pmid: "29302014"
title: "O microbioma comensal está associado à eficácia do anti-PD-1 em pacientes com melanoma metastático."
authors: "Matson V, Fessler J, Bao R, Chongsuwat T, Zha Y, Alegre ML, Luke JJ, Gajewski TF"
journal: "Science (New York, N.Y.)"
pubdate: "2018 Jan 05"
doi: "10.1126/science.aao3290"
source: "PMC Full Text"

O microbioma comensal está associado à eficácia do anti-PD-1 em pacientes com melanoma metastático.

Autores

Matson V, Fessler J, Bao R, Chongsuwat T, Zha Y, Alegre ML, Luke JJ, Gajewski TF

Periodico

Science (New York, N.Y.) (2018 Jan 05)

Conteudo

O microbioma comensal está associado à eficácia do anti-PD-1 em pacientes com melanoma metastático
A imunoterapia baseada em anti-PD-1 teve um grande impacto no tratamento do câncer, mas beneficiou apenas um subconjunto de pacientes. Entre as variáveis que podem contribuir para a heterogeneidade entre pacientes está a composição diferencial do microbioma dos pacientes, que demonstrou afetar a imunidade antitumoral e a eficácia da imunoterapia em modelos pré-clínicos de camundongos. Analisamos amostras basais de fezes de pacientes com melanoma metastático antes do tratamento imunoterápico, por meio de uma integração do sequenciamento do gene 16S rRNA, sequenciamento metagenômico shotgun e reação em cadeia da polimerase quantitativa para bactérias selecionadas. Uma associação significativa foi observada entre a composição microbiana comensal e a resposta clínica. Espécies bacterianas mais abundantes nos respondedores incluíram Bifidobacterium longum, Collinsella aerofaciens e Enterococcus faecium. A reconstituição de camundongos livres de germes com material fecal de pacientes respondedores pode levar a um melhor controle tumoral, respostas aumentadas de células T e maior eficácia da terapia anti-PD-L1. Nossos resultados sugerem que o microbioma comensal pode ter um impacto mecanístico na imunidade antitumoral em pacientes humanos com câncer.
A eficácia terapêutica das imunoterapias direcionadas à interação PD-1/PD-L1 é favorecida em pacientes que apresentam evidências de um microambiente tumoral inflamado por células T na linha de base. Portanto, fatores do hospedeiro e do tumor que regulam a magnitude da ativação imune endógena e da infiltração de células T no microambiente tumoral estão sendo buscados como uma oportunidade para expandir ainda mais a eficácia terapêutica. Estudos pré-clínicos indicaram que a composição do microbioma comensal poderia exercer uma influência importante; camundongos com microbiota favorável apresentaram atividade terapêutica muito maior do tratamento anti-PD-L1 do que camundongos com microbioma desfavorável, e esse benefício poderia ser transferido por coabitação ou transplante fecal. Essas observações motivaram uma análise análoga do microbioma humano em relação à eficácia terapêutica do anti-PD-1 em pacientes com câncer.
Para avaliar se a composição bacteriana comensal pode estar associada à eficácia clínica da imunoterapia com bloqueio de PD-1, amostras fecais foram coletadas de 42 pacientes antes do tratamento como parte de uma análise multidimensional de biomarcadores em melanoma metastático. A maioria dos pacientes recebeu um regime anti-PD-1; quatro pacientes receberam tratamento anti-CTLA-4, mas as conclusões dos dados downstream não mudaram com a remoção desses sujeitos, então eles foram mantidos na análise. A taxa de resposta clínica foi determinada de forma cega em relação aos resultados de biomarcadores usando os Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos (RECIST) versão 1.1. Houve 16 respondedores (daqui em diante, referidos como R) e 26 não respondedores (NR), resultando em uma taxa de resposta de 38%, que está alinhada com dados clínicos publicados da terapia anti-PD-1 em pacientes com melanoma metastático. Não foram observadas diferenças importantes nas características dos pacientes entre R e NR, exceto uma diferença limítrofe no histórico de tabagismo prévio (mas não atual) (tabela S1).

Para determinar se a composição da microbiota comensal está associada à resposta clínica, integramos três métodos para identificação bacteriana baseada em sequência de DNA (fig. S1A). Primeiro, usando sequenciamento de amplicon do gene 16S RNA ribossômico (rRNA), identificamos unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com atribuição taxonômica presente em abundância diferente em R versus NR (tabela S2). Usamos uma pesquisa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) das sequências de 16S contra o banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) para revelar potenciais identidades em nível de espécie (tabela S3). Um nível adicional de confiança na identificação de espécies foi obtido ao combinar as OTUs do conjunto de dados de 16S com identidades em nível de espécie reveladas por meio de sequenciamento metagenômico shotgun (tabela S4). Usamos reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa específica para espécies para aquelas espécies candidatas com primers previamente validados (tabela S5). Em comparação com a análise de 16S, o sequenciamento metagenômico produziu um número menor de espécies representadas diferencialmente em R versus NR, que se sobrepuseram aos resultados de 16S (tabela S6). Tratando esses ensaios como uma triagem para maximizar o número de espécies candidatas, usamos o método de sequenciamento de 16S como ponto de partida em nossa análise.
Após remover as OTUs presentes em menos de 10% das amostras, o sequenciamento 16S revelou 62 OTUs de abundância diferente em R versus NR [P < 0,05, não ajustado, teste de permutação com Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME)] (tabela S2). O agrupamento hierárquico das amostras com base na abundância relativa dessas OTUs revelou que a maioria dos pacientes foi agrupada com precisão de acordo com a resposta clínica (fig. S2). O agrupamento dos pacientes dentro de cada grupo clínico é representado na Fig. 1A. Trinta e nove OTUs foram mais abundantes em R, e 23 foram mais abundantes em NR. Uma OTU de Bifidobacteriaceae foi significativamente mais abundante em R, e uma segunda OTU de Bifidobacteriaceae (559527) teve significância limítrofe (P = 0,058, não ajustado) e foi incluída nas análises (total = 63 OTUs). Essa observação recapitula nossos achados anteriores que associaram membros da família Bifidobacteriaceae ao controle tumoral imunomediado melhorado e à eficácia da terapia anti-PD-L1 em camundongos. Uma análise de componentes principais (PCA) das 63 OTUs revelou separação de R de NR (Fig. 1B).

Uma busca BLAST das 63 OTUs contra o banco de dados NCBI de sequências bacterianas retornou, para a maioria das OTUs, múltiplas espécies com ≥98% de identidade (tabela S3). Para obter uma caracterização em nível de espécie mais precisa, as mesmas amostras foram submetidas ao sequenciamento metagenômico shotgun (disponível para 39 das 42 amostras). As leituras pareadas Illumina foram atribuídas a clados microbianos e analisadas quanto às correspondências mais próximas com as 63 OTUs identificadas com o sequenciamento 16S. Possíveis correspondências de espécies foram identificadas para 43 das 63 OTUs originais (tabela S4). Ensaios de PCR quantitativo específicos para espécies foram realizados como uma abordagem adicional para avaliar a identidade das espécies, para as quais estavam disponíveis primers de PCR quantitativo suficientemente validados (tabela S5). Assim, a integração dos três métodos levou à seleção de 10 espécies diferencialmente enriquecidas em R versus NR. Oito destas foram mais abundantes em R—Enterococcus faecium, Collinsella aerofaciens, Bifidobacterium adolescentis, Klebsiella pneumoniae, Veillonella parvula, Parabacteroides merdae, Lactobacillus sp. e Bifidobacterium longum—enquanto duas foram mais abundantes em NR: Ruminococcus obeum e Roseburia intestinalis. Como exemplo, a análise integrativa para B. longum (OTU 559627) é representada na Fig. 2, A a C. Análises de correlação semelhantes para as nove espécies restantes são representadas nas figs. S3 e S4. Os resultados de PCR quantitativo para essas 10 espécies foram integrados em um escore de PCR quantitativo somatório para cada paciente, que foi significativamente maior nos respondedores (P = 0,004) (Fig. 2D).
Esta lista de espécies provavelmente é uma subestimativa do número total de entidades que apresentam abundância diferencial em R versus NR devido ao rigor desta análise composta. Por exemplo, a OTU de Akkermansia muciniphila (185186), em consonância com o estudo de eficácia do anti-PD-1 em cânceres epiteliais por Routy et al., foi detectada por sequenciamento de 16S em quatro pacientes, e todos eram respondedores, mas a análise estatística da coorte inteira é limitada pelo número de amostras acima do limiar de detecção. Como uma forma alternativa de representar os dados agregados para o desenvolvimento de um biomarcador preditivo candidato, os números totais de OTUs potencialmente “benéficas” e “não benéficas” foram pontuados para cada paciente (fig. S5), e uma razão foi calculada. Quando plotada contra a variação absoluta no tamanho do tumor avaliada pelo RECIST, uma correlação clara foi observada, de modo que pacientes com uma razão superior a 1,5 apresentaram resposta clínica (Fig. 2E). Esses resultados sugerem que a composição da microbiota comensal pode ser útil como biomarcador para prever a resposta à terapia de bloqueio de checkpoint, o que motivou a comparação com outros biomarcadores preditivos candidatos. Amostras de tumores pré-tratamento arquivadas que passaram no controle de qualidade estavam disponíveis para 15 pacientes (5 R, 10 NR). A composição microbiana permaneceu significativamente diferente em R versus NR para este subconjunto (P < 0,01) (fig. S6, A e B). O sequenciamento do exoma seguido pela enumeração de mutações somáticas não sinônimas mostrou uma tendência de maior frequência em R, assim como os níveis de mRNA de PD-L1 e PD-1 (fig. S6, C a E) e a enumeração de células T CD8+ basais por meio de imuno-histoquímica (fig. S6F). Embora essas tendências não tenham atingido o nível de significância estatística de 0,05, provavelmente limitadas pelo tamanho da amostra, os parâmetros da microbiota ainda separaram marcadamente respondedores e não respondedores.
A forte correlação entre bactérias comensais e resposta clínica à imunoterapia sugeriu um efeito causal potencial, à luz de dados demonstrando um impacto imunoestimulante do microbioma em modelos de tumores de camundongos (). Para investigar a capacidade de micróbios comensais humanos de potencializar respostas de células T antitumorais, usamos camundongos livres de germes (GF) como receptores. Nós relatamos anteriormente que o controle tumoral imune-mediado espontâneo em camundongos Taconic poderia ser melhorado por meio de transferência de microbiota fecal de camundongos obtidos de um fornecedor diferente, o Jackson Laboratories. Ao montar o modelo atual, descobrimos que o crescimento do tumor de melanoma B16.SIY em camundongos GF era semelhante ao de camundongos específicos livres de patógenos (SPF) (ambos da Taconic), e a colonização de camundongos GF com fezes de camundongos SPF Taconic não afetou essa taxa de crescimento basal (fig. S8).

Esses resultados sugerem uma redução do controle tumoral imune-mediado espontâneo inerente aos camundongos GF, o que os torna receptores adequados para microbiota derivada de humanos, com uma oportunidade de detectar imunidade antitumoral melhorada dependendo da composição microbiana.

Material fecal foi transferido de três R e três NR para coortes de camundongos GF (Fig. 1A e figs. S2, S5 e S7), seguido pela implantação de células de melanoma B16.SIY duas semanas depois. Os grupos de camundongos colonizados com microbiota humana se segregaram em dois fenótipos em relação à taxa de crescimento tumoral: (i) um grupo de crescimento mais rápido e (ii) um grupo de crescimento mais lento (Fig. 3A).

Dois dos três coortes de camundongos reconstituídos com material fecal de R tiveram crescimento tumoral basal mais lento, e dois dos três coortes reconstituídos de NR mostraram crescimento tumoral basal mais rápido. Assim, a capacidade da microbiota humana de suportar um melhor controle tumoral em camundongos geralmente, mas nem sempre, acompanhou a resposta clínica ao anti–PD-1 observada no paciente doador.

Alcançar um crescimento tumoral mais lento apenas com o transplante fecal é semelhante a estudos anteriores com camundongos, nos quais a transferência de fezes de Jackson para camundongos Taconic foi suficiente para um efeito terapêutico parcial devido a um microbioma mais favorável.
A composição dos táxons bacterianos que reconstituíram com sucesso camundongos e a fidelidade ao doador humano original foram avaliadas por sequenciamento de amplicons do gene 16S rRNA. Os grupos C e D, que não apresentaram o mesmo padrão de controle tumoral que o desfecho terapêutico nos doadores humanos originais, mostraram um grande grau de diferença na composição da microbiota em relação aos doadores humanos originais (fig. S9). Em concordância, um índice de dissimilaridade binário de Bray-Curtis para cada par doador/receptor foi mais alto, em 0,7, para as coortes C e D, versus 0,5 a 0,6 para o restante dos grupos. Concluímos que, embora a reconstituição de camundongos GF com material fecal humano frequentemente recapitula a composição microbiana e o fenótipo do doador humano, em alguns casos há um alto grau de deriva, de modo que algumas bactérias se expandem e outras se contraem em um grau suficiente para alterar o fenótipo. No entanto, para os camundongos GF reconstituídos que realmente recapitulam o desfecho clínico do doador original, este sistema modelo pode ser útil para o isolamento final de bactérias específicas que regulam a imunidade antitumoral in vivo.

Focamos nos grupos de camundongos A e B para estudos mecanísticos adicionais. Houve um alto nível de consistência entre experimentos repetidos, tanto em relação à taxa de crescimento tumoral quanto à colonização microbiana (Fig. 3B, comparações A1 versus A2 e B1 versus B2). Para determinar se a diferença no controle tumoral poderia ser atribuída à imunidade do hospedeiro, foi realizado o ensaio ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot) de interferon-γ (IFN-γ) em esplenócitos estimulados ex vivo com SIY, indicando um aumento na frequência de células T ativadas de camundongos reconstituídos com microbiota R 3 semanas após a inoculação com células de melanoma B16.SIY (Fig. 3C). A análise do microambiente tumoral também mostrou um número significativamente maior de células T CD8+ específicas para SIY, mas não de células T reguladoras FoxP3+CD4+, nesses camundongos (Fig. 3, D e E), o que é consistente com um aumento da ativação de células T CD8+ específicas para antígeno tumoral. O anti-PD-L1 foi marcadamente eficaz em camundongos colonizados com microbiota R, mas completamente ineficaz em camundongos derivados de NR (Fig. 3F), demonstrando um impacto profundo da microbiota comensal na eficácia da imunoterapia in vivo. A análise do DNA fecal desses camundongos por meio de PCR quantitativo recapitulou os resultados de nossa análise de pacientes. Das reações de PCR validadas em pacientes, seis foram observadas em camundongos reconstituídos, com o mesmo padrão de enriquecimento observado em pacientes (Fig. 2G).
Juntos, nossos dados sugerem que a composição da microbiota comensal em pacientes está associada à eficácia terapêutica do anticorpo monoclonal (mAb) anti–PD-1. Embora o B. longum tenha sido um comensal identificado no presente estudo que também havia sido encontrado em modelos murinos associado a um melhor controle tumoral mediado pelo sistema imunológico, parece provável que múltiplas bactérias específicas possam contribuir para a melhora da imunidade antitumoral em pacientes. Além do painel de bactérias super-representadas em respondedores, várias OTUs foram super-representadas em não respondedores, e trabalhos anteriores em camundongos indicaram que alguns comensais têm potencial para serem imunoinibidores — por exemplo, através da indução de células T reguladoras FoxP3+ (). Além disso, nossa coorte atual sugeriu que uma razão entre OTUs “benéficas” e OTUs “não benéficas” foi o preditor mais forte de resposta clínica. Isso pode indicar que uma maior frequência de bactérias benéficas, juntamente com uma menor frequência de bactérias de impacto negativo, pode se combinar para o desfecho clínico mais favorável.

Várias das espécies bacterianas identificadas no presente estudo como diferencialmente abundantes em pacientes respondedores versus não respondedores foram examinadas anteriormente quanto ao impacto mecanístico nas respostas imunes do hospedeiro em camundongos GF in vivo. A monocolonização com várias espécies encontradas em maior frequência em nossos respondedores — incluindo E.faecium, C. aerofaciens, B. adolescentis e P. merdae — foi relatada como resultando em uma frequência diminuída de células T reguladoras do cólon derivadas de forma periférica em comparação com outras espécies bacterianas. Uma frequência aumentada de células dendríticas (DCs) da linhagem Batf3 e maiores respostas de células T helper 1 (TH1) também foram encontradas com bactérias atualmente identificadas como mais abundantes em respondedores. A diminuição das células T reguladoras, o aumento das DCs Batf3 e as respostas TH1 aumentadas seriam todas esperadas para melhorar o controle tumoral mediado pelo sistema imunológico. Embora se deva ter cautela ao extrapolar esses resultados no contexto de uma microbiota complexa, os dados sugerem que as bactérias associadas a pacientes respondedores podem ter um efeito distinto sobre a imunidade inata e adaptativa, tanto local quanto sistemicamente.

Dois estudos adicionais identificaram uma associação do microbioma comensal com a eficácia do mAb anti–PD-1 em diferentes cânceres sólidos. Nossas abordagens diferem no método de segregação dos pacientes entre os grupos R e NR e em alguns métodos de análise. Portanto, a comparação direta da microbiota comensal diferencialmente enriquecida em pacientes R e NR entre as publicações deve ser abordada com cautela. No entanto, há concordância em relação a um impacto mecanístico do microbioma na eficácia da imunoterapia anti–PD-1, pois a transferência fecal de camundongos GF de pacientes R versus NR também foi capaz de recapitular o fenótipo do paciente.
Além do microbioma, é evidente que outros fatores tumorais e do hospedeiro podem afetar a eficácia da imunidade antitumoral e da imunoterapia contra o câncer. A ativação intrínseca ao tumor da via Wnt/β-catenina e a deleção ou mutação de Pten demonstraram levar a uma infiltração deficiente de células T no microambiente tumoral e resistência à imunoterapia com bloqueio de checkpoint. Polimorfismos germinativos em genes reguladores imunológicos também têm potencial para influenciar a magnitude das respostas de células T antitumorais espontâneas. Nossos resultados descritos aqui abrem o caminho para integrar a composição microbiana comensal, juntamente com a genômica tumoral e a genética germinativa, em um modelo multiparamétrico com o qual maximizar a capacidade de prever quais pacientes provavelmente responderão a imunoterapias, como anti-PD-1.

Material Suplementar

REFERÊNCIAS E NOTAS

Comunidades microbianas comensais distintas em pacientes respondedores e não respondedores ao anti-PD-1, avaliadas por sequenciamento de amplicons do gene 16S rRNA.
(A) Abundância relativa de táxons diferencialmente abundantes em respondedores versus não respondedores; 62 OTUs foram identificadas como diferentes com P < 0,05 (não ajustado, teste de permutação). Uma OTU adicional 559527 (seta) identificada como Bifidobacteriaceae se aproximou da significância (P = 0,058). O agrupamento hierárquico das amostras foi realizado dentro de cada grupo clínico. Amostras individuais são organizadas em colunas, rotuladas com o número de identificação do paciente. Asteriscos indicam amostras usadas em experimentos in vivo adicionais. O ID das OTUs montadas de novo (novas OTUs de referência limpas selecionadas com QIIME) foi abreviado para mostrar apenas os dígitos identificadores individuais, e os IDs completos das OTUs são fornecidos na tabela S4. (B) PCA da abundância relativa das 63 OTUs mostradas na Fig. 1A.

Identificação de espécies bacterianas comensais associadas à resposta clínica do paciente à terapia anti-PD-1.
(A) Coeficientes de correlação de Spearman entre as abundâncias relativas da OTU 559527 de Bifidobacteriaceae do conjunto de dados de 16S e as identidades em nível de espécie sugeridas pelo sequenciamento shotgun. As espécies perfiladas com sequenciamento shotgun foram comparadas com a taxonomia das OTUs geradas a partir do sequenciamento de 16S em nível de família. (B) Correlação de Spearman entre a abundância da OTU 559527 do conjunto de dados de 16S e B. longum identificada por meio de análise de sequenciamento metagenômico shotgun (esquerda) e PCR quantitativo (direita). A faixa sombreada indica o intervalo de confiança (IC) de 95% dos valores ajustados por regressão linear. (C) Abundância relativa em respondedores (R) versus não respondedores (NR) da OTU 559527 (sequenciamento de 16S; esquerda), B. longum (sequenciamento shotgun; meio) e B. longum (PCR quantitativo; direita). LD, limite de detecção. (D) Escore de PCR quantitativo representando dados agregados para as abundâncias relativas de 10 espécies correlacionadas a OTUs com abundância diferencial em R versus NR. O teste de Wilcoxon-Mann-Whitney (não paramétrico) foi utilizado para comparar o escore de PCR quantitativo entre os grupos R e NR. (E) Razão entre o número de OTUs benéficas e não benéficas para cada paciente versus a alteração agregada na medida do tumor do paciente pelo RECIST. As linhas tracejadas marcam RECIST% = −30 e razão = 1,5. Apenas as 43 OTUs de 16S confirmadas com sequenciamento metagenômico shotgun foram incluídas. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.
As comunidades comensais humanas modulam a imunidade antitumoral em um modelo de melanoma em camundongos.
Camundongos GF receberam por gavagem material fecal de três doadores respondedores (P28, P34 e P09) e três não respondedores (P06, P21 e P11). (A) O melanoma B16.SIY foi injetado por via subcutânea 2 semanas após a gavagem; os dados de crescimento tumoral são de um (grupos C, D, E e F) ou dois experimentos (grupos A e B) com 7 a 11 camundongos por grupo por experimento. As barras de erro representam média + EPM. (B) Abundância relativa de 207 OTUs de doadores pacientes que colonizaram camundongos e foram diferencialmente abundantes entre grupos de crescimento tumoral lento e rápido. As colunas representam camundongos individuais organizados nos grupos A a F. Os grupos A1, B1, A2 e B2 são de dois experimentos duplicados independentes. As linhas indicam OTUs individuais com correspondência exata de ID de referência entre os conjuntos de dados de 16S rRNA humano e de camundongo. (C) Nos grupos A e B, a ativação ex vivo de esplenócitos pelo peptídeo SIY foi medida por ELISPOT de IFN-γ 3 semanas após a injeção do tumor. (D e E) Linfócitos T CD8+ específicos para SIY infiltrantes do tumor (D) e linfócitos T reguladores FoxP3+ (E) foram enumerados por citometria de fluxo. (F) A eficácia da terapia anti-PD-L1 foi determinada nos grupos A e B. Os dados são de um experimento com 7 ou 8 camundongos por grupo. (G) Abundância relativa nos grupos de camundongos A e B de espécies-chave validadas para pontuação por PCR quantitativo. Seis das 10 espécies são mostradas que deram sinais de PCR positivos. As quatro espécies restantes estavam ausentes desses grupos receptores específicos. As curvas de crescimento tumoral foram analisadas por análise de variância de dois fatores com teste post-hoc de comparações múltiplas de Tukey; os dados de citometria de fluxo e PCR quantitativo foram analisados pelo teste de Wilcoxon-Mann-Whitney (não paramétrico). P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.