pmid: "32354259"
title: "Ácidos Graxos de Cadeia Curta Derivados da Microbiota Intestinal Promovem a Recuperação Pós-AVC em Camundongos Idosos."
authors: "Lee J, d'Aigle J, Atadja L, Quaicoe V, Honarpisheh P, Ganesh BP, Hassan A, Graf J, Petrosino J, Putluri N, Zhu L, Durgan DJ, Bryan RM, McCullough LD, Venna VR"
journal: "Circulation research"
pubdate: "2020 Jul 31"
doi: "10.1161/CIRCRESAHA.119.316448"
source: "PMC Full Text"

Ácidos Graxos de Cadeia Curta Derivados da Microbiota Intestinal Promovem a Recuperação Pós-AVC em Camundongos Idosos.

Autores

Lee J, d'Aigle J, Atadja L, Quaicoe V, Honarpisheh P, Ganesh BP, Hassan A, Graf J, Petrosino J, Putluri N, Zhu L, Durgan DJ, Bryan RM, McCullough LD, Venna VR

Periodico

Circulation research (2020 Jul 31)

Conteudo

Ácidos Graxos de Cadeia Curta Derivados da Microbiota Intestinal Promovem a Recuperação Pós-AVC em Camundongos Idosos

Justificativa:
Os idosos apresentam respostas sistêmicas profundas após o AVC, que contribuem para maior mortalidade e incapacidade de longo prazo mais grave. Estudos recentes revelaram que os desfechos do AVC podem ser influenciados pela composição do microbioma intestinal. No entanto, os benefícios potenciais da manipulação do microbioma intestinal após a lesão são desconhecidos.

Objetivo:
Para determinar se a restauração da microbiota intestinal jovem após o AVC auxilia na recuperação de indivíduos idosos, alteramos o microbioma intestinal por meio de gavagem de transplante fecal jovem (FTG jovem) em camundongos idosos após AVC experimental. Além disso, o efeito do enriquecimento direto de bactérias seletivas produtoras de ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs) foi testado como uma terapia microbiana mais direcionada e refinada.

Métodos e Resultados:
Camundongos machos idosos (18–20 meses) foram submetidos a AVC isquêmico por oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Realizamos FTG três dias após a MCAO usando bioma de doador jovem (2–3 meses) ou bioma idoso (18–20 meses). No dia 14 após o AVC, camundongos idosos com AVC que receberam FTG jovem apresentaram menor comprometimento comportamental e inflamação reduzida no cérebro e no intestino. Com base em dados de sequenciamento microbiano e análise metabolômica demonstrando que os transplantes fecais jovens continham níveis muito mais elevados de AGCCs e cepas bacterianas relacionadas, selecionamos quatro produtores de AGCC (Bifidobacterium longum, Clostridium symbiosum, Faecalibacterium prausnitzii e Lactobacillus fermentum) para transplante. Esses produtores de AGCC aliviaram os déficits neurológicos e a inflamação pós-AVC, e elevaram as concentrações de AGCC no intestino, cérebro e plasma de camundongos idosos com AVC.

Conclusões:
Este é o primeiro estudo sugerindo que a recuperação deficiente do AVC em camundongos idosos pode ser revertida por meio da "bacterioterapia pós-AVC" após a reposição do microbioma intestinal jovem através da modulação dos perfis imunológico, microbiano e metabolômico no hospedeiro.

Resumo Gráfico
O AVC isquêmico é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em idosos. Estudos recentes enfatizaram a importância de compreender a comunicação cruzada entre a microbiota, o intestino e o cérebro no AVC. Aqui, manipulamos a microbiota intestinal após o AVC para testar nossa hipótese de que o rejuvenescimento da microbiota intestinal, mesmo em um momento tardio após o AVC, melhoraria a recuperação funcional em animais idosos. A restauração pós-AVC da microbiota jovem em camundongos idosos usando gavagem de transplante fecal de camundongos doadores jovens (FTG jovem) melhorou a recuperação comportamental. O FTG jovem aumentou a integridade intestinal e conferiu um fenótipo protetor tanto nas células T do intestino quanto do cérebro, refletido pelo aumento de células T reguladoras (Treg). Curiosamente, o FTG jovem reduziu a IL-17 pró-inflamatória nas células T γδ do cérebro. Para testar se os efeitos benéficos do FTG jovem são mediados por ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs), transplantamos uma combinação de quatro cepas bacterianas produtoras de AGCC. O transplante de produtores de AGCC em combinação com inulina reduziu significativamente o comprometimento funcional e a neuroinflamação em camundongos idosos receptores com AVC. O enriquecimento do intestino com produtores de AGCC aumentou os níveis de AGCC no cérebro e no plasma. Esta é a primeira demonstração de que a “bacterioterapia” é uma opção de tratamento pós-AVC viável em idosos.
INTRODUÇÃO
A recente demonstração de comunicações bidirecionais entre o cérebro e o intestino abriu novas áreas de investigação para o AVC e outras doenças neurológicas. Essa comunicação bidirecional, denominada eixo microbiota-intestino-cérebro (MIC), fornece novas vias tanto para a prevenção quanto para o tratamento do AVC. Após o AVC, as comunicações do cérebro para o intestino (sinalização de cima para baixo) através do eixo MIC provavelmente ocorrem por meio de fibras eferentes simpáticas e parassimpáticas que inervam o intestino direta ou indiretamente através do sistema nervoso entérico. Embora o mecanismo exato não seja bem compreendido, é cada vez mais evidente que o AVC altera a motilidade intestinal, aumenta a permeabilidade intestinal, ativa células imunes residentes no intestino e desloca o microbioma intestinal para um estado mais tóxico, um estado que designamos como disbiótico.
Um microbioma intestinal disbiótico, por sua vez, parece comunicar-se ao cérebro através do eixo MGB (sinalização de baixo para cima) para exacerbar os efeitos prejudiciais do acidente vascular cerebral (AVC). Essa sinalização de baixo para cima provavelmente envolve a migração de células pró-inflamatórias do intestino para o cérebro via sangue. Outros mecanismos potenciais para sinalizar o cérebro incluem redes parassimpáticas e sensoriais aferentes originadas no intestino, ou por bactérias, toxinas bacterianas ou metabólitos bacterianos que ganham acesso ao sangue através de uma barreira intestinal rompida. Independentemente dos mecanismos de sinalização para a comunicação bidirecional do MGB, acredita-se que ocorra um mecanismo feedforward onde o cérebro do AVC é responsável pela disbiose intestinal e inflamação intestinal, e subsequentemente a disbiose intestinal retroalimenta para promover neuroinflamação após o AVC. Esse ciclo prejudica a recuperação uma vez que ocorreu um AVC.

Interferir nesse ciclo alterando o microbioma intestinal através de gavagem de transplante fecal (FTG) ou antibióticos antes ou no momento do AVC experimental pode afetar significativamente a recuperação. No entanto, não se sabe se um FTG anti-inflamatório é eficaz em melhorar o desfecho quando realizado horas a dias após o AVC, um momento em que a janela crítica para outros tratamentos já passou. Se a alteração pós-AVC no microbioma intestinal fosse eficaz, então indivíduos que não possuem um microbioma intestinal saudável ou anti-inflamatório no momento do AVC poderiam se beneficiar da terapia. O estudo do AVC e do microbioma intestinal é especialmente significativo em idosos, uma população que está em risco de AVC. Os desfechos após o AVC também são piores em camundongos idosos em comparação com camundongos jovens. Complicando ainda mais as coisas, o envelhecimento por si só é acompanhado por disbiose intestinal. Assim, é importante realizar estudos em animais idosos para direcionar essas condições mais relevantes para a população humana com AVC. Para tanto, realizamos todos os estudos em camundongos idosos (18–20 meses). Diante do exposto, testamos a hipótese de que microbiota menos tóxica de camundongos jovens poderia melhorar os desfechos em camundongos idosos, mesmo quando o FTG é atrasado por três dias após o AVC experimental.

Um segundo componente deste estudo investiga bactérias produtoras de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e os AGCC que elas produzem. Os AGCC, que são gerados por bactérias que metabolizam fibras não digeríveis no intestino, servem para estabilizar o intestino através da ativação de receptores acoplados à proteína G e inibição de histonas desacetilases. Mostramos anteriormente que os AGCC fecais diminuem ~70% em camundongos idosos e nas fezes de camundongos jovens após FTG com uma suspensão fecal de camundongos idosos. Portanto, testamos a hipótese de que poderíamos restaurar as concentrações de AGCC através de probióticos e prebióticos e melhorar os desfechos em camundongos idosos após AVC experimental.

MÉTODOS
Os dados que apoiam as descobertas deste estudo estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável. Métodos detalhados estão disponíveis no Suplemento de Dados Online.
RESULTADOS
Perfis bacterianos intestinais em camundongos receptores idosos com AVC replicam o perfil do doador.
Camundongos machos idosos (18–20 meses) foram submetidos a uma oclusão transitória da artéria cerebral média (MCAO) de 60 minutos e receberam estreptomicina (Abx) por gavagem durante dois dias consecutivos. Nos dias 3 e 4 após o AVC (dias 1 e 2 após o tratamento com Abx), microbiota fecal fresca de camundongos jovens sem AVC (2–3 meses; FTG jovem) ou camundongos idosos sem AVC (18–20 meses; FTG idoso) foi transplantada por gavagem oral. Antibióticos foram usados para reduzir a carga bacteriana, permitindo uma colonização mais eficiente das bactérias recém-introduzidas (P=0,0002; Figura Online I). Testes comportamentais foram realizados nos dias 3, 7 e 14 após o AVC.

Primeiro, perfilamos a composição bacteriana intestinal após ambos os FTGs usando sequenciamento do rRNA 16S. A análise de efeito de tamanho discriminante linear (LEfSe) revelou que a composição da microbiota intestinal entre camundongos doadores jovens e idosos apresentou diferenças significativas, conforme mostrado no cladograma (Figura 1A). Além disso, descobrimos que membros de Bifidobacteriaceae, uma família da classe Actinobacteria (por exemplo, Bifidobacterium e Bifidobacteriaceae), e membros de Clostridiaceae, uma família da classe Clostridia (por exemplo, Clostridium e Clostridiaceae), estavam enriquecidos na microbiota jovem. Importante, dados incluindo gráficos de análise de coordenadas principais (PCoA) em UniFrac não ponderado e ponderado revelaram que o microbioma dos camundongos receptores transplantados refletiu o microbioma dos doadores 10–11 dias após o FTG [Figura 1B (P=0,042 para UniFrac não ponderado e P=0,007 para UniFrac ponderado) e 1C]; enquanto o FTG sem antibióticos não afetou os perfis da microbiota intestinal nos camundongos receptores (Figura Online I). Camundongos idosos com AVC colonizados com microbioma jovem continham abundâncias menores de Bacteroides e Prevotella, potenciais patobiontes, em comparação com aqueles que receberam FTG idoso por gavagem (Figura Online I).

A restauração pós-AVC da microbiota jovem melhora a recuperação comportamental em camundongos idosos independentemente do tamanho do infarto.
Para avaliar o impacto de uma microbiota intestinal jovem, primeiro avaliamos as alterações fisiológicas em camundongos receptores idosos enxertados com FTG jovem ou idoso até o dia 14 após o AVC (Figura 2A). Pacientes com AVC e camundongos após MCAO experimentam alterações fisiológicas, como perda de peso. Os camundongos do nosso estudo perderam peso (11%) até o dia 3 após o AVC. No dia 14 após a MCAO, camundongos idosos com biome jovem apresentaram recuperação ao peso corporal pré-AVC (3% de ganho de peso), enquanto os camundongos com FTG idoso não retornaram ao peso corporal original após 14 dias (Figura 2B). No entanto, nenhuma diferença estatística entre os grupos foi observada.
Para testar se um microbioma jovem melhora os desfechos após acidente vascular cerebral (AVC) em camundongos idosos, realizamos uma bateria de testes comportamentais, incluindo: (1) teste de campo aberto (OFT) para atividade locomotora espontânea; (2) teste de reconhecimento de novo objeto (NORT) para função cognitiva; (3) teste de suspensão pela cauda (TST) para fenótipos depressivos pós-AVC; (4) teste de suspensão em arame para força de preensão; e (5) escore de déficit neurológico (NDS) como medida dos déficits gerais pós-AVC. No 14º dia após o AVC, não observamos diferença significativa no NDS ou no teste de suspensão em arame entre os grupos (Figura Online II). No entanto, camundongos idosos com AVC que receberam FTG jovem demonstraram melhora na atividade locomotora no OFT (P=0,0265; Figura 2C) e melhor cognição pós-AVC no NORT (P=0,0022; Figura 2D) em comparação com camundongos idosos que receberam FTG idosa. Determinamos ainda o efeito do FTG sobre os fenótipos depressivos pós-AVC, que é uma comorbidade psiquiátrica comum após o AVC. Curiosamente, o microbioma jovem reduziu significativamente a imobilidade no TST, o que sugere um efeito antidepressivo (P=0,0386; Figura 2E). Importante, não houve diferença significativa no dano por infarto, medido pela atrofia cerebral aos 14 dias pós-AVC, entre o grupo transplantado com microbioma jovem (19,7±3,1%) em comparação com camundongos com FTG idosa (20,3±2,5%) (Figura Online II). Esses achados demonstram que a melhora nos desfechos do AVC observada em camundongos idosos com FTG jovem, em termos de atividade (OFT), memória (NORT) e comportamento do tipo depressivo (TST), é independente do tamanho do infarto.
O FTG jovem pós-AVC confere um fenótipo protetor nas células T intestinais e melhora a integridade intestinal.
No intestino, os micróbios moldam o sistema imunológico local comunicando-se com vários tipos de linfócitos T, especialmente as células T reguladoras (Treg) encontradas na lâmina própria (LP) intestinal, que são anti-inflamatórias e suprimem respostas imunológicas. Para determinar se o microbioma transplantado externamente pode modular as células Treg intestinais, analisamos primeiro a LP do intestino delgado (ID) e do intestino grosso (IG) após o FTG em camundongos com AVC. A análise por citometria de fluxo revelou que camundongos idosos com AVC que receberam FTG jovem não apresentaram diferença estatística significativa na frequência de células T CD4+ na LP do ID ou do IG. No entanto, descobrimos que o FTG jovem aumentou significativamente as células Treg CD4+Foxp3+ na LP do ID (P=0,0362), mas não na LP do IG, em comparação com camundongos idosos com AVC que receberam FTG idosa (Figura 3A e 3B). Os níveis de células T CD3+ (linhagem de células T), células T citotóxicas CD8+, células B CD19+, células natural killer NK1.1+, células Th17 e células T γδ não diferiram entre os grupos de FTG jovem e idoso (Figura Online III). Esses dados indicam que as células T intestinais em camundongos idosos com AVC adquiriram um fenótipo regulador após a introdução de microbiota jovem por meio do FTG.
Em seguida, buscamos elucidar as interações entre o microbioma transplantado e a camada de células epiteliais intestinais em camundongos idosos com AVC, uma vez que essa camada está em contato com a microbiota luminal. No intestino, essas camadas epiteliais mantêm a homeostase e desempenham um papel central na inflamação, permitindo que as células imunes do hospedeiro interajam com a microbiota no lúmen. A camada de muco, uma rede protetora semelhante a um polímero formada por mucinas (Muc) produzidas por células caliciformes, cobre o epitélio intestinal para proteger o hospedeiro. A coloração histoquímica com azul alciano e ácido periódico-Schiff (AB-PAS) mostrou que o FTG jovem aumentou o número de células caliciformes maduras nas criptas superiores, que produzem mucinas no intestino grosso (IG) (P=0,0138; Figura 3C). Além disso, descobrimos que a integridade da barreira intestinal no 14º dia pós-AVC foi maior em camundongos com FTG jovem em comparação com FTG idoso, conforme refletido pela diminuição do efluxo de dextrana marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) circulante (P=0,0131; Figura 3D). Em seguida, isolamos células epiteliais (CEs) do IG de camundongos que receberam FTG de doadores jovens e idosos. Examinamos a expressão gênica de mucinas investigando Muc2 e Muc4, responsáveis pelas camadas interna e externa do muco. Em comparação com camundongos idosos com AVC que receberam FTG idoso, camundongos idosos com AVC com FTG jovem apresentaram um nível significativamente maior de expressão de Muc2 (aumento de 3,4 vezes, P=0,0286) e Muc4 (aumento de 44,8 vezes, P=0,0286) (Figura 3E). Em seguida, examinamos as alterações nos peptídeos antimicrobianos epiteliais (AMPs), uma vez que o material fecal transplantado, incluindo potenciais patógenos, pode provocar respostas imunes indesejadas no epitélio do hospedeiro. Isolamos CEs do IG e testamos a expressão gênica das proteínas AMPs específicas da família da proteína regeneradora derivada de ilhotas (Reg), Reg3β e Reg3γ. Não observamos diferença significativa na expressão gênica de Reg3 entre os grupos FTG jovem e idoso (Figura 3E). Em conjunto, esses dados sugerem que o transplante de FTG jovem foi protetor tanto no intestino delgado (ID) quanto no IG de animais idosos após o AVC.
O FTG jovem pós-AVC aumenta as células Treg e diminui as células γδ T IL-17+ no cérebro idoso.
Em seguida, investigamos se o FTG jovem pode alterar as populações de células Treg no cérebro idoso após o AVC, o que observamos no ID. Curiosamente, a análise por citometria de fluxo mostrou que o FTG jovem aumenta significativamente a expressão de Foxp3 em células T CD4+ no hemisfério ipsilateral do AVC de camundongos idosos com AVC em comparação com os grupos FTG idoso (P=0,0190; Figura 4A e 4B). Esses dados indicam um papel potencial do microbioma jovem na regulação da neuroinflamação após o AVC em camundongos idosos.
Um estudo recente mostrou que as meninges contêm um repertório de células imunes, especialmente células γδ T, que estão envolvidas na inflamação cerebral induzida por AVC. As células γδ T desempenham um papel fundamental no agravamento da lesão após isquemia cerebral, secretando IL-17. Assim, perguntamos se o FTG alterava as células γδ T no cérebro após o AVC. No dia 14 após o AVC (ou seja, dia 10 pós-FTG), não observamos qualquer diferença na frequência de células γδ T (CD45highCD11b−TCRβ−TCRγδ+) no hemisfério ipsilateral do AVC de camundongos idosos com AVC que receberam FTG jovem, em comparação com camundongos idosos com AVC que receberam FTG idoso (Figura 4C e 4D). No entanto, a expressão proteica de IL-17 nas células γδ T (CD45highCD11b−TCRβ−TCRγδ+IL-17+) foi menor em camundongos idosos com AVC com FTG jovem em comparação com camundongos idosos tratados com FTG idoso (2,6 vezes, P=0,0301; Figura 4E). Não foram observadas diferenças significativas na frequência de outras células cerebrais, incluindo micróglia (células CD45intCD11b+) e células da linhagem mieloide (células CD45+CD11bhigh) (Figura Online IV). No entanto, a análise de imuno-histoquímica revelou a redução da ativação microglial, ou seja, diminuição de Iba1 e aumento da expressão de P2RY12, no grupo FTG jovem em comparação com os cérebros de camundongos tratados com FTG idoso (Figura Online IV). A sensibilidade observada da expressão de P2RY12 em nossos grupos FTG jovem e idoso é consistente com estudos anteriores que relatam uma regulação negativa de P2RY12 por micróglia ativada em resposta a vários modelos de lesão do sistema nervoso central em camundongos e humanos. Investigações futuras serão necessárias para elucidar os mecanismos moleculares que medeiam os efeitos do microbioma envelhecido na expressão de P2RY12 pela micróglia. Em conjunto, nossos dados apoiam que os efeitos benéficos do FTG jovem em camundongos idosos com AVC são mediados por mecanismos periféricos (isto é, relacionados ao intestino) e pela modulação da imunidade central, regulando a resposta inflamatória no cérebro.
Gavagem oral pós-AVC com produtores de SCFA melhora a recuperação em camundongos idosos.
Com base em nossas descobertas anteriores mostrando que o pré-tratamento com biome jovem contendo níveis mais altos de SCFA contribui para melhores desfechos de AVC em camundongos receptores em comparação com um biome idoso com menos SCFA, levantamos a hipótese de que aumentar os SCFA após o AVC poderia melhorar a recuperação. Para esse fim, primeiro determinamos se os SCFA diferiam nas amostras fecais usadas para FTG neste estudo. Medimos as concentrações fecais de SCFA em camundongos jovens ingênuos (2–3 meses) e camundongos idosos (18–20 meses) e avaliamos as concentrações de metabólitos primários, incluindo acetato, propionato e butirato. A análise por espectrometria de massa revelou uma relação inversa entre envelhecimento e concentrações de SCFA: a quantidade de alguns SCFA fecais, incluindo acetato (P=0,0010), propionato (P=0,0002) e butirato (P=0,0133), diminuiu significativamente com a idade (Figura 5A). Esses dados nos levaram a testar se o aumento de bactérias produtoras de SCFA seletivas (produtoras de SCFA) poderia ser uma opção de tratamento viável pós-AVC para reduzir os déficits funcionais em camundongos idosos.
Para aumentar as concentrações de SCFA, tratamos camundongos pós-AVC com um prebiótico (inulina) e um coquetel de quatro cepas bacterianas primárias produtoras de SCFA (Bifidobacterium longum, Clostridium symbiosum, Faecalibacterium prausnitzii e Lactobacillus fermentum). Notavelmente, dois gêneros, Bifidobacterium e Clostridium, foram identificados como uma assinatura microbiana para o microbioma jovem, em comparação com o microbioma envelhecido (Figura 1A). A inulina, uma fibra solúvel que pode chegar ao cólon em estado intacto devido à sua resistência à degradação enzimática no trato gastrointestinal superior e no intestino delgado, é um substrato que suporta a produção aumentada de SCFA pelas bactérias mencionadas. Empregamos um protocolo semelhante (Figura 5B) ao usado nos estudos de FTG (Figura 2A).

Para testar nossa hipótese, primeiro examinamos os efeitos da inulina e dos produtores de SCFA nos resultados comportamentais após o AVC, usando quatro grupos separados de camundongos tratados com: 1) veículo (meio de cultura estéril), 2) apenas inulina, 3) apenas produtores de SCFA e 4) a combinação de inulina + produtores de SCFA. Camundongos envelhecidos com AVC tratados com inulina + produtores de SCFA apresentaram escores de déficit neurológico significativamente melhorados no dia 14 pós-AVC em comparação com os animais controle tratados com veículo (P = 0,0016; Figura 5C). Além disso, este grupo de camundongos apresentou melhorias significativas na coordenação motora e força no teste de barra (hangwire test), quando comparado aos controles com veículo (P = 0,0016; Figura 5D). Semelhante ao efeito observado após o FTG jovem, os produtores de SCFA com inulina tiveram um efeito antidepressivo significativo em camundongos envelhecidos com AVC (P = 0,0486; Figura 5E). Curiosamente, não encontramos benefícios comportamentais significativos em camundongos envelhecidos com AVC tratados apenas com inulina ou apenas com bactérias, sugerindo um efeito sinérgico da inulina com as bactérias.

As células T γδ produtoras de IL-17+ no cérebro são reduzidas em camundongos envelhecidos com AVC tratados com produtores de SCFA e inulina.

Em seguida, avaliamos se a gavagem oral com produtores de SCFA e inulina teve um efeito anti-inflamatório semelhante no cérebro de camundongos envelhecidos com AVC ao observado em camundongos jovens tratados com FTG. Focamos na alteração nas células T γδ produtoras de IL-17+ e analisamos as células imunes do cérebro usando citometria de fluxo com a mesma estratégia de seleção (gating) usada no estudo de FTG (Figura 4C e 6A). Curiosamente, descobrimos que o tratamento com bactérias e inulina reduziu significativamente as células T γδ produtoras de IL-17+, mas não as células T γδ, no dia 14 pós-AVC (Figura 6B a 6D). A atrofia cerebral aos 14 dias após o AVC não foi diferente entre os grupos (19,2% vs. 16,1%, dados não mostrados).

O aumento dos SCFAs intestinais altera os perfis de SCFA sistêmicos e cerebrais em camundongos envelhecidos com AVC.
Nós levantamos a hipótese de que as cepas bacterianas benéficas contribuíram diretamente para a manutenção da integridade intestinal. Camundongos tratados com bactérias produtoras de SCFA e inulina apresentaram um perfil anatômico mais saudável em comparação com a lesão intestinal induzida por AVC que ocorre na ausência de bactérias produtoras de SCFA (Figura Online V). Em seguida, testamos se os SCFAs poderiam estimular as ECs, incluindo células caliciformes, a sintetizar mucinas protetoras. A imuno-histoquímica para proteínas Muc2 mostrou que camundongos idosos com AVC que receberam produtores de SCFA e inulina apresentaram expressão significativamente aumentada das proteínas Muc2 nas células caliciformes do intestino grosso (LI), ao longo do revestimento epitelial nas criptas, em comparação com o grupo tratado com veículo (P=0,0339; Figura Online V).

Por fim, perfilamos as alterações nos SCFAs no intestino de camundongos idosos com AVC que receberam produtores de SCFA e inulina por meio de análise metabolômica de amostras fecais. Os principais metabólitos que aumentaram neste grupo foram acetato (P=1.2E-08), propionato (P=0.0003), butirato (P=0.0140), isobutirato (P=0.0033) e 2-metilbutirato (P=8.9E-06), quando comparados ao grupo veículo (Figura 7). Além disso, conforme mostrado na Figura Online VI, o tratamento com bactérias produtoras de SCFA e inulina aumentou as concentrações fecais de valerato (P=0.0205), isovalerato (P=0.0071), 3-metilvalerato (P=0.0003), caproato (P=2.0E-09) e isocaproato (P=0.0003). Assim, questionamos se esse aumento nos SCFAs intestinais pode resultar em um aumento concomitante dos níveis de SCFAs no cérebro e no sangue circulante. Surpreendentemente, os camundongos que apresentaram aumento de SCFAs fecais tinham níveis significativamente mais altos de acetato (P=0.0212), butirato (P=5.3E-05), isobutirato (P=0.0025), 2-metilbutirato (P=0.0025), valerato (P=0.0004), isovalerato (P=0.0025), 3-metilvalerato (P=0.0177), caproato (P=0.0019) e isocaproato (P=0.0248) no cérebro (Figura 7 e Figura Online VI). No plasma dos mesmos camundongos, as concentrações de acetato (P=0.0203), propionato (P=0.0246), butirato (P=0.0003), 2-metilbutirato (P=0.0059), isovalerato (P=0.0037), 3-metilvalerato (P=0.0093) e caproato (P=0.0140) foram maiores no grupo tratado com bactérias em comparação ao grupo veículo (Figura 7 e Figura Online VI). Em conjunto, isso sugere que os SCFAs podem ser o componente chave do microbioma jovem que beneficia a recuperação pós-AVC em camundongos idosos.

DISCUSSÃO
Neste estudo, determinamos que o TMF da microbiota jovem melhorou significativamente os desfechos em camundongos idosos, mesmo quando o TMF foi realizado vários dias após o acidente vascular cerebral experimental. Essa proteção está relacionada ao aumento da integridade da barreira intestinal e à atenuação da resposta inflamatória tanto no intestino quanto no cérebro. Uma diminuição nos AGCCs derivados de bactérias no microbioma envelhecido é, em parte, responsável pelo estado imunológico aumentado e pelos piores desfechos após o AVC observados em camundongos idosos. Apoiando essa ideia está a descoberta de que os desfechos do AVC melhoraram significativamente após os AGCCs serem restaurados aos níveis observados no microbioma jovem, usando bactérias produtoras de AGCCs (probióticos) e uma fonte de alimento (prebiótico) para essas bactérias. De forma significativa, esses efeitos nos desfechos não estavam relacionados à idade cronológica dos camundongos, mas sim à "idade" do microbioma.

Descobrimos que o transplante de microbiota jovem em camundongos idosos após o AVC teve vários efeitos benéficos na recuperação comportamental. Importante, para controlar os volumes do infarto entre os grupos, atrasamos a alteração da composição da microbiota até 72 horas após o AVC, momento em que o infarto histológico está maduro neste modelo. Essa estratégia abordou especificamente os efeitos na recuperação. Nossos dados mostraram que esses efeitos benéficos do TMF jovem foram independentes do volume do infarto, uma vez que não foram observadas diferenças no tamanho do infarto entre os grupos de TMF no 14º dia pós-AVC. Em segundo lugar, a toxicidade de um microbioma envelhecido está relacionada a uma resposta imunológica aumentada do hospedeiro. Sabe-se que os micróbios intestinais programam as células T CD4+ para se diferenciarem em células T reguladoras (Treg) anti-inflamatórias ou células T efetoras pró-inflamatórias. Em nosso estudo, um bioma jovem aumentou a frequência de células Treg intestinais em comparação com um microbioma envelhecido 14 dias após o AVC.
Uma descoberta importante deste estudo é a redução das células T γδ IL-17+ no cérebro observada após o transplante de microbiota fecal (FTG) de camundongos jovens em camundongos idosos após o acidente vascular cerebral (AVC). As células T γδ produtoras de IL-17 de origem intestinal, presentes nas meninges, têm sido implicadas na gravidade do desfecho do AVC. Elas normalmente estão presentes em pequeno número no sangue circulante e representam de 3 a 5% de todos os linfócitos T circulantes. As células T γδ também ocupam nichos altamente singulares tanto na imunidade inata quanto na adaptativa; elas respondem a perturbações mais cedo do que outros tipos de células T, como as células T αβ, pois não requerem ativação específica do receptor de células T (TCR). Notavelmente, camundongos idosos que receberam FTG jovem apresentaram uma diminuição significativa das células T γδ IL-17+ no cérebro após o AVC, indicando uma atenuação da inflamação cerebral. Não observamos uma redução nas células T γδ pró-inflamatórias no intestino após o AVC, o que foi relatado anteriormente em camundongos jovens. Essa discrepância possivelmente se deve à diferença de idade dos camundongos utilizados neste estudo. Vale ressaltar que demonstramos que o envelhecimento altera significativamente a resposta imune ao AVC. Em conclusão, esses dados fornecem uma prova de conceito de que a modulação do intestino envelhecido por meio do transplante de microbiota jovem pode melhorar tanto a saúde intestinal quanto a cerebral.

O epitélio intestinal consiste em uma única camada de células epiteliais (CEs) responsáveis pela imunidade e homeostase da mucosa, desempenhando um papel integral no diálogo com bactérias e antígenos luminais. As células caliciformes são uma população celular única no epitélio e produzem exclusivamente mucinas no lado apical do intestino, formando uma barreira física entre o lúmen e os tecidos do hospedeiro. É importante destacar que o envelhecimento está associado à produção alterada de muco. Nossa descoberta anterior também mostrou os efeitos negativos da idade na permeabilidade intestinal e no desfecho do AVC. Uma descoberta intrigante neste estudo foi que a reposição do bioma jovem restaurou a capacidade de camundongos idosos de aumentar a expressão dos genes de mucina, Muc2 e Muc4, nas CEs do intestino grosso. Assim, a restauração das mucinas com probióticos seria uma opção terapêutica promissora em outras doenças relacionadas à idade para proteger contra desafios bacterianos.
Uma diminuição nos SCFAs derivados de bactérias no microbioma envelhecido parece ser pelo menos parcialmente responsável pelo estado imune aumentado e maus desfechos após o AVC. A conversão de ambientes luminais por antibióticos e componentes dietéticos (ex., fibra não digerível) em metabólitos é um fator importante na imunidade da mucosa e na homeostase geral do intestino. Uma classe desses metabólitos críticos é os SCFAs, moléculas protetoras que estão diminuídas em camundongos idosos ou camundongos jovens com um microbioma envelhecido. Assim, optamos por investigar os SCFAs derivados do microbioma como um mecanismo potencial pelo qual o bioma jovem melhora a recuperação após o AVC em camundongos idosos. Sabe-se que os SCFAs e vários outros metabólitos são difíceis de detectar pelos ensaios de triagem metabólica imparciais atualmente disponíveis, mas a análise de metabolômica direcionada por LC-MS pode medir com precisão as alterações nas concentrações de SCFAs. Empregamos metabolômica direcionada por LC-MS para analisar os principais SCFAs, butirato, propionato e acetato, e descobrimos que as concentrações desses SCFAs estavam significativamente reduzidas com a idade. Isso é consistente com estudos clínicos que mostram uma diminuição nos níveis de acetato em amostras fecais de pacientes com AVC. Em seguida, determinamos se o aumento exógeno de SCFAs replicaria os benefícios observados em camundongos idosos que receberam transplantes de bioma jovem. Para avaliar os efeitos dos SCFAs na recuperação, transplantamos um coquetel de probióticos produtores de SCFAs, B. longum, C. symbiosum, F. prausnitzii e L. fermentum e inulina em camundongos idosos três dias após o AVC e os comparamos com controles que receberam meio de cultura e inulina ou apenas produtores de SCFAs. Os SCFAs atuam localmente na camada mucosa para manter a função intestinal e a integridade da barreira, aumentar a camada protetora de muco, alterar populações de linfócitos T, modular a secreção de anticorpos e podem potencialmente ter acesso à circulação sistêmica para modular a secreção de citocinas. Sabe-se também que os SCFAs regulam o tráfego de leucócitos do intestino para tecidos extra-intestinais, ex., a úvea. Eles foram relatados como controladores da função e maturação da microglia cerebral e são instrumentais no desenvolvimento e manutenção da barreira hematoencefálica. Além disso, um estudo recente mostrou que os SCFAs, ex., ácido propiônico, desempenham um papel imunomodulador potente na esclerose múltipla, regulando o equilíbrio das células T.
Descobrimos que os AGCCs estavam aumentados no intestino com inulina + bactérias, e melhoraram o dano intestinal induzido pelo AVC ao estimular as CE a produzir mucina, que sustenta a função de barreira intestinal. De forma importante, transplantar bactérias com seu substrato, inulina, em camundongos idosos com AVC foi suficiente para melhorar os déficits neurológicos, a função motora, a força de preensão e os fenótipos depressivos quando comparado a camundongos tratados apenas com inulina, apenas com produtores de AGCCs ou veículo. Isso sugere que fornecer às bactérias um substrato apropriado é necessário para melhorar a recuperação comportamental. Notavelmente, isso indica ainda que as bactérias recém-introduzidas são viáveis nos camundongos receptores e são capazes de metabolizar a inulina. Em seguida, testamos se as bactérias do intestino também podem alterar os níveis cerebrais de AGCCs. Surpreendentemente, encontramos um aumento em vários AGCCs tanto no cérebro quanto no plasma de camundongos após gavagem de produtores de AGCCs com inulina. Curiosamente, foi descoberto recentemente que a administração intraperitoneal de nanopartículas lipossomais encapsuladas com acetato protegeu ratos do AVC isquêmico. Essa estratégia permite uma meia-vida mais longa, já que o acetato, assim como outros AGCCs, tem meia-vida curta no sangue. Nossa abordagem, que substituiu as bactérias por produtores de AGCCs e forneceu a elas o substrato necessário para produzir AGCCs, é provavelmente uma abordagem mais translacional para aumentar a durabilidade da produção desses metabólitos benéficos. Uma limitação dos estudos de microbioma baseados em laboratório é que todos os camundongos são criados em um ambiente limpo e rigorosamente controlado; seu microbioma pode não representar com precisão a diversidade de micróbios intestinais observada em animais selvagens. Outra limitação é que, embora tenhamos realizado ajuste de testes múltiplos para comparações post-hoc entre grupos, não ajustamos para todo o conjunto do trabalho, pois este foi um estudo exploratório.
Em conclusão, nossos achados demonstram que a restauração de um microbioma intestinal jovem, mesmo dias após o acidente vascular cerebral (AVC), pode reduzir a inflamação e melhorar a recuperação do AVC em animais idosos. Isso é mediado em grande parte por metabólitos produzidos por bactérias, especificamente os ácidos graxos de cadeia curta (AGCCs). Nosso estudo apoia fortemente a ideia de que direcionar a "sinalização de baixo para cima" (intestino para o cérebro) pode melhorar a recuperação pós-AVC em indivíduos idosos. Nossos resultados indicam que o rejuvenescimento pós-AVC do microbioma intestinal em camundongos idosos melhora dramaticamente a integridade intestinal e aumenta a imunidade do hospedeiro. Finalmente, os efeitos benéficos dos AGCCs/probióticos podem ter benefício direto em outros modelos de lesão neuronal aguda. Este estudo fornece, portanto, a primeira evidência experimental direta de que a composição da microbiota pode ser explorada terapeuticamente para melhorar a recuperação após o AVC.
Material Suplementar
DIVULGAÇÕES
Nenhuma.
MATERIAIS SUPLEMENTARES
Materiais e Métodos Expandidos
Figuras Online I – VI
Tabela Online I
Referências
Abreviaturas e Acrônimos Não Padronizados:
AMP
peptídeo antimicrobiano
EC
célula epitelial
FTG
gavagem de transplante fecal
LEfSe
tamanho do efeito da análise discriminante linear
LI
intestino grosso
LP
lâmina própria
MCAO
oclusão da artéria cerebral média
MGB
microbiota-intestino-cérebro
Muc
mucina
NDS
escore de déficit neurológico
NORT
teste de reconhecimento de objeto novo
OFT
teste de campo aberto
PCoA
análise de coordenadas principais
Reg
família de proteínas derivadas de ilhotas regeneradoras
SCFA
ácido graxo de cadeia curta
SI
intestino delgado
Treg
célula T reguladora
TST
teste de suspensão pela cauda
REFERÊNCIAS
O AVC isquêmico induz permeabilidade intestinal e aumenta a translocação bacteriana levando à sepse em camundongos idosos
A microbiota comensal afeta o resultado do AVC isquêmico regulando as células γδt intestinais
A disbiose da microbiota controla a resposta neuroinflamatória após o AVC
Mudanças relacionadas à idade na microbiota intestinal influenciam a inflamação sistêmica e o resultado do AVC
Translocação e disseminação de bactérias comensais na infecção pós-AVC
Uma visão sobre a ruptura da microbiota da mucosa intestinal após o AVC
Examinando o papel do eixo microbiota-intestino-cérebro no AVC
Resultado e fatores de risco apresentados em pacientes idosos acima de 80 anos versus pacientes mais jovens após AVC isquêmico
Resultado do AVC naqueles com mais de 80 anos
Da fibra alimentar à fisiologia do hospedeiro: Ácidos graxos de cadeia curta como metabólitos bacterianos chave
Ácidos graxos de cadeia curta microbianos e regulação da pressão arterial
Flora fecal anaeróbica gram-negativa em pacientes com doença de Crohn e indivíduos saudáveis
A microflora associada à mucosa retal em pacientes com colite ulcerativa
Interpretando prevotella e bacteroides como biomarcadores de dieta e estilo de vida
Depressão pós-AVC: Uma revisão
O isolamento social após o AVC leva a comportamento do tipo depressivo e níveis diminuídos de bdnf em camundongos
A maturação imunológica intestinal depende da colonização com uma microbiota específica do hospedeiro
Indução de células t reguladoras do cólon por espécies de clostridium indígenas
A colonização bacteriana intestinal induz respostas mutualísticas de células T reguladoras
O butirato derivado de microrganismos comensais induz a diferenciação de células T reguladoras do cólon
O reconhecimento de bactérias comensais por células epiteliais e a manutenção da homeostase imune no intestino
Especialização regional dentro do sistema imunológico intestinal
Dinâmica da mucina e patógenos entéricos
A neutralização do eixo IL-17 diminui a invasão de neutrófilos e protege contra o acidente vascular cerebral isquêmico
Papel fundamental das células γδ T produtoras de interleucina-17 cerebrais na fase tardia da lesão cerebral isquêmica
A idade influencia a ativação microglial após desmielinização induzida por cuprizona
Um tipo único de micróglia associado à restrição do desenvolvimento da doença de Alzheimer
A micróglia emerge como protagonista nas doenças cerebrais
O receptor P2Y12 é expresso na micróglia humana sob condições fisiológicas durante todo o desenvolvimento e é sensível a doenças neuroinflamatórias
O efeito bifidogênico da inulina e da oligofrutose e suas consequências para a saúde intestinal
A síntese de mucina colônica é aumentada pelo butirato de sódio
O butirato aumenta a síntese proteica dos colonócitos na colite ulcerativa
A microbiota desempenhou um papel crítico na evolução do sistema imunológico adaptativo?
Os mecanismos que moldam o repertório de células T reguladoras CD4+ Foxp3+
Respostas de células T reguladoras antígeno-específicas à microbiota intestinal
Linfócitos T γδ como primeira linha de defesa imunológica: Formas antigas e novas de reconhecimento de antígenos e implicações para a imunoterapia do câncer
Células T γδ: Primeira linha de defesa e além
O envelhecimento altera a resposta imunológica ao acidente vascular cerebral isquêmico
O efeito da idade na espessura do muco intestinal, composição da microbiota e imunidade em relação ao sexo em camundongos
O butirato (AGCC) estimula a produção epitelial de ácido retinoico através da inibição da HDAC epitelial
O sequenciamento metagenômico shotgun e a perfilagem metabolômica não direcionada identificam microbiota intestinal humana específica e metabólitos associados à eficácia da terapia com checkpoint imunológico em pacientes com melanoma
A disbiose intestinal está associada ao metabolismo e à inflamação sistêmica em pacientes com acidente vascular cerebral isquêmico
Os ácidos graxos de cadeia curta amenizam a uveíte imunomediada parcialmente pela alteração da migração de linfócitos do intestino
A microbiota do hospedeiro controla constantemente a maturação e função da micróglia no SNC
O ácido propiônico molda o curso da doença esclerose múltipla por um mecanismo imunomodulador
O enfraquecimento estrutural da barreira de muco colônico é um evento precoce na patogênese da colite ulcerativa
A administração intraperitoneal de nanopartículas lipossomais encapsuladas com acetato para neuroproteção da penumbra em um modelo de rato de acidente vascular cerebral isquêmico
Diretrizes de rigor: Escada e degraus crescentes para pesquisa translacional eficaz
Óxido nítrico isquêmico e poli(ADP-ribose) polimerase-1 na isquemia cerebral: Toxicidade masculina, proteção feminina
Células linfoides inatas do grupo 3 medeiam a seleção intestinal de células T CD4+ específicas para bactérias comensais
Perfis de redes de microRNA em células epiteliais intestinais em um modelo de colite em camundongos
Diacilglicerol quinase sintetizada pelo comensal Lactobacillus reuteri diminui a fosforilação da proteína quinase C e a sinalização mediada por histamina no epitélio intestinal de mamíferos
O comensal Akkermansia muciniphila exacerba a inflamação intestinal em camundongos gnotobióticos infectados por Salmonella typhimurium
Um método de derivatização química com isótopos marcados para a quantificação de ácidos graxos de cadeia curta em fezes humanas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem
Composição da microbiota fecal de camundongos doadores jovens e idosos e agrupamento em camundongos receptores idosos com AVC.
A, Representação geral dos perfis bacterianos em camundongos doadores jovens (2–3 meses) e idosos (18–20 meses) no início do estudo, pela análise de efeito de tamanho discriminante linear (LEfSe) (n=4 por grupo). B, Análise de coordenadas principais (PCoA) da microbiota fecal dos camundongos doadores (jovens: 2–3 meses, idosos: 18–20 meses) e camundongos receptores com AVC (18–20 meses) submetidos à gavagem de transplante fecal (FTG) usando distâncias UniFrac não ponderadas (R²=0,2567) e ponderadas (R²=0,4562) (n=4 por grupo). C, Composição bacteriana no nível de família nos receptores transplantados, agrupando-se de acordo com os perfis dos doadores no dia 14 pós-AVC (n=4 por grupo).
O transplante pós-AVC do microbioma fecal jovem melhora o comportamento em camundongos idosos.
A, O protocolo experimental para FTG de camundongos doadores jovens (2–3 meses) e idosos (18–20 meses) para camundongos receptores idosos com AVC (18–20 meses). Alterações no peso corporal (B), atividade locomotora total usando o teste de campo aberto (OFT, C), função cognitiva usando o teste de reconhecimento de objeto novo (NORT, D) e comportamentos do tipo depressivo usando o teste de suspensão pela cauda (TST, E) após FTG jovem (n=5) e FTG idoso (n=7) no dia 14 após AVC. Ao longo do gráfico, as barras de erro representam média±EPM. Para o estudo de medidas repetidas, um modelo linear misto foi utilizado para levar em conta a correlação intrassujeito (B e C). Comparações de grupo foram posteriormente realizadas em cada momento, ajustadas para testes múltiplos. Para comparações de dois grupos, o teste t de Student foi utilizado após a normalidade dos dados ser confirmada pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk (D e E).
O FTG jovem aumenta as células T reguladoras (Treg) intestinais na lâmina própria (LP) e aumenta as produções de mucina no epitélio de camundongos idosos com AVC.
A, Gráficos representativos de citometria de fluxo para identificar células Treg na LP intestinal de camundongos idosos com AVC. Células CD45+CD4+Foxp3+ na LP do intestino delgado (ID) e do intestino grosso (IG) foram selecionadas e analisadas como células Treg. Um corante de viabilidade Live/Dead Aqua reativo a amina foi usado para identificar células vivas e mortas. Apenas células vivas foram selecionadas para a análise. Os gráficos representam as porcentagens de células Foxp3+ entre as células T CD4+ na LP do ID. B, Análise por citometria de fluxo de células T CD4+ e células Treg na LP intestinal de camundongos idosos com AVC no dia 14 após MCAO (n=5 por grupo). C, Coloração com azul alciano e ácido periódico-Schiff (AB-PAS) do IG de camundongos idosos com AVC no dia 14 pós-MCAO (n=4 por grupo) e o número de células caliciformes maduras por 10 criptas superiores/camundongo é quantificado. O colchete indica a cripta superior contendo células maduras. Barras de escala, 50 μm. D, Ensaio de permeabilidade intestinal com FITC-dextrano no dia 14 após MCAO em camundongos idosos com FTG idoso (n=4) e FTG jovem (n=5). Os dados foram normalizados para os controles FTG idosos. E, Abundância relativa de mRNA para genes de mucina epitelial e genes Reg3 do IG em camundongos idosos com AVC no dia 14 pós-MCAO (n=4 por grupo). Em todos os gráficos, as barras de erro representam média±EPM. O teste t de Student (B, C e D) e o teste U de Mann-Whitney (E) foram utilizados com base na normalidade dos dados avaliada pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk.

FTG jovem aumenta as células Treg e reduz a produção de IL-17 pelas células T γδ no cérebro de camundongos idosos com AVC.

A, Gráficos representativos de citometria de fluxo para identificar células Treg (CD45+CD4+Foxp3+) no cérebro de camundongos idosos com AVC. B, Análise por citometria de fluxo de células Treg no cérebro de camundongos idosos com AVC no dia 14 após MCAO (n=5 por grupo). C, Gráficos representativos de citometria de fluxo para identificar células T γδ (CD45highCD11b−TCRβ−TCRγδ+) no cérebro de camundongos idosos com AVC. Células T γδ IL-17+ (CD45highCD11b−TCRβ−TCRγδ+IL-17+) foram analisadas no dia 14 pós-MCAO. Um corante de viabilidade Live/Dead Aqua reativo a amina foi usado para identificar células vivas e mortas. O hemisfério ipsilateral do AVC foi utilizado para o isolamento celular e apenas células vivas foram selecionadas para a análise em ambos (A) e (C). Análise por citometria de fluxo de células T γδ cerebrais (D) e células T γδ IL-17+ (E) de camundongos idosos com AVC no dia 14 após MCAO (n=5 por grupo). Em todos os gráficos, as barras de erro representam média±EPM. O teste t de Student (B, D e E) foi utilizado após a normalidade dos dados ser confirmada pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk.

As concentrações fecais de SCFA diminuem com a idade e o tratamento combinado de bactérias produtoras de SCFA e inulina prebiótica após o AVC melhora os distúrbios comportamentais em camundongos idosos.
A, O envelhecimento diminui a concentração de SCFAs primários em amostras fecais de camundongos jovens (2–3 meses) e idosos (18–20 meses). Amostras fecais foram coletadas e analisadas por espectrometria de massa. Os gráficos representam alterações de SCFAs individuais (microbiota jovem, n=9; microbiota idosa, n=10). B, Para examinar o efeito da inulina e dos produtores de SCFAs no desfecho do AVC, quatro grupos separados de camundongos foram gavados oralmente com 1) veículo, 2) inulina, 3) produtores de SCFAs e 4) inulina+produtores de SCFAs. Para os produtores de SCFAs, a mistura de Bifidobacterium longum (1×107), Clostridium symbiosum (5×106), Faecalibacterium prausnitzii (1×106) e Lactobacillus fermentum (1×109) foi recentemente cultivada e administrada por gavagem aos camundongos. O escore de déficit neurológico (NDS) (C), o teste de hangwire (D) e o TST (E) foram realizados no dia 14 após MCAO (veículo, n=5; inulina isolada, n=3; produtores de SCFAs isolados, n=4; inulina+produtores de SCFAs, n=5). Para o TST, dois camundongos dos grupos tratados com veículo e inulina (um de cada grupo) que apresentaram giros devido a déficits neurológicos graves foram excluídos. O valor P geral para NDS, teste de hangwire e TST foi de 0,0001, 0,0004 e 0,0036, respectivamente. Ao longo do texto, as barras de erro representam média±EPM. Para comparações entre grupos, foram utilizados o teste U de Mann-Whitney (A) e ANOVA unifatorial comum ou teste de Kruskal-Wallis (C, D e E) com base na normalidade dos dados avaliada pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett.

O transplante de produtores de SCFAs reduz a produção cerebral de IL-17 pelas células T γδ em camundongos idosos com AVC.
A, Gráficos de citometria de fluxo representativos para identificar células T γδ no cérebro (hemisfério ipsilateral do AVC) de camundongos idosos com AVC. A mesma estratégia de gates utilizada no estudo FTG foi empregada. As células T γδ do cérebro (B) e as células T γδ IL-17+ (C) de camundongos idosos com AVC foram analisadas no dia 14 após MCAO (n=5 por grupo). A intensidade mediana de fluorescência (MFI) da IL-17 foi calculada (D). Ao longo do texto, as barras de erro representam média±EPM. O teste U de Mann-Whitney (B, C e D) foi utilizado porque a normalidade dos dados foi rejeitada pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk.

Perfis de SCFAs em camundongos idosos com AVC tratados com produtores de SCFAs.
No dia 14 após o tratamento com MCAO e Abx (dias 1 e 2) e inulina+bactérias (dias 3 e 4), as amostras foram coletadas de camundongos idosos com AVC. As alterações dos metabólitos fecais (veículo, n=7; inulina+bactérias, n=8), plasmáticos (veículo, n=7; inulina+bactérias, n=8) e cerebrais (veículo, n=5; inulina+bactérias, n=7) foram avaliadas por espectrometria de massa. Ao longo do texto, as barras de erro representam média±EPM. O teste U de Mann-Whitney (butirato fecal, butirato plasmático, isobutirato e 2-metilbutirato e isobutirato e 2-metilbutirato cerebral) e o teste t de Student (outros metabólitos) foram utilizados com base na normalidade dos dados avaliada pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk.

NOVELDADE E SIGNIFICÂNCIA
O Que É Conhecido?
O envelhecimento é um fator de risco importante para o AVC.
Tanto o AVC quanto o envelhecimento induzem disbiose intestinal.
A microbiota intestinal e os metabólitos derivados de microrganismos estão implicados em várias doenças neurológicas, incluindo o AVC.
Que Novas Informações Este Artigo Contribui?
A reconstituição da microbiota pós-AVC em camundongos idosos usando gavagem de transplante fecal (FTG) de camundongos jovens, que contém níveis mais elevados de bactérias produtoras de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), melhora os resultados funcionais e comportamentais.
A FTG jovem melhora a integridade intestinal, expande as células T reguladoras (Treg) no intestino e no cérebro e diminui a produção de IL-17 pelas células T γδ do cérebro após o AVC.
O transplante de bactérias produtoras seletivas de SCFA com a inulina prebiótica reproduz os efeitos benéficos da FTG jovem na recuperação do AVC em camundongos idosos com AVC.