pmid: "39738244"
title: "Lactococcus lactis e Bifidobacterium bifidum aliviam os sintomas pós-menopáusicos ao suprimir a sinalização de NF-κB e a disbiose da microbiota."
authors: "Shin YJ, Ma X, Joo MK, Baek JS, Kim DH"
journal: "Scientific reports"
pubdate: "2024 Dec 30"
doi: "10.1038/s41598-024-81500-0"
source: "PMC Full Text"

Lactococcus lactis e Bifidobacterium bifidum aliviam os sintomas pós-menopáusicos ao suprimir a sinalização de NF-κB e a disbiose da microbiota.

Autores

Shin YJ, Ma X, Joo MK, Baek JS, Kim DH

Periodico

Scientific reports (2024 Dec 30)

Conteudo

Lactococcus lactis e Bifidobacterium bifidum aliviam sintomas pós-menopáusicos ao suprimir a sinalização de NF-κB e a disbiose da microbiota

Para entender o mecanismo de ação de probióticos contra sintomas pós-menopáusicos, examinamos os efeitos de Lactococcus lactis P32 (PL) e Bifidobacterium bifidum P45 (PB), que suprimiram a expressão de interleucina (IL)-6 e do ligante do receptor ativador do fator nuclear-κB (RANK) (RANKL) em macrófagos estimulados por Gardnerella vaginalis (Gv), sobre vaginite, osteoporose e depressão/comprometimento cognitivo (DC) em camundongos com infecção vaginal por Gv, ovariectomia (Ov) ou Ov/Gv (oG). A administração oral de PL ou PB reduziu o comportamento do tipo DC induzido por Gv e a expressão de fator de necrose tumoral (TNF)-α, IL-6, RANK e/ou RANKL na vagina, osso, hipotálamo, hipocampo e cólon, enquanto os níveis de osteoprotegerina óssea e de serotonina cerebral e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), suprimidos por Gv, aumentaram. Eles alteraram parcialmente a disbiose vaginal e intestinal em camundongos infectados por Gv para a composição da microbiota intestinal de camundongos controle normais. Em camundongos com oG, a administração oral de PL ou PB reduziu o comportamento do tipo DC induzido por oG e a expressão de TNF-α, IL-6, RANK e/ou RANKL na vagina, osso, cérebro e cólon, enquanto os níveis de osteoprotegerina óssea e de serotonina cerebral e BDNF, suprimidos por oG, aumentaram. Eles também aliviaram a disbiose vaginal e intestinal induzida por oG: reduziram a população de Proteobacteria. A mistura de PL e PB (4:1) (PM) suprimiu o comportamento do tipo DC em camundongos com Gv, Ov ou oG. A PM também suprimiu a expressão de TNF-α, IL-6, RANK e/ou RANKL na vagina, osso, cólon e cérebro. A PM aliviou a disbiose vaginal e intestinal induzida por Gv: reduziu a população de Proteobacteria. Estes achados sugerem que PL e PB, isoladamente ou em conjunto, podem aliviar sintomas pós-menopáusicos incluindo vaginite, colite, osteoporose e DC, ao suprimir a ativação de NF-κB mediada por RANK/RANKL e aliviar a disbiose da microbiota vaginal/intestinal.
Informações Suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41598-024-81500-0
A menopausa é a cessação permanente dos ciclos menstruais com a perda da atividade folicular ovariana e desequilíbrio hormonal. Mulheres na menopausa e pós-menopausa sofrem de ondas de calor, distúrbios do sono, depressão, osteoporose, infecção por patógenos vaginais e inflamação sistêmica. Curiosamente, elas apresentam níveis sanguíneos mais elevados de fator de necrose tumoral (TNF)-α e interleucina (IL)-6 do que mulheres na pré-menopausa. A menopausa e a inflamação aumentam a patogênese da osteoporose em mulheres através da regulação positiva do ligante do receptor ativador do fator nuclear-κB (RANK) (RANKL) e do TNF-α, que estimulam a diferenciação de progenitores mieloides em osteoclastos. Porphyromonas gingivalis exposta gengivalmente induz periodontite e osteopenia através da ativação da sinalização NF-κB mediada por RANK/RANKL. Gardnerella vaginalis (Gv) infectada vaginalmente induz vaginite em camundongos através da ativação da sinalização NF-κB. Mulheres na pós-menopausa frequentemente sofrem de vaginite e osteoporose. Esses achados sugerem que a vaginite pode deteriorar a osteoporose em mulheres na menopausa.
Os probióticos têm diversos efeitos biológicos que suprimem a infecção por patógenos, a inflamação sistêmica e tópica e os distúrbios psiquiátricos. Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus rhamnosus atenuam a vaginose bacteriana em camundongos. Lactobacillus plantarum e Bifidobacterium longum aliviam a vaginose bacteriana e a osteoporose em camundongos. Lactobacillus reuteri alivia a osteoporose primária e secundária em voluntários. Uma mistura probiótica (Lactobacillus fermentum 57 A, L. plantarum 57B, Lactobacillus gasseri 57 C e mistura de L. plantarum) melhora a saúde vaginal em voluntários. Os probióticos também aliviam a disbiose relacionada à menopausa em voluntários. No entanto, o(s) mecanismo(s) de ação dos probióticos contra vaginose bacteriana, osteoporose, depressão e disbiose intestinal relacionados aos sintomas da menopausa permanece(m) elusivo(s).
No presente estudo, para entender o mecanismo de ação dos probióticos contra os sintomas da menopausa, isolamos Lactococcus lactis P32 (PL) e Bifidobacterium bifidum P45 (PB), que suprimiram a expressão de TNF-α, IL-6 e RANKL induzida por Gv em macrófagos, a partir de uma coleção de bactérias fecais humanas saudáveis e seus efeitos sobre marcadores relacionados à osteoporose, depressão/comprometimento cognitivo (DC), vaginite e colite e na composição da microbiota vaginal e intestinal em camundongos com Gv infectado vaginalmente, ovariectomia (Ov) ou Ov/Gv (oG).
Resultados
PL e PB suprimiram a diferenciação de osteoclastos induzida por Gv em células de macrófagos
Investigamos os efeitos de trinta cepas probióticas selecionadas da coleção de bactérias fecais humanas saudáveis na expressão de IL-6 e RANKL em macrófagos estimulados por Gv (Fig. 1). Das cepas testadas, PL e PB suprimiram mais potentemente a expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL induzida por Gv (Fig. 1a–e). Elas também suprimiram a diferenciação de osteoclastos (células positivas para fosfatase ácida resistente ao tartarato [TRAP]) induzida por Gv a partir de macrófagos (Fig. 1f). Quando misturadas (4:1, 1:1 e 1:4), a mistura (4:1) (PM) suprimiu mais potentemente, mas não significativamente, a expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL e a diferenciação de osteoclastos (Fig. 1g–j). Com base nas análises de coloração de Gram, gene 16S rRNA e sequências do genoma completo, e kits API, PL e PB foram nomeados L. lactis P32 e B. bifidum P45, respectivamente. As sequências do genoma completo de PL e PB exibiram a maior similaridade filogenética com L. lactis NCDO2181 (99,9%) e B. bifidum KCTC3202 (99,8%), respectivamente, usando OrthoANI (Fig. Suplementar S1).
Efeitos de PL, PB e suas misturas (4:1, 1:1 e 1:4) (PM) na expressão de TNF-α, IL-6, IL-10, RANK e TRAP em macrófagos estimulados por Gv ou RANKL (RL). Efeitos na expressão de TNF-α (a), IL-6 (b), IL-10 (c), RANK (d) e RANKL (e) e na população de células positivas para TRAP/ALP (f) em macrófagos estimulados por Gv. Efeitos na expressão de TNF-α (g), IL-6 (h) e RANK (i) e na população de células positivas para TRAP/ALP (j) em macrófagos estimulados por RL. Vh, salina; Gv, 1 × 10⁴ UFC de Gv; GPL, Gv + 1 × 10⁴ UFC/mL de PL; GPB, Gv + 1 × 10⁴ UFC/mL de PB; GPM, Gv + 1 × 10⁴ UFC/mL de PL+PB (PM: 4:1, 1:1 e 1:4); RL, 50 ng/mL de RANKL; RPL, RL + 1 × 10⁴ UFC/mL de PL; RPB, RL + 1 × 10⁴ UFC/mL de PB; RPM, RL + 1 × 10⁴ UFC/mL de PM. Os dados indicam média ± DP (n = 4). Letras diferentes na figura indicam diferenças significativas (p < 0,05).
PL, PB e PM aliviaram a vaginite e a colite induzidas por Gv em camundongos
Em seguida, examinamos os efeitos de PL, PB e PM na vaginite induzida por Gv em camundongos (Fig. 2, Fig. Suplementar S2). A infecção por Gv causou vaginite. No entanto, a administração oral de PL, PB ou PM suprimiu significativamente o nível do gene 16S rRNA de Gv na vagina (Fig. 2a). Eles também suprimiram o peso do útero induzido por Gv e os níveis de expressão de TNF-α, IL-6 e RANKL na vagina, enquanto a expressão de IL-10 suprimida por Gv aumentou (Fig. 2b–f). Eles suprimiram a razão de expressão de TNF-α ou IL-6 em relação à IL-10 induzida por Gv. No exame histológico, o tratamento com PL, PB ou PM suprimiu o edema maciço induzido por Gv e as populações de células NF-κB+CD11c+ e TNF-α+ na vagina (Fig. 2g). Além disso, eles suprimiram o nível de osteocalcina, mas não de RANKL, no sangue induzido por Gv (Fig. 2h, i).
Efeitos de PL, PB e PM na vaginite e colite induzidas por Gv em infecção vaginal em camundongos. Efeitos no nível de expressão do gene 16S rRNA de GV vaginal (a), peso do útero (b), TNF-α vaginal (c), IL-6 (d), IL-10 (e) e expressão de RANKL (f) e populações de células coradas com H&E, NF-κB+ e TNF-α+ (g) na vagina. Efeito na osteocalcina sanguínea (h) e nível de RANKL (i). Efeito na mieloperoxidase (j), expressão de TNF-α (k), IL-6 (l) e IL-10 (m) e populações de células NF-κB+CD11c+ (n). Nc, salina; Gv, 1 × 106 UFC de GV; GPL, Gv + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PL; GPB, Gv + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PB; GPM, Gv + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PL+PB (PM: mistura 4:1). Os dados indicam média ± DP (n = 6). Letras diferentes na figura indicam diferenças significativas (p < 0,05).

A infecção por Gv causou colite: aumentou a expressão de mieloperoxidase, TNF-α e IL-6 e a população de células NF-κB+CD11c+ no cólon (Fig. 2j–n). No entanto, a administração oral de PL, PB ou PM diminuiu a expressão de mieloperoxidase, TNF-α e IL-6 e a população de células NF-κB+CD11c+ induzidas por Gv, enquanto a expressão de IL-10 aumentou.

PL, PB e PM aliviaram a osteíte/osteopenia, o comportamento semelhante a DC e a neuroinflamação induzidos por Gv em camundongos

A expressão periférica ou central de IL-6 está intimamente associada à patogênese da osteoporose e depressão. Portanto, examinamos os efeitos de PL, PB e PM sobre a osteíte/osteopenia, comportamento semelhante a DC e neuroinflamação induzidos por Gv em camundongos (Fig. 3, Fig. Suplementar S3). A infecção vaginal por Gv aumentou a expressão de RANK, RANKL e osteocalcina e o número de células TRAP-positivas no osso (Fig. 3a–j). No entanto, a administração oral de PL, PB ou PM suprimiu as populações de células RANK+, TNF-α+ e TRAP+ e a expressão de RANK, RANKL, TRAP, metaloproteinase de matriz 2 (MMP2) e osteocalcina no fêmur induzidas por Gv, enquanto a expressão de osteoprotegerina suprimida por Gv e a população de células TGF-β+ aumentaram.

Efeitos de PL, PB e PM na osteíte/osteólise e DC induzidos por Gv em infecção vaginal em camundongos. Efeito no peso do fêmur (a) e na expressão de osteoprotegerina (b), RANK (c), RANKL (d), TRAP (e), MMP-2 (f), osteocalcina (g), TNF-α (h) e IL-6 (i) e populações de células coradas com H&E, RANK+, TNF-α+, TGF-β+ e TRAP+ (j) no fêmur. Efeito no OT no EPMT (k), CD (l) e CT (m) no OFT, alternância espontânea no teste do labirinto em Y (n) e exploração no teste de reconhecimento de novos objetos (o). Efeito na expressão hipotalâmica de serotonina (p) e TNF-α (q), expressão hipocampal de serotonina (r) e TNF-α (s) e populações de células hipotalâmicas NF-κB+Iba1+ (esquerda), células hipocampais BDNF+NeuN+ (meio) e populações de células hipocampais NF-κB+Iba1+ (direita) (t). Nc, salina; Gv, 1 × 106 UFC de GV; GPL, Gv + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PL; GPB, Gv + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PB; GPM, Gv + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PL+PB (PM: mistura 4:1). Os dados indicam média ± DP (n = 6). Letras diferentes na figura indicam diferenças significativas (p < 0,05).
A infecção vaginal por Gv aumentou o comportamento semelhante a DC em camundongos. A infecção por Gv diminuiu o tempo gasto no braço aberto (OT) no teste de labirinto em cruz elevado (EPMT) e o tempo gasto na área central (CT) no teste de campo aberto (OFT) para 15,3% (F[4,25] = 53,54, p < 0,0001) e 15,5% (F[4,25] = 32,62, p < 0,0001) do grupo controle normal tratado com veículo (Nc), respectivamente, e aumentou o tempo de imobilidade (IT) no teste de suspensão pela cauda (TST) para 139,4% (F[4,25] = 12,29, p < 0,0001) do grupo Nc (Fig. 3k–o). A infecção por Gv prejudicou a função cognitiva: diminuiu a alternância espontânea (SA) no teste de Y-maze (YMT) e a exploração no teste de reconhecimento de novo objeto (NORT) para 57,3% (F[4,25] = 23,19, p < 0,001) e 82,3% (F[4,25] = 3,69, p < 0,001) do Nc, respectivamente. No entanto, a administração oral de PL, PB e PM diminuiu os comportamentos semelhantes a DC induzidos por Gv. Eles reverteram o OT no EPMT para 81,7%, 54,4% e 69,8% do grupo Nc, respectivamente, e o CT no OFT para 130,5%, 105,8% e 122,7% do grupo Nc, respectivamente, e reverteram o IT no TST para 101,7%, 94,3% e 88,9% do grupo Nc, respectivamente. Eles também reverteram a SA no YMT para 92,15%, 92,5% e 97,3% do Nc, respectivamente, e a exploração no NORT para 107,3%, 110,7/% e 112,3% do Nc, respectivamente.
Eles aumentaram o nível de serotonina suprimido por Gv no hipocampo e hipotálamo, enquanto a expressão de TNF-α, IL-6, IFN-γ e IL-17 induzida por Gv e a população de células NF-κB+Iba1+ diminuíram (Fig. 3p-t). A administração oral de PL, PB ou PM diminuiu significativamente a expressão de TNF-α e IFN-γ induzida por Gv e a população de células NF-κB+Iba1+ no hipocampo e hipotálamo, enquanto a expressão de serotonina e IL-10 suprimida por Gv e a população de células de fator neurotrópico derivado do cérebro (BDNF)+NeuN+ aumentaram.
PL, PB e PM aliviaram a disbiose vaginal e intestinal induzida por Gv em camundongos
Também investigamos os efeitos de PL, PB e PM na composição da microbiota vaginal e intestinal em camundongos infectados por Gv (Fig. 4, Fig. Suplementar S4). A infecção vaginal por Gv causou disbiose vaginal: aumentou as populações de Actinobacteria e Proteobacteria e diminuiu as populações de Firmicutes e Bacteria_uc na microbiota vaginal (Fig. 3a, b). Além disso, a infecção vaginal por Gv aumentou a α-diversidade (riqueza de unidades taxonômicas operacionais [OTU]) e alterou a β-diversidade (PCoA) na microbiota vaginal (Fig. 4c, d). No entanto, a administração oral de PL, PB ou PM alterou fracamente a β-diversidade induzida por Gv. A administração oral de PL aumentou a α-diversidade, enquanto PB e PM não a afetaram. Além disso, PL, PB ou PM administrados por via oral diminuíram as populações induzidas por Gv de Proteobacteria e Actinobacteria, incluindo Propionibacteriaceae, Enterobacteriaceae e Bacillaceae, que foram positivamente correlacionadas com os níveis de expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL na vagina e osso, níveis de expressão de TNF-α e IL-6 no cólon e hipocampo, e comportamento semelhante a DC (Fig. 4e–g). PL, PB e PM aumentaram as populações de Morganellaceae e Acetobacteriaceae suprimidas por Gv, que foram negativamente correlacionadas com os níveis de expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL.
Efeitos de PL, PB e PM na disbiose vaginal e intestinal induzida por infecção vaginal por Gv em camundongos. Efeitos na composição da microbiota vaginal: (a) nível de filo, (b) nível de família, (c) OTU (α-diversidade), (d) β-diversidade (gráfico de análise de coordenadas principais baseado na análise de Bray–Curtis), análise de rede: (e) microbiota vaginal e peso do fêmur/níveis de expressão de RANK/RANKL/TNF-α/IL-6 e (f) microbiota vaginal e serotonina/TNF-α/IL-6 (cérebro)/CD/IT (comportamentos), e (g) heatmap entre nível de família e níveis de biomarcadores ou comportamentos. Efeitos na composição da microbiota intestinal: (h) nível de filo, (i) nível de família, (j) OTU (α-diversidade), (k) β-diversidade (gráfico PCoA), análise de rede: (l) microbiota intestinal e peso do fêmur/níveis de expressão de RANK/RANKL/TNF-α/IL-6 e (m) microbiota intestinal e serotonina/TNF-α/IL-6 (cérebro)/CD/IT (comportamentos), e (n) heatmap entre nível de família e níveis de biomarcadores ou comportamentos. Nc, solução salina; Gv, 1 × 106 UFC de GV; GPL, Gv + 0.5 × 109 UFC/camundongo de PL; GPB, Gv + 0.5 × 109 UFC/camundongo de PB; GPM, Gv + 0.5 × 109 UFC/camundongo de PL+PB (PM: mistura 4:1). Os dados representam média ± DP (n = 6). Letras diferentes na figura indicam diferenças significativas (p < 0,05).
A infecção vaginal por Gv aumentou a população de Proteobacteria e diminuiu a população de Bacteroidetes na microbiota intestinal (Fig. 4h, i). A infecção vaginal por Gv alterou a diversidade β (PCoA) na microbiota intestinal, enquanto a diversidade α não foi afetada (Fig. 4j, k). No entanto, a administração oral de PL, PB ou PM diminuiu as populações induzidas por Gv de Proteobacteria, incluindo Helicobacteriaceae, Odoribacteriaceae e Ruminococcaceae, que foram positivamente correlacionadas com os níveis de expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL na vagina e no osso, níveis de expressão de TNF-α e IL-6 no cólon e no hipocampo, e comportamento semelhante a DC (Fig. 4l–n). A administração oral de PL, PB ou PM aumentou as populações de Prevotellaceae e Lactobacillaceae suprimidas por Gv, que foram negativamente correlacionadas com a expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL.
PM aliviou osteíte, vaginite, DC, colite e disbiose vaginal e intestinal induzidas por Ov em camundongos
Ov induz a perda óssea desencadeada pela deficiência de estrogênio. Portanto, para entender se Ov poderia induzir vaginite e osteíte, bem como neuroinflamação, e se probióticos poderiam aliviar vaginite, osteíte e neuroinflamação induzidas por Ov, primeiro investigamos os efeitos de PM, uma mistura de PL e PB (1:4), na osteoporose e vaginite em camundongos com Ov (Fig. 5, Suplemento Fig. S5). A administração oral de PM recuperou o peso do fêmur suprimido por Ov, o nível de osteoprotegerina e a população de células positivas para TGF-β, enquanto a expressão de TNF-α, IL-6, MMP2, osteocalcina, RANK, RANKL e TRAP induzida por Ov e as populações de células RANK+, TNF-α+ e TRAP+ diminuíram (Fig. 5a–j).
Efeitos de PM na osteíte/osteólise e vaginite induzidas por Ov em camundongos tratados com antibióticos. Efeito no peso do fêmur (a) e na osteoprotegerina óssea (b), expressão de RANK (c), RANKL (d), TRAP (e), MMP2 (f), osteocalcina (g), TNF-α (h) e IL-6 (i) e nas populações de células coradas com H&E, RANK+, TNF-α+, TGF-β+ e TRAP+ (j), Efeitos no peso do útero (k), expressão de TNF-α (l), IL-6 (m), IL-10 (n) e RANKL (o) e populações de células TNF-α+ (p). Efeito nos níveis sanguíneos de osteocalcina (q) e RANKL (r). Nc, salina; Ov, veículo + Ov; OvPM, Ov + 0,5 × 10^9 UFC/camundongo de PL+PB (PM: mistura 4:1). Os dados indicam média ± DP (n = 6). Letras diferentes na figura indicam diferenças significativas (p < 0,05).
A administração oral de PM aumentou o peso do útero e a expressão de IL-10 suprimidos por OV e diminuiu a expressão de TNF-α, IL-6, RANKL, RANK e osteocalcina induzida por Ov na vagina (Fig. 5k–r). A administração oral de PM diminuiu os níveis sanguíneos de osteocalcina e RANKL induzidos por Ov.
Em seguida, investigamos o efeito da PM sobre o comportamento do tipo DC e inflamação intestinal em camundongos com Ov (Fig. 6, Suplemento Fig. S6). Ov aumentou o comportamento do tipo DC em camundongos: diminuiu o OT no EPMT e o CT no OFT para 20,0% (F[2,15] = 33,42, p < 0,001) e 24,2% (F[2,15] = 13,12, p < 0,001) dos camundongos sham, respectivamente, e aumentou o IT no TST para 169,8% (F[2,15] = 66,02, p < 0,001) dos camundongos sham (Fig. 6a–e). Ov também diminuiu a SA no YMT e a exploração no NORT para 82,8% (F[2,15] = 5,28, p < 0,001) e 68,6% (F[2,15] = 8,33, p < 0,001) do Nc, respectivamente. No entanto, a administração oral de PM aumentou o OT no EPMT e o CT no OFT para 80,6% e 67,9% dos camundongos sham, respectivamente, e diminuiu o IT no TST para 138,0% dos camundongos sham. A PM recuperou a SA e a exploração suprimidas por Ov para 95,8% e 112,3% do Nc, respectivamente.
Efeitos da PM sobre DC e colite induzidas por Ov em camundongos. Efeito sobre o OT no EPMT (a), CD (b) e CT (c) no OFT, alternância espontânea no teste do labirinto em Y (d) e exploração no teste de reconhecimento de novos objetos (e). Efeito sobre a serotonina hipotalâmica (f) e expressão de TNF-α (g), serotonina hipocampal (h) e expressão de TNF-α (i), e populações de células NF-κB+Iba1+ (esquerda) hipotalâmicas e BDNF+NeuN+ (meio) e NF-κB+Iba1+ (direita) hipocampais (j). Efeito sobre a mieloperoxidase (k), expressão de TNF-α (l), IL-6 (m) e IL-10 (n) e populações de células NF-κB+CD11c+ (o) no cólon. Nc, salina; Ov, veículo + Ov; OvPM, Ov + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PL+PB (PM: mistura 4:1). Os dados indicam média ± DP (n = 6). Letras diferentes na figura indicam diferenças significativas (p < 0,05).
A PM aumentou a serotonina e a expressão de IL-10 e/ou a população de células BDNF+NeuN+ suprimidas por Ov no hipocampo e hipotálamo, enquanto a expressão de TNF-α, IL-6, IFN-γ e IL-17 e a população de células NF-κB+Iba1+ induzidas por Ov diminuíram (Fig. 6f–j).
A PM também suprimiu a expressão de mieloperoxidase, TNF-α e IL-6 e a população de células NF-κB+CD11c+ induzidas por Ov no cólon, enquanto a expressão de IL-10 suprimida por Ov aumentou (Fig. 6k–o).
Investigamos o efeito da PM sobre a composição da microbiota vaginal e intestinal em camundongos com Ov (Fig. 7, Suplemento Fig. S7). Ov aumentou fracamente a população de Actinobacteria, enquanto as populações de Proteobacteria, Firmicutes e Bacteria_uc diminuíram (Fig. 7a, b). Ov não afetou a α-diversidade (OTU) na microbiota vaginal, enquanto a β-diversidade (PCoA) foi deslocada (Fig. 7c, d). No entanto, a administração oral de PM diminuiu as populações de Staphylococcaceae e Aerococcaceae induzidas por Ov, que foram positivamente correlacionadas com TNF-α, IL-6, RANK e RANKL na vagina e osso e com os níveis de expressão de TNF-α e IL-6 no cólon e hipocampo e comportamento do tipo DC (Fig. 7e-g). A PM aumentou a população de Morganellaceae suprimida por Ov, que foi negativamente correlacionada com os níveis de expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL.
Efeito do PM na disbiose vaginal e intestinal induzida por Ov em camundongos. Efeitos na composição da microbiota vaginal: (a) nível de filo, (b) nível de família, (c) OTU (diversidade α), (d) diversidade β (gráfico PCoA), análise de rede: (e) microbiota vaginal e peso do fêmur/níveis de expressão de RANK/RANKL/TNF-α/IL-6 e (f) microbiota vaginal e serotonina/TNF-α/IL-6 (cérebro)/CD/IT (comportamentos), e (g) mapa de calor entre nível de família e níveis de biomarcadores ou comportamentos. Efeitos na composição da microbiota intestinal: (h) nível de filo, (i) nível de família, (j) OTU (diversidade α), (k) diversidade β (gráfico PCoA), análise de rede: (l) microbiota intestinal e peso do fêmur/níveis de expressão de RANK/RANKL/TNF-α/IL-6 e (m) microbiota intestinal e serotonina/TNF-α/IL-6 (cérebro)/CD/IT (comportamentos), e (n) mapa de calor entre nível de família e níveis de biomarcadores ou comportamentos. Nc, solução salina; Ov, veículo + Ov; OvPM, Ov + 0,5 × 10⁹ UFC/camundongo de PL+PB (PM: mistura 4:1). Os dados indicam média ± DP (n = 6). Letras diferentes na figura indicam diferenças significativas (p < 0,05).

Ov diminuiu as populações de Verrucomicrobia e Tenericutes na microbiota intestinal (Fig. 7h, i). Ov alterou a diversidade β (PCoA) na microbiota intestinal, enquanto a diversidade α (OTU) não foi afetada (Fig. 7j, k). No entanto, a administração oral de PM aumentou a população de Verrucomicrobia suprimida por Ov, incluindo Akkermansiaceae, que foi correlacionada negativamente com os níveis de expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL na vagina e no osso, níveis de expressão de TNF-α e IL-6 no cólon e hipocampo, e comportamento semelhante a DC em camundongos com Ov (Figura l-n). PM diminuiu as populações de Helicobacteriaceae e Bacteroidaceae induzidas por Ov, que foram correlacionadas positivamente com os níveis de expressão de TNF-α e IL-6.

PL, PB ou PM administrados por via oral aliviaram a vaginite e osteíte induzidas por oG em camundongos
Também examinamos o efeito de PL, PB e PM na vaginite induzida por oG em camundongos (Fig. 8, Figura Suplementar S8). A administração oral de PL, PB ou PM diminuiu o nível do gene Gv 16S rRNA induzido por oG, a expressão de TNF-α, IL-6 e RANKL, e as populações de células NF-κB+ e TNF-α+ na vagina (Fig. 8a-g). Eles também diminuíram os níveis de RANKL e osteocalcina no sangue induzidos por oG (Fig. 8h, i).

Efeitos de PL, PB e PM na vaginite e osteíte/osteólise induzidas por oG em camundongos. Efeitos no nível de expressão do gene GV 16S rRNA vaginal (a), peso do útero (b), expressão vaginal de TNF-α (c), IL-6 (d), IL-10 (e) e RANKL (f), e populações de células coradas com H&E, NF-κB+ e TNF-α+ (g). Efeito no nível de osteocalcina (h) e RANKL no sangue (i). Efeito no peso do fêmur (j) e nos níveis de expressão de osteoprotegerina (k), RANK (l), RANKL (m), TRAP (n), MMP-2 (o), osteocalcina (p) e TNF-α (q), e populações de células coradas com H&E, RANK+, TNF-α+, TGF-β+ e TRAP+ (r). Nc, solução salina; oG, veículo + oG; oGPL, oG + 0,5 × 10⁹ UFC/camundongo de PL; oGPB, oG + 0,5 × 10⁹ UFC/camundongo de PB; oGPM, oG + 0,5 × 10⁹ UFC/camundongo de PL+PB (PM: mistura 4:1). Os dados indicam média ± DP (n = 6). Letras diferentes na figura indicam diferenças significativas (p < 0,05).
oG também aumentou a expressão de RANK, RANKL, TRAP, MMP2 e osteocalcina e as populações de células RANK+, TRAP+ e TNF-α+ no osso (Fig. 8j-r). No entanto, a administração oral de PL, PB ou PM aumentou as populações de células RANK+, TNF-α+ e TRAP+ induzidas por oG e suprimidas, e a expressão de RANK, RANKL, TRAP, MMP2 e osteocalcina no fêmur, enquanto a expressão de osteoprotegerina suprimida por oG e a população de células positivas para TGF-β aumentaram.

PL, PB e PM aliviaram o comportamento semelhante a DC, a neuroinflamação e a colite induzidos por oG em camundongos
Em seguida, examinamos os efeitos de PL, PB e PM no comportamento semelhante a DC, na neuroinflamação e na colite induzidos por oG em camundongos (Fig. 9, Suplemento Fig. S9). A exposição ao oG aumentou potentemente o comportamento semelhante a DC (Fig. 9a–e). O oG reduziu o OT no EPMT e o CT no OFT para 10,2% (F[4,25] = 18,83, p < 0,0001) e 7,3% (F[4,25] = 13,66, p < 0,0001) dos camundongos sham, respectivamente, e aumentou o IT no TST para 165,2% (F[4,25] = 43,52, p < 0,0001) dos camundongos sham. O oG reduziu o SA no YMT e a exploração no NORT para 56,0% (F[4,25] = 23,16, p < 0,001) e 44,6% (F[4,25] = 19,45, p < 0,001) do Nc, respectivamente. No entanto, a administração oral de PL, PB e PM aumentou o OT no EPMT para 95,4%, 71,8% e 85,3% dos camundongos sham, respectivamente, e o CT no OFT para 78,1%, 65,0% e 67,4% dos camundongos sham, respectivamente, e diminuiu o IT no TST para 111,0%, 127,0% e 121,1% dos camundongos sham, respectivamente. PL, PB e PM aumentaram o SA suprimido por oG para 109,8%, 107,6% e 113,05% dos camundongos sham, respectivamente, e a exploração para 107,7%, 106,3% e 111,5% dos camundongos sham, respectivamente.

Efeitos de PL, PB e PM na DC e colite induzidas por oG em camundongos. Efeito no OT no EPMT (a), CD (b) e CT (c) no OFT, alternância espontânea no teste do labirinto em Y (d) e exploração no teste de reconhecimento de objetos novos (e). Efeito na expressão de serotonina hipotalâmica (f) e TNF-α (g), serotonina hipocampal (h) e TNF-α (i), e populações de células NF-κB+Iba1+ e BDNF+NeuN+ (esquerda) e NF-κB+Iba1+ (direita) no hipocampo (j). Efeito na expressão de mieloperoxidase (k), TNF-α (l), IL-6 (m) e IL-10 (n) e populações de células NF-κB+CD11c+ (o). Nc, salina; oG, veículo + oG; oGPL, oG + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PL; oGPB, oG + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PB; oGPM, oG + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PL+PB (PM: mistura 4:1). Os dados indicam média ± DP (n = 6). Letras diferentes na figura indicam diferenças significativas (p < 0,05).
Eles também aumentaram a expressão de serotonina e/ou IL-10 suprimida por oG no hipocampo e hipotálamo, enquanto a expressão de TNF-α, IFN-γ, IL-6 e IL-17 induzida por oG e a população de células NF-κB+Iba1+ diminuíram (Fig. 9f–j). A expressão de TNF-α e IFN-γ induzida por oG e a população de células NF-κB+Iba1+ no hipocampo e hipotálamo diminuíram, enquanto a expressão de serotonina e IL-10 suprimida por oG e a população de células BDNF+NeuN+ aumentaram. Além disso, a administração oral de PL, PB ou PM diminuiu a expressão de mieloperoxidase, TNF-α e IL-6 induzida por oG e a população de células NF-κB+CD11c+ no cólon, enquanto a expressão de IL-10 aumentou (Fig. 9k–o).
PL, PB e PM aliviaram a disbiose vaginal e intestinal induzida por oG em camundongos
Os efeitos de PL, PB e PM na alteração da microbiota vaginal e intestinal induzida por oG em camundongos foram investigados (Fig. 10, Suplemento Fig. S10). A exposição a oG causou disbiose vaginal: aumentou as populações de Actinobacteria e Proteobacteria na microbiota vaginal (Fig. 10a, b). oG aumentou a α-diversidade e alterou a β-diversidade (PCoA) na microbiota vaginal (Fig. 10c, d). No entanto, a administração oral de PL, PB ou PM diminuiu as populações de Proteobacteria e Actinobacteria induzidas por oG, incluindo Propionibacteriaceae, Paenibacillaceae e Bacillaceae, que estão positivamente correlacionadas com os níveis de expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL na vagina e no osso, níveis de expressão de TNF-α e IL-6 no cólon, hipocampo e hipocampo, e comportamentos do tipo DC (Fig. 10e–g). PL, PB e PM aumentaram as populações de Streptococcaceae e Morganellaceae suprimidas por oG, que estavam positivamente correlacionadas com os níveis de expressão de TNF-α e IL-6.
Efeitos de PL, PB e PM na disbiose vaginal e intestinal induzida por oG em camundongos. Efeitos na composição da microbiota vaginal: (a) nível de filo, (b) nível de família, (c) OTU (α-diversidade), (d) β-diversidade (gráfico PCoA), análise de rede: (e) microbiota vaginal e peso do fêmur/níveis de expressão de RANK/RANKL/TNF-α/IL-6 e (f) microbiota vaginal e serotonina/TNF-α/IL-6 (cérebro)/CD/IT (comportamentos), e (g) mapa de calor entre nível de família e níveis de biomarcadores ou comportamentos. Efeitos na composição da microbiota intestinal: (h) nível de filo, (i) nível de família, (j) OTU (α-diversidade), (k) β-diversidade (gráfico PCoA), análise de rede: (l) microbiota intestinal e peso do fêmur/níveis de expressão de RANK/RANKL/TNF-α/IL-6 e (m) microbiota intestinal e serotonina/TNF-α/IL-6 (cérebro)/CD/IT (comportamentos), e (n) mapa de calor entre nível de família e níveis de biomarcadores ou comportamentos. Nc, salina; oG, veículo + oG; oGPL, oG + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PL; oGPB, oG + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PB; oGPM, oG + 0,5 × 109 UFC/camundongo de PL+PB (PM: mistura 4:1). Os dados indicam média ± DP (n = 6). Letras diferentes na figura indicam diferenças significativas (p < 0,05).
oG aumentou a população de Proteobacteria, incluindo Lachnospiraceae, Helicobcteriaceae e Ruminococcaceae na microbiota intestinal (Fig. 10h, i). Além disso, oG alterou significativamente a β-diversidade (PCoA) na microbiota intestinal, enquanto a α-diversidade não foi afetada (Fig. 10j, k). No entanto, a administração oral de PL, PB ou PM reduziu as populações induzidas por oG de Proteobacteria, incluindo Lachnospiraceae, Helicobcteriaceae e Ruminococcaceae, que foram positivamente correlacionadas com os níveis de expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL na vagina e no osso, os níveis de expressão de TNF-α e IL-6 no cólon e hipocampo, e comportamentos semelhantes a DC (Fig. 10l–n). Eles aumentaram as populações de Lactobacillaceae, Odoribacteriaceae e Acholeplasmataceae suprimidas por oG, que foram negativamente correlacionadas com os níveis de expressão de TNF-α e IL-6.
Discussão
A microbiota vaginal é composta por enormes micróbios contendo Lactobacilos, Actinobactérias, Prevotella, Veillonella, Streptococci, etc. A composição da microbiota é flutuada por fatores intrínsecos e extrínsecos, como menopausa, ciclo menstrual, gravidez, uso de contraceptivos e estresse. A disbiose vaginal induzida por patógenos acelera o crescimento excessivo de patógenos oportunistas residentes na vagina, resultando em vaginose bacteriana e vaginite. No presente estudo, descobrimos que a infecção vaginal por Gv causou vaginite e colite em camundongos: aumentou a expressão de TNF-α e IL-6 na vagina e no cólon. A infecção por Gv também aumentou a expressão de RANKL na vagina. A infecção por Gv causou disbiose vaginal e intestinal: aumentou as populações de Proteobacteria e Actinobacteria na microbiota vaginal e a população de Proteobacteria na microbiota intestinal. A infecção por Gv deteriorou severamente a vaginite e a colite, e a disbiose vaginal e intestinal em camundongos com Ov, que também induziu a expressão de TNF-α e IL-6 na vagina e no cólon. Patógenos infectados vaginalmente causam inflamação sistêmica com vaginite. A inflamação intestinal pode induzir disbiose intestinal. No entanto, a administração oral de PL, PB ou PM suprimiu a expressão de TNF-α, IL-6 e RANKL induzida por Gv na vagina e no cólon. Eles também aliviaram a disbiose vaginal e intestinal induzida por Gv: reduziram a população de Proteobacteria induzida por Gv, particularmente Enterobacteriaceae na vagina e Helicobacteriaceae no cólon. Isso sugere que PL e/ou PB podem melhorar a vaginite, colite e disbiose vaginal induzidas por Gv através do alívio da disbiose intestinal.
A menopausa aumenta o risco de osteoporose, vaginite e distúrbios psiquiátricos, incluindo perda de memória e depressão. A menopausa e a inflamação aumentam a expressão de RANKL e TNF-α, levando à osteoporose. No presente estudo, descobrimos que a Ov aumentou a expressão de TNF-α e RANKL na vagina, sangue e fêmur de camundongos. Curiosamente, a infecção vaginal por Gv isoladamente aumentou a expressão de TNF-α e RANKL na vagina, sangue e fêmur. Além disso, a infecção por Gv aumentou a expressão de TRAP, osteocalcina e MMP2 e as populações de células NF-κB+ e TRAP+ALP+ em camundongos com ou sem Ov, resultando em osteopenia/osteoporose. No entanto, a administração oral de PL, PB ou PM reduziu a expressão de TNF-α, RANKL, TRAP, osteocalcina e MMP2 induzida por Gv e as populações de células NF-κB+ e TRAP+ALP+ em camundongos com ou sem Ov. Além disso, eles aumentaram a expressão de IL-10 e osteoprotegerina e o peso do osso (fêmur). O TNF-α e o RANKL podem causar osteoporose ao induzir a sinalização de NF-κB mediada por RANK. Probióticos, incluindo Lactobacillus reuteri, são relatados por aliviar os sintomas da menopausa. Sapra et al. relataram que B. longum preveniu parcialmente a perda óssea em camundongos com Ov. L. reuteri suprime a reabsorção e perda óssea e modifica as comunidades da microbiota intestinal em camundongos com Ov. L. plantarum NK3 e B. longum NK49, isoladamente e em conjunto, aliviam a vaginite induzida por Gv e a osteoporose induzida por Ov ao suprimir a ativação de NF-κB mediada pela microbiota intestinal. L. rhamnosus HN001 (L1) e L. acidophilus La-14 (L2), e Lactobacillus johnsonii HY7042 aliviam a vaginite induzida por Gv ao regular a ativação de NF-κB. Estes resultados sugerem que PL e/ou PB podem aliviar a vaginite, bem como a osteoporose/osteopenia, ao suprimir a sinalização de NF-κB mediada por RANK/RANKL.
A inflamação intestinal induz neuroinflamação, levando a distúrbios psiquiátricos. No presente estudo, descobrimos que a infecção vaginal por Gv aumentou o comportamento tipo-DC e a expressão de TNF-α e IL-6 e diminuiu a expressão de serotonina e BDNF no hipocampo e hipotálamo. No entanto, a administração oral de PL e/ou PB diminuiu o comportamento tipo-DC, a expressão de TNF-α e IL-6 no hipocampo/hipotálamo e cólon, e a disbiose intestinal em camundongos infectados por Gv com ou sem Ov, enquanto os níveis de serotonina e BDNF no cérebro aumentaram. Bifidobacterium longum NK41 alivia o comprometimento cognitivo e a colite em camundongos com inflamação sistêmica induzida por LPS através da supressão da disbiose intestinal. Muitos probióticos aliviam o comprometimento cognitivo ao regular o eixo microbiota intestinal-cérebro. Estes resultados sugerem que PL, PB e PM podem aliviar a vaginite, colite e DC induzidas por Gv ao suprimir a sinalização de NF-κB mediada pela microbiota vaginal/intestino.
A infecção por Gv causou disbiose vaginal e intestinal, que foi aliviada em camundongos com ou sem Ov pela administração oral de PL, PB ou PM. As populações de Propionibacteriaceae, Enterobacteriaceae e Bacillaceae induzidas por Gv na vagina foram positivamente correlacionadas com os níveis de expressão de TNF-α e IL-6 na vagina, cólon, osso e hipotálamo e com o comportamento do tipo DC. A administração oral de PL, PB ou PM reduziu as populações de Helicobacteriaceae e Ruminococcaceae induzidas por Gv em camundongos com ou sem Ov, que estão positivamente correlacionadas com os níveis de expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL na vagina e no osso e com os níveis de expressão de TNF-α e IL-6 no cólon e hipotálamo e com o comportamento do tipo DC. Eles aumentaram a população de Lactobacillaceae suprimida por Gv, que estava negativamente correlacionada com os níveis de expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL.
Mulheres na menopausa frequentemente experimentam depressão, osteoporose e vaginite bacteriana devido ao hipoestrogenismo e desequilíbrio imunológico. A Ov causa osteoporose através do hipoestrogenismo. A infecção vaginal por Gv causou vaginite, osteoporose, depressão e disbiose vaginal e intestinal, que são sintomas representativos da menopausa. No entanto, os probióticos B. longum, L. reuteri e L. plantarum melhoraram a osteoporose através da regulação do desequilíbrio imunológico. Também descobrimos que PL e PB, isoladamente e em conjunto, aumentaram os níveis de serotonina e BDNF no cérebro e suprimiram a expressão de TNF-α, IL-6, RANK e RANKL na vagina e no osso, TNF-α e IL-6 no cérebro e cólon, e o comportamento do tipo DC em camundongos com ou sem Ov. Eles aliviaram a inflamação sistêmica envolvendo NF-κB em camundongos com ou sem Ov e/ou Gv, modulando a microbiota intestinal e vaginal. O anticorpo anti-RANKL (Denosumabe) alivia a osteoporose e a depressão. O nível de RANK no sangue pode estar positivamente envolvido com sintomas de depressão em pacientes em hemodiálise. Esses resultados sugerem que PL, PB e PM podem aliviar a vaginite, colite, osteoporose e transtorno psiquiátrico (incluindo comprometimento cognitivo e depressão) induzidos por patógenos infectados vaginalmente, suprimindo a sinalização de NF-κB mediada por RANK/RANKL através da regulação da microbiota vaginal e intestinal. Além disso, camundongos infectados vaginalmente com Gv podem ser aplicáveis como um modelo animal com sintomas menopáusicos. No presente estudo, testamos os efeitos de PL e/ou PB vivos contra vaginite, osteoporose e DC in vivo. No entanto, pesquisas futuras são necessárias para examinar se PL morto, PB morto e PL/PB combinados com outros probióticos podem ser eficazes e seus efeitos em camundongos knockout para RANK ou RANKL.
Em conclusão, a infecção vaginal por Gv induziu vaginite e inflamação intestinal em camundongos com ou sem Ov através da indução de disbiose vaginal e intestinal, o que pode induzir osteoporose e DC ativando a sinalização de NF-κB mediada por RANKL/RANK. PL e PB, isoladamente ou em conjunto, podem aliviar os sintomas da menopausa, incluindo vaginite, colite, osteoporose e DC, regulando a sinalização de NF-κB mediada por RANKL/RANK e a microbiota intestinal/vaginal.
Materiais e métodos
Cultura bacteriana
Gardnerella vaginalis KCTC5096 (adquirida da Korean Collection for Type Cultures, Daejeon, Coreia) foi cultivada anaerobicamente em caldo de meio anaeróbico geral (GAM, Nissui Pharm Co, Tóquio, Japão) a 37 °C por 48 h.
Trinta cepas probióticas, incluindo PL (KCCM13222P) e PB (KCCM13223P), selecionadas da coleção de bactérias isoladas de fezes frescas de humanos saudáveis, foram cultivadas em meios gerais para probióticos, como caldo De Man–Rogosa–Sharpe (MRS) (BD, Radnor, PA). As células foram coletadas por centrifugação (5000 g, 20 min) e liofilizadas. Para experimentos in vitro, Gv ou células probióticas liofilizadas foram mantidas por 6 h a 25 °C e suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) esterilizada. Para experimentos in vivo, Gv ou células probióticas liofilizadas foram suspensas em solução salina esterilizada.
Animais
Camundongos fêmeas C57BL/6 (6 semanas de idade para vaginite induzida por Gv e 11 semanas de idade para osteoporose induzida por Ov) foram obtidos da Koatech Inc. (Gyunggi-do, Coreia). Os camundongos foram mantidos em gaiolas de policarbonato com piso de arame elevado em 5 cm a 20–22 °C e umidade de 50 ± 10%, em ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, com ração roedora regular e água ad libitum. Os camundongos foram aclimatados por 1 semana e utilizados nos experimentos. Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Universidade Kyung Hee (IACUC nº KHUASP(SE)-21059) e realizados eticamente de acordo com as Diretrizes do NIH e da Universidade para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e a diretriz ARRIVE.
Macrófagos e diferenciação osteoclastogênica
Macrófagos foram isolados da cavidade peritoneal de camundongos, conforme relatado anteriormente. (1) As células (1 × 10⁶ células por poço) foram tratadas com PL, PB ou suas misturas (4:1, 1:1 e 1:4) (1 × 10⁶ unidades formadoras de colônias [UFC]/mL) na ausência ou presença de Gv (1 × 10⁶ UFC/mL) por 22 h em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma). No sobrenadante, os níveis de TNF-α e IL-6 foram analisados usando kits de ensaio imunoenzimático (ELISA). (2) As células (1 × 10⁶ células por poço) foram semeadas em placas de 24 poços e incubadas em DMEM com 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina e 50 ng/mL de RANKL (Fujifilm, Tóquio, Japão) por 5 dias. Gv (1 × 10⁶ UFC/mL) na ausência ou presença de probióticos (1 × 10⁶ UFC/mL) foi adicionado aos meios, incubado por 5 dias e coletado. O isolamento de mRNA (usando o kit RNeasy Mini, Qiagen) ou a coloração para fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) (usando o kit de dupla coloração TRACP & ALP, TaKaRa) foram realizados de acordo com as instruções do fabricante.
Preparação de camundongos infectados com Gv e/ou ovariectomizados
Para investigar os efeitos de PL, PB e PM (uma mistura de PL e PB [4:1]) contra vaginite, osteoporose (osteíte/osteopenia/osteólise), DC e microbiota intestinal, preparamos camundongos infectados por Gv, ovariectomizados e infectados por Gv e ovariectomizados e, posteriormente, os probióticos foram administrados por gavagem oral, conforme relatado anteriormente. Cada grupo era composto por seis camundongos.

Primeiro, os camundongos foram separados em cinco grupos (Nc, Gv, GPL, GPB e GPM). Camundongos, exceto Nc, foram infectados vaginalmente com Gv (1 × 10⁶ UFC, suspensos em 10 µL de solução salina) uma vez ao dia por 2 dias. Probióticos (Gv, veículo; GPL, 5 × 10⁸ UFC/camundongo de PL; GPB, 5 × 10⁸ UFC/camundongo de PB; GPM, 5 × 10⁸ UFC/camundongo da mistura de PL e PB [4:1] (PM), suspensos em 0,2 mL de solução salina) foram administrados por gavagem oral uma vez ao dia durante 2 semanas, a partir de 2 dias após a infecção final por Gv. Nc foi tratado com solução salina em vez de Gv.

Segundo, os camundongos foram separados em cinco grupos (Sh, oGv, oGPL, oGPB e oGPM). Camundongos oGv, vPL, vPB e vPM foram submetidos à ressecção bilateral dos ovários sob anestesia com isoflurano. O grupo Sh foi operado sem a ressecção dos ovários bilaterais. oGv, oGPL, oGPB e oGPM foram infectados vaginalmente com Gv (1 × 10⁶ UFC, suspensos em 10 µL de solução salina) uma vez ao dia por 2 dias, a partir de 3 dias após a operação. Probióticos (oGv, veículo; oGPL, 5 × 10⁸ UFC/camundongo de PL; oGPB, 5 × 10⁸ UFC/camundongo de PB; oGPM, 5 × 10⁸ UFC/camundongo de PM) foram administrados por gavagem oral uma vez ao dia durante 2 semanas, a partir de 3 dias após a infecção final por Gv. Camundongos Sh foram tratados com solução salina em vez de Gv e probióticos.

Terceiro, os camundongos foram separados em três grupos (Sh, Ov e OvPM). Camundongos Ov e OvPM foram submetidos à ressecção bilateral dos ovários sob anestesia com isoflurano. O grupo Sh foi operado sem a ressecção dos ovários bilaterais. Probióticos (Ov, veículo; OvPM, 5 × 10⁸ UFC/camundongo de PM) foram administrados por gavagem oral uma vez ao dia durante 2 semanas, a partir de 5 dias após a operação. Camundongos Sh foram tratados com solução salina em vez de probióticos.

Tarefas comportamentais

Para o ensaio do comportamento do tipo DC, as tarefas comportamentais foram realizadas em uma sala equipada com uma câmera de gravação e quantificadas usando o software EthoVision XT. O OFT foi realizado em uma câmara (40 × 40 cm; zona central, 20 × 20 cm). O EPMT e o TST foram avaliados no aparato de labirinto em cruz elevado e na borda da mesa, respectivamente, conforme relatado anteriormente. O YMT e o NORT foram realizados em um labirinto horizontal de três braços (40 cm de comprimento e 3 cm de largura com paredes de 12 cm de altura) e em uma caixa de campo aberto (45 × 45 × 45 cm), respectivamente, conforme relatado anteriormente.

Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)

Para o ELISA, tecidos da vagina, cólon, osso, hipocampo e hipotálamo foram homogeneizados e centrifugados (10.000 g, 10 min, 4 °C), conforme relatado anteriormente. No sobrenadante dos homogenatos teciduais, sanguíneos e de culturas celulares, as concentrações de TNF-α, IL-10 e osteocalcina foram medidas usando kits de ELISA (R&D Systems).

Ensaio de cálcio e fosfatase alcalina

Os níveis de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina no sangue foram analisados usando seus kits (Asan Pharm Co., Seul, Coreia).
Coloração por hematoxilina e eosina (H&E), TRAP/ALP e imunofluorescência
Seus cérebros, vaginas e tecidos de camundongos perfundidos transcardiacamente com formaldeído foram coletados, pós-fixados, citoprotegidos, congelados e seccionados, conforme relatado anteriormente. Para a coloração H&E e TRAP/ALP, os cortes foram corados usando um kit de coloração H&E (Agilent Dako) e um kit de coloração TRAP/ALP (Fujifilm Wako Pure Chemical Co.), respectivamente, e observados em microscópio óptico.
Para a coloração por imunofluorescência, os cortes foram incubados com anticorpos primários contra BDNF, NeuN, NF-κB, Iba1, CD11c, TNF-α e/ou RANK por 12 h, tratados com anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor 594 ou Alexa Fluor 488 (1:200, Invitrogen) por 2 h, em seguida corados com 4′,6-diamidino-2-fenilindol, dilactato (DAPI), e observados em microscópio confocal a laser.
Reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR)
O DNA bacteriano foi purificado dos tecidos vaginais usando um QIAamp DNA stool mini kit e QIAamp DNA Microbiome kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) e a análise de qPCR para o gene Gv 16S rRNA foi realizada usando SYBER premix Ex Taq II (TaKaRa, Shiga, Japão).
A condição de ciclagem térmica foi a seguinte: desnaturação inicial a 95°C por 30 s, desnaturação a 95°C por 5 s, anelamento a 63°C por 30 s, extensão a 72°C por 30 s e 35 ciclos. Os níveis populacionais bacterianos foram calculados por comparação com o gene bacteriano 16S rRNA.
Os mRNAs (2 µg) da vagina, cólon, hipocampo, hipotálamo e osso foram isolados usando um kit RNeasy Mini e seus cDNAs foram preparados usando um kit de síntese de cDNA (TaKaRa). A PCR em tempo real para TNF-α, IL-10, RANK, RANKL, osteocalcina, TRAP e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi realizada usando SYBER premix Ex Taq II (TaKaRa). A condição de ciclagem térmica foi a seguinte: desnaturação inicial a 95°C por 30 s, desnaturação a 95°C por 15 s, anelamento a 60°C por 30 s, extensão a 72°C por 30 s e 40 ciclos. Os níveis de expressão gênica foram calculados por comparação com GAPDH. Os primers estão mostrados na Tabela Suplementar S1.
Análise da microbiota vaginal e intestinal
Os DNAs genômicos bacterianos foram extraídos das fezes frescas e fluidos vaginais de camundongos usando um QIAamp DNA stool mini kit (Qiagen) e os genes 16S rRNA foram sequenciados. As leituras sequenciadas foram depositadas no arquivo de leitura curta do NCBI sob o número de acesso 1031006.
Análise do genoma completo
O sequenciamento do genoma completo de PL e PB foi realizado de acordo com o método de Lee et al.. A sequência do genoma de PL (3 contigs) foi obtida usando a plataforma PacBio RSII e a sequência do genoma de PB (10 contigs) foi completamente obtida usando a plataforma PacBio Sequel.
Análise estatística
Todos os valores dos dados experimentais foram descritos como média ± desvio padrão (DP). O valor F resultante e os graus de liberdade para os conjuntos de dados comportamentais de cada experimento foram descritos. A significância foi analisada usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas post hoc de Bonferroni e as diferenças significativas foram indicadas por letras diferentes nas figuras (p < 0,05). A correlação entre a microbiota intestinal ou vaginal e os biomarcadores (análises de rede e heatmap) foi analisada usando o coeficiente de correlação de Spearman.
Material suplementar eletrônico
Abaixo está o link para o material suplementar eletrônico.
Abreviações
ANOVA
Análise de variância de uma via
BDNF
Fator neurotrófico derivado do cérebro
CD
Distância percorrida na área central
CT
Tempo gasto na área central
CFU
Unidade formadora de colônia
DC
Depressão e comprometimento cognitivo
ELISA
Ensaio de imunoadsorção enzimática
EPMT
Teste do labirinto em cruz elevado
Gv
Gardnerella vaginalis
IL
Interleucina
NeuN
Antígeno nuclear neuronal
OFT
Teste do campo aberto
oG
Ov e Gv
OT
Tempo gasto no braço aberto
Ov
Ovariectomia
PB
Bifidobacterium bifidum P45
PL
Lactococcus lactis P32
PM
Mistura de PL e PB (4:1)
RANK
Ativador do receptor do fator nuclear κB
RANKL
Ligante de RANK
TGF
Fator de transformação do crescimento
TNF
Fator de necrose tumoral
SA
Alternância espontânea
SD
Desvio padrão
TST
Teste de suspensão pela cauda
YMT
Teste do labirinto em Y
NORT
Teste de reconhecimento de objetos novos
Nota da editora
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Contribuições dos autores
YJS e DHK escreveram o texto principal do manuscrito. YJS e XM prepararam as Figs. 1, 2 e 5, e 8. YJS, XM, MKJ, JSB prepararam as Figs. 3 e 6, e 9. YJS preparou as Figs. 4 e 7, e 10. Todos os autores revisaram o manuscrito.
Financiamento
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Segurança de Alimentos e Medicamentos (22203MFDS539) financiado pelo Instituto de Desenvolvimento da Indústria Saudável da Coreia e pelo Programa de Pesquisa Médica (2017R1A5A2014768) através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo Ministério da Ciência e TIC, Coreia.
Disponibilidade dos dados
Todos os dados que apoiam nossas descobertas podem ser encontrados no artigo principal ou nos arquivos suplementares. Os dados de sequenciamento estão disponíveis através do número de acesso do archive de leituras curtas do NCBI 1031006.
Declarações
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Referências
Alterações hormonais na transição da menopausa
A perimenopausa na vida da mulher: Uma fase inflamatória sistêmica que possibilita doença neurodegenerativa posterior
O aumento da inflamação vascular em mulheres no início da menopausa está associado à gravidade dos fogachos
Efeitos do envelhecimento e da menopausa nos níveis séricos de interleucina-6 e na produção de citocinas por células mononucleares do sangue periférico em mulheres saudáveis não obesas
Regulação da osteoclastogênese mediada por NF-κB
O fator de necrose tumoral alfa (TNF) estimula a osteoclastogênese induzida por RANKL através do acoplamento das vias de sinalização do receptor de TNF tipo 1 e RANK
TNF-α contribui para a osteoporose pós-menopausa ao promover sinergicamente a formação de osteoclastos induzida por RANKL
A infecção por Porphyromonas gingivalis aumenta a reabsorção óssea osteoclástica e a formação óssea osteoblástica em um modelo de periodontite em camundongos
Porphyromonas gingivalis estimula a reabsorção óssea ao aumentar o RANKL (ligante do receptor ativador do NF-κB) através da ativação do receptor toll-like 2 em osteoblastos
Gardnerella vaginalis como causa da vaginose bacteriana: Avaliação das evidências de modelos in vivo
Papel da Gardnerella vaginalis na patogênese da vaginose bacteriana: Um modelo conceitual
Prevalência de vaginose bacteriana e Candida entre mulheres na pós-menopausa nos Estados Unidos
Prevalência de vaginite inespecífica e correlação com o isolamento de Gardnerella vaginalis em pacientes ambulatoriais italianas
Probióticos e imunidade
Probióticos para o tratamento de sintomas depressivos: Um mecanismo anti-inflamatório?
Mecanismos de ação dos probióticos
Jang, S. E. et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 e Lactobacillus acidophilus La-14 atenuam a vaginose bacteriana infectada por Gardnerella vaginalis em camundongos. Nutrients9. 10.3390/nu9060531 (2017).
Lactobacillus plantarum NK3 e Bifidobacterium longum NK49 aliviam a vaginose bacteriana e a osteoporose em camundongos ao suprimir a expressão de TNF-α ligada ao NF-κB
Collins, F. L., Rios-Arce, N. D., Schepper, J. D., Parameswaran, N. & McCabe, L. R. O potencial dos probióticos como terapia para a osteoporose. Microbiol. Spectr.510.1128/microbiolspec.BAD-0015-2016 (2017).
Osteoporose pós-menopausa e probióticos
Lactobacillus reuteri 6475 aumenta a densidade óssea em fêmeas intactas apenas sob um contexto inflamatório
Lactobacillus reuteri reduz a perda óssea em mulheres idosas com baixa densidade mineral óssea: Um ensaio clínico randomizado, controlado por placebo, duplo-cego
Eficácia e segurança de um produto medicinal vaginal contendo três cepas de bactérias probióticas: Um ensaio multicêntrico, randomizado, duplo-cego e controlado por placebo
Probióticos e prebióticos: Algum papel nas doenças relacionadas à menopausa?
Depressão: Um grande fator de risco não reconhecido para a osteoporose?
A deficiência de estrogênio induz perda óssea através da microbiota intestinal
Holdcroft, A. M., Ireland, D. J. & Payne, M. S. O microbioma vaginal na saúde e na doença - qual o papel das práticas comuns de higiene íntima? Microorganisms11. 10.3390/microorganisms11020298 (2023).
O microbioma vaginal feminino na saúde e na vaginose bacteriana
Microbiota na saúde vaginal e patogênese de infecções vulvovaginais recorrentes: Uma revisão crítica
Agentes hormonais para o tratamento da depressão associada à menopausa
TNF-α e RANKL promovem a osteoclastogênese ao regular positivamente RANK através da via NF-κB
Bifidobacterium longum melhora a perda óssea induzida por ovariectomia ao potencializar o potencial anti-osteoclastogênico e imunomodulador das células B reguladoras (Bregs)
O tratamento probiótico com L. reuteri previne a perda óssea em um modelo de camundongo ovariectomizado na menopausa
Craig, C. F. et al. Neuroinflamação como um gatilho etiológico para depressão comórbida com doença inflamatória intestinal. J. Neuroinflammation1910.1186/s12974-021-02354-1 (2022).
Inflamação gastrointestinal por distúrbio da microbiota intestinal induz comprometimento de memória em camundongos
Lactobacillus mucosae e Bifidobacterium longum aliviam sinergicamente a ansiedade/depressão induzida por estresse de imobilização em camundongos ao suprimir a disbiose intestinal
Probióticos modulam o eixo microbiota-intestino-cérebro e melhoram déficits de memória em camundongos SAMP8 envelhecidos
Síndrome geniturinária da menopausa
Síndrome pós-menopausa
Menopausa transicional versus cirúrgica em um modelo roedor: etiologia da perda de hormônios ovarianos impacta a memória e o sistema colinérgico
Efeitos benéficos do anticorpo anti-RANKL no fenótipo semelhante à depressão, marcadores ósseos inflamatórios e densidade mineral óssea em camundongos machos suscetíveis após estresse crônico de derrota social
Efeito do RANKL em sintomas depressivos mais baixos em pacientes em hemodiálise
Diretrizes ARRIVE 2.0: diretrizes atualizadas para relatar pesquisas com animais
Lactobacillus johnsonii HY7042 melhora a vaginose induzida por Gardnerella vaginalis ao matar Gardnerella vaginalis e inibir a ativação de NF-κB
Joo, M. K. et al. Enterococcus mundtii derivado de paciente e seus polissacarídeos capsulares causam depressão através da regulação negativa da expressão de serotonina e BDNF envolvendo NF-κB. Microbes Infect. 105116 10.1016/j.micinf.2023.105116 (2023).
Yoo, J. W. et al. O alívio da depressão e colite induzidas pela microbiota intestinal em camundongos por probióticos anti-inflamatórios NK151, NK173 e NK175. Nutrients14. 10.3390/nu14102080 (2022).
Alívio do comprometimento cognitivo pela supressão da produção de lipopolissacarídeos da microbiota intestinal por Lactobacillus plantarum e Bifidobacterium longum em camundongos
Enterococcus faecium e Pediococcus acidilactici deterioram a depressão e colite induzidas por Enterobacteriaceae em camundongos
A vesícula extracelular do micróbio intestinal Paenalcaligenes hominis é um fator de risco para comprometimento cognitivo mediado pelo nervo vago
Interação entre as bactérias intestinais humanas Escherichia coli e Lactobacillus mucosae na ocorrência de distúrbios neuropsiquiátricos em camundongos