum apresentou uma razão F/B significativamente diminuída (Figura 7b).
A coloração com hematoxilina e eosina mostrou gotículas lipídicas anormais e inflamação em camundongos alimentados com DOD, que foram aliviadas pela administração de B. bifidum, e mostrou um efeito de alívio da esteatose hepática no grupo administrado com Trp coadministrado com B. bifidum. Como resultado, o grau de inflamação e o grau de balonização foram significativamente reduzidos, e o NAS foi significativamente melhorado com o tratamento com B. bifidum (Figura 7c). Além disso, os níveis de AST e ALT, indicadores da função hepática, aumentaram significativamente nos camundongos dos grupos DOD e Trp, e a função hepática melhorou significativamente através da administração de B. bifidum. Por outro lado, não houve diferença significativa nos níveis de TG, e os níveis de CHOL foram significativamente reduzidos apenas no grupo tratado com Trp e B. bifidum (Figura 7d). Esses dados demonstraram melhora tanto nas alterações histológicas quanto sorológicas com a administração de B. bifidum por 12 semanas, sugerindo que B. bifidum pode desempenhar um papel protetor ao metabolizar o Trp, especialmente na esteatose hepática induzida por Trp.
A administração de B. bifidum alivia a esteatose hepática e a inflamação induzidas por DOD
A administração de B. bifidum alivia a esteatose hepática e a inflamação induzidas por DOD em camundongos.
Para determinar se o B. bifidum exerce um efeito inibitório sobre a esteatose hepática, avaliamos camundongos induzidos por WD em grupos tratados com B. bifidum isoladamente ou em combinação com Trp e B. bifidum. Primeiramente, os níveis de Tnf-α, uma citocina pró-inflamatória, estavam significativamente aumentados no grupo WD, mas melhoraram significativamente no grupo tratado com a cepa. No entanto, como em estudos anteriores, não houve diferença entre os níveis de Il-6 e Il-1β (Figura 8a e Figura Suplementar S6a). Os níveis da quimiocina Cxcl10 diminuíram no grupo tratado apenas com B. bifidum, e os níveis de Ccl2 e Ccl5, que recrutam macrófagos, foram bastante reduzidos no grupo tratado com B. bifidum e meio de cultura (Figura 8b). No teste TEER com L. plantarum e B. bifidum, o B. bifidum aumentou a função de junção apertada (Figura 8c). Em seguida, a expressão de genes envolvidos na β-oxidação de ácidos graxos, Ppar-α e Acox1, aumentou no grupo tratado com a cepa, especialmente no grupo que recebeu Trp e B. bifidum juntos (Figura 8d). A expressão de Ppar-γ, envolvida na síntese de gordura, aumentou no grupo WD e melhorou significativamente com o tratamento com B. bifidum. No entanto, ao contrário de estudos anteriores, o tratamento com B. bifidum não alterou significativamente a expressão de genes relacionados à síntese de gordura (Figura Suplementar S6b). Na análise de células Raw264.7, o B. bifidum e o meio de cultura melhoraram efetivamente a expressão da inflamação (Figura Suplementar S7). Na análise da microbiota, cada grupo apresentou achados típicos de beta-diversidade, composição de filo e gênero, e proporção de Bifidobacterium (Figura Suplementar S8).

Também avaliamos genes associados ao AHR, que se liga ao IAA. A expressão de AHR estava quase ausente no grupo WD, mas aumentou nos grupos Trp e cepa. Em particular, a expressão de AHR aumentou significativamente no grupo que recebeu Trp e B. bifidum juntos, sugerindo que o B. bifidum pode metabolizar Trp para gerar IAA e ativar o AHR no íleo (Figura 8e e Figura Suplementar S9a). Por outro lado, consistente com estudos anteriores, o nível de expressão de AHR no tecido hepático não foi ativado pelo tratamento com B. bifidum (Figura Suplementar S6c).

Nossos resultados sugerem que o B. bifidum pode reduzir a translocação e inibir a ativação de macrófagos, como em estudos anteriores. Além disso, esses resultados não melhoraram no grupo Trp, sugerindo que o B. bifidum atenuou a inflamação no fígado ao metabolizar Trp. Os níveis séricos de IAA aumentaram nos grupos B. bifidum (isoladamente e com Trp) (Figura 8f). Apenas nos dados humanos, os níveis diminuídos de IAA e IPA cecais no WD foram recuperados no grupo B. bifidum (Figura Suplementar S9b e Tabela Suplementar S2). No tecido hepático, os níveis alterados de IAA e IPA foram recuperados no grupo B. bifidum (Figura Suplementar S9c).
Em seguida, avaliamos o papel do AHR usando o antagonista de AHR, CH-223191 (Sigma Korea, Seul) (Figura 8g, h). O nível de citocina inflamatória, escore NAS e fatores de regulação da gordura, que foram melhorados no grupo B. bifidum com Trp, pioraram (Figura Suplementar S9c, S9d e S9f). Esse resultado sugere que a microbiota produtora de indol aumentou a expressão de AHR no íleo e inibiu a progressão da MASLD.
No geral, o tratamento apenas com B. bifidum melhorou a inflamação hepática e a esteatose via AHR. Além disso, embora o grupo Trp tenha apresentado exacerbação da inflamação hepática e da esteatose hepática, a administração de B. bifidum teve um efeito anti-MASLD, o que validou nossa hipótese.
Discussão
A MASLD é atualmente a doença hepática mais comum nos países ocidentais, e a disbiose intestinal resultante está fortemente associada à MASLD e a doenças relacionadas à obesidade, incluindo a síndrome metabólica. Os mecanismos que ligam a obesidade e o microbioma intestinal estão sendo elucidados por meio de uma combinação de estudos vigorosos em modelos humanos e animais. Melhorar a microbiota intestinal usando pré-, pró-, para- ou pós-bióticos é uma abordagem promissora para prevenir ou tratar a MASLD, regulando o eixo intestino-fígado. Nosso objetivo foi identificar as principais bactérias que atenuam a MASLD, estudando o efeito preventivo do IPA e do IAA na MASLD e investigando bactérias que produzem IAA usando Trp.
Os compostos indólicos, que são metabólitos do Trp derivados de microrganismos intestinais, desempenham um papel importante na homeostase intestinal ao se ligarem ao AHR e estão relacionados à patogênese de doenças intestinais, como doença inflamatória intestinal e colite. No entanto, a doença hepática associada ao AHR permanece em grande parte inexplorada. Os mecanismos específicos do IPA e do IAA na prevenção e tratamento da MASLD não são bem compreendidos. Em um relato anterior, C. sporogenes, um microrganismo intestinal que sintetiza IPA usando Trp, é bem conhecido, mas um microrganismo intestinal que produz IAA não foi bem relatado.
O Trp possui três vias principais: Kyn, serotonina e indol. Os níveis dos indóis IPA e IAA tenderam a diminuir nessas vias à medida que a MASLD piorava. Importante, o nível de Trp, um precursor do indol, estava aumentado em pacientes com esteatose hepática, sugerindo que a via metabólica do Trp para IPA e IAA pela microbiota intestinal estava prejudicada. Portanto, nosso estudo sugere um papel inibitório do desenvolvimento devido à suplementação com IPA e IAA no fenótipo da MASLD.
Para estudar os efeitos inibitórios da suplementação de IPA e IAA na MASLD, primeiro caracterizamos um modelo murino de MASLD que induz esteatose hepática. Nossos resultados mostraram que a exposição a uma WD por 12 semanas induziu inflamação e esteatose. A suplementação com IPA e IAA diminuiu a razão L/B em comparação ao grupo WD, consistente com os resultados de histologia e bioquímica sanguínea, levando a uma recuperação significativa dos níveis de NAS, AST, ALT, TG e CHOL. Aqui, descobrimos que a administração de IPA e IAA reduziu significativamente a gravidade da inflamação hepática induzida por WD, conforme indicado pelos níveis de mRNA de Tnf-α e Cxcl10.
Além disso, nosso estudo demonstrou que Ppar-α regula positivamente a expressão de Cpt1a, aumenta a β-oxidação mitocondrial e regula a captação e eliminação de ácidos graxos. Os genes que regulam a adipogênese no fígado foram significativamente reduzidos pela administração de IPA e IAA. Esses resultados fornecem evidências do efeito anti-MASLD da administração de IPA e IAA. O IAA derivado do Trp foi relatado como um ligante de AHR. Além disso, os genes relacionados ao AHR foram bastante aumentados pela administração de IAA. Essa descoberta sugere que a administração de IAA contribuiu para a inibição da progressão da MASLD ao manter a homeostase intestinal através do ligante de AHR e regular o eixo intestino-fígado.
Um crescente corpo de evidências indica que endotoxinas bacterianas, como o LPS, estão intimamente relacionadas à MASLD. As endotoxinas estimulam células no fígado ao liberar citocinas e quimiocinas inflamatórias por um mecanismo mediado por Tlr-4. Demonstramos em estudos in vitro que o tratamento com IPA e IAA afeta diretamente os macrófagos, reduzindo a sinalização de endotoxinas. Especificamente, o nível de expressão do mRNA de Tlr4, que reconhece e ativa o LPS, foi reduzido pelo tratamento com IPA e IAA. Os níveis proteicos também apresentaram os mesmos resultados, com níveis reduzidos de LBP no soro. Estudos recentes mostraram evidências de papéis importantes das quimiocinas na patogênese da MASLD, e Ccl2 e Ccl5 são reconhecidas como mediadores importantes no dano hepático e nos tecidos inflamatórios, pois estão associadas a macrófagos. Estudos anteriores mostraram evidências de que macrófagos estimulados por LPS contribuem para a resposta inflamatória ao ativar membros da família do fator de transcrição NF-ϰB. Aqui, especulamos que o LPS é um metabólito que pode inibir a atividade de macrófagos e inibir a via de sinalização do NF-kB devido ao tratamento com IPA e IAA. Nossos achados mostram que o tratamento com IPA e IAA inibiu a ativação de macrófagos induzida por WD. Curiosamente, a expressão do transcrito de RNA de Ccl2 também se mostrou diminuída. Além disso, os tratamentos com IPA e IAA mostraram eficácia em aliviar a inflamação ao inativar a sinalização de NF-ϰB, conforme especulado. Nossos achados demonstraram que o tratamento com IPA e IAA contribuiu para a inativação de macrófagos ao reduzir os níveis de endotoxinas na progressão da MASLD. Além disso, consistentemente com seus efeitos anti-inflamatórios, a sinalização de NF-ϰB também é importante no tratamento com IPA e IAA. Portanto, IPA e IAA são metabólitos alvo potenciais para terapias destinadas a inibir ou prevenir a progressão da MASLD. Confirmamos os efeitos anti-inflamatórios de IPA e IAA na inflamação induzida por LPS na linhagem de macrófagos murinos RAW264.7 in vitro. O tratamento com IPA e IAA contribuiu para efeitos anti-inflamatórios de maneira dose-dependente, conforme observado no experimento in vivo.

Mecanisticamente, usamos análise de transcriptoma hepático para destacar a importância da função gênica no tratamento com IPA e IAA no fígado. O tratamento com IPA reduziu a produção de Il-6 e a regulação da ativação de leucócitos, que contribuem para a inflamação. Por outro lado, a oxidação biológica aumentou. O IAA também reduziu a regulação negativa da fosforilação de proteínas, e o metabolismo de lipídios foi regulado positivamente. Esses resultados diferentes sugerem que IPA e IAA atuam na prevenção da MASLD por meio de mecanismos distintos.
Recentemente, foi demonstrado que o distúrbio do metabolismo lipídico é um fator de risco para hiperlipidemia, aterosclerose e MASLD. Um desequilíbrio no metabolismo lipídico pode levar a vários distúrbios nas vias envolvidas na síntese de ácidos graxos e na secreção de lipoproteínas de densidade muito baixa e em alterações β-oxidativas. Portanto, nosso estudo demonstra que o tratamento com IPA e IAA pode atenuar a esteatose hepática melhorando o metabolismo lipídico. Também confirmamos que os tratamentos com IPA e IAA aumentaram o metabolismo do Trp em comparação com o grupo WD. Além disso, ao comparar o grupo WD com os grupos IPA e IAA, o Ccl2 foi regulado negativamente e o marcador AHR Cyp1a2 foi regulado positivamente, o que é consistente com estudos anteriores. Portanto, a administração de IPA e IAA aumenta o metabolismo do Trp, a manutenção da homeostase energética e o metabolismo lipídico, sugerindo a possibilidade de mediar a regulação da sinalização transcricional relacionada ao metabolismo e à inflamação.

Recentemente, evidências crescentes sugeriram uma ligação estreita entre doenças hepáticas como MASLD, incluindo comprometimento da função de barreira endotelial intestinal que permite a translocação de componentes do microbioma intestinal e leva à inflamação hepática. A composição do microbioma intestinal está associada a pacientes com MASLD e, à medida que a doença hepática progride, os Bacteroides diminuem e os Firmicutes aumentam. Isso é consistente com a composição da microbiota intestinal de pacientes com MASLD em nosso estudo. Nosso estudo encontrou semelhanças na microbiota intestinal nos grupos tratados com IPA e IAA, diferentes do grupo induzido por WD. Além disso, vários metabólitos produzidos pela microbiota intestinal chegam ao fígado por meio de vias de sinalização intestinal.

Mar et al. forneceram evidências de alguns isolados bacterianos presentes no microbioma intestinal que sintetizam IAA. Neste estudo, selecionamos 12 culturas probióticas com e sem Trp e confirmamos a abundância relativa de IAA em B. bifidum. Isso sugere que B. bifidum é uma cepa que produz IAA potente usando Trp. Bifidobacterium é a bactéria mais comum no microbioma intestinal infantil. Bifidobacterium também é um dos principais gêneros de bactérias que compõem o microbioma gastrointestinal de mamíferos. O gênero Bifidobacterium possui uma via de fosfocetolase de frutose-6-fosfato usada para fermentação de carboidratos. Portanto, muitos estudos metabólicos de Bifidobacterium focaram no metabolismo de oligossacarídeos. Entre eles, B. bifidum foi demonstrado em estudos anteriores preservar a integridade intestinal ao reduzir danos na mucosa e melhorar a hiperglicemia e a dislipidemia em modelos de camundongos diabéticos. No entanto, o papel de B. bifidum na MASLD não é claro. Além disso, existem poucos estudos sobre se B. bifidum combinado com prebióticos tem efeito anti-MASLD. Portanto, é necessária uma investigação mais aprofundada sobre a eficácia de B. bifidum na MASLD. Além disso, investigamos se a progressão da MASLD poderia ser inibida por prebióticos e probióticos.
Como esperado, os fígados dos camundongos induzidos por WD estavam dilatados e hipertróficos, e, como esperado, o grupo Trp também apresentou o mesmo. Verificou-se que essa dilatação e hipertrofia foram significativamente melhoradas pelo B. bifidum. Em particular, a progressão da MASLD foi inibida no grupo tratado com Trp e B. bifidum em conjunto. Além disso, histologicamente, o grupo WD e o grupo Trp eram iguais, e foram significativamente melhorados pela administração de B. bifidum. Em termos de bioquímica sanguínea, as enzimas hepáticas foram significativamente reduzidas em resposta ao B. bifidum. Análises adicionais mostraram que o tratamento com B. bifidum reduziu a expressão de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias. Portanto, a administração do probiótico B. bifidum e do prebiótico Trp melhorou a inflamação hepática e a esteatose, resultando em um potencial efeito preventivo contra a MASLD.

Neste estudo, mostramos que os níveis comunitários de metabólitos produzidos pela microbiota intestinal diferem de acordo com o grau de progressão da MASLD. Os AGCCs, como propionato, acetato e butirato, são metabólitos que possuem uma variedade de funções fisiológicas e regulação do sistema imunológico. Por outro lado, os níveis de BAs, especialmente ácido cólico e ácido quenodesoxicólico, estavam aumentados. Conforme relatado anteriormente, os BAs são regulados pelo receptor X farnesoide (FXR), dos quais 95% são ativamente reabsorvidos no íleo terminal e reciclados no fígado, e o FXR desempenha um papel importante na regulação do metabolismo lipídico e na supressão da inflamação no fígado. Como resultado, a causa subjacente do aumento dos ácidos biliares nas fezes de pacientes com esteatose hepática sugere um comprometimento da função do FXR.

Neste estudo, o B. bifidum está enriquecido em pacientes com MASLD e o gênero Bifidobacterium foi enriquecido em pacientes com NASH e presente em níveis constantes em pacientes com MASLD. Além disso, Bifidobacterium foi depletado em camundongos alimentados com WD. Esses resultados conflitantes sugerem que o papel do Bifidobacterium pode diferir entre a MASLD humana e de camundongos.

Em conclusão, os níveis de IPA e IAA foram reduzidos em pacientes com MASLD em comparação com indivíduos saudáveis. Em nosso estudo, usando um modelo animal de MASLD induzida por WD, demonstramos que a administração de IPA e IAA melhorou a esteatose hepática induzida pela dieta e a inflamação hepática. Essas administrações de IPA e IAA revelaram o mecanismo anti-MASLD ao inibir a via NF-κB por meio da redução dos níveis de endotoxina e inativação de macrófagos. Importante, descobrimos que o probiótico B. bifidum produziu IAA derivado de Trp e mostrou um efeito inibitório na progressão da MASLD. Nossos dados, portanto, destacam o potencial valor prognóstico dos IAAs derivados de B. bifidum e sua contribuição para o controle da esteatose hepática. Portanto, nossos dados sugerem que os IAAs derivados de B. bifidum provavelmente são de importância clínica.

Material Suplementar

Declaração de divulgação

Nenhum potencial conflito de interesse foi relatado pelo(s) autor(es).

Contribuições dos autores
K.T.S. e B.H.M. conceberam e desenharam o estudo. B.H.M. escreveu o texto principal do manuscrito. B.H.M., H.G., G.H.K., J.J.J., S.S., R.G., S.M.W., K.K.O., S.J.Y., H.J.P., J.A.E., M.K.J., J.Y.H. e S.H.H. analisaram e interpretaram os dados. K.T.S., S.D., N.S. e T.P. redigiram e revisaram o manuscrito. Todos os autores contribuíram para a revisão do manuscrito, e leram e aprovaram a versão submetida.
Disponibilidade de dados e materiais
Todos os dados estão disponíveis no manuscrito e no arquivo suplementar.
Declaração de aprovação ética
Os animais receberam cuidados humanitários e todos os procedimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Este projeto seguiu a ética da Declaração de Helsinque de 1975, conforme refletido por uma aprovação prévia do conselho de revisão institucional para pesquisa em seres humanos em hospitais (2016–134). O consentimento informado foi obtido de todos os participantes. Todos os autores tiveram acesso aos dados do estudo e revisaram e aprovaram o manuscrito final.
Material suplementar
Os dados suplementares para este artigo podem ser acessados online em https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2307568
Referências
Mecanismos do desenvolvimento da DHGNA e estratégias terapêuticas
A DHGMA melhora a prática clínica para doenças hepáticas na região da Ásia-Pacífico
Mudando de DHGNA para DHGMS: incidência cumulativa semelhante de esofagite de refluxo entre DHGNA e DHGMS
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