pmid: "35239463"
title: ""
authors: "Fang Z, Pan T, Li L, Wang H, Zhu J, Zhang H, Zhao J, Chen W, Lu W"
journal: "Gut microbes"
pubdate: "2022"
doi: "10.1080/19490976.2022.2044723"
source: "PMC Full Text"

Autores

Fang Z, Pan T, Li L, Wang H, Zhu J, Zhang H, Zhao J, Chen W, Lu W

Periodico

Gut microbes (2022)

Conteudo

Metabolismo do triptofano mediado por Bifidobacterium longum para melhorar a dermatite atópica via eixo intestino-pele
RESUMO
O distúrbio microbiano intestinal afeta doenças alérgicas, incluindo asma, dermatite atópica (DA) por meio da resposta imune aberrante. Algumas espécies e cepas de Bifidobacterium foram relatadas como capazes de melhorar a DA através da modulação das interações imune-microbiana em pacientes. No entanto, os metabólitos eficazes e o mecanismo de alívio da DA em bifidobactérias ainda precisam ser elucidados. Este estudo teve como objetivo explorar o metabólito microbiano e o mecanismo de Bifidobacterium longum para melhorar a DA. Com base no sequenciamento metagenômico shotgun e em experimentos metabólicos direcionados por UHPLC Q-Exactive-MS in vitro e in vivo, focamos no metabolismo do triptofano e nos derivados de indol, que são ligantes endógenos do receptor de hidrocarboneto arílico (AHR). O indol-3-carbaldeído (I3C), um metabólito do triptofano de B. longum CCFM1029, ativou a via de sinalização imune mediada por AHR para melhorar os sintomas da DA em experimentos animais e clínicos. B. longum CCFM1029 regulou positivamente o metabolismo do triptofano e aumentou o I3C para suprimir respostas imunes aberrantes do tipo T auxiliar 2, mas esses benefícios foram eliminados pelo antagonista do AHR CH223191. Além disso, B. longum CCFM1029 remodelou a composição microbiana intestinal em pacientes com DA, aumentou o I3C fecal e sérico e manteve a abundância de Lachnospiraceae relacionada ao metabolismo do triptofano da microbiota intestinal. Os resultados sugeriram que, com base nas interações do eixo intestino-pele, B. longum CCFM1029 regulou positivamente o metabolismo do triptofano e produziu I3C para ativar a resposta imune mediada por AHR, aliviando os sintomas da DA. Os derivados de indol, metabólitos microbianos do triptofano, podem ser os potenciais metabólitos das bifidobactérias para aliviar a DA através da via de sinalização do AHR.
Introdução
Estudos anteriores demonstraram as diferenças na diversidade bacteriana e na composição da microbiota intestinal em pacientes com dermatite atópica (DA) em comparação com controles saudáveis. Bactérias benéficas intestinais, como Lactobacillus e Bifidobacterium, diminuem, mas Staphylococcus aureus e Clostridium difficile aumentam em pacientes com DA. Assim, a microbiota intestinal é um alvo potencial para aliviar a DA devido às interações do eixo intestino-pele. Alguns probióticos demonstraram aliviar a DA através da interação com a microbiota intestinal e as respostas imunes em estudos animais e clínicos. Embora os efeitos de alguns probióticos específicos tenham sido revelados por numerosos estudos, os metabólitos eficazes e a via de sinalização mediadora dos probióticos para aliviar a DA estão longe de serem esclarecidos.
Triptofano é um dos aminoácidos essenciais e participa da regulação imunológica intestinal. Metabólitos do metabolismo direto do triptofano pela microbiota intestinal incluem indol e seus derivados, como ácido indol-3-acrílico (IA), ácido indol acético (IAA), ácido indol-3-láctico (ILA), ácido indol-3-propiônico (IPA) e indol-3-carbaldeído (I3C), e são ligantes do receptor de aril hidrocarboneto (AHR). A sinalização do AHR desempenha um papel importante na modulação imunológica em sítios de barreira, como pele e intestino, por meio da interação com diversas células imunológicas, incluindo células dendríticas e células linfoides inatas. Estudos recentes demonstraram que catabólitos do metabolismo microbiano do triptofano aliviam a colite e protegem contra infecção por Candida albicans por meio da ativação do AHR para produzir a citocina anti-inflamatória IL-22 no intestino. O I3C sérico e o IPA estão negativamente relacionados à aterosclerose e complicações cardíacas pós-operatórias, e têm sido considerados potenciais biomarcadores para doença aterosclerótica. A microbiota intestinal protege contra danos induzidos por radiação por meio do aumento de Lachnospiraceae, Enterococcaceae e seus metabólitos, incluindo propionato, I3C e quinurenina (KYN) em camundongos. Esses resultados sugerem que os derivados do indol são importantes para a homeostase imunológica e a saúde humana. Em pacientes com DA, o metabolismo do triptofano foi reduzido, e a administração oral de I3C ativou a ligação do AHR aos sítios AHRE2 e AHRE4 na região promotora do gene da linfopoietina estromal tímica (TSLP) para suprimir respostas imunes aberrantes do tipo Th2. Isso implica que os metabólitos do triptofano derivados de microrganismos têm o potencial de aliviar os sintomas clínicos da DA e desencadear as interações do eixo intestino-pele.

Os efeitos atenuantes de cepas de B. longum sobre os sintomas da DA foram demonstrados em nosso estudo anterior. Elas exerceram diferentes efeitos na imunorregulação e nas alterações microbianas intestinais em camundongos com DA. No entanto, o mecanismo de ação para atenuar a DA ainda precisa ser elucidado. Neste estudo, combinando análise de sequenciamento metagenômico e análise metabólica direcionada do triptofano, as interações entre B. longum CCFM1029 e a microbiota intestinal foram reveladas em experimentos de intervenção dietética em animais e clínicos, e o mecanismo de B. longum CCFM1029 para aliviar a DA foi elucidado. B. longum CCFM1029 remodelou a composição microbiana intestinal e regulou positivamente o metabolismo do triptofano da microbiota intestinal para aumentar o I3C, que mediou a via de sinalização do AHR para melhorar os sintomas clínicos da DA.

Resultados

O tratamento com B. longum CCFM1029 regulou positivamente o metabolismo do triptofano da microbiota intestinal em camundongos com DA.
Efeitos de B. longum CCFM1029 na composição microbiana intestinal e no metabolismo do triptofano em camundongos. (a) Análise de coordenadas principais para a microbiota intestinal. (b) Composição microbiana intestinal no nível de filo. (c) Alterações na microbiota intestinal no nível de gênero. (d) Alterações funcionais de genes da microbiota intestinal com base nas vias KEGG. (e) Alterações dos metabólitos do triptofano em amostras fecais. KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; DNFB, 2,4-dinitrofluorobenzeno; CCFM1029, B. longum CCFM1029; KYN: Quinurenina; IA: ácido indol-3-acrílico; IAA: ácido indolacético; ILA: ácido indol-3-láctico; IPA: ácido indol-3-propiônico; I3C: indol-3-carbaldeído.
Um modelo de camundongo semelhante à DA foi induzido usando 2,4-dinitrofluorobenzeno (DNFB) e a metodologia detalhada e o progresso referem-se à parte da construção do modelo animal (materiais e métodos). Para explorar melhor o mecanismo das cepas de B. longum no alívio da DA, uma cepa otimizada de bifidobactérias que suprime respostas aberrantes do tipo Th2 foi selecionada. B. longum CCFM1029 morta não aliviou os sintomas semelhantes à DA em camundongos nem suprimiu as respostas imunes do tipo Th2 (Figura S1). B. longum CCFM1029 morta não reduziu significativamente o escore patológico e a espessura da orelha em camundongos com DA. Além disso, não afetou significativamente a IgE, a proporção de células T reguladoras (Treg) e a IL-4, embora tenha aumentado significativamente a expressão de IL-10 e IFN-γ. Isso sugeriu que os efeitos de alívio da B. longum CCFM1029 estavam associados ao seu metabolismo e/ou comunicação com a microbiota intestinal. Portanto, analisamos as alterações na microbiota intestinal de camundongos dos grupos controle, DNFB e CCFM1029 vivo usando sequenciamento metagenômico shotgun (n = 4–5). A PCoA revelou a similaridade ou dissimilaridade da composição microbiana intestinal entre os grupos (Figura 1a). Os três grupos foram divididos em diferentes clusters pelos fatores de influência PC1 (23,93%) e PC2 (15,79%), e isso mostrou as diferenças na microbiota intestinal dos camundongos. Actinobacteria, Bacteroidetes e Firmicutes foram as bactérias dominantes nos três grupos (Figura 1b). Actinobacteria (9,13%) aumentou, mas Firmicutes (49,60%) diminuiu no grupo DNFB em comparação com o grupo controle (Actinobacteria e Firmicutes foram 5,79% e 51,57%, respectivamente). Em comparação com o grupo DNFB, o tratamento com B. longum CCFM1029 aumentou Actinobacteria (11,84%) e Firmicutes (50,13%), mas reduziu Bacteroidetes (32,13%). Proteobacteria não teve alteração significativa nos três grupos, mas Candidatus_Saccharibacteria foi significativamente reduzida no grupo DNFB. No nível de gênero (abundância relativa >0,5%), Prevotella, unclassified_p_Firmicutes, unclassified_c_Bacilli Enterohabdus, Alistipes, Streptococcus, Eggerthella, Enterococcus e Adlercreutzia aumentaram, mas unclassified_f_Lachnospiraceae, Lactobacillus, Staphylococcus, Clostridium e unclassified_p_Candidatus_Saccharibacteria diminuíram no grupo DNFB em comparação com o grupo controle (Figura 1c). Em comparação com o grupo DNFB, o tratamento com B. longum CCFM1029 aumentou Lactobacillus, unclassified_f_Lachnospiraceae, unclassified_p_Candidatus_Saccharibacteria, Enterorhabdus, Clostridium e Staphylococcus e reduziu unclassified_p_Firmicutes, Bacteroides, Prevotella, Streptococcus e Enterococcus.
Para analisar as diferenças nas funções gênicas da microbiota intestinal entre os grupos DNFB e CCFM1029+ DNFB (CCFM1029, doravante o mesmo), foi realizada a análise discriminante linear (LDA) do tamanho do efeito (LEfSe) (escore LDA (log10)>2, Figura 1d). As vias, incluindo biossíntese de aminoácidos, biossíntese de valina, leucina e isoleucina, metabolismo de ácidos dibásicos de cadeia ramificada C5, biossíntese de ansamicinas, biossíntese de acarbose e validamicina e biossíntese de antibióticos do grupo vancomicina, foram maiores no grupo DNFB do que no grupo CCFM1029. Por outro lado, a biossíntese de aminoacil-tRNA, recombinação homóloga, legionelose e metabolismo do triptofano (p < 0,05, Figura 1d, à direita) foram maiores no grupo CCFM1029. Além disso, os metabólitos fecais do triptofano foram determinados por análise de UHPLC Q-Exactive Plus MS. Em comparação com o grupo controle, o KYN aumentou, mas os derivados de indol foram reduzidos no grupo DNFB (Figura 1e). O tratamento com B. longum CCFM1029 aumentou significativamente o I3C fecal, mas não outros derivados de indol, em comparação com o grupo DNFB. Coletivamente, os resultados mostraram que B. longum CCFM1029 remodelou a composição microbiana intestinal e regulou positivamente o I3C por meio do metabolismo do triptofano.
O aumento do I3C proveniente do metabolismo do triptofano estava intimamente associado ao metabolismo de B. longum CCFM1029
O I3C foi derivado do catabolismo do triptofano por B. longum CCFM1029. (a-b) A análise da contribuição dos micróbios intestinais para o metabolismo do triptofano. (c) A análise de correlação entre a alteração microbiana intestinal e as mudanças no I3C. (d) Avaliação de B. longum CCFM1029 metabolizando triptofano in vitro. (e) Comparação da produção de I3C por cepas de B. longum metabolizando triptofano in vitro. ***p < 0,001, ****p < 0,0001 vs grupo CCFM1029 (teste ANOVA de uma via).
Para analisar a fonte do aumento de I3C fecal em camundongos do grupo CCFM1029, foi realizada a análise de contribuição da microbiota intestinal para o metabolismo do triptofano. Akkermansia muciniphila, Alistipes shahii, Bacteroides thetaiotaomicron, Burkholderia cenocepacia, Enterorhabdus caecimuris, Ralstonia solanacearum contribuíram para o metabolismo do triptofano da microbiota intestinal nos três grupos, mas B. longum foi detectado apenas no grupo CCFM1029 (Figura 2a). Além disso, as abundâncias relativas de Enterorhabdus caecimuris e B. longum aumentaram, mas outras bactérias foram reduzidas no grupo CCFM1029 (Figura 2b). Com base na análise de correlação, o I3C fecal foi positivamente relacionado a B. longum (p < 0,05) (Figura 2c). No entanto, a correlação foi fraca entre I3C e Enterorhabdus caecimuris. As bactérias que contribuíram para o metabolismo do triptofano tiveram interações complexas, por exemplo, Akkermansia muciniphila foi positivamente relacionada a Bacteroides thetaiotaomicron (p < 0,05) mas foi negativamente relacionada a B. longum. Para avaliar a capacidade de B. longum CCFM1029 de metabolizar o triptofano, determinamos derivados de indol usando um sistema de cultura de células em repouso para B. longum CCFM1029 in vitro. B. longum CCFM1029 (8.5 × 10^8 UFC/mL) metabolizou triptofano para produzir ILA (16967.43 ± 1257.53 ng/mL), IAA (3.89 ± 1.78 ng/mL) e I3C (11.20 ± 0.64 ng/mL), mas IPA e IAA não foram detectados (Figura 2d, Figura S2). Além disso, selecionamos aleatoriamente algumas cepas ineficazes de B. longum para analisar suas capacidades de produzir I3C in vitro de acordo com os resultados de nosso estudo anterior. Em comparação com B. longum CCFM1029, essas cepas produziram menor I3C (Figura 2e). Esses resultados mostraram que B. longum CCFM1029 produziu I3C via metabolização do triptofano e tinha potencial para catabolizar o triptofano dietético no intestino.

O I3C induzido por B. longum CCFM1029 ativou o AHR para suprimir as respostas imunes do tipo Th2

B. longum CCFM1029 inibiu os sintomas de DA através de respostas imunes mediadas por AHR. (a) Efeitos de B. longum CCFM1029 na inflamação da pele. (b) Alteração da espessura da orelha em camundongos. (c) Alterações no IgE sérico (***p < 0,001, ****p < 0,0001, ANOVA de duas vias seguido pelo teste de comparações múltiplas de Tukey). (d) Variação (fold-change) na expressão de AHR. (e-g) TSLP, IL-4 e IL-5 em lesões de pele. (h) Efeitos de B. longum CCFM1029 no I3C sérico. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 vs grupo DNFB (teste ANOVA de uma via). AHR, receptores de hidrocarboneto arílico; TSLP, linfopoietina estromal tímica.
A sinalização de AHR contribui para a inibição da expressão do gene TSLP e suprime a resposta imune aberrante do tipo Th2 na DA. Assim, assumimos que o B. longum CCFM1029 aliviou os sintomas da DA por meio da via de sinalização mediada por AHR. O CH223191, um antagonista de AHR, foi utilizado para bloquear a AHR. A coloração por hematoxilina-eosina mostrou que o infiltrado inflamatório estava aumentado na pele dorsal no grupo DNFB em comparação com o grupo controle (Figura 3a). Em comparação com o grupo DNFB, o B. longum CCFM1029, assim como o controle positivo do fármaco I3C, reduziu significativamente o inchaço dorsal, mas os efeitos atenuantes do B. longum CCFM1029 foram eliminados pelo tratamento com CH223191. Os tratamentos com B. longum CCFM1029 e I3C reduziram significativamente a espessura da orelha e a IgE sérica em comparação com o tratamento com DNFB (Figura 3b,c). Para investigar os efeitos da ativação de AHR nas manifestações clínicas induzidas por B. longum CCFM1029, avaliamos a expressão de AHR. Os tratamentos com B. longum CCFM1029 e I3C aumentaram significativamente a expressão de AHR, mas o tratamento com CH223191 bloqueou significativamente a ativação de AHR (Figura 3d). Além disso, a expressão de TLSP e citocinas relacionadas a Th2 foi avaliada na via downstream. O B. longum CCFM1029 diminuiu significativamente o TSLP e, consequentemente, suprimiu as expressões de IL-4 e IL-5 por meio da ativação de AHR em comparação com o grupo DNFB (Figura 3e–g). Para explorar se a ativação de AHR estava relacionada ao I3C, medimos os níveis séricos de I3C, ILA e IAA. O I3C aumentou significativamente no grupo CCFM1029 em comparação com o grupo DNFB (Figura 3h), mas os níveis séricos de ILA e IAA não apresentaram diferenças significativas entre os dois grupos (Figura S3). Os resultados mostraram que o B. longum CCFM1029 aliviou os sintomas clínicos da DA ao produzir I3C para ativar a via de sinalização de AHR.

O tratamento com B. longum CCFM1029 aumentou o I3C para aliviar os sintomas da DA em pacientes

Características clínicas basais dos pacientes

Característica Grupo placebo (n = 43) Grupo CCFM1029 (n = 44) Valor-p Sexo feminino, n. (%) 27 (62,79) 31 (70,45)   Idade, média (DP), anos 50,38 (10,80) 47,81 (13,73) 0,586 Altura, média (DP), cm 164,0 (5,88) 163,5 (4,10) 0,964 Peso, média (DP), kg 59,5 (9,10) 60,09 (8,07) 0,552 SCORAD, média (DP) 27,75 (19,32) 24,27 (14,85) 0,534 DLQI, média (DP) 9,05 (5,19) 9,59 (5,63) 0,758 Uso de corticosteroide, n. (%) 6 (13,95) 2 (4,55)   Uso de antibióticos, n. (%) 5 (11,63) 3 (6,82)   Histórico de doença de hipersensibilidade, n. (%) 8 (18,60) 6 (13,64)  
SCORAD, índice de escore de dermatite atópica; DLQI, índice de qualidade de vida em dermatologia.
Efeitos do B. longum CCFM1029 em pacientes com DA. (a) Fluxograma do estado dos pacientes nos grupos placebo e CCFM1029. (b) Efeito do B. longum CCFM1029 nos indicadores SCORAD e DLQI. (c) Efeitos do B. longum nos marcadores séricos. (d) Efeitos do B. longum CCFM1029 nos derivados de indol em amostras fecais e séricas. *p < 0,05 (teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn). SCORAD, índice de escore de dermatite atópica; DLQI, índice de qualidade de vida em dermatologia; NR-B, subgrupo sem resposta (antes do tratamento com CCFM1029); NR, subgrupo sem resposta (após o tratamento com CCFM1029); R-B, subgrupo com resposta (antes do tratamento com CCFM1029); R, subgrupo com resposta (após o tratamento com CCFM1029).

Os pacientes foram coletados e os indivíduos elegíveis foram randomizados para os grupos placebo (n = 43) e CCFM1029 (n = 44) (Figura 4a). Não houve diferenças significativas nas características clínicas basais entre os grupos placebo e CCFM1029 (Tabela 1). Após 8 semanas de tratamento, o B. longum CCFM1029 reduziu significativamente o índice de escore de dermatite atópica (SCORAD) e o índice de qualidade de vida em dermatologia (DLQI) em comparação com antes da intervenção, mas o placebo não teve efeitos significativos (Figura 4b). Além disso, o tratamento com B. longum CCFM1029 reduziu significativamente a IgE em comparação com antes da intervenção e após o tratamento com placebo, mas não conseguiu reduzir significativamente as citocinas do tipo Th2 (Figura 4c, Figura S4). Embora o B. longum CCFM1029 não tenha diminuído a IL-4 em comparação com antes da intervenção, ele reduziu a IL-4 sérica em comparação com após o tratamento com placebo (p = 0,078). Para analisar os efeitos do B. longum CCFM1029 nos derivados de indol, suas alterações foram determinadas em amostras fecais e séricas. No subgrupo sem resposta (NR, sem redução no SCORAD após o tratamento com CCFM1029, n = 12), não houve efeitos significativos nos seis derivados de indol, tanto nas amostras fecais quanto séricas, em comparação com antes da intervenção com B. longum CCFM1029 (NR-B, Figura 4d). No subgrupo com resposta (R, uma diminuição no SCORAD após o tratamento com CCFM1029, n = 31), o B. longum CCFM1029 aumentou significativamente o ILA sérico, o I3C sérico e o I3C fecal em comparação com antes da intervenção (R-B). Além disso, o I3C foi negativamente relacionado ao SCORAD e DLQI (p < 0,05, Figura 4e) com base na análise de correlação, mas o ILA não mostrou correlação negativa significativa com eles. As alterações no I3C nos pacientes foram consistentes com os resultados nos resultados experimentais animais acima. Esses resultados mostraram que o B. longum CCFM1029 atenuou os sintomas de DA em pacientes por meio do aumento do I3C.

O tratamento com B. longum CCFM1029 remodelou a composição microbiana intestinal e regulou positivamente genes funcionais relacionados ao metabolismo do triptofano da microbiota intestinal.
Efeitos do B. longum CCFM1029 na microbiota intestinal de pacientes. (a) Análise de NMDS para diversidade β da microbiota intestinal. (b-c) Alterações microbianas intestinais no nível de filo em pacientes. (d) Análise de LEfSe para táxons diferenciais entre antes e depois da intervenção com placebo (p < 0,05, escore LDA (log10) > 2,0). (e) Cladograma para táxons diferencialmente abundantes no grupo CCFM1029-B, subgrupo NR e subgrupo R. (f) Alterações nas proporções de Sutterella e Lachnospiraceae. (g) Abundância de genes funcionais relacionados ao metabolismo do triptofano. *p < 0,05 vs. CCFM1029-B, ****p < 0,0001 (teste ANOVA de uma via). NMDS, escalonamento multidimensional não métrico. LEfSe, análise de tamanho de efeito por discriminante linear.

O placebo e o B. longum CCFM1029 não afetaram o índice de Shannon da microbiota intestinal (Figura S5). A análise de NMDS revelou que o B. longum CCFM1029, mas não o placebo, alterou significativamente a diversidade beta em pacientes (p < 0,004, Figura 5a, Figura S5). No nível de filo, o placebo reduziu a proporção de Actinobacteria e Proteobacteria e aumentou Firmicutes (Figura 5b). Em comparação com antes da intervenção com *B. longum* CCFM1029 (CCFM1029-B), a proporção de Bacteroidetes aumentou, mas Proteobacteria e Actinobacteria diminuíram no subgrupo NR (Figura 5c). No entanto, a abundância de Proteobacteria diminuiu, mas Actinobacteria, Bacteroidetes e Firmicutes aumentaram no subgrupo R. No nível de gênero (abundância > 0,5%), a análise de LEfSe mostrou uma maior abundância de Phascolarctobacterium e Acidaminococcaceae após o tratamento com placebo (Figura 5d). O tratamento com placebo por 8 semanas reduziu as proporções de Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria, incluindo Acinetobacter, Bifidobacterium, Klebsiella, Haemophilus, Enterobacter, Weissella e Collinsella em pacientes. No entanto, em comparação com CCFM1029-B e NR, Lachnospiraceae e Sutterella foram os táxons diferenciais no subgrupo R (Figura 5e). A abundância relativa de Sutterella aumentou significativamente no subgrupo NR, mas não houve efeito significativo sobre ela no subgrupo R em comparação com antes do tratamento com B. longum CCFM1029. Além disso, a proporção de Lachnospiraceae foi significativamente reduzida no subgrupo NR, mas foi mantida no subgrupo R em comparação com o grupo CCFM1029-B (Figura 5f). Com base na análise funcional gênica do PICRUSt, o tratamento com B. longum CCFM1029 regulou positivamente significativamente a abundância de genes funcionais relacionados ao metabolismo do triptofano da microbiota intestinal (Figura 5g), e isso foi consistente com o aumento de I3C em amostras fecais e séricas de pacientes com DA. Os resultados mostraram que o tratamento com B. longum CCFM1029 modulou a microbiota intestinal e contribuiu para o aumento do metabolismo do triptofano da microbiota intestinal em pacientes com DA.

Eventos adversos
Não houve eventos adversos em pacientes durante o ensaio de intervenção. Além disso, o B. longum CCFM1029 não mostrou efeitos significativos nos índices bioquímicos séricos e nos índices urinários dos pacientes (Figura S6 e Tabela S3).

Discussão
Este trabalho explorou o mecanismo e os metabólitos eficazes de B. longum CCFM1029 para melhorar os sintomas clínicos por meio de experimentos in vitro e in vivo e revelou os efeitos de B. longum CCFM1029 na imunorregulação via o eixo intestino-pele. Em um ensaio clínico, o tratamento com Lacticaseibacillus rhamnosus IDCC 3201 inativado por 12 semanas reduziu significativamente o SCORAD em pacientes com DA moderada e mostrou grande potencial terapêutico para DA. Os resultados sugeriram que probióticos inativados podem melhorar os sintomas clínicos de doenças através do componente da parede celular. O B. longum CCFM1029 inativado, mas não o B. longum CCFM1029 vivo, não conseguiu reduzir o escore patológico e a infiltração inflamatória na pele em comparação com o grupo DNFB (Figura S1). O próprio componente de B. longum CCFM1029 não conseguiu suprimir a resposta Th2 e melhorar os sintomas semelhantes a DA em camundongos. Portanto, esses resultados sugeriram que o efeito de alívio de B. longum CCFM1029 estava associado ao metabólito dele ou às interações com a microbiota intestinal.

B. longum CCFM1029 regulou positivamente o metabolismo do triptofano em experimentos animais e clínicos (Figura 1d, Figura 5g). O metabolismo do triptofano é um alvo terapêutico em doenças como câncer e neurodegeneração através da via da quinurenina, da via do 5-hidroxitriptofano e da via do metabolismo microbiano. Indol e derivados de indol são catabólitos do metabolismo microbiano do triptofano. B. longum foi detectado apenas no grupo CCFM1029 e positivamente associado à produção de I3C (Figura 2a–c). Embora muitas bactérias contribuíssem para o metabolismo do triptofano no intestino, algumas espécies eram desconhecidas nas amostras fecais com base nos dados de sequenciamento. Além disso, com base na análise HUMAnN2, os níveis de nucleotídeos ou níveis de proteínas de algumas espécies anotadas não foram mapeados para vias relacionadas ao metabolismo do triptofano. Portanto, havia outras espécies não classificadas contribuindo para o metabolismo do triptofano na Figura 2a, e suas funções devem ser elucidadas em estudos futuros. Além disso, em comparação com as cepas não efetivas de B. longum M611, Y6M1, X1M6 e 23M3, B. longum CCFM1029 converteu triptofano em mais I3C in vitro (Figura 2d,e). Consistente com os resultados do experimento animal e in vitro, B. longum CCFM1029 melhorou significativamente os sintomas de DA através da elevação do I3C fecal e sérico em pacientes (Figura 4d). Embora o ILA tenha sido significativamente elevado no subgrupo R em comparação com o subgrupo R-B, o I3C foi muito mais sensível ao AHR do que o ILA. Com base na análise de correlação, o I3C, mas não o ILA, apresentou correlação negativa significativa com SCORAD e DLQI (Figura 4e), e assim o I3C pode ser o metabólito efetivo para melhorar a DA. Esses resultados sugeriram que o I3C produzido por B. longum CCFM1029 contribuiu para a melhora dos sintomas de DA.
A maioria dos derivados de indol, como ILA, IAA e I3C, são ligantes endógenos do AHR, e as respostas imunológicas mediadas pela sinalização do AHR contribuem para o tratamento da DA. A aplicação de alcatrão de hulha para melhorar a DA dependia da ativação do AHR para perturbar a sinalização Th2 por meio da desfosforilação de STAT6. O antagonista do AHR CH223191 eliminou os efeitos de alívio do B. longum CCFM1029 (Figura 3), o que sugeriu que a redução da inflamação cutânea induzida por B. longum CCFM1029 exigia a ativação do AHR. Isso foi consistente com a descoberta anterior de que a ativação do AHR suprimia a expressão de TSLP e, assim, reduzia as respostas Th2 aberrantes em camundongos com DA. No entanto, o B. longum CCFM1029 reduziu significativamente a IgE sérica, mas não teve efeitos significativos sobre TSLP e respostas Th2 em pacientes (Figura 3c). A administração oral de probióticos por 12 semanas não mostrou efeitos significativos sobre marcadores sanguíneos como IL-4, IL-5 e IL-13 em pacientes com DA, o que foi consistente com nossos achados. A administração oral de suco fermentado com L. plantarum 0132 inativado pelo calor por 8 semanas aliviou os sintomas em pacientes com DA moderada e reduziu significativamente os marcadores sanguíneos, incluindo IgE, IgE específica e proteína catiônica eosinofílica. Esses resultados controversos sugeriram que os efeitos das cepas probióticas nas respostas imunológicas eram específicos.

Efeitos distantes da microbiota intestinal foram verificados em doenças como asma e depressão. Alterações na composição e função microbiana intestinal estão ligadas a respostas imunológicas de doenças de pele, e isso fornece alguma visão sobre o desenvolvimento da DA. O B. longum CCFM1029 alterou a beta-diversidade microbiana intestinal e modulou a composição microbiana intestinal (Figura 5a). Em pacientes com DA, a mudança na beta-diversidade, mas não na alfa-diversidade, foi significativa em um ensaio clínico, o que foi consistente com nossos achados. O B. longum CCFM1029 reduziu as proporções de Escherichia-Shigella e Klebsiella, que pertencem ao filo Proteobacteria. A alta proporção de Proteobacteria pode estar associada ao desenvolvimento de DA. Maiores quantidades de Escherichia-Shigella e Staphylococcus aureus foram encontradas em crianças alérgicas na Estônia e Suécia. A suplementação com bifidobactérias em mulheres grávidas reduziu significativamente o risco de dermatite atópica/eczema e apresentou uma proporção menor de Proteobacteria em comparação com o grupo controle. No experimento animal, B. longum CCFM1029 elevou significativamente as abundâncias de Lactobacillus, Clostridium e unclassified_f_Lachnospiraceae (Figura 1c). O tratamento com β-glucano e L. plantarum LM1004 diminuiu as expressões dos fatores de transcrição das células Th2 e Th17 através do aumento de Lachnospiraceae, Bacteroides e Roseburia em camundongos com DA. O aumento de Lactobacillus pode contribuir para a produção de ácido γ-aminobutírico (GABA), inibindo o prurido cutâneo. Em um estudo de coorte sobre o curso natural da DA na primeira infância, uma alta proporção de Streptococcus e baixas proporções de Clostridium e Akkermansia foram detectadas em crianças com DA persistente.
Phascolarctobacterium foi a bactéria diferencial no grupo placebo (Figura 5d) e estava relacionada ao desenvolvimento da doença de Parkinson e da síndrome metabólica. No subgrupo NR, Sutterella estava aumentada, mas Lachnospiraceae estava reduzida em comparação com o grupo CCFM1029-B. No entanto, as abundâncias de ambas as bactérias não mostraram alteração significativa no subgrupo R em comparação com o grupo CCFM1029-B. Sutterella está intimamente associada ao início e desenvolvimento de doenças gastrointestinais e transtornos psiquiátricos, como doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa e autismo. Lachnospiraceae, uma bactéria produtora de SCFA, o acúmulo tardio de SCFA foi intimamente associado ao risco de desenvolvimento em lactentes com DA sensibilizados a alérgenos em um estudo longitudinal. Além disso, Lachnospiraceae, com metabólitos downstream como propionato e I3C, protege contra radiação em camundongos. O tratamento com B. longum CCFM1029 manteve a proporção de Lachnospiraceae no subgrupo R em comparação com o grupo CCFM1029-B. Isso sugeriu que a microbiota intestinal poderia estar envolvida na produção de I3C, mas não foi suficiente para exercer os efeitos de alívio na DA sem o tratamento com B. longum CCFM1029. Portanto, o tratamento com B. longum CCFM1029 remodelou a composição microbiana intestinal e contribuiu para o aumento do metabolismo do triptofano em pacientes com DA (Figura 5g). Não excluímos a contribuição da microbiota intestinal in situ no metabolismo do triptofano no presente estudo, o que foi uma limitação. Os efeitos dos derivados de indol serão explorados por meio de um modelo de camundongo livre de germes para avaliar os efeitos da microbiota intestinal no metabolismo do triptofano em estudos futuros.
Em conclusão, os resultados mostraram que os sintomas da DA poderiam ser aliviados ao afetar o agonista AHR I3C produzido por B. longum CCFM1029, desencadeando a comunicação entre intestino e pele. Além disso, os derivados de indol, metabólitos microbianos intestinais do triptofano, têm o potencial de afetar a imunorregulação no hospedeiro com o papel de moléculas sinalizadoras e podem ser um alvo eficaz para melhorar doenças alérgicas.
Materiais e métodos
Materiais
IA, IAA, ILA, IPA, I3C, DNFB, antagonista AHR CH223191, metanol (grau gradiente, Supelco) e acetonitrila (grau gradiente, Supelco) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Acetona e azeite foram adquiridos da Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Xangai, China).
Preparação bacteriana
Cepas de B. longum (CCFM1029, M203F02M611 (M611), FSCDJY6M1 (Y6M1), FSHMX1M6 (X1M6), FXJWS23M3 (23 M3)) foram armazenadas na Coleção de Culturas de Microrganismos Alimentares (Wuxi, Jiangsu, China). Após ativação consecutiva por duas gerações, as cepas foram cultivadas em caldo MRS com 0,05% (p/v) de L-cisteína-HCl (Sinopharm, Xangai, China) em uma estação de trabalho anaeróbica (Electrotek AW400SG, Keighley, West Yorkshire, Reino Unido) a 37°C por 24–36 h. As informações detalhadas sobre a preparação das culturas bacterianas foram referidas em nosso artigo anterior. O número de bactérias viáveis foi determinado pelo método de contagem em placas.

Construção do modelo animal

Fluxograma experimental. HE: hematoxilina-eosina; KYN: Quinurenina.

Camundongos fêmeas C57BL/6 (grau SPF) com 6 semanas de idade foram adquiridos da Charles River Laboratories (Pequim, China). Os camundongos foram alimentados em uma instalação com ciclo de luz controlado (12 h claro/12 h escuro), temperatura (20–26°C) e nível de umidade (40–50%). Ração padrão e água estavam disponíveis ad libitum durante o experimento. Após 1 semana de adaptação, sintomas semelhantes à DA foram induzidos conforme referido em nosso artigo anterior. Resumidamente, após administração oral de B. longum CCFM1029 ou soro fisiológico estéril por 1 semana, 2,4-dinitrofluorbenzeno (DNFB, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi misturado com uma solução substrato (acetona:óleo de oliva = 4:1, v/v, Sinopharm, Xangai, China) para preparar a solução sensibilizante (0,5% e 0,2%). No dia 15, a solução de DNFB a 0,5% foi aplicada na pele dorsal depilada e na orelha esquerda dos camundongos. Em seguida, a solução de DNFB a 0,2% foi aplicada nos mesmos locais para induzir sintomas semelhantes à DA nos dias 19, 22, 25 e 28. O fluxograma experimental foi mostrado na Figura 6.

Experimento de suplementação com I3C em camundongos com DA

Camundongos fêmeas foram divididos aleatoriamente no grupo controle, grupo DNFB, grupo I3C, grupo CCFM1029 e grupo do antagonista de AHR CH223191 (Sigma-Aldrich) (n = 8). Uma semana antes do estabelecimento do modelo, os camundongos receberam por gavagem suspensão de B. longum CCFM1029 (diluída para 10⁹ UFC/0,2 mL com soro fisiológico estéril) uma vez ao dia nos grupos CH223191 e CCFM1029 até o final do experimento, e 10 μM de CH223191 (20 μL) foi aplicado na orelha e na pele por 30 min antes do tratamento com B. longum CCFM1029. Os camundongos receberam por gavagem 0,2 mL de soro fisiológico estéril nos grupos controle e DNFB, e administração oral de 0,2 mL de solução de I3C (10 μg/mL, Sigma-Aldrich) no grupo I3C.

Sequenciamento metagenômico shotgun para amostras fecais de camundongos
O sequenciamento metagenômico shotgun de amostras fecais (n = 4–5) foi realizado pela Majorbio Biopharm Technology Co., Ltd. (Xangai, China). As informações detalhadas foram mencionadas em um artigo anterior. Resumidamente, uma biblioteca com tamanho médio de inserto de 400 pb foi construída para cada amostra e sequenciada usando a plataforma Illumina NovaSeq (Illumina, San Diego, CA, EUA). Sequências de alta qualidade foram obtidas após a filtragem dos dados brutos e controle de qualidade. As leituras limpas foram montadas para gerar contigs usando o MEGAHIT (Tabela S1). Sequências gênicas não redundantes foram alinhadas ao banco de dados NR do NCBI e ao banco de dados KEGG usando BLASTP (versão 2.2.28+) para obter informações detalhadas sobre táxons e funções gênicas. A análise de coordenadas principais (PCoA) foi realizada com base na distância de Jaccard. LEfSe foi utilizado para determinar as diferenças nas funções gênicas entre os grupos DNFB e CCFM1029. Os dados foram processados na Plataforma em Nuvem Majorbio (http://www.majorbio.com). A contribuição da microbiota intestinal para o metabolismo do triptofano foi realizada usando HuMAnN2 (versão 0.11.2).

Recrutamento de pacientes com DA e coleta de amostras

A avaliação clínica foi um ensaio clínico randomizado controlado por placebo. Pacientes com DA foram recrutados no Hospital Popular de Tinghu (Yancheng, Jiangsu, China) e os sintomas clínicos da DA foram diagnosticados por dermatologistas de acordo com os critérios de Hanifin & Rajka. Todos os pacientes forneceram consentimentos informados por escrito. Os participantes eram inelegíveis se tivessem tomado corticosteroides sistêmicos e ciclosporina, ou produtos antibióticos e probióticos nas 2 semanas anteriores, ou apresentassem sinais de infecção bacteriana. Todos os sujeitos (n = 102) foram divididos aleatoriamente nos grupos placebo e CCFM1029, e as características clínicas basais dos pacientes foram coletadas. Os pacientes receberam diariamente um sachê contendo pó liofilizado de B. longum CCFM1029 (10⁹ UFC/2 g) ou pó de maltodextrina (2 g) durante 8 semanas. Amostras de soro e fezes foram coletadas e congeladas a -80°C até o uso.

Sequenciamento de amplicon de 16S rRNA

No experimento de avaliação clínica, o DNA total das amostras fecais foi obtido usando o kit FastDNA spin para fezes (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EUA). A região V3-V4 foi amplificada (341F e 806R) e sequenciada usando a plataforma de sequenciamento Illumina (MiSeq, Illumina Co., Santiago Canyon, CA, EUA). Os dados de 16S rRNA foram analisados usando o pipeline QIIME2 (código aberto, http://qiime2.org). A análise de escalonamento multidimensional não métrico (NMDS) foi realizada para revelar as diferenças entre os grupos com base na distância de Bray-Curtis. Os genes funcionais da microbiota foram avaliados usando a investigação filogenética de comunidades por reconstrução de estados não observados (PICRUSt).

Determinação de derivados de indol em amostras de soro e fezes
Pré-tratamento das amostras de soro e fezes, e a preparação da solução padrão foram referidos ao material suplementar. A determinação dos derivados de indol foi realizada em um Vanquish UHPLC Q-Exactive Plus MS (Thermo Fisher, CA, EUA) equipado com uma coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (Waters, Milford, Massachusetts; 1,7 μm, 2,1 × 100 mm). Um sistema de solvente binário composto pela fase móvel A (acetonitrila, ACN, Supelco, Sigma-Aldrich) e fase móvel B (ácido fórmico a 0,1%, Supelco, Sigma-Aldrich). Os gradientes binários foram os seguintes: 5% A por 3 min, 5% A para 30% A por 6 min, 30% A para 100% A por 6 min, 100% A por 1,5 min, e reequilíbrio da coluna com 5% A por 3,5 min. O tempo total foi de 20 min a uma vazão de 300 μl/min, e a temperatura da coluna foi de 35°C. O volume de injeção foi de 2 μL. A espectrometria de massas foi realizada em um Q-Exactive Plus MS operando em modo de ionização positiva. As condições de ionização por electrospray aquecido foram as seguintes: voltagem do spray de íons, 3,5 kV; temperatura do capilar, 320°C, temperatura do aquecedor, 320°C, fluxo de volume de gás auxiliar, 15 arb, e taxa de fluxo de gás de bainha, 35 arb. O modo de varredura foi uma aquisição de varredura completa de 80 a 1200 m/z com resolução de 70.000 e alvo AGC 3e6.
Determinação de derivados de indol do metabolismo do triptofano de B. longum in vitro
Na fase estacionária inicial do crescimento da cepa de B. longum, a solução bacteriana foi centrifugada a 3400 × g a 4°C por 20 min. Removendo o sobrenadante e as bactérias foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (pH = 7,4). Após recentrifugação nas mesmas condições, 1 mL de meio de cultura M9 (Tabela S2) foi adicionado ao tubo e as bactérias foram cultivadas por 48 h em condições anaeróbicas. Em seguida, as bactérias foram centrifugadas a 7000 × g a 4°C por 10 min para obter o sobrenadante. 100 μL de sobrenadante foram misturados com 800 μL de metanol pré-resfriado e a mistura foi colocada em gelo por 30 min para remover proteínas. A mistura foi centrifugada a 15000 × g a 4°C por 10 min para obter o sobrenadante. Após concentração a vácuo e tratamento por centrifugação, a amostra final foi obtida para análise por UHPLC Q-Exactive-MS.
Análise estatística
O software SPSS (versão 20.0, Chicago, Illinois, EUA) e o software Origin Pro 9 (Origin Lab Corporation, Wellesley Hills, Massachusetts, EUA) foram utilizados para realizar a análise estatística. Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Material Suplementar
Declaração de divulgação
Nenhum potencial conflito de interesse foi relatado pelo(s) autor(es).
Aprovação ética
O experimento animal foi aprovado pelos Comitês de Ética da Universidade de Jiangnan (JN.No20191115 c0480105[314] e JN.No20180115c2600531[5]). O ensaio clínico foi aprovado pelos Comitês de Ética do Hospital Popular de Tinghu (aprovação ética nº ET2019030, registro de ensaio clínico nº ChiCTR1900024199).
Declaração de disponibilidade de dados
Os dados de sequenciamento shotgun estão disponíveis mediante solicitação razoável ao autor correspondente, WWL. Como os participantes deste estudo não concordaram com a divulgação pública de seus dados, os dados de sequenciamento de amplicon do gene 16S rRNA do ensaio clínico não estão disponíveis.
Material suplementar
Os dados suplementares para este artigo podem ser acessados no site da editora.
Referências
Desenvolvimento da microbiota intestinal durante a infância: impacto da introdução de alimentos alergênicos
Perturbações nos genes do microbioma intestinal em lactentes com dermatite atópica de acordo com o tipo de alimentação
Diversidade reduzida na microbiota fecal inicial de lactentes com eczema atópico
Desenvolvimento de alergias e a microflora intestinal durante o primeiro ano de vida
Diferenças na microflora fecal entre pacientes com dermatite atópica e indivíduos controle saudáveis
Probióticos no tratamento da síndrome eczema/dermatite atópica em lactentes: um ensaio duplo-cego controlado por placebo
Efeito da administração oral de uma mistura de cepas probióticas no índice SCORAD e no uso de corticoides tópicos em pacientes jovens com dermatite atópica moderada: um ensaio clínico randomizado
Lactobacillus sakei WIKIM30 melhora lesões cutâneas semelhantes à dermatite atópica induzindo células T reguladoras e alterando a estrutura da microbiota intestinal em camundongos
Impacto da microbiota intestinal na imunidade intestinal mediada pelo metabolismo do triptofano
O triptofano (Trp) modula a homeostase intestinal através do receptor de hidrocarboneto arílico (AhR)
Regulação da microbiota intestinal no metabolismo do triptofano na saúde e na doença
CARD9 impacta a colite alterando o metabolismo do triptofano pela microbiota intestinal em ligantes do receptor de hidrocarboneto arílico
Catabólitos do triptofano provenientes da microbiota engajam o receptor de hidrocarboneto arílico e equilibram a reatividade mucosal através da interleucina-22
A segmentação do receptor de hidrocarboneto arílico com indol-3-aldeído protege contra candidíase vulvovaginal através da interação IL-22-IL-18
Metabólitos modulados pelo microbioma plasmático derivados de indol e fenil associam-se à aterosclerose avançada e aos resultados pós-operatórios
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Um metabólito do triptofano da microbiota cutânea atenua a inflamação em pacientes com dermatite atópica através do receptor de hidrocarboneto arílico
Efeito melhorador cepa-específico de Bifidobacterium longum na dermatite atópica em camundongos
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